方法論記事

一次哺乳類細胞におけるエディタRNAのエレクトロポレーションによるゲノム編集

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DOI：

10.3791/71449

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2026年7月31日

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1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

この記事について

サマリー

RNAとしてゲノム編集者を送達することは、一次哺乳類の細胞や細胞株のゲノム改変において特に強力な手段です。このプロトコルの目的は、ゲノム編集者をmRNAとして一次哺乳類の細胞および細胞株に届け、その後、Illuminaの標的シーケンスと解析を行って編集結果を定量化することです。

要約

ヌクレアーゼ、塩基エディター、プライムエディターを含むCRISPRエディターは、疾患を引き起こす遺伝的変異を効率的に修正したり、標的遺伝子を破壊したりすることができます。編集結果は、遺伝子変異の影響を研究するため、または動物実験や臨床翻訳を開始する前の第一段階として、培養一次細胞、患者由来細胞、または遺伝子操作細胞株で評価されることが一般的です。mRNAとして編集者を合成ガイドRNAと哺乳類細胞に送達することで、プラスミドベースのアプローチに比べて編集効率が向上し、DNA統合やオフターゲット編集などの持続発現の問題を防げます。本記事では、共転写キャッピングや化学修飾ヌクレオチド、エレクトロポレートエディターmRNAを誘導し、一次ヒト線維芽細胞、誘導多能性幹細胞(iPSC)、リンパ芽細胞株(LCL)への誘導RNA、そしてIlluminaプラットフォームでの標的アンプリコンシーケンシングとCRISPResso2による解析による編集結果の定量化を含む、in vitro転写(IVT)によるワークフローを紹介します。このワークフローにより、ガイドRNA、エレクトロポレーションパラメータ、エディタバリアントの定量的ベンチマーキングが可能となり、単一細胞クローニング、表現型アッセイ、前臨床動物試験、治療開発などの後続応用もサポートします。

概要

一次哺乳類細胞における効率的なゲノム編集は、遺伝モデルの作成や候補治療戦略の前臨床評価を支援します。塩基編集やプライム編集を含むCRISPRベースの技術の最近の進歩により、二本鎖DNA断線を導入せずに正確なヌクレオチド修飾が可能となり、編集結果の純度が向上します1,2。これらの技術は、鎌状赤血球症3や嚢胞性線維症4を引き起こす変異を修正する戦略を含む、疾患モデリングや治療ゲノム編集研究に成功裏に応用されています。

哺乳類細胞にゲノム編集成分を届ける特に効果的な戦略は、編集酵素をコードするin vitro転写(IVT)mRNAと合成ガイドRNA(gRNA)を組み合わせて電気穿孔することです。mRNAの送達によりゲノム編集者の一時的発現が可能となり、ヌクレアーゼ活性の長期化を最小限に抑え、オフターゲット編集イベントの可能性を低減します。IVT技術の進歩により、mRNA合成の効率、収率、品質が向上しました 4,5,6。プラスミドDNAテンプレートとPCR由来DNAテンプレートは、それぞれin vitro転写に一般的に用いられ、それぞれ独自の利点と限界を持っています。このプロトコルでは、プラスミド内で長いポリ(A)路の伝播に伴う問題を避けるため、PCR生成型テンプレートが好まれます。これらのトラクトは組換えや長さの変動が起こりやすいためです。しかし、このプロトコルで説明されているPCRテンプレートを使用するには、120ヌクレオチドのポリ(A)尾を持つ高価な逆プライマーが必要であり、プライマーにコードされていない配列に対しては、PCRは細菌によるプラスミド伝播よりも誤りやすい可能性があります。代わりに、Elegenや4basebioのような商業プロバイダーが高精度DNAテンプレートを提供し、信頼性が高くなるものの高コストな転写テンプレート生成の選択肢を提供します。

慎重なガイドRNA設計は、成功するゲノム編集実験の重要な要素の一つです。予測されたオンターゲット効率と最小限のオフターゲット活性に基づく最適なgRNA配列を特定するために、いくつかの計算ツールが開発されています。広く使われているプラットフォームにはCHOPCHOPやCRISPORがあり、これらはCas酵素のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)要件を満たすガイド配列の同定を可能にし、高い予測活性と特異性を持つ候補ガイドの優先順位付けのためのスコア指標を提供します。ガイドRNA設計の基本原理とベストプラクティスは、CRISPR文献9、10、11、12、13で広く記述されています。

エレクトロポレーションは、脂質系トランスフェクションに耐性のある細胞タイプで高い送達効率を達成できるため、哺乳類細胞へのゲノム編集試薬の送達に一般的に用いられます。電気穿孔は一時的に細胞膜を透過し、mRNAやgRNAなどの外因性核酸が細胞質内に侵入できるようにします。最適化された電気穿孔プロトコルは、一次細胞、線維芽細胞、リンパ芽細胞株、誘導多能性幹細胞など複数の哺乳類細胞タイプに対して開発されています14。Lonza 4DやAmaxaシステムなどの商用エレクトロポーションプラットフォームは、細胞の生存率を維持しつつ、送達効率を向上させるための細胞型特有のプログラムや試薬を提供しています。Amaxa 96ウェル・シャトルプラットフォームのような高スループット電気穿孔システムは、複数の実験条件下でのスケーラブルなゲノム編集実験をさらに可能にします。ネオン電気孔径システムも一般的に使用されていますが、このプロトコルの焦点ではありません。

