炎症誘発代謝変化の研究を目的としたインターロイキン10ノックアウトマウスにおけるピロキシカム加速型腸炎のモデル

サマリー

このプロトコルはピロキシカムを用いてインターロイキン(IL-10)ノックアウトマウスモデルにおける大腸炎の発症を加速させます。このプロトコルは大腸炎の同期を保証し、性別、背景株、ビバリウムの状態に依存しない厳格で再現性の高い結果をもたらします。これは腸の炎症中の代謝変化を研究する有用なモデルとして機能します。

要約

炎症性腸疾患(IBD)は、世界中で1,000万人以上に影響を及ぼす慢性的な消化管の炎症性疾患です。IBDの免疫学的メカニズムや影響については多くの研究が行われてきましたが、粘膜炎症が代謝調節障害、特に体重減少や食欲減退にどのように寄与するかについては、あまり理解されていません。本件では、著者らはインターロイキン10ノックアウト(IL-10-KO)マウスにおけるピロキシカム加速腸炎のマウスモデルを記述し、炎症誘発性代謝調節障害を研究しています。IL-10-KOマウスは自発性腸炎を発症することが知られており、感染や薬物によって引き起こされる腸炎に対する感受性が高まります。しかし、このモデルではビバリウムの状態やストレインバックグラウンドが大腸炎発症の交絡要因として報告されています。非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)であるピロキシカムは、動物モデルにおいて腸炎を引き起こしたり加速したりすることが示されており、腸道炎の粘膜曝露を増加させることで示されています。このプロトコルでは、オスとメスのIL-10-KOマウスに通常のチャウダイエットの代わりにピロキシカム強化飼料を与えられました。食事量と体重は、全身の代謝変化や下痢や直腸出血などの腸炎の臨床症状を反映するために毎日測定されました。このプロトコルは効率的かつ再現性が高く、複数のマウスで同時に腸炎を誘発し、炎症性腸疾患モデルにおける代謝調節障害の評価を可能にします。このプロトコルを用いたさらなる研究では、腸炎がエネルギー消費や体組成など代謝調節の他の要素に与える影響を調査し、炎症性腸疾患と宿主代謝のより広範な関連を明らかにする可能性があります。

概要

クローン病および潰瘍性大腸炎は、総称して炎症性腸疾患(IBD)として知られ、消化管の慢性自己免疫疾患であり、粘膜の炎症を特徴とし、腹痛、体重減少、血尿、下痢などの臨床症状が現れます。IBDは世界中で何百万人もの人々に影響を与え、西洋化社会で最も有病率が高い^1.アメリカでは、300万人以上^{が影響を受け}ていると推定^{されており、特に}子どもや若者の間で発症率と有病率が増加^{しています。}

IBDの病因の正確なメカニズムは完全には解明されていませんが、遺伝的に感受性の高い個人における腸内細菌叢に対する過剰な免疫反応が原因と考えられています。炎症反応を調節するサイトカインは、腸内恒常性の維持やIBDの発症において重要な役割を果たします。その中でも、インターロイキン10(IL-10)はよく研究されている抗炎症性サイトカインであり、自然免疫反応群と適応免疫応答の両方を調節することで、人間の免疫学的恒常性を維持するのに役立ちます^6,7。特に、IL-10およびその受容体(IL-10RA/B)における多型が、非常に早期に発症するIBD(VEO-IBD)の乳児で確認されており、典型的には生後数か月以内に肛門周疾患を呈します⁸。この関連は、クローン病の成人患者に対する大規模なエクソームシーケンスによってさらに支持されており、IL-10RAが非単一遺伝子IBD⁹の感受性遺伝子座として同定されました。さらに、VEO-IBD患者においてはIL-10中和抗体を関与する非遺伝的経路が記載されており、この経路が粘膜免疫恒常性維持に重要であることがさらに強調されています¹⁰。

