本研究は、脳卒中後の四肢痙縮をラットモデルで用いる頭皮鍼治療と運動の組み合わせが運動皮質シナプス可塑性に与える影響を調査し、PI3K/Akt経路活動と治療効果との関連を探ることを目指します。
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研究記事
本研究は、脳卒中後の四肢痙縮をラットモデルで用いる頭皮鍼治療と運動の組み合わせが運動皮質シナプス可塑性に与える影響を調査し、PI3K/Akt経路活動と治療効果との関連を探ることを目指します。
脳卒中後痙縮(PSS)に対する効果的な治療法は限られており、頭皮鍼治療と運動(SAE)の組み合わせがPSSを緩和するメカニズムも完全には解明されていません。本研究では、PSSを持つラットにおけるSAEの影響を調査し、SAEがPI3K/Akt経路を通じてシナプス可塑性を調節するかどうかを調査しました。中脳動脈閉塞(MCAO)ラットモデルを確立し、ラットを5つのグループ(ブランク、シャム、MCAO、SAE、バクロフェン)にランダムに割り当てました。すべての介入は7日間連続で実施されました。神経機能、脳梗塞容積、組織病理学、シナプス超微構造および関連するタンパク質発現を評価しました。MCAO群と比較して、SAEは神経学的欠損を改善し、筋の過緊張を減少させ、梗塞容積を減少させ、神経損傷を緩和し、シナプス数を増加させ、シナプス形態を改善しました。SAEはまた、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、リン酸化PI3K(p-PI3K)、リン酸化Akt(p-AKT)、シナプスタンパク質(シナプトフィシン(SYN)、シナプス後密度タンパク質95(PSD-95)、成長関連タンパク質43(GAP-43)のアップレギュレーションも行いました。免疫蛍光染色はさらに、SAE治療後に運動皮質におけるSYNおよびp-Aktの発現が増加することを示唆しました。これらの発見は、SAEがGDNFのアップレプレギュレーションによるPI3K/Aktシグナルの活性化と相関し、シナプス可塑性を改善しPSS症状の緩和に寄与していることを示唆しています。本研究は、PSSラットにおけるSAEの影響を調査し、SAE介入、PI3K/Akt経路活性、シナプス可塑性との潜在的な関連性を探りました。
脳梗塞は世界的に主要な死因および障害の原因であり続けています。虚血と低酸素はニューロンを損傷し、運動回路の興奮抑制バランスを乱し、運動機能障害を引き起こします。脳卒中後の痙縮は筋肉緊張の増加と関節の可動性の低下として現れ、日常生活の活動が妨げられ、介護者の負担が増大します。バクロフェンのような抗痙性薬は一時的な症状緩和をもたらすことがありますが、長期使用すると薬耐性や副作用を引き起こし、神経機能の障害を回復させることはありません。3.従来の運動リハビリテーションは、効果の開始が遅く、治療期間が長引くことにも制約があります。したがって、より安全で効果的な治療戦略が緊急に求められており、その根本的なメカニズムはさらなる調査を必要としています。神経可塑性は脳卒中後の機能回復の中心的なメカニズムであり、シナプスの再構築、軸索再生、神経細胞の生存を含みます。虚血性脳卒中後、梗塞コアのニューロンは急速に死滅し、局所的な炎症反応が虚血半影の組織損傷を悪化させます。これらのプロセスが合わさって脳損傷を引き起こします5,6。神経可塑性の重要な要素であるシナプス可塑性は、シナプス関連タンパク質(シナプス関連マーカー:シナプトフィシン(SYN)や成長関連タンパク質43(GAP-43)、さらにシナプス後密度タンパク質95(PSD-95)7,8,9によって評価できます。