ゲノム編集コンポーネントの提供後、編集結果は通常、編集部位周辺のゲノム領域のターゲット次世代シーケンシング(NGS)を用いて評価されます。シーケンシングライブラリは、ターゲット遺伝子座のPCR増幅、その後インデックス作成およびハイスループットシーケンシングによって生成されます。得られたシーケンスリードは、ゲノム編集実験用に設計された特殊なバイオインフォマティクスパイプラインで解析されます。このプロトコルでは、編集結果を定量化します。CRISPResso2は広く使われている計算プラットフォームで、データシーケンスからゲノム編集結果の詳細な解析を可能にします。CRISPResso2はシーケンスリードを参照配列にアライメントし、編集結果を定量化します。これには、全体の編集効率、挿入・欠失(indel)周波数、正確なヌクレオチド置換、ターゲット領域全体の編集分布が含まれます。また、実験条件の比較や編集パラメータの最適化を容易にするグラフィカルな可視化や統計的要約も提供しています。

高品質なIVT mRNA産生の統合、エレクトロポレーションによる最適化された送達、高解像度シーケンシング解析が組み合わさることで、培養細胞におけるゲノム編集戦略の評価に堅牢なワークフローが提供されています(図1)。このアプローチにより、編集効率、特異性、実験パラメータの反復最適化が可能となり、ゲノム編集戦略を生体内研究や治療応用へと進めることができます。

プロトコル

倫理声明:
ヒト由来細胞株を用いるすべての手技は、機関のガイドラインおよび承認されたプロトコルに従って実施されました。

1. PCRを用いた線形DNAテンプレートの生成

注意:すべてのRNAステップはRNaseフリーの消耗品と作業面を使用して行ってください。指定されたmRNAエディターとその異なるバリアントを考慮して、意図するゲノム修飾に適したエディターを選ぶ際(表1)。

  1. ミニプレップまたはミディップレップキットを使って細菌から抽出したプラスミドDNA上のPCR反応を組み立てます。50 μL PCR反応ごとに20 ngのプラスミドDNAを酵素NEBNext Ultra II Q5 Master Mixと組み合わせ、 表2に記載されたようにPCRを組み立てます。
    1. プラスミドの不活性T7プロモーターを補正する前方プライマーを使用し、円形転写を防ぎます。
    2. 効率的な転写とmRNA安定性をサポートするために、120-ntのポリ(A)₁₂₀テールを導入する逆プライマーを使用します。
    3. ウラシルの代わりにN1-メチルプセイドリジンを使用し、CleanCap AGを用いてmRNA翻訳を改善し、自然免疫活性化を減少させます(図1)。
      注:他のヌクレオチド類似体やキャッピング試薬も存在しますが、これらはゲノム編集mRNAにおいて一貫して高い活性を示しています。ナノ粒子ベースの送達は適切な代替手段ですが、このプロトコルでは議論されていません。
  2. エディタのコーディングシーケンスをPCRで30サイクル増幅し、プライマーを用いてコーディング領域の上流に機能的なT7プロモーターを導入し、下流にポリ(A)配列を導入します(表2 および 表3)。
    注:IVTテンプレートのヌクレオチド配列は 表4に下線で示されています。
  3. PCR産物の検証と精製
    1. PCR産物5μLを1%アガロースゲルのTEバッファーに180Vで30分間投与します。PCR産物精製に進む前に、約4000〜6500 bp(転写される編集者によります)に単一のバンドが存在することを確認してください。
    2. PCRクリーニングキット(材料表)を使ってPCR産物を精製してください。
      注意:複数のバンドやPCR製品の品質が低い場合は、熱サイクル条件を最適化してください(表5 – トラブルシューティング表)。
    3. 精製されたDNAを蛍光測定DSDアッセイで定量します。Qubit dsDNA解析では、高感度Qubit作業液796 μLとキット付属の染料4 μLを組み合わせてバッファー・ダイエムマスターミックスを準備します。
    4. 別々のチューブで、バッファーダイマスターミックス198μLと低濃度標準S1、高濃度標準S2222μL、そしてサンプルを混合します。Qubit蛍光計機器の指示に従って各標準物質と試料を挿入し、在庫濃度を測定します。
      注意:サンプルが分析範囲を超える場合は、希釈の準備が必要になる場合があります。