IL-10がIBDに関与していることを示すヒト研究を基に、IL-10ノックアウト(IL-10-KO)マウスをモデルとして開発し、IL-10の役割を研究しています。IL-10-KOマウスは、通常¹¹歳の8〜12週頃に刺激に対してCD4+ Th1反応が過剰に現れる自発性腸炎を発症することが知られています。しかし、IL-10-KOマウスにおける自発性腸炎の発症は、遺伝子株、微生物叢の構成、飼^{育条件により}12,13,14の加速因子がない場合に予測不能^{である可能性があります。}信頼性の高いプロトコルを用いて大腸炎を誘発することは、IL-10-KOモデルが実用的に機能するために極めて重要です。これまでの研究では、ピロキシカムなどの非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)を用いてIL-10-KOマウスに腸炎を誘発してきました(^17,18)。しかし、これらの研究は主に免疫学的変化に焦点を当てており、腸炎が代謝に与える影響や大腸炎重症度における性別の役割にはあまり重点が置かれ^{ていません。}著者らは、IL-10-KOマウスにおける腸炎誘発におけるピロキシカム強化飼料の使用を記述し、オスとメスのマウスを用いて代謝調節障害および粘膜炎症反応を特徴づけています。このプロトコルは、全身の代謝変化や大腸炎の臨床症状、粘膜炎症を反映する組織学的およびトランスクリプトムの変化を反映するために体重と食事摂取量を測定します。この効率的かつ再現性の高いモデルは、IBDと宿主代謝の関連を調査するための貴重なツールを提供します。

プロトコル

すべての動物実験は、テキサス大学サウスウェスタン医療センターの施設動物ケア・利用委員会(IACUC)が承認したプロトコルに従い、「実験動物のケアと使用に関するガイド」[承認番号:2017-102011]に従って実施されました。安楽死は機関のガイドラインに従って行われました。施術には麻酔は必要ありませんでした。材料に関する具体的な詳細は 材料表に記載されています。

1. IL-10-KOマウスにおけるピロキシカム加速大腸炎モデルの確立

1. IL-10-KOマウスは特定の病原体フリー(SPF)施設で12時間の光サイクルで飼育し、 食事 と水の自由なアクセスが可能です。
2. 7〜8週間齢の年齢・性別が一致したマウスを個別にマイクロアイソレーターケージで飼育します。実験開始の少なくとも1週間前から、マウスが単一飼育と日常的な扱いに慣れるまで待ってください。
   注意:オスは体重>20g、メスは>17gであることを確認し、マウスには戦闘傷がないことを確認してください。
3. マウスを実験群と対照群に割り当てます。実験グループでは、標準的なチャウをピロキシカム強化の食事に置き換えてください。対照群には新鮮な標準食を用意してください。各ケージホッパーに50gのチャウを加えます。
   注意:各グループに性別ごとに少なくとも5匹のマウスを割り当ててください。ピロキシカム強化飼料(200 ppm)は、研究者から提供されたピロキシカムを用いてテクラッドが製造し、カスタム実験動物飼料の製造に使われました。バッチごとの変動を最小限に抑えるために、実験内のすべての動物が同じ生産バッチから食事を与えることが推奨されます。可能であれば、同じバッチを実験全体で使用して再現性を高めるべきです。

2. 体重と摂食行動のモニタリング

1. 分析スケールを使って、各マウスの体重を記録します。毎日同じ時間に、1日連続で1匹ずつ体重を量ってください。0日目に基準体重のパーセンテージ(100%に設定)で1日体重を報告してください。
   注:体重減少が20%を超える場合は、過度のストレスと差し迫った死亡のリスクを示します。この閾値に達した場合、マウスは安楽死させるべきです。
2. 分析スケールを使い、ピロキシカム強化飼料と標準飼料の初期重量を各ケージに記録します。
3. その後、各ケージホッパーに残った食料を毎日同じ時間に、7日間連続で測定します。
4. 前日の残りのチャウから1日のチャウの重量を差し引いて計算します。
   注意:定期的に食事量を確認し、10g未満の場合は補充してください。ピロキシカムの食の味覚性は摂取に影響を与えず、標準的な食事に非常に近いものであるべきです。