神経栄養因子はシナプス可塑性の分子基盤を提供します。グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)は特に重要であり、神経細胞の生存と修復を促進し、炎症を抑制し、シナプス微小環境を改善する10。Ret受容体に結合することで、GDNFはPI3K/Aktシグナル伝達11を活性化します。PI3K/Aktカスケードは神経系における主要な生存促進経路であり、その活性化はアポトーシスを抑制しつつ、シナプス再構築に必要なタンパク質合成を支えます12,13。頭皮鍼治療と運動(SAE)は、頭皮鍼刺激と能動運動トレーニングを組み合わせた統合リハビリテーション戦略です。この方法の全体的な目的は、同時に中枢神経活動を調節し、課題関連の運動回復を促進し、筋の過緊張を軽減し、脳卒中後の機能的転帰を改善することです。SAEは中国で脳卒中後の痙縮(PSS)治療に広く用いられています。この複合アプローチの根拠は、頭皮鍼治療が皮質の興奮性や脳灌流を調節する可能性がある一方で、運動療法は活動依存的な運動訓練を提供し、機能回復とシナプス再構築を促進するためです。運動療法単独と比較して、これまでの臨床的証拠では、頭皮のポイントでの頭皮鍼治療と運動療法を組み合わせることで、脳卒中後肢痙攣患者の四肢痙縮がさらに減少し、運動機能や日常生活活動が改善することが示されています。
最近のシステマティックレビューおよびメタアナリシスでは、モーションスタイルの頭皮鍼治療や関連する頭皮鍼治療と運動の併用介入が、単一成分または連続的介入よりも痙縮、運動機能、バランス、日常生活活動においてより大きな改善をもたらすことが示唆されており、神経調節と運動トレーニングの併用の利点を支持しています15.前臨床研究では、SAEまたは関連するモーションスタイルの頭皮鍼治療プロトコルが、5-HT₂A受容体介有の脊椎KCC2再活性化を通じて脳血流を改善し、痙縮を緩和することが示されています16,17。最近の研究では、鍼治療がPI3K/Aktシグナル伝達を通じて神経可塑性を促進することが示唆されています。したがって、SAEは脳卒中後の神経可塑性の調節、運動回復、痙縮の軽減が主要な治療目標となる実験的・臨床的文脈に特に適している可能性があります。しかし、SAE、GDNF/PI3K/Aktシグナル伝達、シナプス可塑性とPSSの緩和における潜在的な関連性は、依然として十分に解明されていません。本研究では、SAEが神経学的欠損および筋肉痙縮に与える影響を評価し、介入後のGDNF発現、PI3K/Akt経路活性、シナプス可塑性関連タンパク質の変化を特徴づけるために、PSSのラットモデルを確立しました。本研究は、SAEがPSSの適切なリハビリテーション戦略であるかどうかを判断し、その作用機序を明らかにするための実験的証拠を提供する可能性があります。
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すべての手技は長春中国医科大学動物倫理委員会(承認番号20251038)によって承認され、動物研究:生体内実験報告(ARRIVE 2.0)ガイドラインおよびNIHの実験動物ケア・利用ガイドに従って実施されました。本研究で使用されるすべての材料は 材料表に示されています。
実験的手法
実験動物とグループ分け
中国長春市広城区のホンダ動物育種農場から、80匹の特定病原体フリー(SPF)成体オスのスプラグ–ドーリーラット(220–250g)を購入しました。動物は長春中国医薬大学実験動物センターに収容され、22〜25°C、相対湿度50〜60%、12時間の明暗サイクルで飼育され、餌と水は自由に利用されました。1週間の順応後、ラットは無作為にブランクグループ(n = 12)、シャムグループ(n = 12)、モデルリザーブグループ(n = 56)に割り当てられました。ブランク群は、健康なラットにおける行動パフォーマンス、組織病理学的特徴、分子マーカー発現の基準値を提供するために、正常かつ未処理の対照群として含めました。シャム群はMCAO群と同じ麻酔と外科的曝露を受けましたが、動脈閉塞は行われませんでした。したがって、このグループは麻酔および手術操作の潜在的な影響の対照群として機能しました。ブランク群とシャム群の両方を含めることで、虚血性損傷の影響を手術自体に関連するものと区別できるようになりました。