2. mRNAの転写

  1. T7 RNAポリメラーゼ、NTP(共転写キャッピング用のキャップ類似体)、およびウリジン代替としてN1-メチルプセイドリジン三リン酸を用いて氷上でIVT反応を準備し、自然免疫活性化1˒5˒6を低減します。
  2. IVT反応混合物は 表4に従って準備します。 表4に示されている注釈付きテンプレートのシーケンスを使用してください。各転写反応を最終体積40μLに組み立てます。
  3. 複数の実験に十分なmRNAを生成するために、5〜10本の反応チューブを準備します。40μLの反応ごとに約100μgのmRNAが生成されます。プライム編集エレクトロポレーションに1 μgのmRNA、塩基編集エレクトロポレーションに3 μgのmRNAを使用すると、約33〜100回の電気ポレーションに十分です。
  4. RNAを転写します
    1. IVT反応をピペットで十分に混ぜます。反応を37°Cで2時間培養します。
  5. RNAを精製する
    1. 1.5 mLのチューブに移し、IVT反応に7.5 M塩化リチウム(LiCl)溶液を全反応体積の半分の体積で加え、最終的なLiCl濃度2.5 Mにします。40μLのIVT反応の場合は、7.5 m LiClを20 μL加えます。優しくピペットで混ぜてよく混ぜます。
    2. 反応を-20°Cで30分間培養します。サンプルを16,000 × g 、4°Cで15分間遠心分離します。
    3. ピペットで上澄液を除去し、捨てます。ペレットを1mLの70%エタノールで4°Cで洗浄します。 ペレットを乱す必要はありません。遠心分離機は16,000 × g 、4°Cで5分間行われます。
    4. エタノールを完全に除去し、RNaseフリーのバイオセーフティキャビネットで1〜2分間自然乾燥させます。ペレットを乾燥させすぎると再懸浮が難しくなることがあります。
  6. RNAを再懸濁し、定量する
    1. RNAをヌクレアーゼフリーの水に再懸濁させます。最初に各反応をヌクレアーゼフリー水50μLに再懸濁し、RNA濃度を測定した後にさらに希釈します。ナノドロップなどの蛍光RNAアッセイを用いてRNAを定量します。
      一時停止点:RNA定量化とアリクオート後、mRNAアリクオートを-80°Cで電気穿孔まで保存します。繰り返される凍結融解サイクルは避けてください。使用前に各アルコットは一度だけ解凍してください。
    2. 精製されたmRNA収率が約100〜400μg/40 μL IVT反応であることを確認しましょう。分解前にmRNAをヌクレアーゼフリー水で2μg·μL-1 に希釈します。アリコウトは−80°Cで保存します。
      注意:繰り返しの凍結融解サイクルは避けてください。使い捨てのアリコートを用意し、未使用の解凍材は廃棄します。12.5μLのアリコートをPCRストリップで準備し、1アリコートあたり8〜20回の電気穿孔を行います。
  7. RNAの完全性を評価する
    1. アガロースゲル電気泳動または自動電気泳動によってRNAのサイズと完全性を評価する(図2)
    2. 10,000倍希釈されたSYBRゴールドを含む0.8%アガロースゲルを準備します。NEB ssRNAマーカーのような単一鎖RNAラダーを使いましょう。
    3. 2本のRNAゲルローディング染料を使ってmRNAを変性させ、試料を65°Cに加熱して10分間加熱した後、試料をゲルに積み込みます。
    4. mRNAが約4000〜6500 ntで優勢なバンドとして現れることを確認し、転写される編集者によります。そこは最小限のに塗りつぶされ、低分子量産物であることも確認してください。大幅な分解、にじみ、複数の予期せぬバンドが見られるRNAサンプルは廃棄します。

3. ガイドRNAの設計と調製

注意:ターゲットゲノム遺伝子座内のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を特定し、選択した編集者および意図されたゲノム修飾と互換性のあるガイドRNAを選択してください。CHOPCHOP、CRISPOR、CRISPRware、IDT Cas9 Checker、Benchling、VectorBuilderなどのガイドRNA設計プラットフォームは、6,7,8,9,10,11,12,13の予測活性と特異性を持つガイドRNAを優先順位付けするために使用できます。

  1. ガイドRNA設計ツールを用いて、選択したヌクレアーゼ変異(NGN互換変異を含む)と適合する標的ゲノム遺伝子座内のPAM部位を特定します。
  2. オンターゲット活性が予測され、オフターゲット活性が低いガイドRNAを選択します。ガイドRNAの編集ウィンドウを確認してください。
  3. ベース編集やプライム編集アプリケーションでは、選択した編集者の最適なアクティビティウィンドウ内に編集を位置づけるガイドRNAを選択してください。
  4. 最初の3塩基および最後の3塩基に2'-O-メチル塩基類似体を含むsgRNAまたはペグRNAの順序、ガイドの最初の3塩基と最後の2塩基間の3'ホホロチオエイト結合を含みます。
  5. ガイドRNAをヌクレアーゼフリー水またはTEバッファー(100μM)に再懸濁させます。5μLのアリコートを準備し、−80°Cで保存します。 使用時には、電気穿孔の前に電気穿孔バッファーで解凍・希釈します。