3. 病害活動の監視

1. 0日目と7日目には、個々のマウスの糞便ペレットを目視で確認し、便に血液が混じっているかどうかを確認します。
2. 血液が見当たらない場合は、検査カードにペレットを塗りつけて糞便潜血検査を行い、付属の現像剤を加えます。スコア結果は 表1に従っています。
3. 0日目と7日目には、排便したばかりの糞ペレットを目視で確認し、便の質感を確認してください。一貫性を判断するために平らな鉗子を使いましょう。スコア結果は 表1に従っています。
4. 0日目と7日目には肛門周囲を検査して直腸脱の程度を判断します。スコア結果は 表1に従っています。
5. 上記のように体重を測ってください。スコア結果は 表1に従っています。
   注:疾患活動指数(DAI)スコアリングは、一貫性を確保し、観察者バイアスを最小限に抑え、評価の信頼性を高めるために、実験全体を通じて同じ研究者がブラインド方式で行うべきです。

4. 大腸組織の採取

1. 他の報告通り、_CO2 窒息および頸椎脱臼によるマウスの安楽死²⁰。
2. マウスを仰向けにし、腹側に70%のエタノールをスプレーします。
3. ピンセットで皮膚を持ち上げ、外科用ハサミで正中線に沿って切ります。腹膜腔を露出させて大腸の位置を特定します。
4. 鈍的解離で大腸と盲腸を露出させます。大腸 を一括 で取り除き、盲腸と肛門カフも含まれます。
5. 大腸を平らな面に置き、結合組織を除去します。
6. 大腸の長さを測定して記録してください。
7. 結腸の長さを測定した後、盲腸と結腸接合部で切開して盲腸を除去します。
8. リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を充填した10mLの注射器を準備し、22ゲージのボールチップ再使用可能なスチールガベージ針を取り付けます。針を大腸に通し、腸の内容物を洗い流します。
9. 沖洗した大腸をPBSを含むペトリ皿に入れ、残留物を洗い流して除去します。クリアになったら、下流のアッセイに使ってください。

5. 組織学分析

1. 大腸をガラスのスライドに平らに置く。鉗子を使って組織を遠位端から巻きつけ、「スイスロール」を作ります。このようにして、遠位/肛門端は内側のロールに残り、より近位的な領域は外側のロールに広がります。
2. 27ゲージの針を使い、巻いた大腸をピンで固定し、埋め込み組織カセットに入れます。
3. 組織固定には、10%緩衝ホルマリン溶液に4°Cで16時間浸す組織カセットを保有します。
   注意:10%ホルマリンは皮膚に触れると有害で、重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こす可能性があります。保護用の手袋と科学用ゴーグルを慎重に着用してください。残留ホルマリンは施設のガイドラインに従って適切に処分されるべきです。
4. ホルマリン固定後、パラフィン埋め込み用の組織を処理し、ガラススライドに取り付けるために切断します。
   注意:サンプルは、パラフィンでの組織カセット処理、スクロール切片、スライドマウント、ヘマトキシリンおよびエオシン染色に必要な機器を備えた組織学検査室に提出してください。
5. 組織の染色は、確立されたプロトコルに従いヘマトキシリンおよびエオシン(HE)でスライド^します。
6. 表2に記載された組織学的スコアリングシステムを用いて、各セクションの組織学的特徴を評価する:腸炎による組織損傷、固有層の炎症細胞浸潤、関与面積の割合。各セクションのスコアを組み合わせて合計スコアを算出します(表2)。
   総得点 = 関与×特徴(組織損傷)+ 関与×特徴(Lamina propira炎症細胞の過過)(1)
7. 組織損傷および細胞浸潤の代表的な組織病理学的画像は、Erbenらによる論文²²に掲載されています。
   注意:組織学的採点は、評価の一貫性と信頼性を確保するために、できれば訓練を受けた病理医による盲検方式で行うべきです。

6. ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織の免疫蛍光染色

1. ティッシュスライドをスライドラックに置き、55°Cのスライドドライヤーに1時間入れてパラフィンを溶かします。
2. スライドを染色ラックに置き、順番にシレン入りの染色瓶に3分間浸します。このステップを3回繰り返します。
3. 染色ラックを100%エタノール入りの染色瓶に3分間浸します。このステップを3回繰り返します。
4. 染色ラックを染色瓶に95%エタノールで3分間浸します。
5. 染色ラックを80%エタノールで染色瓶に3分間浸します。
6. 染色棚を脱イオン水(DI)入りの染色瓶に5分間浸します。
   注意:キレンの蒸気のため、すべての工程は換気されたフード内で行う必要があります。保護用の手袋と科学用ゴーグルを慎重に着用してください。残留キシレンは施設のガイドラインに従って適切に処分されるべきです。
7. スライドをスライドラックに移し、1 ×クエン酸塩抽出液を塗った染色ジャーに浸します。
8. 染色用の瓶を染色皿の支柱に入れます。
9. 染色皿の支柱を圧力鍋に入れます。
10. 圧力鍋で15分間調理します。
11. 圧力鍋からスライドを回収し、室温まで冷ます。
12. 300μLのブロッキングバッファー(3.5%ヤギ血清をPBSで希釈したもの)を加湿チャンバーで1時間スライド培養します。組織がブロッキングバッファーで完全に覆われていることを確認しましょう。
13. スライドを4°Cで4°Cで16時間、加湿チャンバー内で薄めた一次抗体300μLにさらします。組織が一次抗体で完全に覆われていることを確認しましょう。以下の一次抗体が使用されました:抗S100A8/S100A9(1:500)。
    注意:抗体希釈は試薬ごとに異なり、供給者の推奨に従うべきです。
14. すすぎは、PBSに3回連続して5分間浸して染色用のジャーに浸すことです。
15. 希釈した蛍光セカンダリ抗体300μLを室温で加湿チャンバーでブロッキングバッファー中に1時間曝露します。組織が二次抗体で完全に覆われていることを確認しましょう。以下の蛍光二次抗体が使用されました:ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 555(1:150希釈)。
    注意:この時点で以降、蛍光分子の光漂白を防ぐためにスライドは光から保護する必要があります。二次抗体の希釈は試薬特異的であり、供給者の推奨に従うべきです。
16. すすぎは、PBSに3回連続して5分間浸して染色用のジャーに浸すことです。
17. スライドを核染色に曝露し、1:5000 PBSで希釈したHoechst溶液に20分間浸して染色ジャーに浸します。
18. すすぎは、PBSに3回連続して5分間浸して染色用のジャーに浸すことです。
19. スライドのPBSは研磨性のないティッシュで慎重に拭き取ってください。アンチフェードマウントメディウム50μLとカバースリップを加えます。

7. RNA抽出

1. 大腸全体または断片を液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。 または、1.5mLのRNALater保存液に浸して、製造元の指示に従って保存する方法もあります。
2. 凍結した大腸を解凍し、平らな場所に置きます。ハンドヘルドホモジナイザーで組織を破壊し均質化します。
3. メーカーの指示に従い、キットを使ってRNAを単離してください。
4. 分光光度計を使ってRNA濃度を測定します。₂₆₀/A₂₈₀ 比>1.8、_A260/_{A 230} 比が2.0–2.2であることは許容できるRNA純度を示しています。
5. 逆転写を行い、その後SYBRグリーン挿入染料を用いたqPCR検査を行います。
6. 定量プラットフォームや類似のツールを使って結果を分析します。