モデル予備グループはMCAOモデリングを受けました。手術後最初の3日間はモデル誘導期間と定義されました。この期間中、56匹中8匹が死亡し、死亡率は14.29%にあたり、モデル化が成功しなかったため12匹は除外されました。モデル確立に成功した残りの36頭のラットは、ランダム番号表を用いてMCAO、SAE、バクロフェン群にランダムに割り当てられ、各群に12頭ずつ割り当てられました。グループ介入は以下の通りです:(I) ブランクグループ:通常の給餌のみで介入なし。(II) シャム群:結紮やフィラメント挿入なしに総頸動脈、内外頸動脈、迷走神経の外科的露出。(III)MCAO群:MCAOは腹腔内麻酔下で3%のペントバルビタールナトリウムを用いて確立され、その後の治療はありませんでした。(IV) SAE群:MCAOのモデリングと検証に成功した後、ラットは運動と組み合わせて頭皮鍼治療を受けました。イソフルラン吸入麻酔は1.5%〜2.0%で短時間の針挿入段階のみ使用されました。トレッドミルのトレーニングは、意識が完全に回復し、自発的な歩行能力が回復した後にのみ開始されました。鍼治療はGV20および両側EX-HN1で行われました。針は深さ1mmまで挿入され、トレッドミルトレーニング期間中は保持されました。標準化された30分の針保持・トレーニング期間はトレッドミルでのトレーニング期間と定義され、6 m/minで10分間、続いて12 m/minで20分間、傾斜0°で行われました。介入は7日間連続で1日1回実施されました。(V) バクロフェン群:MCAOのモデリングと検証に成功した後、ラットは0.4 mg/kgの胃内ガヴェージで7日間連続でバクロフェンを投与されました。
MCAOモデルの確立
ラットのMCAOモデルは、修正されたluminal intrafilament法を用いて確立されました。19。12時間の断食と水分除去の後、ラットは腹腔内注射で3%のペントバルビタールナトリウムを注射し、仰向け姿勢に置きました。皮膚消毒後、右総頸動脈(CCA)および隣接する神経・筋肉を露出させるために頸椎の中央切開が行われました。外頸動脈(ECA)を特定し結紮し、内頸動脈(ICA)を分離しました。近位内側内側側切(ICA)と内側内側(CCA)に結紮し、遠位の内側内側側(CCA)を一時的にクランプしました。その後、クランプ近位のCCAに小さな動脈切開術が行われました。0.26mmのナイロンフィラメントを挿入し、ICAを18〜20mm進めて中大脳動脈の起点を塞ぎました。その後、ICAとCCAが結紮され、切開部は縫合されました。手術後、ラットは回復中に温められ、感染を防ぐためにペニシリン(40,000 U)の腹膜内注射を受けました。シャム群では、フィラメント挿入なしに血管曝露のみが行われました。創傷閉鎖および術後ケアはMCAO群と同一でした。成功したモデル確立は、手術後3日目にZea Longaスコア≥2、19 、修正Ashworthスケール(MAS)筋トーンスコア≥グレード120と定義されました。
介入方法
頭皮鍼治療と運動介入を組み合わせる
過去の研究では、MCAOラットでは神経障害が3日目にピークに達し、手術後10日以内に高値を維持しますが、末梢筋抵抗は6日目から9日目にかけて徐々に増加していることが示されています。したがって、治療は術後3日目から開始され、自然回復の影響を最小限に抑えるため、7日間連続で1日1回継続しました。モデリング前に、SAEグループに割り当てられたラットは、5分/分で3日間、10分/日22分の適応型トレッドミルトレーニングを受けました。この適応訓練は、ラットがトレッドミルランニングに慣れ、介入期間中に抵抗、転倒、走り拒否、停止の可能性を減らすために用いられました。適応トレーニングおよび正式な介入において、異常なトレッドミル関連イベントは、持続的な抵抗、ランニングレーンからの転倒、1分以上走ること拒否、またはトレッドミルトレーニング中に1分以上停止することと定義されました。これらの出来事は観測された際に実験ログに記録されました。短いためらいや一時的な停止は、優しい促しでトレッドミルランニングを再開できれば除外にはつながりませんでした。データは、動物が繰り返し転倒、持続的な走り拒否、または重度の苦痛により割り当てられた毎日のトレッドミルセッションを完遂できなかった場合にのみ除外しました。3日目にモデル検証が成功した後、SAE介入は7日間連続で1日1回実施されました。