4. 細胞培養調製

注意:電気穿孔前に顕微鏡観察と生存可能性アッセイで細胞の完全性を評価してください。

  1. DMEMで一次線維芽細胞またはHEK293T細胞を10% FBS(4.5 g·)を補足して培養します。L-1 グルコース、グルタMAX、そして110 mg·L-1 ピルビン酸ナトリウム。細胞を無菌のT75フラスコ(TC表面)に1フラスコあたり20%のコンフル率でプレートします。パッセス1から20の間の細胞を維持してください。80%のコンフルエンシーでセルを分割し、70〜80%のコンフルエンシーで電気穿孔を行う。
  2. mTeSR Plus培地で多能性幹細胞を培養。細胞をゲルトレックスでコーティングした滅菌T75フラスコに20%のコンフル率でプレートします。培地を毎日交換し、1番から20番までの細胞を維持。各通行の24時間分、メディアにCEPTカクテルを加えます。80%のコンフルエンシーでセルを分割し、70〜80%のコンフルエンシーで電気穿孔を行う。
  3. セルを5%のCO₂で37°Cの温度を維持し、通常は70%〜80%の合流率で電気穿孔に適した密度に達するまで保ちます。
  4. 細胞が適切な数と合流に達して電気穿孔に適したら培地を除去します。
  5. 細胞にTrypLE発現酵素(T75フラスコは1mL)を加え、37°Cで5分間培養します。細胞をフラスコに優しくパイプで当てて、単一細胞の懸濁液を得る。細胞培養培地3 mLを加えて解離を防ぎ、カウント前に大きな細胞塊が存在しないことを確認します。
  6. 細胞を1,000 × g で5分間ペレットし、15 mLのダルベッコリン酸緩衝生食塩水(DPBS)で1回洗浄し、再度遠心分離します。
  7. Nucleocounter NC-3000 with Solution 13 などの自動生存アッセイを用いて細胞濃度と生存率を評価します。Nucleocounterで測定する前に、11.4μLの細胞と0.6μLの溶液13を組み合わせます。細胞の生存率が少なくとも85%に達した場合にのみ電気穿孔を行い、この閾値以下のサンプルは廃棄または再準備してください。
  8. 細胞を約0.5 ×10 6–2 × 106 mL-1の密度でDPBS中に再懸浮させます。細胞数を数え、ヘモサイトメーターや細胞カウンターを使って生存率を評価します。
  9. 細胞の生存率が85%≥場合にのみ進行してください。
  10. セルを電気孔槽バッファーに再懸浮させてください。反応ごとに5 μLの冷たい電気穿孔バッファーに10個、5個のセルを2個×再懸濁します。
  11. 使用直前に製造元の指示に従い、補助液で電気穿孔バッファーを準備し、バッファーは氷の上で保管してください。
  12. 細胞を冷たく保ち、迅速に進めてください。セルを氷の上に置いたまま、すぐに電気穿孔の準備に進みましょう。

5. 電気穿孔

注意:マルチチャネルピペッティングを容易にするために、編集貨物をPCRストリップチューブで準備してください。電気穿孔後、細胞をCEPTカクテルを補足した培地に再懸浮させて細胞生存率を高めます12。

  1. RNAカーゴの準備をしろ。
    1. エディターmRNAとガイドRNAを電気孔孔バッファーで結合して、氷上でRNAカーゴを準備します。
    2. 塩基エディターおよびヌクレアーゼについては、1サンプルあたり1.5 μL(3 μg)のmRNA、0.5 μL(50 pmol)のガイドRNA、15 μLの電気穿孔バッファーを含む最終電気穿孔溶液を準備します。
    3. プライムエディターの場合、1サンプルあたり0.5 μL(1 μg)のmRNA、1.5 μL(150 pmol)のガイドRNA、15 μLの電気穿孔バッファーを含む最終電気穿孔溶液を準備します。
    4. RNAカーゴ溶液は1.2 ×マスターミックスとして準備し、輸送およびサンプル取り扱い中の体積損失を補います。必要に応じて、各ターゲットサイトやエディタバリアントごとに試薬の体積と比率を最適化します。
  2. セル、貨物、そしてエレクトロポレートを供給してください。
    1. 各エレクトロポレーション井戸に5μLのセル懸濁液を加えます。
    2. 5μLの細胞に17μLのRNA貨物を電気穿孔バッファーに加えます。ピペットで2回混ぜてサスペンションを混ぜます。
      注意:細胞とRNAカーゴを組み合わせた後は、細胞から分泌されるRNaseがエディターmRNAを急速に分解する可能性があるため、迅速に進めてください。細胞とRNA貨物を混合してから2分以内に電気穿孔を完了してください。
    3. 選択したセルタイプに最適化された電気孔孔プログラムを実行してください(表6; 図2; 図3)。
      1. 原発性ヒト皮膚線維芽細胞やHEK293T細胞の場合は、バッファーSF付きのLonza 4D電気穿孔システムを使用してください。20μLの電気穿孔キューベットに1回の反応で200,000個の細胞を追加します。プログラムCM-130を実行しろ。直ちに予熱DMEM80μL+10%FBS、4.5g·L-1 グルコース、4mML-グルタミン、110mg·L-1 ピルビン酸ナトリウム。細胞を10分間回収し、その後96ウェルまたは24ウェルプレートに希釈します。
      2. 多能性幹細胞には、緩衝剤P3を用いたロンザ4D電気穿孔システムを使用してください。20μLの電気穿孔キューベットに1回の反応で200,000個の細胞を追加します。プログラムDN-100を実行しろ。すぐに80μLの予備加熱済みmTeSR Plus培地を加えます。細胞を10分間回収した後、24ウェルプレートに希釈します。
    4. プレート後は毎日細胞を検査し、細胞の健康状態と回復を観察してください。

6. ゲノムDNA抽出

注意:PCR増幅前にゲノムDNAが十分な品質で阻害剤が含まれていないことを確認してください。DNAの質はシーケンスライブラリの準備やゲノム編集結果の正確な定量に影響を与える可能性があります(9,10,11)。

