方法論記事

新生児敗血症のためのトランスレーショナル早産子豚モデル

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DOI：

10.3791/71456

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2026年7月10日

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1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

早産児の細菌性敗血症モデルは不可欠ですが、既存の齧歯類モデルは臨床的な関連性に欠けています。生きたブドウ球菌に感染した早産子豚を用いて、新生児敗血症の高度に翻訳的なモデルが開発されました。

要約

早産児は特に細菌感染にかかりやすく、急速に生命を脅かす敗血症、すなわち過度な炎症や臓器機能障害の状態に陥る可能性があります。疾患のメカニズムを調査し治療開発を進めるためには、新生児敗血症の複雑な病態生理と臨床的表現を再現する堅牢なトランスレーショナル動物モデルが不可欠です。本プロトコルは、出生直後または出生後3日目に生ブ ドウ球 菌表皮球菌の動脈内輸注によって誘発される新生児敗血症の臨床的に関連性の高い早産子豚モデルを提示します。子豚は妊娠率90%で帝王切開で出産され、新生児集中治療のもとでケアされます。これには、温度と酸素を制御するインキュベーターや、経腔栄養の投与や連続的な血液採取を可能にする内置臍帯動脈カテーテルが含まれます。 S. epidermidis感染後、子豚は24〜48時間にわたってモニタリングされます。敗血症の発生率や重症度は、細菌の投与量や静脈注射によるグルコースの供給によって調節されます。経経によるグルコースの供給が増加すると炎症促進免疫反応が加速し、臨床的悪化を招きます。致死性敗血症およびヒト性エンドポイントは、動脈血ガスパラメータ(pH ≤ 7.1)と、無気力、皮膚変色、頻呼吸などの血行動態の低下の臨床症状によって定義されます。このモデルは、エネルギー代謝と免疫調節介入が新生児感染中の細菌の除去、全身炎症、組織損傷にどのように影響するかを探る独自のプラットフォームを提供します。新生児敗血症の予防と治療のための臨床戦略に大きな影響を与える可能性を秘めています。

概要

新生児感染症は世界的に死亡および長期的な罹患率の主な原因であり、特に早産児、また低出生体重や周産期合併症を持つ正期産児にも見られます1,2。非特異的な臨床症状、未成熟かつ高度に変動する免疫応答、感染と非感染性炎症を区別できる感度かつ特異的なバイオマーカーの欠如により、早期診断は依然として困難です。3,4。その結果、臨床医はしばしば微生物学的確認前に経験的広範囲抗生物質療法を開始し、抗生物質の過剰使用、初期微生物定着の妨げ、抗菌薬耐性の発生に寄与します5。

新生児敗血症は、感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされ、臓器機能障害を引き起こす生命を脅かす状態です。感染と敗血症は生物学的および臨床的に異なる存在ですが、新生児学の文献では両用語がしばしば同義で使われます。臨床的には、新生児敗血症は一般的に早期敗血症または後期発症敗血症(EOS、LOS)に分類され、それぞれ生後72時間前後に発症します。EOSは通常、出生時に移された病原体、例えば大腸菌やグループB連鎖球菌によって引き起こされます。対照的に、LOSは非特異的な症状を示すことが多く、培養陰性であることもあり、侵襲的手技、経腔栄養、長期入院などのリスク要因と関連しています。最も一般的な原因菌には、特に凝固酵素陰性ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)やグラム陰性菌が含まれますが、真菌や多元微生物感染も発生します(1,2,6)。病因に関わらず、新生児感染症は一般的な敗血症表現型1,2に収束することがあります。重要なのは、早産児は先天免疫と適応免疫の両方の発達未熟さを示し、代謝予備力も限られているため、感染への反応性に影響を与える可能性があることです。

診断と治療の進展は、既存の実験システムの限界によって妨げられてきました。in vitroアプローチは免疫経路の機構的研究を可能にしますが、複雑な免疫応答の統合された生理学を捉えきれていません。齧歯類モデルは、新生児免疫応答の遺伝学的・分子的研究に有用ですが、免疫発生、代謝、サイズ8.9において人間と大きく異なります。これらのモデルでは、集中的なモニタリング、繰り返し採血、臨床的に現実的な支持的または治療的ケアの試験が限られているため、敗血症の臨床管理を研究することは困難です。

大型動物モデル、特に早産の新生子豚は強力な補完的アプローチを提供します。豚は、免疫細胞集団、パターン認識受容体シグナル伝達、代謝調節など、解剖学的、生理学的、免疫学的に人間と非常に似ている。重要なのは、豚が成人敗血症のモデルとして広く使われていることです13,15。豚の物理的なスケールにより、臨床的に関連した器具、継続的な生理学的モニタリング、繰り返しのバイオサンプリング、そして経腔栄養、点滴療法、抗生物質、呼吸補助などの標準化された集中治療介入が可能となります。実験的感染はまた、発生未熟の文脈で研究できるため、臨床実践に近い条件下で疾患の軌跡、宿主反応、治療効果の調査が可能になります。