各治療セッションで、ラットには1.5%〜2.0%のイソフルランで麻酔が投与されました。麻酔は針挿入直後に中止されました。実験では、ラットは通常、イソフルラン離脱後約1〜2分以内に完全に意識を取り戻しました。ラットが麻酔されている間にトレッドミルのトレーニングは開始されませんでした。経穴は、2020年に中国鍼灸灸協会が発行した『実験動物における一般的な経穴の命名法および局所化』に基づき、経験豊富な動物鍼灸師によって特定されました。GV20は頭蓋中央線上の前泉門と後泉門をつなぐ線の中点として定義されました。両側のEX-HN1ポイントはGV20の外側2mmに配置されていました。0.25mm×13mmの使い捨て針を縦に1mmの深さまで挿入し、標準化された30分間のトレッドミルトレーニング期間中ずっと保持されました。針は通気性のある医療用テープで固定され、手術の一貫性を確保するために触診で頭蓋骨の貫通を排除しました。針の位置とテープ固定は、トレッドミルトレーニング前、異常なランニング行動が起きた場合の短い休憩中、トレーニング終了直後にチェックされました。さらに、動物の行動に関係なく、トレッドミルトレーニング中は5分ごとに針の位置を目視で確認しました。針の置位は、目に見える緩み、針の角度の変化、部分的な引き抜き、またはトレッドミル走行中の完全な外れと定義されました。針の位置を失わずに軽い緩みが見られた場合は、トレッドミルを一時停止しながらテープを優しく補強しました。針が部分的に抜かれたり完全に外れた場合は、そのセッション中に針は再挿入されませんでした。ラットは追加の針操作なしで残りのトレッドミルトレーニングを完了し、この出来事は実験ログに記録されました。動物は、単一の針置位事件だけで除外されることはありませんでした。ただし、その出来事にトレッドミルでのトレーニングが完了できないか、重度の苦痛の兆候が伴う場合は例外でした。
標準化された30分間の針保持・トレーニング期間は、イソフルラン麻酔からの完全回復後にラットがトレッドミル走行を開始し、トレーニング終了後すぐに針を除去した時点で終了しました。イソフルラン中止後の短い回復期間は、標準化された30分のトレーニング期間には含まれていませんでした。針は回復前に挿入されたため、実際の身体的滞在時間は30分のトレッドミルトレーニング時間より約1〜2分長かった。この定義はSAE群のすべてのラットに一貫して適用されました。ラットは、以下の条件を満たすと判断され、意識の完全回復、自立能力、平坦な面を一定に歩く能力、そして穏やかな外部刺激に対する正常な反応が満たされた。これらの基準はトレッドミルに乗せる前に確認されました。
針保持中、ラットは傾斜0度のトレッドミル運動を行いました:6 m/minで10分間、続いて12 m/minで20分間行いました。研究中、電気ショックは一切使用されませんでした。ラットが正式なトレーニング中に走るのをやめたり、1分以上走ることを拒否した場合は、トレッドミルの壁を軽く叩くなどの優しく非嫌悪感を伴う聴覚刺激を用いて動きを促しました。このような促しの使い方や、もがく、転倒、停止、走るのを拒否する、針のずれなどは、観察された実験ログに記録されました。これらの出来事は記述的に監視され、観察された際に実験ログに記録されました。運動強度は、頭皮鍼治療とトレッドミルトレーニングを組み合わせた既に報告されたプロトコルに基づき包括的に調整されました16,23。SAE介入は7日間連続で1日1回実施されました(図1A)。
バクロフェン介入
モデル検証に成功した後、バクロフェン群のラットは0.4 mg/kgの用量で胃内ガベージによるバクロフェン溶液を受け取りました。この薬は7日間連続で午前9時に1日1回投与されました。
結果は確定
一般的な観察
全グループで体重、精神状態、食事と水分摂取、自発活動を含む全てのグループで毎日の全容態がモニタリングされました。
神経機能と筋緊張の評価
神経学的欠損および四肢痙縮は、Zea Longaスコア、修正神経重症度スコア(mNSS)、修正Ashworthスケールを用いてモデル検証後の1日目、3日目、5日目、7日目に評価されました。すべての行動評価は、観察期間中ずっとグループ割り当てを盲目にした2名の研究者によって独立して実施されました。詳細な得点基準を示します(表1–3)。
脳梗塞容積の測定