結果

雄と雌のIL-10-KOマウスは、ピロキシカム強化飼料への短期間の曝露後に腸炎を発症します(図1A–E)。2日目までに、ピロキシカム曝露マウスは同性の通常の食事給餌対照群よりも統計的に有意に大きな体重減少を示し、性別間で同等の体重減少が観察されました(図1B)。ピロキシカム曝露および腸炎の発症を通じて、見かけの1日の食事摂取量は変化せず、標準的な食事の摂取量に似ていることから、このモデルにおける体重減少は主に摂取量の減少によるものではなく、代謝支出を促進する他の要因によって引き起こされていることを示しています(図1C)。

腸内炎症の進行をさらに調査するため、疾患活動性は体重減少、便中の血、便の濃度、直腸脱の程度の総合スコアで評価されました。修正疾患活動指数(DAI)はベースラインおよび7日目に評価されました。7日目のスコアは 図1Dに示されています。さらに、ピロキシカム曝露マウスで観察された腸炎の発症は死亡率の増加傾向と強く関連していましたが、この差は統計的に有意ではありませんでした(p = 0.12; 図1E)。このモデルでは、早期死亡はマウスがヒューテリー・エンドポイント(体重減少>20%)に達することにより二次的であり、特に雄に影響を及ぼします(図1E)。死亡率が実験的終点として求められる場合、ここで使われたよりも多くの実験動物が考慮されることがあります。本研究では、著者らは研究終了によって統計的検出力を得るために必要な最小数の動物を用い、予想される死亡率を考慮しました。

大腸短縮は、マウスモデルにおける大腸炎の重症度に関連する特徴です。収穫時、ピロキシカム飼料を与えられた雄・雌のIL-10-KOマウスは、通常の飼料を与えられたマウスよりも結腸が短かった(図2A–B)。組織学的評価の結果、ピロキシカム投与群の大腸は上皮損傷と免疫細胞浸潤の増加、すなわち大腸炎に関連する変化が認められました(図2C)。これらの結果は組織学的スコアの向上につながりました(図2D)。さらに、ヒトIBDおよび大腸炎のマウスモデルに関与する炎症促進サイトカインの転写レベルも評価^{されました。}先行報告と一致し、ピロキシカム投与されたIL-10-KOマウスの大腸は転写産レベルで炎症促進サイトカインの有意なアップレギュレーションを示しました(図3A–D)。注目すべきは、通常の食事やピロキシカム強化飼料を摂取したIL-10-KOマウスではこの転写変化が観察されなかったことであり、転写署名はIL-10欠損症とピロキシカムの組み合わせによって引き起こされたことを示し、どちらか一方の因子だけによるものではありませんでした。最後に、著者らはピロキシカム処理マウスの大腸で観察された転写署名が、大腸粘膜におけるカルプロテチン染色の増加と関連していることを確認しました(図3E)^24,25。