本論文では、柔軟な翻訳プラットフォームとして設計された早産子豚の標準化された新生児敗血症モデルを説明しています。このモデルは、全身性細菌感染の制御された誘導と臨床的、免疫学的、代謝的応答の縦断的評価を可能にし、新生児敗血症の病態生理の探究や新規予防・治療的介入の有効性評価に利用できます。

プロトコル

詳細に記載されたすべての手順は、EU指令2010/63/EUの動物実験に関するものであり、デンマーク動物実験検査局(ライセンス番号:2020-15-0201-00520)によって承認されました。

1. 出産に関する手続き

  1. 妊娠90%(妊娠106〜107日)で早産の子豚を出産するため、選択的帝王切開を行います。
    1. 商業的な特定病原体フリー農場から妊娠中の雌豚(ランドレース・×・ラージ・ホワイト、3番目または4番目の産駒)を入手してください。
      注意:母豚は人工授精(× Duroc)によって受胎させなければならず、正確な受胎日が把握されています。
    2. 母豚は手術前に 水 を自由に利用し、最低12時間の断食を続けてください。アトロピン(1頭あたり2 mL)、ブトルファノール(2 mL/100 kg体重、10 mg/mL)、ゾレチル50獣医(3.3 mL/100 kg体重、ティレタミン25/mL、ゾラゼパム 25 mg/mL)を含むカクテルを筋肉内注射で鎮静誘導します。
    3. 鎮静後、耳静脈カテーテルを挿入し、プロポフォール(10 mg/mL)で全身麻酔を誘導し、唇反射と顎の張りが失われるまで減量します。
    4. 気道を確保するために、直接喉頭鏡下で気管挿管を行います。帝王切開中は、100%酸素(1–2 L/min)で蒸発したイソフルランを用いて、調整済みの蒸気器で投与し、手術的な麻酔面を維持します。
    5. 5%から開始し、1.5〜2.5%の濃度を維持し、心拍数と末梢酸素飽和度に基づいて最低有効用量まで調整します。
      注意:無呼吸が発生した場合は、十分な酸素供給を確保するために人工呼吸を開始してください。
    6. 雌豚を右側横たわりの姿勢に置きます。手術部位の無菌準備を行います。意図した左脇腹部切開線に沿って、皮下および筋内浸潤によりリドカイン120 mL(10 mg/mL)を投与します。
    7. メスを使った左側腹部開腹術を行い、子宮角を露出・外側に露出させます。子宮の角を大きな湾曲に沿って切開し、個々の子豚を産みます。
    8. 臍帯を切断する前に、ヘモグロビン濃度と鉄の蓄積を増やすために、子豚に向かって2〜3回乳を搾乳します。へその帯にA–Zと書かれたへそクランプとガーゼを巻きつけて出血を防ぎ、臍帯を切断します。
    9. 出産直後、各子豚をポリエチレン製の袋に入れ、頭を露出させます。このバッグは熱損失を最小限に抑え、低体温症のリスクを減らします。
    10. 首に筋肉内でドキサプラム0.1mL(20 mg/mL)とフルマゼニル(0.1 mg/mL)を0.1 mLの固定量投与します。ドキサプラムは自然呼吸を刺激する一方、ベンゾジアゼピン拮抗薬であるフルマゼニルは帝王切開時に母豚から移植された麻酔を部分的に逆再生します。
    11. 子豚を新生児集中治療室に移してください。
  2. 蘇生、ランダム化、カテーテル挿入
    1. 新生児集中治療室に移送する際に、各子豚の性別を体重測定・判定してください。
    2. 自然呼吸できない子豚の場合は、個別に蘇生を行います。ドキサプラムおよび/またはフルマゼニルの投与を繰り返し、必要に応じて陽圧換気を行い呼吸を安定させてください。
    3. 子豚が生理的に安定し、母体からの麻酔から麻酔状態が続いたら、無菌技術を用いて臍帯動脈カテーテル(4 Fr PVC栄養チューブ)を切断した臍帯の動脈のいずれかに挿入します。カテーテルの先端を背側大動脈に前進させます。カテーテルを縫合糸で皮膚に固定し、点滴ラインに接続して経腔栄養を供給します。
      注:早産の豚では、カテーテル先端が肝実質内での位置異常による肝壊死のリスクが高いため、臍帯静脈への動脈内投与が確立された標準です。
    4. 子豚を出生体重と性別で階層化し、ランダムに治療グループに割り当てます。
  3. 住宅環境
    1. 各子豚を個別に、温かいパッド付きのインキュベーターに収容し、換気が制御されています。
    2. 低酸素症を防ぐために、出生後最大12時間は補助酸素(1〜2 L/分)を供給してください。
    3. 出産後最初の12時間は直腸の体温を監視してください。中心温度を38〜39°C(目標:38.5°C)に維持するために、必要に応じて加熱条件を調整します。
      注意:出生直後およびカテーテル挿入時に短時間の低体温が予想されます。

2. 血漿注入による受動免疫

注:豚は免疫グロブリンを胎盤を介して移動させないため、24時間以上の実験では自然感染を防ぐために部分受動免疫を実施してください。

  1. 帝王切開後の母豚の母体血を無菌ヘパリンコーティング容器に採取します。血液を無菌ファルコンチューブで4°C、2500 × gで10分間遠心分離し、これを1回繰り返します。分離後は、新しい滅菌ファルコンチューブに血漿を慎重に集め、使用まで4°Cで保存します。
  2. 出生後12時間以内に、8 mL/kgの用量で30分間の連続動脈内輸液でポンプを投与します。

3. 実験的感染の誘導

注:実験的な感染は出生後3〜4時間、または出生後3日目に誘発されることがあります。

  1. 細菌懸濁液の調製
    1. 凍結した S. epidermidis のストックバイアル(WT-1457、グリセロール15〜25%)を室温で解凍します。一時的に(2〜3秒)渦を起こして均質な懸濁を得る。
      注:感染性病原のリスク群分類によると、 S. epidermidis はWHOのリスクグループ1微生物に分類されています。WHOリスクグループ1の微生物は人間の病気を引き起こす可能性は低く、特別な配慮は必要ありません。
    2. 無菌100mLのエルレンマイヤーフラスコに、解凍した S. epidermidis ストック5μLを接種し、脳心臓注入(BHI)ブロス20mLを一晩培養します。37°Cで180rpmの軌道振動を経て約16時間培養し、培養が静止相に到達できるようにします。同一条件下で未接種のBHIブロスコントロールを含めて、中程度の無菌性を検証します。
    3. 新しい培養液20mLに、200μLの一晩培養液(希釈1:100)を無菌100mLのエルレンマイヤーフラスコで接種して新しい培養を準備します。すべての子豚に感染できる十分な培養を準備してください(ステップ3.1.4 – 3.1.6の計算を参照)。37°Cで180rpmの軌道振動を伴い2.5時間インキュベートし、細菌が初期の対数成長段階に達するまで続けます(補足図1A)。
    4. 目標投与量、平均体重、子豚の数、培養密度に基づいて、すべての子豚に感染させるために必要な総培養量を推定します。
    5. 培養が2.5時間の培養後、600 nm(外径)で≥1(補足図1B)に達し、ODの変換率を1 = 3 × 108コロニー形成単位(CFU)/mLと設定します。
    6. 損失処理を考慮して15%の追加ボリュームを含めましょう。推定培養体積は次の式で計算します:
      V推定 = [目標線量(CFU/kg体重)×体重)×体重量×N × 1.15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      ここで:
      V推定 = 推定総培養体積(mL)
      BW = 子豚の平均体重(kg)
      N = 子豚の総数
    7. 孵化後、培養のODを決定します。分光光度計の直線範囲内に測定値を保つために、必要に応じて試料を希釈します。
    8. 目標CFU濃度を達成するために必要な最終培養体積を次の式で計算します。
      Vファイナル = OD1 · V推定値/ 測定外径(2)
      ここで:
      V最終 = 最終培養量(mL)
    9. 計算された Vファイナル を50 mLのファルコンチューブに移し、室温で3,000 × g で10分間遠心分離します。
    10. 上澄液は慎重に捨てます。
    11. 細菌ペレットを3 ×Vファイナル の無菌0.9%生理食塩水に再懸浮させ、動脈内投与の準備を行います(体重3 mL/kg、3分間投与)。解が骨材を含まないことを確認しましょう。
    12. 細菌懸濁液を使った50mLの注入注射器を準備します。
    13. 感染していない対照群には、無菌0.9%生理食塩水を使った別個の50mL点滴注射器を準備します。
  2. 感染手順
    1. 各子豚に細菌懸濁液または滅菌生理食塩水を、3分間で目標投与するポンプを用いて臍動脈カテーテルを通じて投与します。連続した子豚の間に5分の間隔を保ちましょう。
    2. 感染直後は、カテーテルを洗浄し、全量の投与を確保するために経経栄養の連続点滴を開始します。
    3. 細菌の懸濁液を4°Cで保存して投与量を確認しましょう。 その後、これを希釈して血液寒天プレートにプレートし、細菌密度を測定することができます(ステップ8参照)

4. 経腸外栄養

  1. 実験期間中、子豚に全静脈栄養(TPN)を与えます。例えば、新生子豚のマクロ栄養素の必要量に合わせて改造したKabiven 1900kcalのような3室のヒトTPNバッグを使用してください。
  2. 無菌条件下で経経栄養液を準備してください。
    1. グルコースチャンバーから300mLを取り出します。
    2. 脂質室から70mLを抽出します。
    3. グルコースチャンバーに50%グルコース155mLを加えます。
    4. バミン214mLをグルコースチャンバーに加えます。
    5. グルコースチャンバーに150mLの滅菌水を加えます。
    6. グルコースチャンバーに0.1 mL(5000 IE/mL)のヘパリンを加えます。
    7. 3つのチャンバーの内容物をよく混ぜます。
      注:これにより 、表1に示されたマクロ栄養素組成の静脈栄養液が得られます。この処方を、代替栄養療法が感染反応に与える効果を評価する際の標準的な対照食として用いてください。
    8. 使用まで4°Cで保存してください。溶液はバッチで準備し、準備後48時間以上は使用しないでください。
      注:このモデルは、口胃栄養チューブを子豚に装着することで、腸内栄養および腸刺激の効果を評価するために修正可能です。
  3. 経腔栄養の供給
    1. 50 mLの滅菌輸液注射器に経経栄養を充填し、輸液ポンプを使って動脈内カテーテルから連続的に輸注します。
    2. 注入速度を6 mL/kg/hに設定します。子豚の体重を毎日測り、更新された体重に応じて投与量を調整してください。
      注:長期研究では末梢浮腫(過水分補給)が観察された場合、輸注速度を4 mL/kg/hに減らしてください。
    3. 注射器が空になっていないか、点滴ポンプを定期的に監視してください。必要に応じて注射器を補充してください。

5. 臨床モニタリング

  1. 研究期間中、子豚を定期的に評価し、対応が必要かどうか判断します。細菌注入後は、安楽死まで経験豊富なスタッフによって1〜2時間ごとに動物を監視する必要があります。
    注:臨床的悪化、すなわち無症状から人道的な終末への進行は、30〜60分以内に急速に起こり得ます。
    1. 呼吸に関連する症状、頻呼吸、呼吸困難、チアノーゼ、苦痛呼吸などを観察してください。
      注意:低酸素症(酸素飽和度<80%)の場合、酸素供給を開始するか増加させる必要があります。
    2. 血流に関連する症状、変色、手足の冷え、毛細血管の充満時間の延長、頻脈、徐脈などを観察してください。
    3. 活動に関連する症状、倦怠感、立ったり歩いたりできない(出生後3日目以降に関連)、痛み刺激に対する反応性などを観察してください。
    4. 凝固に関連する症状、例えば皮膚の点状出血や点状出血を観察してください。変色した部分には優しく圧力をかけます。赤みが白くならなければ、皮膚出血と分類します。
  2. 臨床症状が認められた場合は、血液ガス測定を行い、pH、乳酸、酸素飽和度、二酸化炭素の分圧を基準値と比較して評価します(ステップ6.3参照)。
    注:血圧、心拍数、呼吸数などの継続的な臨床モニタリングは使用可能ですが、これらの実験では通常は用いられません。

6. 血液採取

注:縦方向の血液採取は、子豚の動脈内カテーテルまたは頸静脈穿刺によって行うことができます。サンプルされた総血液量は推定総血液量(体重の約7%)の7.5%を超えてはなりません。すべての血液採取手順は、地域の倫理ガイドラインを遵守しなければなりません。

  1. 動脈内カテーテル血液採取
    1. 清潔で手袋をした手で、慎重にカテーテルポートにアクセスしてください。開店前にアクセス部位をエタノールで消毒してください。輸液ラインの汚染を避けてください。
    2. 最低2mLの血液を抽出し、この量は点滴ラインからの経腔栄養で汚染されている可能性があるため、取っておいてください。採取したサンプルの滅菌を保ちます。
    3. 必要な血液量を採取して分析してください。例えば、血液学分析用の血液はEDTAコーティングチューブで採取し、血液ガス分析用のサンプルはヘパリン被覆シリンで採取すべきです。
    4. サンプリングが完了した後、最初に抽出した2mLの血液を子豚に再注入し、カテーテルを静脈栄養注入ラインに慎重に再接続します。
  2. 頸静脈穿刺による血液採取
    1. 子豚をインキュベーターから取り出し、首の部分を露出させるために背側横たわりにします。子豚の動きを防ぎ、頸静脈への安全なアクセスを確保するためにしっかりと拘束してください。
      注意:頸静脈穿刺は出血、血腫形成、気道障害などの潜在的なリスクを伴うことがあります。この手術を行うかどうかの決定は、結果の科学的重要性と慎重に比較検討されるべきです。
    2. 頸静脈の解剖学的場所を特定し、刺し傷部位をエタノールで消毒してください。
    3. バキューテナーシステムを用いて頸静脈穿刺を行い、必要な血液量を採取してください。例えば、0.2mLの血液を採取し、4°Cの温度で細菌プレートを塗るまで保存します。
    4. 静脈穿刺部位に圧迫を加え、止血が達成されるまで続けます。その後、子豚をインキュベーターに戻します。
    5. 子豚の再出血の兆候を引き続き観察してください。重大な出血が起きた場合は、子豚を安楽死させてください。また、皮下血腫の形成や気道を妨げる可能性のある内出血も監視してください。
  3. 血液ガス測定
    1. ヘパリン化注射器の血液サンプルに気泡がないか調べてください。気泡がある場合は、ガスの測定値を変わらないように注射器を軽く叩いて優しく排出または取り除きましょう。
    2. サンプルを血液ガス分析装置に運び、製造元の指示に従ってください。正確さを保つために、サンプルを迅速に処理することを必ず確認してください。

7. 敗血症の基準と人道的終末項目

  1. 敗血症を示すあらかじめ定められた人道的終点に達したら、子豚を安楽死させてください。
    注意:その他の病理や医因性損傷については、人道的評価項目に関する現地の倫理ガイドラインを参照してください。
    1. 敗血症の主な指標として血液pHを用い、主要な人道的エンドポイントとしましょう。血液pHが7.1≤の子豚はすぐに安楽死させてください。血液pH≤7.2の子豚の場合、15〜30分ごとに血液ガス測定を繰り返し、二次的な人道的エンドポイントを監視します。
    2. 二次的な人道的評価項目として、尿布性血管内凝固(湿疹や点状出血、呼吸停止、著度の倦怠、痛み刺激への反応欠如(解剖学的鉗子による指間隙の優しいつまみによる離脱反射の欠如で確認)が現れた場合、血液のpHに関係なく子豚を安楽死させます。
  2. ゾレティル系混合物(0.1 mL/kg)を筋肉内注射して子豚を麻酔します。
    注:ゾレチル50獣医用薬(チレタミン125mg、ゾラゼパム125mg)を6.25mLキシラジン(20mg/mL)、ケタミン1.25mL(100mg/mL)、ブトルファノール2.5mL(10mg/mL)を用いて10mLに再構成します。最終濃度は、チレタミン、ゾラゼパム、キシラジン、ケタミンそれぞれ12.5 mg/mL、ブトルファノール2.5 mg/mLです。
  3. 痛み刺激に対する離脱反射がないことで、十分な麻酔深度を確認しましょう(ステップ7.1.2参照)。
  4. 心臓内注射によるナトリウムペントバルビタール(3 mL/kg、400 mg/mL)の過剰投与による安楽死。
    注意:安楽死前にバキューテイナーシステムを用いて心内血液採取を行うことがあります。

8. 細菌の板付けと定量化

  1. 実験中に採取した頸静脈穿刺サンプルと安楽死時に採取した心臓穿刺サンプルを用いて血液中の細菌密度を定量化します。
    注意:動脈カテーテルから採取した血液は使用しないでください。初期の実験的感染から残留する細菌が含まれている可能性があり、定量が混乱する恐れがあります。
    1. 各血液サンプルごとに羊の血液寒天プレートを用意し、下部に象限0、-1、-2、-3をマークし、動物IDと時間点をラベル付けします。
    2. 各サンプルから50μLの血液を使い、10-1、10-2、10-3 を10倍ずつ希釈し、1.5mLのマイクロ遠心分離機管内の450μL無菌PBSに淹れます。
    3. 各プレートには、指定された象限内に対応する希釈液の20μL滴を3滴置き、接触や持ち越しを避け、エアロゾル化を防ぐために間隔を設けます。
    4. プレートは37°Cで一晩培養し、その後4°Cで保存してカウントします。
    5. 希釈液に含まれるすべての細菌コロニーを数え、各スポットあたり約10個の菌株を含みます。通常、白色で円形、滑らかな縁を持つ S. epidermidisの群落のみを含みます。形態に変化があるコロニーは注意深く検査・記録してください。これらはサンプリングなどの汚染を示す可能性があります。CFU/mLは次の式で計算します。
      (CFU/mL) = [(コロニー数・希釈因子)/(3 · 20μ L)] ·[1000μL/mL](3)

結果

早産の子豚を出生後5日目まで飼育したものに対して、線量反応実験が実施されました(図1)。産後3日目には、子豚に低用量の S. epidermidis (109 CFU/kg、n = 9)、高用量の S. epidermidis (5 × 109 CFU/kg、n = 9)、または対照として生理食塩水(n = 3)のいずれかの点滴を受け、44時間にわたってモニタリングされました。

S. epidermdisの輸注後、高用量投与の子豚の血液細菌負荷は低用量群に比べて44時間の追跡期間を通じて高く維持されました(図2A、P < 0.05)。高用量群(3/9)の子豚のみが敗血症を発症し、発症は感染後約12〜15時間で起こりました(図2B)。これに一致して、高用量のS. epidermidisを投与された子豚は12時間で血液pHが低く(図2C、P < 0.001)、低用量群に比べて二酸化炭素分圧(pCO₂)が著しく上昇した(図2D、P < 0.01)を示しました。

感染の急性期(6時間)では、両感染群とも塩基過剰が低く乳酸濃度が高いことが見られ、高用量の S. epidermidis 群では12時間まで持続するより顕著な変化が見られました(図2E、F、P < 0.01 – 0.05)。血糖値はグループ間で差がありませんでした(図2G)。

6時間経過時には、感染群とも未感染対照群と比較して強い血中好中球枯渇を示しました(図3A、いずれもP< 0.001)。感染の後半では、両感染群で好中球の補充が観察されましたが、低用量の S. epidermidis 群でより多く見られました(図3A、P < 0.05)。感染した両グループは実験中に血小板減少症を発症しました。しかし、高用量の S. epidermidis 群は低用量群および未感染対照群と比べて、より早く、より顕著に減少しました(図3B、P < 0.01–0.05)。感染後6時間および12時間の感染群で、両グループでTNF-α、IL-6、IL-10の血漿レベルが対照群と比較して上昇していました(図3C、P < 0.001–0.05)。24時間時点で、血漿中のTNF-αおよびIL-10レベルは高用量の S. epidermidis 群のみで高値に保たれていました(P< 0.05)、44時間後にはTNF-αレベルのみが高値でした(P < 0.05)。