脳梗塞容積は2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)染色を用いて評価されました。7日間の介入後、各群から3匹のラットが無作為に選抜され、腹腔内過剰投与のペントバルビタールナトリウム投与で安楽死させ、その後迅速な頭部切断による脳全体採取が行われました。脳はまず−20°Cで凍結され、その後2mm厚の冠状切片に切り分けられました。切片は2%TTC溶液、37°Cで暗闇で30分間培養され、その後4%パラホルマルデヒド4°Cで一晩固定されました。 翌日、すべてのセクションがデジタルカメラで撮影されました。正常な脳組織は濃い赤色に染まり、梗塞した組織は淡い白色に見えました。梗塞部位はImageJで定量化され、梗塞量は次の式でパーセンテージで表されました。
心動量 (%)= 梗塞面積/脳切面総面積 ×100%。 (1)
脳組織の組織病理学的検査
ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色
ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて、梗塞周囲皮質の組織病理学的変化を評価する。7日間の介入後、ラットは腹腔内過剰投与のペントバルビタールナトリウムで安楽死させられました。その後、0.01 Mリン酸緩衝生食塩水(PBS)を用いた迅速な心裏灌流を行い血液を除去し、その後、固定のために冷たい4%パラホルマルデヒド250 mLを投与しました。脳全体を採取し、筋膜炎周辺の皮質組織を単離して4%パラホルムアルデヒドに4°Cで24時間固定しました。組織はパラフィンで埋め込まれ、5μmで冠状切片を施しました。セクションはスライドに取り付けられ、60°Cで30分間焼かれ、キレンI–IIIで脱硫され(各10分)、その後、HE染色が行われ、脱水とクリアリングが行われました。最後に、切片を中性バルサムでカバースリップし、ニコンの光学顕微鏡で画像を取得しました。
ニッスル染色
ニッスル染色法は、神経細胞の生存率および梗塞周囲領域におけるニッスル体密度を評価するために用いられました。7日間の介入後、ラットは安楽死され、0.01 M PBS(37°C)を経心灌流し、続いて4%パラホルマルデヒド250mL(4°C)を投与しました。脳全体を摘出し、筋膜周囲および対側皮質組織を4°Cの4%パラホルムアルデヒドで一晩で解離・固定した。 パラフィン埋め込み後、5μmの切片を準備しました。切片はキシレンで10分間脱硫され、その後、段階化されたエタノール溶液(95%、90%、80%、70%、50%、各濃度5分)で再水和され、室温で30分間ニッスル作業液で染色されました。蒸留水で軽くすすいだ後、区画はグレードエタノールで脱水され、キシレンで2分間洗浄され、最後にカバースリップでマウントされました。画像は撮影され、光学顕微鏡で分析されました。
ウェスタンブロット解析によるタンパク質顕現
ウェスタンブロッティングは、PI3K/Aktシグナル伝達およびシナプス可塑性に関与するタンパク質を評価するために実施されました。7日間の介入後、ラットはペントバルビタールナトリウムの過剰投与で安楽死させ、梗塞周運動皮質組織を採取しました。組織は氷上の放射免疫沈殿法(RIPA)溶解バッファーで完全に均質化され、1610 × g 、4°Cで30分間遠心分離して全タンパク質を抽出しました。市販のビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を定量化しました。同量のタンパク質(1レーンあたり50μg)をナトリウムドデシル硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離し、ポリフッビニリデン(PVDF)膜に電気的に移されました。膜は室温で5%牛血清アルブミン(BSA)溶液で1時間封じて非特異的結合を除去し、その後4°Cで一次抗体と一晩培養しました。 Tris緩衝食塩水とTween-20(TBST)緩衝液で3回洗浄した後、膜は室温で1時間、二次抗体(希釈比1:1000)で1時間培養されました。タンパク質バンドは増強化学発光(ECL)を用いて可視化し、バンド強度はImageJで定量化しました。相対タンパク質発現は、標的タンパク質と内部対照群の比率として計算されました。一次抗体は以下の通りです:GAPDH(1:1000)、PI3K(1:1000)、リン-PI3K(1:1000)、Akt(1:1000)、リン-Akt(1:1000)、GAP-43(1:1000)、SYN(1:1000)、PSD-95(1:1000)、GDNF(1:1000)。