  1. 細胞を洗浄して採取してください。
    1. 電気穿孔術の2〜3日後に細胞を採取してください。細胞を一度DPBSで洗浄し、すぐにゲノムDNA抽出に進みます。
    2. 不完全溶解バッファーは、10mLの1MトリスHCl(pH8.0)、10%(wt/vol)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液5mL、ヌクレアーゼフリー水を混合して最終体積1Lにします。未完全溶解バッファーは室温で最大6ヶ月保存します。
    3. 未完全溶解バッファーのアリコートに1:1,000(vol/vol)希釈したプロテナーゼKを加え、新たに完全な溶解バッファーを準備します。細胞に完全な溶解バッファーを加えて溶解を開始します。約80,000個の細胞を含む96ウェルプレートに各ウェルに40μLの完全溶解バッファーを加えます。ピップを上下にしないようにしてください。これはサンプル損失の原因になる可能性があります。
  2. サンプルを消化してください。
    1. サンプルを37°Cで60分間インキュベートし、細胞溶解とプロテナーゼKの消化を完了させます。
  3. プロテイナーゼKを不活性化します。
    1. 溶解液をPCRチューブまたは96ウェルPCRプレートに移します。サンプルを80°Cで30分間インキュベートし、プロテイナーゼKを不活化させます。
  4. リサートを保管してください。

一時停止点:分解液をPCR増幅まで−20°Cで保存します。

7. 編集解析のためのターゲットアンプリコンシーケンス

注意:シーケンス前にPCR産物を一定量でまとめてください。サンプルあたり約10,000件のシーケンシングリードで、一般に大量ゲノム編集アウトカムの定量化には十分です。

  1. 遺伝子座特異的プライマーを設計し、編集部位の上流25bp以上、下流25bpにまたがる約300 bpの増幅生成を図ります(表7)。
  2. 表8、表9に示された条件に従ってPCR1を行い、標的ゲノム遺伝子座を増幅します。
  3. PCR1製品をテンプレートとしてPCRで一意のサンプルインデックスを追加できます。例えば、 表7 の「PCRインデックスの例」タブに示されたプライマーを用いて。 表8 および表9のタブ2に示されたPCR条件を用 いてください。
  4. PCR1およびPCR2製品を1.5%アガロースゲルにかけて、予想されるサイズで単一バンドの存在を確認します。
  5. PCR2産物を等量でプールします。メーカーの指示に従い、AMPure XPのビーズ対サンプル比0.65:1でプールされたPCR2ライブラリを清掃してください。精製ライブラリーをヌクレアーゼフリー水30μLで洗脱し、シーケンス前にゲル電気泳動によるアダプターダイマーの除去を確認します。
  6. フルオロメトリックdsDNAアッセイを用いて最終的なプールライブラリを定量します。毛細血管電気泳動による断片サイズ分布の評価。
  7. Illumina MiSeq機器のシングルエンド300サイクルリードを使ってライブラリをシーケンスします。最終的なプールライブラリを4 nMに希釈します。プールした4 nMライブラリー5 μLと0.1 M NaOHの5 μLを混合し、ピペットを混ぜます。室温で5分間培養して変性させ、その後MiSeqキット付属の冷却HTバッファー990μLを加えて溶液を中和し、20 pMに希釈します。PhiXのコントロールが15%で急増しました。ライブラリをIllumina MiSeqカートリッジに読み込み、メーカー標準の実行設定で単一エンドの300サイクルシーケンスを実行します。サンプルあたり約30,000回のリードを生成することを目標にしていますが、1サンプルあたり10,000回のリードは編集分析に十分です。MiSeqシーケンスは、GenewizやQuintaraのような一部の企業ではサンプルごとで行うことができます。

8. ゲノム編集成果の分析

注:CRISPResso2解析は、全体的な編集効率、ヌクレオチド変換頻度、挿入/欠失(indel)頻度の定量化を可能にし、実験条件15における編集成果の特徴付けにも利用できます。

  1. シーケンスデータをデマルチプレックスし、FASTQファイルをゲノム遺伝子座と実験条件に従って整理します。
  2. Githubリポジトリ(https://github.com/pinellolab/crispresso2)にある手順に従ってCRISPResso2をインストールしてください。
  3. 入力されたFASTQファイルと解析パラメータを指定するbatch.txtファイルを使ってCRISPResso2バッチ解析を実行します(例 は表7に示されています)。最低読書品質スコアを30に設定してください。「w」ウィンドウの幅を20に設定してください。シトシン塩基エディタを使用する場合、一部のインデルはニックサイトに加えて塩基編集ヌクレオチドを中心に作成できます。その場合は、ニックサイトのデフォルトの中心ではなく「wc」ウィンドウの中心を-10に調整し、インデルを最もよく捉えましょう。
  4. ヌクレオチド変換周波数、挿入/削除(インデル)周波数、および(該当する場合は)HDRやプライム編集周波数などの定量的出力を、適切な要約出力ファイルから抽出します。これらは通常「CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt」や「Nucleotide_percentage_summary.txt」という名前のファイルに含まれており、Microsoft Excelやその他のスプレッドシート編集ソフトで開くことができます。
  5. 図 3-4のように、下流のプロットおよびデータ解釈のために定量的編集値をエクスポートします。「alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf」ファイル( 図5参照)を使ってアレリック編集の結果を評価してください。