図1:IL-10-KOマウスにおけるピロキシカム加速型腸炎。(A) 実験プロトコルの概観。(B)体重、(C)食事量、(D)7日目の疾患活動指数(DAI)、(E)ピロキシカム強化食または通常の食事をしている8週間齢の雄および8週間齢雌のIL-10-KOマウスの生存曲線。男性対照:n = 5、男性ピロキシカム:n = 5、女性対照:n = 6、女性ピロキシカム:n = 6 (B)、(C)、および(D)。男性対照群:n = 6、男性ピロキシカム n = 10、女性対照群:n = 6、女性ピロキシカム:n = 7 in (E)。* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 オス(上アスタリスク)とメス(下アスタリスク)マウスのペアワイズ比較による(B)。統計解析は、(B)、(C)、(D)で両側の非ペアt検定、(E)で対数検定を用いて実施されました。平均値と標準誤差(SEM)を表す誤差バーが示されています。棒グラフでは、個々の測定値はジッタープロットで示されます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:大腸短縮と組織学的評価。(A) ピロキシカム食(上)または通常の食事(下)を7日間服用した生後8週間の雄雌雌マウスの代表的な結腸標本。スケールバー=1cm(B)7日目の大腸長(男性対照群:n = 5、男性ピロキシカム:n = 5、女性対照群:n = 6、女性ピロキシカム:n = 6)。(C) HE染色された大腸の代表画像。スケールバー=100μm。(D)7日目の組織学スコア。(B)および(D)における二側の非対t検定。SEMを表す平均値と誤差バーが示されています。棒グラフでは、個々の測定値はジッタープロットで示されます。有意でない(NS)、* p ≤ 0.05、*** p ≤ 0.001、**** p ≤ 0.0001 ペアワイズ比較。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:ピロキシカム加速型腸炎における炎症変化。 採集時点の8週間齢野生型(WT)およびインターロイキン10ノックアウト(IL-10-KO)雄マウスの大腸組織における(A) Tnf、(B) Il6、(C) Il1b、 (D) Ifng の定量的RT-PCR結果。パネルA–Dの場合、WTピロキシカムn=7、KOピロキシカムn=6、KOコントロールn=3。(E) 8週間齢IL-10-KOマウスの収穫時に大腸組織の代表的なカルプロテチン免疫蛍光染色。統計解析は両側無対t検定を用いて実施されました。平均値と標準誤差(SEM)を表す誤差バーが示されています。棒グラフでは、個々の測定値はジッタープロットで示されます。スケールバー(E)=200μm。有意でない(NS)、* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001 ペア比較。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ドメイン	スコア
重量	0 – 変更なし
	1 – 1〜5%の損失
	2 – 6〜10%の減少
	3 – 11〜20%の減少
	4 – ;20%を超える損失
便の濃度	0 – ノーマル;
	1 - 柔らかいが形を成している
	2 – 軟便(水っぽくない)
	4 – 下痢(液体便)
出血	0 – なし
	2 – 血液性陽性便
	3 – 便に血が目立つ
	4 – 直腸あたりの総出血量
直腸脱	0 – 欠席
	1 – 現在
総得点	総得点:各ドメインの(ドメインスコア)の合計

表1:疾患活動スコア(DAI)。 体重減少、便の質、便中の血便、直腸脱によって疾患の進行度を判別するスコアリングシステム。Sifuentes-Dominguezらより引用:²⁶頁。

組織損傷					ラミナ・プロプリア炎症性細胞浸潤
特徴		関与			特徴		関与
0	全くありません	1	表面積の1〜25%		0	まれに	1	表面積の1〜25%
1	稀;	2	表面積の26〜50%		1	好中球が増加した	2	表面積の26〜50%
2	粘膜の侵食と潰瘍	3	表面積の51〜75%		2	炎症性細胞クラスターの粘膜下存在	3	表面積の51〜75%
3	腸壁の奥深くに広範囲に損傷	4	76〜100%の表面		3	壁外細胞浸透	4	76〜100%の表面

表2:組織学的スコアリングシステム。 組織学的変化や損傷を判断するためのスコアリングシステム。Sifuentes-Dominguezらより引用:²⁶頁。

ディスカッション

炎症性腸疾患は複雑な多遺伝子疾患であり、前臨床モデルはIBDの発症に寄与する経路を解明し、新しい診断および治療戦略を開発するための貴重なツールとして機能します。現在、多くのIBD前臨床モデルは、使いやすさからデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)、オキサゾロン、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)などの化学物質曝露に依存しています。自発性大腸炎を発症する遺伝モデルも存在します。その中でもIL-10-KOモデルは特に価値があります。なぜなら、IL-10経路の遺伝的変異がヒトの腸炎を引き起こすことが知られており、IL-10-KOマウスは人間の病気に似た自然性慢性腸炎を発症するからです。しかし、このモデルの大きな制約は表現型の変動を考慮できないことです。腸炎は自然発生しますが、発症は系統背景やビバリ^{ウムの条件}によって変動します。