シナプス超微細観測
透過電子顕微鏡(TEM)を用いてシナプス数と構造的完全性を評価しました。7日間の介入後、ラットに麻酔をかけ、4%パラホルマルデヒドおよび2.5%グルターアルデヒドを含む混合固定剤を経心液で灌流しました。梗塞周囲の皮質ブロック(1 mm × 1 mm × 1 mm)を採取し、2.5%グルターアルデヒドに2時間固定し、その後1%オスミウム四酸化物で1時間固定しました。その後、試料は段階的なエタノール脱水、エポキシ樹脂埋め込み、超薄片切片(50nm厚さ)、およびウラニル酢酸塩とクエン酸鉛による二重染色で処理されました。透過電子顕微鏡を用いてシナプス超微細を観察しました。構造評価のために画像は8,000×で取得され、シナプスは5,000×でカウントされました。各グループに3つのランダムなニューロピルフィールドを解析して平均シナプス数を算出し、データを一方向ANOVAで比較しました。
免疫蛍光二重標識アッセイ
免疫蛍光二重標識染色を用いて、周周梗塞皮質におけるSYNおよびp-Aktの発現と分布を評価しました。7日間の介入後、ラットは腹膜内過剰投与のペントバルビタールナトリウムで安楽死させられ、梗塞周囲の皮質組織は迅速に剥離されました。試料は4%パラホルムアルデヒドに24時間固定され、最適切削温度化合物(OCT)に埋め込み、厚さ10μmの断片に切断されました。セクションは室温で1時間の自然乾燥後、TBSTバッファーで3回洗浄して残留OCT化合物を除去しました。切片は0.3%トリトンX-100で室温で20分間透過し、PBSで洗浄し、室温で1時間にわたり5% BSA溶液でブロッキングしました。暗条件下で、切片を4°Cで一晩、ウサギ抗SYN(希釈1:200)およびウサギ抗p-Akt(希釈1:200)一次抗体とともにインキュベートしました。翌日、切片をPBSで3回洗浄し、室温で暗闇で二次抗体(希釈1:400)で50分間培養しました。さらに6回のTBSTバッファー洗浄後、細胞核は室温で5分間4′6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)作業液で染色されました。画像は蛍光顕微鏡を用いた同一露光および背景設定で取得されました。代表画像を用いて、グループ間で運動皮質におけるSYNおよびp-Aktの発現パターンを評価しました。
統計解析
統計解析はGraphPad Prism 10.1.2およびIBM SPSS Statistics 25を用いて実施されました。データは平均標準偏差(SD)±表示されています。Zea Longaスコア、修正神経重症度スコア、修正Ashworthスケールを含む複数の時点で収集された行動データは、グループを被験者間の因子、時間を被験者内因子とする二方向反復測定ANOVAを用いて解析しました。有意な主効果や相互作用が検出された場合、シダックの多重比較検定が事後分析に用いられました。その他のデータは一方向ANOVAを用いて分析し、その後シダックの多重比較検定を用いて事後比較を行った。二尾の p.0.05 <は統計的に有意とされました。棒グラフでは、統計的有意性は対応する図の凡庸な表示に定義されたアスタリスクで示されます。
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SAEはPSSラットの神経機能を改善し、筋肉の痙縮を軽減します
SAEが脳卒中後痙生を伴うラットにおける行動機能障害に対する治療効果は、モデル検証後の1日目、3日目、5日目、7日目にZea Longaスコア、修正神経重症度スコア、修正Ashworthスケールを用いて評価されました(n=12件)。Zea LongaスコアとmNSSは神経学的欠損の評価に用いられ、MASスコアは筋緊張や痙縮の評価に用いられました。モデル化の結果、ブランク群とシャム群のラットは体重増加が安定し、行動は正常で活動も維持されました。対照的に、MCAO群のラットは体重減少、倦怠感、食物摂取量の減少、左肢の動き制限が見られました。治療後、SAE群およびバクロフェン群のラットは徐々に体重が回復し、MCAO群と比較して行動状態が改善しました(図2)。
Zea Longaスコアでは、二者反復測定ANOVAが時間およびグループ×時間の相互作用に有意な効果を...
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過去の臨床研究では、頭皮鍼治療と運動を組み合わせることで、脳卒中後痙縮の患者の痙攣症状を緩和し、運動機能や日常生活活動の改善が可能であることが示されています(ADL)14,24。これらの発見はその臨床的価値を裏付けています。本研究は、Zea Longaスコア、mNSS、MASの3つの行動指標を用いて、ラットモデルにおけるSAEの治療効果をさらに確認しました。繰り返しの行動評価では、SAEは時間とともに神経学的欠損を改善し筋の過緊張を減少させ、モデル群よりも明確かつ早期に改善傾向を示しました。これらの行動改善は、SAEが神経修復と運動制御の両方に実質的な効果があることを示唆しています。しかし、行動の改善だけでは組織レベルや分子メカニズムの根本的なメカニズムを明らかにすることはできません。そのため、脳梗塞量、神経障害、シナプス超微構造、シグナル伝達経路におけるタンパク質発現がさらに調査されました。
組織...
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著者たちは競合する金銭的利害関係がないと宣言しています。
著者の貢献:
Sainan Zhao:概念化、方法論、形式分析、調査、プロジェクト管理、執筆 – 原稿、執筆 – レビューと編集。Lingxu Li:調査、データ管理、検証。ウェンナ・リー:データキュレーション、形式分析、可視化。ワン春夢:調査、リソース。ジン燕龍:ソフトウェア、検証、執筆 – レビューと編集。光誠誌:監督、資金調達、リソース、執筆 – レビューと編集。
著者らは本研究に参加したすべての参加者に感謝します。この作業は吉林省科学技術開発プロジェクト(No.YDZJ202401122ZYTS]。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物染色溶液 | Beyotime | C0651 | TTC染色 |
| 3MM フィルターペーパー | Whatman, UK | 3030861 | ウェスタンブロット転写 |
| AKT抗体 | Affinity | AF0836 | 一次抗体 |
| アセトン | シノファームケミカルリAGENTS Co., Ltd. | 10000418 | 電子顕微鏡標本の浸透 |
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | バージョン 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html | 64ビット版、グラフィック編集と科学的図の作成に使用 |
| 無水エタノール | シノファームケミカルリAGENTS Co., Ltd. | 100092683 | パラフィン切片の脱パラフィン化 |
| 抗褪色マウンティング媒体 | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C1020 | カバリング |
| BCAタンパク質アッセイキット | MDL | MD913053 | タンパク質濃度測定 |
| 青染液 | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C2104 | ヘマトキシリン染色 |
| 化学発光イメージングシステム | CLINX, 中国 | ChemiScope6100 | タンパク質検出システム |
| 濃縮正常ヤギ血清 | Bosterバイオテクノロジー | AR1009 | 血清ブロッキング |
| DAPI | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C1030 | 核染色 |
| ダイヤモンドナイフ | Daitome | Ultra 45° | 超薄切片の切断 |
| 分化液 | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C2104 | HE染色 |
| 乾燥オーブン | 天津ラボリー機器有限公司 | GFL-230 | 固定組織切片の焼成 |
| EDTA (pH 9.0) 抗原回収溶液 | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C1052 | 抗原回収 |
| 電子顕微鏡固定液 | ASPEN | AS1063 | 電子顕微鏡標本の固定 |
| 電気泳動電源 | Longfang | LF-2000 | 電気泳動電圧の提供 |