結果

ABE8eベースエディタとHEK3対照サイトを備えた効率的なエディタを用いると、実験に使用される細胞に適した配達システムであれば、90%以上の編集効率が得られることが多いです。編集者mRNA、ガイドRNA、ターゲット部位、または編集に適した配達条件に問題がある場合、編集効率が低下する可能性があります。より多様なPAM配列にアクセスしつつも結合が緩いCas9バリアントや、理想的な編集ウィンドウ外のヌクレオチドにエディタをターゲットにするバリアントを使うと、編集効率が低下する可能性があります。IVTで生成された成功した編集者mRNAは通常、最小限のスミアや低分子量分解産物を持つ単一の優勢バンドとして現れ、下流の電気穿孔に適した高い転写本の完全性を示しています(図2)。

編集用mRNAおよび合成ガイドRNAの電気穿孔後、ほとんどの細胞は24〜48時間以内に回復し、適切な電気穿孔プログラムにより通常の形態を維持します(図3–4)。電気孔の条件は特定の細胞タイプに合わせて調整すべきであり、バッファーによっては著しく異なる結果をもたらすことがあります。オンラインのLonzaナレッジセンターでは、一般的な細胞タイプ向けのバッファーコードやエレクトロポレーションコードの推奨が提供されており、Lonzaは細胞株と一次細胞用の別々の最適化キットを提供しています。バッファーの経験比較は効率的な配送に最適な条件を特定するのに役立ちます。不適切なプログラムは送達が全く行われなかったり、細胞に対して非常に有害な(50%以上を失うか、細胞周期の継続を妨げる)こともあります。代表的な最適化実験では、エレクトロポレーション条件によって編集結果に大きな差が見られ、あるプログラムは高い編集効率が得られるものもあれば、編集が最小限で済むプログラムもあり、各細胞タイプにおける経験的最適化の重要性が浮き彫りになりました(図3–4)。

iPSCs、線維芽細胞、LCLsにおいて、標的アンプリコンシーケンスとCRISPResso2解析を用いて編集効率と副産物を定量化しています(図4)。HEK3試験遺伝子座のアデニン塩基編集は以下の図4で示されており、解析サンプルで低インデル周波数で意図されたヌクレオチド変換が得られました。CRISPResso2解析により、標的遺伝子座における編集済みおよび未編集の対立遺伝子の可視化が可能となり、意図されたヌクレオチド変換、インデル頻度、その他の編集副産物の定量化が可能となり、編集成果の包括的な評価が可能となります(図5)。編集効率は、ターゲット部位におけるこの正確な単一塩基置換の頻度を測定することで定量化されます。HEK3遺伝子座は、その優れた編集プロファイルと実験システム間での再現性によりモデルロックスとして用いられており、異なる条件下での塩基編集性能の堅牢な評価が可能です。新しい編集手法を最適化する際には、このガイドをヒト細胞でのポジティブコントロールとしてテストすることを推奨します。塩基編集は通常、低インデル周波数で意図されたヌクレオチド変換のために濃縮されますが、プライム編集は精密編集と低周波副産物の混合をもたらします(3,12)。編集効率は条件によって異なり、細胞の種類や電気孔プログラム間で明確な違いが観察されました(図3-4)。これらの変異は、細胞の取り込み、生存率、DNA修復活性の違い、そして電気穿孔パラメータが送達効率に与える影響を反映していると考えられます。これらの発見は、一貫性のある最大限の編集結果を達成するために、細胞型特異的な電気穿孔設定の最適化の重要性を強調しています。

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図1。in vitro転写によるエディターmRNAの製剤。
エディターmRNA生成の概観。(ステップ1)エディターコーディング配列およびT7プロモーターを含むプラスミドテンプレートの調製。(ステップ2)PCR増幅による直線型DNAテンプレートの生成。(ステップ3)T7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写によるキャップ付きmRNA合成。(ステップ4)mRNAの精製によるテンプレートDNA、酵素、遊離ヌクレオチドの除去。得られたキャップ付きmRNAは、電気穿孔や脂質ナノ粒子による哺乳類細胞への下流輸送に適しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2。mRNAゲル電気泳動の例画像 
3つのゲノムエディタmRNAの電気泳動画像は、SYBR金染色を用いた1%アガロースゲル上で測定されました。NEBのssRNAラダーは左側に示されており、サイズマーカーには長さが示されています。大きなスミアや小さなバンドがないことから、これらのmRNAは適切な品質であることが示唆されます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3。誘導多能性幹細胞(iPSC)におけるゲノム編集のための電気穿孔条件の最適化。 
iPSCにおける異なる電気穿孔条件下で得られる編集効率が示されています。セルは複数のバッファーとプログラムの組み合わせ(CB-150バッファP4、CD-118バッファP3、DN-100バッファP3、DC-100バッファP3など)を用いて電放孔化され、すべてロンザ4Dニュークレオフェクション装置上で行われました。編集はネオン電気穿孔装置を用いてパラメータ(1600 V、20 ms、1パルス)で評価されました。編集効率は、編集された遺伝子座の標的シーケンシング解析によって定量化されました。サンプルあたりN=1。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4。線維芽細胞におけるゲノム編集のための電気穿孔条件の最適化。
異なる核分離プログラムを用いた電気穿孔後の編集効率。線維芽細胞は複数のロンザ核球法プログラム(CA-137、CM-138、DS-150、EH-100、EN-150、EO-114、FF-113)を用いて電気分孔化され、編集結果は標的配列決定によって定量化されました。結果は2回の複製(P2、P3)で示されています。編集者提供なしのネガティブコントロールも含まれています。電気穿孔コードの比較により、電気穿孔設定間で編集効率の違いが明らかになり、線維芽細胞ゲノム編集に最適なパラメータの特定が可能となりました。サンプルあたりN=1。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図5。標的遺伝子座におけるゲノム編集アウトカムの特徴付け。 
CRISPResso2からの対立遺伝子頻度表は、編集後のハイスループットシーケンシング解析で決定されたsgRNA標的領域の編集済みおよび未編集型対立遺伝子の相対的存在比を示します。赤い注釈は、使用された細胞株に存在する塩基編集ウィンドウおよび既存のヘテロ接合多型を示します。ガイドRNAスペーサー配列はグレーで下線で示されています。点線で示される「予測切断位置」は、分析バッチファイル( 表8の例)でウィンドウ中心「wc」が変更されたため、SpCas9の典型的な「PAMマイナス3」位置に対してシフトしています。これは実際の予測切断位置を移動させるものではありませんが、このようにして点線周辺のインデルが20のヌクレオチドのウィンドウ内に位置するインデルが評価されることを示し、真のニック部位を中心としたインデルと脱アミネルヌクレオチドを中心としたインデルの両方を捉えます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1。本研究で使用された編集者とシーケンス 
第1列:AddGeneで利用可能な体外転写用のゲノム編集者。本プロトコルで記述されているように、in vitro転写に適したプラスミドの名前およびAddgene IDが公開されています。列2:本研究で使用されたガイドRNAスペーサーの配列。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2。mRNAプラスミド型の増幅のためのPCR試薬。
プラスミドテンプレートのPCR増幅で直線状DNAを生成するために使用される試薬および反応成分のリスト、ならびに順転写プライマーおよび逆転写プライマーの配列。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表3。mRNAテンプレート増幅のためのPCRサイクル条件。 
この表は、下流応用前にプラスミドDNAからのmRNAテンプレートのPCR増幅に用いられる熱サイクル条件を示しています。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表4。in vitro転 写(IVT)反応に使用される試薬。 
この表は、線形DNAテンプレートからエディターmRNAを合成するためのin vitro転写に使用される試薬および反応成分を一覧にしています。テンプレートシーケンス(ABE8e)の例は色分けされた要素で示されています。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表5。ゲノム編集ワークフローの重要なステップのトラブルシューティングガイド。 
この表は、in vitro転写(IVT)およびMiSeqシーケンス解析による編集者mRNAの調製中に起こりうる一般的な技術的課題をまとめたものです。ワークフローの各段階で、潜在的な問題点、可能な原因、推奨される解決策が提供され、編集効率の最適化と編集結果の正確な検出を支援します。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表6。異なる哺乳類細胞タイプに最適な電気穿孔プログラム。 
この表は、編集者mRNAを効率的に送達し、異なる哺乳類細胞タイプにRNAを誘導するために用いられるエレクトロポレーションプログラムのコードとバッファ条件を一覧にしています。挙げられた電気穿孔パラメータは、ゲノム編集効率を最大化しつつ細胞生存率を維持する条件を特定するために検証されました。同じプログラムがすべての細胞株や一次細胞源に適用できない場合があるため、編集が最初に失敗した場合はこのリストからの代替試験を推奨します。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表7。ゲノム編集アウトカムの定量化のためのCRISPResso2解析パラメータ。 
最初のタブには、標的遺伝子座の増幅に用いられたHTS1プライマー設計の例が記載されています。2つ目のタブは、ライブラリ作成時に使用されるインデックスプライマーの例を示しています。3つ目のタブは、シーケンス中に各サンプルに固有のインデックスを割り当てるためのインデックス配置の例を示しています。4番目のタブにはCRISPResso2解析の例の入力バッチファイルが含まれており、5番目のタブにはCRISPResso2分析入力バッチファイルの追加の例があります。ウィンドウセンターの「wc」は塩基エディター用に調整されており、脱アミネル塩基を中心としたインデルの検出を容易にするためです。これらはニュークレアーゼカットやニック部位を中心に位置しています。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表8。MiSeqライブラリ製製のためのPCR1(タブ1)およびPCR2(タブ2)試薬。
この表は、ターゲットゲノム遺伝子座を増幅するためにタブ1(PCR1)およびサンプル特異的インデックス配列やイルミナシーケンシングアダプターを組み込み、MiSq解析用のシーケンシング準備ライブラリを生成するためにタブ2(PCR2)で使用される試薬と反応成分を一覧にしています。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表9。MiSeqライブラリ調製のためのPCR1(タブ1)およびPCR2(タブ2)のサイクル条件。

この表は、ターゲットゲノム領域を増幅するためにタブ1(PCR1)で使用され、サンプル特異的インデックス配列およびイルミナシーケンシングアダプターを組み込むためにタブ2(PCR2)で用いられ、MiSeq解析のためのシーケンシング対応ライブラリを生成するための熱サイクル条件を一覧にしています。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、原一次哺乳類細胞におけるエディタmRNAおよび合成ガイドRNAのエレクトロポレーションを用いたゲノム編集のワークフローを提供します。mRNAとしてのデリバリーはプラスミドデリバリーに比べて編集が効率的であり、mRNAはエディタタンパク質やリボヌクレオタンパク質に比べてバッチ間でより単純かつ一貫性が高い傾向があります。以前の研究で塩基エディタのmRNAとリボヌクレオタンパク質形態を比較したところ、mRNAの方が編集効率が優れていることが示されています。プラスミドやウイルス送達法と比較して、mRNAベースの送達は一時的な発現とゲノム統合リスクの低減を可能にしますが、異なる細胞タイプに最適化が必要な場合があります。編集効率の低下に加え、ゲノム編集にプラスミドDNAを使用することは標的細胞のゲノムへのランダムな統合リスクを伴い、エディターの発現が長期間続くことでオフターゲット編集のリスクが高まります。標的アンプリコンシーケンシングとCRISPResso2の組み合わせにより、編集効率の標準化された定量化と任意のアレリックアウトカムの特性評価が可能になります3。

成功にはいくつかの要素が不可欠です。このプロトコルの重要なステップには、厳格なRNaseフリー取り扱いによるRNA完全性の維持、最適なガイドRNAの選択、各細胞型の電気穿孔条件の最適化が含まれます。RNAの完全性と慎重なRNase制御はアウトカムに強く影響し、RNA選択の指針は効率性や副産物プロファイルの主要な決定要因であり続けます。電気穿孔の設定には細胞タイプによる経験的最適化が必要であり、高編集率のプログラムによっては毒性を引き起こすこともあります。編集効率が低い場合は、エレクトロポレーションパラメータの最適化、RNA品質の最適化、またはガイドRNA設計を検討すべきです。過度の毒性が発生した場合、電気穿孔強度やRNA入力を減らすことで細胞の生存率が向上する可能性があります。追加の最適化戦略としては、ターゲット細胞タイプに合わせた代替の電気穿孔バッファーやプログラムのテスト、またはRNA濃度の編集・ガイドの修飾が含まれます。このワークフローは、編集者のベンチマークを行い、修正細胞を生成し、その後の単一細胞クローニング、表現型解析、in vivo研究、または翻訳開発に進むための実用的なプラットフォームを提供します。このワークフローは一次細胞におけるゲノム編集戦略の評価に広く応用可能であり、ゲノム文脈や細胞タイプを超えた編集モダリティの体系的な比較を可能にします。臨床的に関連性の高い変異の導入または修正、さらにコーディングおよび非コーディング調節要素の機能的検証を通じて、疾患モデリングを支援します。さらに、オンターゲット効率、オフターゲット活動、編集耐久性の評価を含む治療的編集アプローチの最適化プラットフォームも提供します。このワークフローは、ガイドRNAや編集システムのスクリーニングや優先順位付け、送達戦略の評価、精密医療の枠組みにおける患者特異型の検査にも利用できます。これらは総合的に、基礎ゲノム生物学、トランスレーショナルリサーチ、前臨床開発の間の多才な架け橋として機能します。この方法の制約として、電気穿孔の効率や細胞の生存率が細胞タイプによって大きく異なるため、経験的な最適化が必要です。さらに、編集結果はガイドRNAの設計や純度、標的遺伝子座のアクセス性に依存し、異なる実験システム間での再現性が制限されることがあります。これらの制約にもかかわらず、実験パラメータやガイド設計の綿密な最適化によりばらつきを軽減し、多様な細胞システム全体で信頼性が高く再現性の高い適用が可能になります。

開示事項

N.W.とE.V.B.はジョンズ・ホプキンス大学を通じてゲノム編集技術に関する特許出願を行っています。G.A.N.はブロード研究所およびジョンズ・ホプキンス大学を通じてゲノム編集技術に関する特許出願を行っています。

著者の貢献:
M.V.、J.N.W.、E.V.B、D.M.E.、J.D.、G.A.N.はそれぞれ別々のセクションを起草しました。M.V.は最終的なテキストをまとめて編集し、その後全著者による編集が行われました。

謝辞

このプロトコルに関する有益な議論をいただいたベアトリス・オララ・サストレに感謝します。この研究は、英国心臓財団のビッグビートチャレンジ賞(受賞番号:1000年)の支援を受けました。BBC/F/21/220106)、嚢胞性線維症財団(NEWBY23XX0年受賞)、米国国立衛生研究所(R00HL163805およびG.A.N.への授与DP2OD038783)。J.N.W.はNIH助成金番号T32 GM148383の支援を感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reaction
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul of cell solution and 0.4167 μL of DAPI solution 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Quantity: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2,000 units/ml 100 units 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reaction
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% solutionThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactionsNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-free Thermo
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095-721 

参考文献

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一次哺乳類細胞におけるエディタRNAのエレクトロポレーションによるゲノム編集
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