安楽死時には、子豚が感染後44時間の予定された時点でヒト的なエンドポイントに達するか安楽死された場合、陰性急性期反応物の血漿濃度および臓器損傷のマーカーが測定されました(図4A–G)。これらのうち、高用量の S. epidermdis に感染した子豚では、低用量群に比べてコレステロール(陰性急性相反応物)のみが有意に低用量群より低かった(図4B、P < 0.05)。アラニンアミノトランスフェラーゼやアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ならびにクレアチニンや血尿尿素などの腎損傷マーカーの平均値は、高用量の S. epidermidis 群で数値的に未感染対照群よりも高かった(図4D–G)。

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図1:実験デザイン。 早産の子豚は妊娠90%で帝王切開で出産されました。出生後3日目に、子豚は109または5 ×10 9 CFU/kg、または対照として生理食塩水の生体S. epidermidisの動脈内輸注を受けました。感染後、子豚は44時間にわたってモニタリングされ、定められた時間点で縦断血液採取が行われました。Biorender.com で作成されたフィギュア。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:生理食塩水(CON)または生きた S. epidermidisによる感染後の早産子豚の血液細菌負荷、生存率、血液ガスパラメータ。 (A) 感染後6時間、24時間、44時間に採取した血液サンプル中の S. epidermidis の密度。(b) 感染後44時間で人道的エンドポイントまたは予定された安楽死までの生存曲線。(C–G)感染後0、6、12、24、44時間の動脈血ガスパラメータ。データは平均 ± SD(A)、生存曲線(B)、または中央値(実線)とIQR(点線)(C–G)を含むバイオリンドットプロットとして提示されます。感染群ごとにn = 9;未感染対照群の場合、n = 3。データは、グループ・×・時間相互作用(A、C–G)またはコックス比例ハザードモデル(B)を含む線形混合効果モデルを用いて分析されました。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001.略語;CON = 制御;pCO2 =CO2の分圧;SE = S. epidermidis。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:早産子豚の生理食塩水注入(CON)または生きた S. epidermidisによる感染後の循環炎症マーカー。 (A, B) 感染後6時間、12時間、24時間、44時間時の循環好中球および血小板数。(C) 感染後6、12、24、44時間時点のTNF-α、IL-6、IL-10の血漿レベル。データは中央値(実線)とIQR(点線)(A–C)を含むバイオリンドットプロットとして提示されます。感染群ごとにn = 9;未感染対照群の場合、n = 3。データはグループ・×・時間相互作用(A–C)を含む線形混合効果モデルを用いて解析されました。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001.略語;CON = 制御;IL = インターロイキン;SE = S. epidermidis;TNF = 腫瘍壊死因子。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-4
図4:生理食塩水(CON)による動脈輸注後の早産子豚の血漿生化学的パラメータ(109 または 5 × 109 CFU/kg)。(A–G) 感染後44時間の人道的エンドポイントまたは予定された安楽死時の血漿中のアルブミン、コレステロール、ALP、ALAT、ASAT、クレアチニン、BUNのレベル。データは全範囲(最小から最大まで)(A–G)を示すウィスカープロットとして提示されます。暗紫色の個別データポイントは、敗血症を発症した子豚を示しています。感染群ごとにn = 9;未感染対照群の場合、n = 3。データは多重線形回帰モデル(A–G)を用いて解析されました。*P < 0.05。略語;ALAT = アラニンアミノトランスフェラーゼ;ALP = アルカリホスファターゼ;ASAT = アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ;BUN = 血尿素窒素;CON = 制御;SE = S. epidermidis。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

総額集中
エネルギー7762kJ3525kJ/L
マクロ栄養素
アミノ酸92g42g/L
脂肪66g30g/L
グルコース221g100g/L
微量栄養素
なん64MMOL29mmol/L
K48MMOL22mmol/L
MG8MMOL4mmol/L
Ca4MMOL2mmol/L
PO418MMOL8mmol/L
SO48MMOL4mmol/L
クライ93MMOL42mmol/L
アセテート78MMOL35mmol/L

表1:修正総静脈注射栄養の組成。 経静剤栄養液中のエネルギー、マクロ栄養素(アミノ酸、脂肪、グルコース)、および微量栄養素の総量と濃度。

補足図1: S. epidermidis WT-1457の成長動態。 細菌は脳心臓注入ブロスで37°Cで培養され、180rpmの軌道振動を行った。光密度は600nmで時間をかけて測定されました。データは対数スケール(A)と線形スケール(B)で示されます(n = 3の独立した実験)。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

未熟な新生児未成熟という臨床的に関連した条件下で、早産子豚の新生児敗血症モデルを標準化して設計されました。このモデルは、妊娠周数の管理、蘇生、集中治療支援、感染のタイミング、縦断血液採取を組み合わせています。このアプローチは、齧歯類実験システムと in vitro 実験システムと感染した新生児で遭遇する複雑な生理学とのギャップを埋めることを目指しています。重要なのは、このモデルが性別、低出生体重、妊娠周数の既知の関連性を確認し、ヒト早産児16、17、18歳で敗血症感受性が観察されたことです。

豚は免疫機能や生理学的特徴が人間と大きく似ているため、感染研究において非常に重要な大型動物モデルです。白血球のサブセット、パターン認識受容体シグナル伝達、サイトカイン応答など、自然免疫系の主要な構成要素は、豚と人間の間に密接な対応関係を示しています。新生豚と人間の主な免疫学的違いは、適応免疫応答にあります。豚の妊娠中に免疫グロブリンG(IgG)の胎盤移動がないため、新生豚はこの点で生まれるのが無知です19。同様に、乳児のB細胞は生後3〜6か月までにIgMからIgGへのアイソフォームシフトを経験しませんが、豚のB細胞は20歳の出生直後にIgG応答を発動することができます。

このモデルシステムでは、これらの違いは、出生直後に感染を誘導し、適応免疫反応が起こる前に誘導し、血漿輸血による母体免疫グロブリンの供給によって緩和されます。このアプローチにより、早産による胎盤経IgG輸送の中断を受けやすい新生児の非常に早産児と同様の循環IgGレベルが得られます。さらに、出生時の比較的大きな体格(~800 g)は、新生マウス(~3 g)と比べてモデルを強化しています。その結果、温度、湿度、酸素張力などの環境的影響は、人間の新生児が経験するものにより近くなります。このスケールはまた、新生児の齧歯類モデルでは実現できない臨床グレードの機器、侵襲的モニタリング、血管アクセス、呼吸支援、継続的な生理的モニタリングなどの支持的ケアモダリティの利用を可能にします。具体的には、早産の豚モデルにおける点滴のための血管アクセス(経静脈栄養など)は臍動脈カテーテルを介して行われます。これは臨床新生児学で用いられる標準的な静脈内経路とは対照的ですが、早産子豚の解剖学的制約により必要とされており、臍帯静脈カテーテルは自発的に静脈管を通過することは稀で、肝実質内で位置が変形します。動脈内投与は、臍帯静脈の誤位に伴う肝壊死のリスクが高いことなく、連続的な輸注のための信頼性が高く再現性の高い経路を提供します。同様に、これにより動脈血のサンプルを採取し、血液ガス分析を行うことも可能です。

このモデルにおける全身感染は、新生児集中治療室における遅発性敗血症の主な原因であるS. epidermidisの動脈内輸注によって誘発されます1,2。しかし、新生児敗血症を引き起こす病原体は多様な種類であり、S. epidermidisのような凝固系陰性ブドウ球菌も、E. coli 1,2のような他のより強毒性の病原体よりも感染が軽度で敗血症リスクが低いことが知られています。モデルは低病原性を用いていますが、観察された臨床的悪化、炎症活性化、生理的不安定性はすべて新生児敗血症の主要な特徴を反映しています。本研究における未感染対照群(n = 3)は、同一集中治療条件下で「健康な」早産子豚の生理的状態を示すための基準基準として機能します。これにより設計上のバランスが損なわれますが、これらの比較は宿主の感染反応を示すことを目的としています。図2に示すように、S. epidermidisの投与量を増やすことで明確な線量-反応関係が見られ、生後1日目に感染した子豚の先行的な結果と一致しました。最も高いS. epidermidis投与量を投与された子豚のみが安楽死を必要とする人道的終末に悪化しました。しかし、両感染群とも代謝性アシドーシスを発症し、高用量のS. epidermidis群でのみ呼吸器成分(pCO₂の上昇)が観察されました。同様に、両群とも感染後6時間で顕著な好中球減少症を示し、その後24時間で好中球の補充が見られ、低用量群で増加しました。両群とも血小板減少症が認められ、血漿サイトカインおよび臓器損傷マーカーの増加が伴い、最も高いS. epidermidis用量を投与された子豚の反応がより顕著でした。

早産の子豚では、出生後1日目のS. epidermidis感染が新生児敗血症の副臨床症状(代謝性アシドーシス、白血球減少症、血小板減少症、炎症)に加え、倦怠、凝固障害、補体摂取も誘発します17,22,23。また、この感染はエネルギー代謝に全身的な乱を引き起こし、特にミトコンドリア酸化リン酸化の低下や、新生児敗血症患者で報告されているものと同様の血漿プロテオームおよび代謝の変化を引き起こします。さらに、妊娠90%の早産子豚は、満期17で生まれた子豚よりも敗血症を発症しやすいです。栄養成分は臨床的および免疫学的反応にも影響を与えます。グルコースベースのTPNは解糖分解代謝を促進し、炎症促進免疫応答を増幅する一方で、末梢組織の疾患耐性を損なう24,26。これらの反応の組み合わせは臓器損傷および敗血症表現型への進行と関連しています。TPN組成の調節は、グルコース含有量を低減するか、ガラクトース、グルコゲンアミノ酸、β-ヒドロキシ酪酸28,29などの代替のマクロ栄養素に置き換えることで、炎症反応を緩和し、組織の疾患耐性を維持します。TPNによる高グルコース補給も高血糖(≈10–20 mM)を引き起こします。しかし、観察される解糖系の炎症反応がどの程度血糖値の上昇によって直接的に媒介されているのかは依然として明確ではありません。

実験的観察では、感染後の出生日によって臨床反応に明確な違いがあることが示されています。敗血症のリスクと臨床症状の重症度は、出生直後に感染が誘発される場合に最も高くなります。出生後3日目の感染誘発は、誘発後最初の24時間で病気行動、呼吸器および代謝性アシドーシスを伴う軽度の敗血症表現型を引き起こし、その後臓器損傷のマーカーが高いにもかかわらず臨床回復が見られます。これらの早期誘導と後期誘導の違いのメカニズムは現在不明であり、現在も研究が進められている分野です。しかし、早産子豚では、静脈栄養開始後のグルコース恒常性が出生後最初の3日間で改善し、同様のグルコース摂取量にもかかわらず高血糖が減少します。総じて、感染後の出生日と血糖提供を変化させることで、急性重度および生命を脅かす敗血症、またはより軽度の表現型の特徴を捉えることができます。これらの調整により、特定の疾患表現型に合わせた標的的介入の試験が可能になります。このモデルの臨床的適用性は、新生児逐次臓器不全評価(nSOFA)などの確立された敗血症関連新生児スコアリングシステムと整合させることでさらに強化される可能性があります。心血管および血液学的スコアリングに必要な即時の動脈血圧モニタリングや血小板数の即時測定が困難だったため、本研究ではリアルタイムのnSOFAスコアリングシステムは導入されませんでした。今後のプロトコルの改良版では、疾患の重症度をより適切に分類するために適応されたnSOFAフレームワークを組み込む可能性があります。

翻訳上の強みがある一方で、このモデルにはいくつかの重要な限界があります。これらの実験は資源を多用し、帝王切開、新生児蘇生、産後の収容、早産子豚のケアを行うために専門施設と高度な訓練を受けた人員が必要です。感染実験はさらに、動物福祉と信頼できるデータ収集を確保するために、2〜3名の経験豊富なスタッフによる継続的な実務監視を必要とし、長期的な追跡調査はコスト増加をもたらします。齧歯類モデルと比べて、特に免疫組織化学やフローサイトメトリーにおいては種特異的試薬の利用は限られていますが、適切な検証を経て多くのヒト抗体は成功裏に使用できます。さらに、豚の近親交配により、胎内および子犬間で大きな生物学的変異が生じ、感染反応のわずかな違いを検出するためにはより大きなグループサイズが必要となります。この変動性は実験の複雑さを高める一方で、臨床新生児集団で観察される異質性をよりよく反映し、モデルの翻訳的関連性を高めます。結論として、この新生児敗血症に関する検証済みプロトコルは、将来の新生児学研究や新規予防・治療的介入の検証に役立つツールとなるでしょう。

開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究はコペンハーゲン大学比較小児科グループのスタッフの支援を受け、ノボノルディスク財団(NNF23OC0085457年およびNNF22OC0078747年)から資金提供を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 0.1–10 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL disposable syringes (sterile)e-power150001S
1 mL syringe with 25 G X 16 mm needle (sterile)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL tubesEppendorf30125215
10 mL disposible syringe (sterile)e-power150010S
100 mL Erlenmeyer flasksDuran Wheaton Kimble212162403
1000 μL pipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” needles (sterile)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL disposible syringe (sterile)e-power150002S
2-0 70 cm suture “ Vicryl plus” (sterile)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson304827
20 mL disposable syringe (sterile)e-power150020S
20 μL pipetteSartorius46886095
200 μL pipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer blood collection needles (sterile)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” needles (sterile)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” needles (sterile)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL plastic pipettes (sterile)LP Italian Spa162510
30 mL disposible syringes (sterile)e-power150030S
4L plastic freezer bagsCater.LineABN-105004
5–350 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL disposible syringe (sterile)e-power150005S
5 mL syringe (sterile) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 μL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Syringe B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL tubes (sterile)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% ethanol + 0.5% chlorhexidine disinfection wipesMediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Bandage scissors, stainless steel, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blood gas machine ABL90Radiometer994-667 (service manual)
Brain Heart Infusion broth (BHI/B)Produced in-houseN.A. Commercially available equivalent product: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Cell incubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Centrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Clinical chemistry system “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Closing cones “Combi-Stopper” (sterile)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia agar + 5% sheep blood platesBioRad63784
Disposable soft underpads, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL collection tubes (sterile)Becton Dickinson368856
Endotracheal tube (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silicone, cuffedMilaGVPmL-METC955
Enteral feeding tube 04Fr-L.40cm - PVC (sterile)Vygon310.04Used as umbilical arterial catheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Extension line “Q-Style” (sterile)Becton Dickinson385151
Flowmeter for oxygenDamecaP/N 32018-00
Flumaznil 0.1 mg/mLHamelm pharmacy gmbh33659
Gloves, “Gentle Skin” (sterile)Meditrade9021

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