| Embed 812 埋め込み媒体 | SPI | 90529-77-4 | 電子顕微鏡標本の浸透 |
| EndNote X9 | Clarivate Analytics (US) LLC | バージョン X9, https://endnote.com/ | 参考文献管理と学術引用フォーマットに使用 |
| 凍結ステージ | 武漢君捷電子有限公司 | JB-L5 | 凍結組織ブロックの凍結 |
| GAP-43抗体 | Affinity | Df7766 | 一次抗体 |
| GAPDH抗体 | Affinity | AF7021 | 一次抗体 |
| GDNF抗体 | バイオシンセシス | Bs-1024r | 一次抗体 |
| 氷酢酸 | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C2138 | ニッスル染色 |
| ガラススライドとカバリング | シノファームケミカルリAGENTS Co., Ltd. | 10212432C | 組織切片の取り付け |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | バージョン 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/ | 64ビット版、統計解析と科学的プロット作成に使用 |
| 研削機 | 北京ハーデ | N.9548 | 組織サンプルの研削 |
| HE染色液 | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C2103 | HE染色 |
| HRP結合ヤギ抗マウス二次抗体 | Servicebio | C030205 | 二次抗体 |
| HRP結合ヤギ抗ウサギ抗体 | SeraCare | 5220-0336 | 二次抗体 |
| 過酸化水素 (H2O2) | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C5101 | TSA試薬の調製 |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corp. | バージョン 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics | 64ビット版、統計データ解析と処理に使用 |
| イメージングシステム | ニコン、日本 | Nikon DS-U3 | 顕微鏡画像の撮影 |
| 金属浴 | COYOTE | H203-H | 恒温インキュベーション |
| 電子レンジ | ガランツ電子機器有限公司 | P70D20TL-P4 | 抗原回収 |
| NC膜 (0.22 μm) | GVS, USA | ISEQ00010 | タンパク質ブロット転写 |
| 中性バルサム | シノファームケミカルリAGENTS Co., Ltd. | 10004160 | 脱水とカバリング |
| PBSバッファー | 武漢百迁都バイオテクノロジー有限公司 | C0003 | 脱色と洗浄 |
| PI3K抗体 | Affinity | AF6241 | 一次抗体 |
| PSD-95抗体 | Affinity | Af5283 | 一次抗体 |
| 病理用ミクロトーム | ライカ機器（上海）有限公司 | RM2016 | パラフィン切片の切断 |
| リン酸化AKT抗体 | Affinity | Af0832 | 一次抗体 |
| リン酸化PI3K抗体 | Affinity | Af3241 | 一次抗体 |
| ピペット | Dragonlab | KE0003087/KA0056573 | 定量的液体移送 |
| プロテアーゼ阻害剤コクテイル | Beyotime | P1005 | プロテアーゼ阻害 |
| RIPA溶解バッファー (中) | Beyotime | P0013C | 組織溶解 |
| 冷蔵遠心機 | SEILOGEX, 中国 | CF1524R | 低速サンプル分離 |
| SDS-PAGE電気泳動システム | Beyotime | MiniProGel™ ゲル鋳造、電気泳動、ウェスタンブロット転写システム | タンパク質の電気泳動分離 |
| SDS-PAGEプレキャストゲルキット | MDL | MD911919 | SDS-PAGE電気泳動 |
| SYN (シナプシン) 抗体 | バイオシンセシス | bs-3501R | 一次抗体 |
| シェーカー | Qilinbeier | TS-8 | サンプル振とう洗浄 |