化学的曝露と遺伝モデルを組み合わせることで、ここで述べるプロトコルは、実験的な大腸炎の信頼性が高く再現可能なマウスモデルを提供します。IL-10-KOマウスではピロキシカム強化飼料曝露後7日以内に発症し、腸炎はピロキシカム強化飼料によって加速されます。このプロトコルにより、大腸炎の発症を同期できます。このモデルは、体重減少、便中の血、下痢、結腸短縮、組織学的損傷、転写変化など、他の一般的に用いられる大腸炎のマウスモデルで観察された特徴を再現しています。さらに、このモデルは広く使われているC57Bl/6J株でも再現可能であり、IBDに関連する追加の遺伝子異常を、この株に追加変異を持つマウスを比較的容易に生成できるため、その調査を容易にします。

ここで説明するモデルは、腸の炎症中の代謝変化を研究する有用なツールを提供します。このモデルでは、ピロキシカムに曝露されたマウスが加速した腸炎を発症した場合、1日の摂取量が著しく減少することなく正常に摂食を続けます。これは、このモデルにおける体重減少が摂食障害によるものではなく、他の要因によるものであることを示しています。これらの結果が炎症によるカロリー消費の増加、下痢による過剰なカロリー損失、あるいは熱発生の障害によるものかを明らかにするにはさらなる研究が必要です。さらに、オスとメスのマウスは疾患重症度のパターンが似ており、これはIL-10-KOおよびDSSモデル28,29,30での先行観察と対照的です。

このモデルの再現性を確保するための重要なトラブルシューティングステップがいくつかあります。まず、マウスはピロキシカム曝露の1週間前に毎日の取り扱いと観察に慣れさせる必要があります。これによりストレスに伴う体重減少が防げます。次に、ケージには最大3匹のマウスを収容し、実験には調和のとれた飼育環境のネズミのみを含めるべきです。闘争行動や闘傷を示すマウスは大腸炎の発症にかかりやすく、収穫前に亡くなること^{もあります。}第三に、実験全体を通じて食事摂取量を監視する場合は、マウスを個別に飼育して、食事量を正確に測定できるようにすべきです。さらに、餌料ホッパーには大きく無傷のフードペレットのみを置くべきで、床材に崩れ落ちて測定に影響するのを防ぐためです。ここで述べる食物摂取量の定量化方法は、公開されている齧歯類の食用ガイドライン³³に準拠しています。最後に、実験中はケージの変更を避けるべきで、特に若いマウスでは突然の環境変化が1〜2日間の食事摂取量を減少させる可能性があります。

このプロトコルにはいくつかの制限があります。第一に、代謝変化の評価は体重と食事摂取に限定され、呼吸交換比(RER)、エネルギー消費、身体活動など他の全身代謝指標は評価されませんでした。さらに、減量のメカニズムは調査されませんでした。したがって、食事量の減少、エネルギー消費の変化、吸収不良、その他腸の炎症に関連する要因の相対的な寄与は依然として不明です。次に、大腸組織のみが採取・分析され、脂肪組織、肝臓、骨格筋など代謝調節に関与する他の臓器は検査されませんでした。第三に、このプロトコルはC57BL/6 IL-10-KOマウスを用いて開発されました。マウスは他の遺伝的背景と比べて大腸炎に対する感受性が異なる可能性があります。これらの制約にもかかわらず、プロトコルは追加の代謝表現型解析や腸外組織の解析を容易に取り入れることができ、減量のメカニズムの調査や腸の炎症と全身代謝変化の関係の調査(³⁴)、または新規の抗炎症ナノ材料の評価(³⁵).さらに、このアプローチは他のIL-10-KOマウス株にも適用可能であるべきですが、さらなる検証研究が必要です。

まとめると、著者らは複数のIL-10-KOマウスで同時に腸炎を誘発し、摂食行動の評価を可能にする効率的かつ再現性の高いプロトコルを報告しています。このモデルにおける腸炎がエネルギー消費や体組成に与える影響を調査するためのさらなる研究が必要であり、IBDと宿主代謝のより広範な関連性を明らかにする。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon