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方法論記事

緑色蛍光タンパク質標識トリプルネガティブ乳がん細胞の抗体誘導性マクロファージ食作用のタイムラプスイメージング

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DOI:

10.3791/71461

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2026年8月14日

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1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、末梢血単核球由来マクロファージと自動顕微鏡を用い、緑色蛍光タンパク質で標識したトリプルネガティブ乳がん細胞の抗体依存性マクロファージ貪食を可視化するためのタイムラプス生細胞イメージング法について解説します。

要約

抗体依存性細胞貪食（ADCP）は、マクロファージが抗体でオプソニン化されたがん細胞を貪食するための重要なメカニズムです。本プロトコルでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識され、CD24を発現するトリプルネガティブ乳がん細胞のマクロファージによる抗体依存性貪食を可視化するための、タイムラプス生細胞イメージング法について解説します。マクロファージはヒト末梢血単核細胞から誘導し、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）で分化させ、さらにインターフェロンガンマ（IFN-γ）とリポ多糖（LPS）を用いて極性化させることで、前炎症性表現型を誘導します。がん細胞は、規定のエフェクター対ターゲット比でマクロファージと共培養する前に、抗CD24モノクローナル抗体でオプソニン化させます。貪食イベントは、生理的条件を維持するための環境制御装置を備えた自動顕微鏡を用いて、16時間にわたり記録します。イメージングは明視野および蛍光チャンネルを用いて行い、がん細胞の特定とそのマクロファージによる内部取り込みのモニタリングを可能にします。代表的なタイムラプス画像により、蛍光がん細胞が時間の経過とともに段階的に取り込まれる様子が示されます。定量的な評価を可能にするため、同一の共培養条件下で並行してエンドポイントアッセイを実施し、イメージング前に内部に取り込まれていないがん細胞を除去することで、貪食イベントの正確な測定を行います。本手法は、in vitroにおける抗体主導のマクロファージ貪食を可視化するための、標準化され再現性のあるアプローチを提供します。特に、タイムラプスイメージングとエンドポイントベースの定量化を統合することで、貪食のキネティクスと規模の両面から相補的な評価が可能になります。本プロトコルは、制御されたin vitro環境における治療用抗体およびマクロファージ標的がん免疫療法の評価を支援するものです。

概要

乳がんは世界中の女性において最も頻繁に診断される悪性腫瘍であり、年間約230万件の新規症例が報告されています1。この疾患は臨床的に不均一であり、ホルモン受容体（エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR））の状態と、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）オンコジーンの発現に基づいて、少なくとも4つの主要な分子サブタイプに分類されます2。ルミナルA型腫瘍は、HER2の過剰発現を伴わずERおよび/またはPRを発現し（ER/PR+ かつ HER2−）、ルミナルB型腫瘍はER/PRとHER2を共発現します（ER/PR+ かつ HER2+）。HER2+型腫瘍は、ホルモン受容体の状態に関わらずHER2の高発現を特徴とし、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）はこれら3つのマーカーすべてを発現しません（ER−、PR−、およびHER2−）2,3。これらのサブタイプの中で、TNBCは臨床的に最も困難な形態であり、全乳がんの約15%～20%を占めています。TNBC患者は、従来の化学療法への反応性が低く、効果的な標的療法が存在しないため、最も侵襲的な疾患経過を辿り、予後が最も悪く、5年生存率も最短となります3,4。さらに、TNBCは内臓転移、特に診断後5年以内の肺転移を起こす傾向が非常に高く、進行または転移性TNBC（mTNBC）患者の生存期間中央値が2年を超えることは稀です5,6。これらの統計データは、TNBCに対する新規治療戦略への切実かつ未充足なニーズを強調しています。

腫瘍微小環境（TME）は、乳がんの進行と免疫回避において極めて重要な役割を果たしています。腫瘍関連マクロファージ（TAM）はTME内で最も豊富な免疫細胞の一つであり、近年、自然抗腫瘍免疫の重要な媒介者として認識されています7,8,9。歴史的にTAMは、炎症促進性の「M1」状態と腫瘍促進性の「M2」状態に分類されてきましたが、この二分法的なモデルではマクロファージの不均一性の実態を十分に捉えることはできません。むしろ、TAMは動的な機能スペクトラムを占めており、TME内の多様な生化学的信号に応じて進化します。この複雑な状況において、がん細胞はさまざまな免疫回避戦略、特に「don't eat me」シグナルの過剰発現を通じて、マクロファージの活性を能動的に妨害します。この文脈において最初に特定された自然免疫チェックポイントがCD47/SIRPα軸であり6,10、より最近では、CD24が新規かつ強力な抗食細胞シグナルとして浮上しています11,12。CD24は、グリコシルホスファチジルイノシトール結合を介して細胞膜に固定された、小型で高度に糖鎖修飾されたムチン型糖タンパク質です13。生理的条件下ではさまざまな免疫細胞系譜で発現していますが、乳がん、卵巣がん、膵がん、大腸がんなどの固形腫瘍において頻繁に過剰発現しています14。腫瘍細胞上のCD24は、マクロファージに発現している抑制性受容体であるシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン10（Siglec-10）と結合します。この相互作用により、Siglec-10の細胞質テイルにある免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ITIM）ドメインのリン酸化が誘導され、SHP-1およびSHP-2ホスファターゼが活性化されて、下流の食細胞シグナルが抑制されます11。モノクローナル抗体を用いてCD24/Siglec-10相互作用を遮断することで、マクロファージによるCD24発現ヒト腫瘍の食作用が強力に増強されることが示されています。また、我々の最近の研究では、マウスのトリプルネガティブ乳がんモデルにおいて、乳がん細胞のCD24aをノックアウトすると、マクロファージによる食作用への感受性が高まることが示されました9。

抗体依存性細胞食作用（ADCP）は、抗体がマクロファージに腫瘍細胞の食作用を誘導する重要なメカニズムである15,16。腫瘍発現抗原に結合すると、抗体のFc領域がマクロファージ上のFcγ受容体（FcγRs）と結合し、細胞内シグナル伝達カスケードがトリガーされ、最終的に細胞骨格の再編成、食作用カップの形成、および標的細胞の取り込みが起こる17。

本研究では、抗体誘導性の乳がん細胞に対するマクロファージの食作用を測定するための、タイムラプス生細胞イメージングプロトコルを開発し、検証しました。本手法では、健康なヒトドナー由来の末梢血単核細胞（PBMC）から誘導したマクロファージを使用します。これらの細胞は、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）で分化させた後、リポ多糖（LPS）およびインターフェロンガンマ（IFN-γ）で刺激されます。フローサイトメトリー解析により、刺激後のCD11b⁺集団においてCD80の上昇が確認され（図1）、古典的活性化表現型であることが裏付けられました。この活性化状態で強力な抗体介在性食細胞能が付与されるため、抗体依存性細胞食作用（ADCP）の評価に適しています。ターゲット細胞としてはGFPタグ付きCD24陽性乳がん細胞を使用し、共培養前に治療用抗CD24モノクローナル抗体でオプソニン化します。食作用のイベントは、環境制御された条件下で自動顕微鏡を用い、16時間の間に記録されます。ダイナミックな可視化と並行して定量的な評価を可能にするため、同一の共培養条件下で別途エンドポイントアッセイを行い、内部に取り込まれなかったターゲット細胞を除去した後に食作用の厳密な測定を行います。本プロトコルは、抗CD24抗体によって介在されるADCPを評価するための、標準化され再現性のある、視覚的に情報量の多いプラットフォームを提供します。重要な点として、タイムラプスイメージングと補完的なエンドポイントベースの定量戦略を統合することで、食作用のキネティクスと規模の同時評価が可能になります。本手法は、他のマクロファージ標的免疫療法のターゲットの調査にも適応可能です。このプロトコルは、がん細胞の表面抗体に対する治療用モノクローナル抗体によって介在されるADCPの評価に最適です。また、候補抗体の比較スクリーニング、用量反応特性の評価、および「don’t-eat-me」シグナル遮断（例：CD47–SIRPα）の影響を含むFc–FcγR結合の機序研究にも適しています。本アッセイはヒト一次マクロファージを使用するため、臨床開発前にドナー間の個体差の評価を必要とするトランスレーショナル研究にも適しています。

マクロファージ解析のためのフローサイトメトリーを用いた末梢血単核細胞分離の概略図
図1末梢血単核細胞由来のIFN-γ/LPS刺激マクロファージの作製およびフローサイトメトリーによる検証。 上段：健康なドナーから、Ficoll溶液を用いた密度勾配遠心分離（400 × gで30分間）により末梢血単核細胞（PBMC）を分離する。 20°C、すべての試薬を～に予備平衡化した状態で 20°C ± 2°C分離したPBMCを、100 ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を添加したImmunoCult-SF培地で7日間培養し、マクロファージへの分化を誘導する（0～7日目）。なお、5日目に培地を補充する。8日目に、分化したマクロファージを100 ng/mLのIFN-γで刺激し、 1 µg/mL LPSで48時間処理する（8～10日目）。その後、細胞をフローサイトメトリーで解析する。下段パネル：マクロファージのフローサイトメトリー解析。細胞をCD11b-FITC、CD80-PE、CD206-PerCP-Cy5.5からなる表面パネルで染色し、続いて死細胞を除外するため、データ取得前にDAPIを添加した。ゲーティング戦略：まず生細胞（DAPI⁻）でゲートし、次にCD11b-FITC対FSC-AプロットでCD11b⁺を同定してマクロファージであることを確認した。その後、生細胞のCD11b⁺イベントをCD80対CD206ドットプロットで解析し、IFN-γ/LPS刺激によって誘導されたCD80⁺CD206⁻集団を確認した。右：CD11b-FITC対FSC-Aの代表的なドットプロットであり、ゲートされた細胞の99.8%がCD11b⁺であり、マクロファージであることが確認されたことを示している。左：CD11b⁺細胞の大部分がCD80⁺CD206⁻ゲート内（Q1: 95.2%）にあり、適用した刺激条件下で期待される前炎症性表現型を示している。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この手法を適用する際には、いくつかの制約を考慮する必要があります。第一に、PBMC由来マクロファージにおけるドナー間の個体差が、貪食能の結果に大きなばらつきをもたらす可能性があるため、複数のドナー（n ≥ 3）を使用し、プールした結果と併せて個々のドナーデータを報告することを推奨します。第二に、2D共培養形式は腫瘍微小環境を再現していないため、臨床的な推論を行う前に、3Dモデルまたはin vivoモデルで結果を検証する必要があります。第三に、16時間のイメージングウィンドウでは初期の貪食イベントは捉えられますが、抗原提示や二次的な免疫活性化などの長期的なプロセスは反映されません。したがって、リアルタイムイメージングとエンドポイント定量法を組み合わせて使用することで、ADCP測定の解釈可能性と再現性の両方を高める相補的なフレームワークが得られます。

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プロトコル

本プロトコルでは、健康なドナーの血液サンプルから誘導された初代マクロファージを使用します。サンプルの収集および処理は、中国医科大学の機関審査委員会（IRB）のガイドラインに従って実施されました。

1. PBMC由来マクロファージの調製

注意：ヒト血液を用いるすべての手順は、施設内のIRB（例：CMUH IRB）の承認を得た上で実施してください。採血前に、健康なドナーからインフォームドコンセントを得てください。

注意：すべてのヒト血液製剤は、ユニバーサルプリコーションに従い、バイオセーフティレベル2の条件下で取り扱ってください。

  1. 採血
    1. 健康なドナーから全血を採取し、10 mLのEDTAコーティング済みバキュテナーチューブに回収する。
  2. 血液の希釈
    1. 全血を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺-free）で1:1の比率で希釈する（例：全血10 mL ＋ PBS 10 mL）。
    2. 3〜5回転倒混和する。
      注：PBSは使用前に氷上に保持しておくこと。低温に保つことで、処理中の細胞生存率を維持できる。
  3. 密度勾配の積層
    1. コニカルチューブ内で、希釈した血液をFicoll–Paque PLUSの上に容量比2:1 (v/v) で慎重に積層する（例：15 mLチューブでFicoll 4 mLの上に血液 8 mL、または50 mLチューブで15 mLの上に30 mL）。
    2. 積層前に、希釈血液とFicoll–Paque PLUSの両方を20°C ± 2°Cに馴化させる。
    3. Ficoll–Paque PLUSは使用の少なくとも30分前に4°Cの保存庫から出すか、20°C ± 2°Cの恒温水槽で短時間加温する。
    4. 冷えた試薬は使用しないこと。Ficollの密度は20°C ± 2°Cで校正されており、この温度から逸脱すると分離効率とPBMCの回収率が低下する。
      注：チューブを45°に傾け、界面を明確に維持するため、壁面に沿ってゆっくりと血液をピペッティングする。Ficoll層を乱さないようにすること。
  4. 遠心分離
    1. ブレーキをオフにした状態で、20°C、400 × gで30分間遠心分離する（図1）。
      注：ブレーキをかけると密度勾配が乱れ、PBMCの回収率が低下する。
  5. PBMCの回収
    1. セロロジカルピペットを用い、上層の血漿や下層のFicoll層を乱さないように、バフィーコート層（血漿層とFicoll層の間の白色の界面）のみを慎重に吸引する。
    2. 回収した層を新しい50 mLコニカルチューブに移す。
  6. PBMCの洗浄
    1. 50 mLコニカルチューブ内でPBSを加え、全量を25 mLにする。
    2. 適切な遠心分離とバランス調整を行うため、50 mLチューブを使用する。
    3. 300 × gで10分間遠心分離する。
  7. 赤血球の溶血
    1. 上清を捨てる。
    2. セロロジカルピペットを用いて、ペレットが完全に分散し、目に見える凝集塊がなくなるまで緩やかにピペッティングし、5 mLの赤血球（RBC）溶血バッファーで再懸濁する。
    3. 室温で5分間インキュベートする。
      注意：均一な溶血を確実にするためには完全な分散が必要である。ただし、PBMCを損傷させる可能性があるため、激しいピペッティングやボルテックス処理は避けること。赤血球溶血バッファーでのインキュベーションは5分を超えないようにすること。長時間の曝露はPBMCの生存率を低下させる可能性がある。
  8. PBMCのペレット化
    1. 500 × gで5分間遠心分離し、PBMCをペレット化させ、溶血した赤血球の残渣を除去する。
  9. 最終再懸濁
    1. 上清を捨てる。
    2. ペレットを5 mLのImmunoCult-SFマクロファージ培地で再懸濁する。
      注：標準的な条件下では、全血10 mLから通常1.5–2.0 × 107個のPBMCが回収される。

2. マクロファージ分化（0〜7日目）

注意：単球由来の分化マクロファージを接着により選択するため、組織培養（TC）処理されていないペトリ皿を使用してください。非接着性のリンパ球は、その後の培養過程で洗浄され除去されます。

  1. 0日目：細胞播種
    1. 細胞数をカウントし、1 × 107 個のPBMCを非TC処理済みの10 cmペトリ皿に播種する。
    2. 100 ng/mL M-CSFを添加したImmunoCult-SFマクロファージ培地を用いて、全量を10 mLにする（M-CSFストックを直前に完全培地に直接添加し、緩やかに転倒混和して調製する）。
      注：このプロトコルは、ドナーごとのPBMC回収量の変動に合わせて比例的にスケール調整が可能であり、1 × 106 cells/mL以上の播種密度を基準とする。
  2. インキュベーションおよびモニタリング
    1. 加湿インキュベーター内で、37°C、5% CO₂条件下で培養する。
    2. 浮遊している単球クラスターの形成および接着細胞の出現を毎日モニタリングする。
      注：分化が進むにつれて、単球は徐々にサイズが大きくなり、クラスターを形成する。一部の単球はプレートに接着し始める。この段階での操作は不要である。
  3. 5日目：培地の追加
    1. 接着したマクロファージを乱さないよう注意しながら、100 ng/mL M-CSFを添加した新鮮なImmunoCult-SFマクロファージ培地5 mLを皿に緩やかに加える。
    2. さらに2日間（7日目まで）培養を継続する。
      注意：物理的な乱れは分化効率や細胞収量に影響を及ぼす可能性があるため、新鮮な培地は皿の壁に沿って緩やかに添加すること。
      注：マクロファージの分化を促進するオートクリン/パラクリン因子を保持するため、培地の全交換は避けること。
  4. 7日目：形態学的評価
    1. 倒立顕微鏡下でマクロファージの分化効率を確認する。
    2. 接着細胞は、大型で扁平かつ不規則な形状で、偽足が観察されるというマクロファージ特有の形態を示す。
    3. 7日目には、十分に分化したマクロファージが観察されるはずである。
      注意：7日目の形態学的評価は、その後のフローサイトメトリーによる検証を行うための重要な前提条件となる。十分に分化したマクロファージが顕微鏡下で明確に観察され、マクロファージ形態を持つ接着細胞の割合が高いほど、分化効率が高いことを示す（特徴的な形態を持つ接着マクロファージが約70%のコンフルエンシーに達していることが、分化成功の指標とされる）。接着が疎らな場合や、主に円形の細胞が見られる場合、または形態学的分化が不十分な培養物は、信頼性の高いフローサイトメトリー結果が得られない可能性が高いため、刺激および染色の工程へ進めてはならない。

3. マクロファージの分極化（8～10日目）

  1. 条件培地の回収および清澄化
    1. 8日目に、接着したマクロファージを乱さないように注意して、培養皿から15 mLの培地を吸引し、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移す。
    2. 回収した培地を400 × gで5分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化する。
    3. 次ステップに向けて、清澄化した上清を保持する。
  2. インターフェロンガンマ (IFN-γ) およびリポポリサッカライド (LPS) による刺激
    1. 清澄化した15 mLの上清を新しい滅菌チューブに移し、100 ng/mLのIFN-γと1 µg/mLのLPSを添加する。
    2. 気泡を導入しないように、緩やかにピペッティング（5～10回）して十分に混合し、サイトカインを均一に分散させる。
    3. サイトカインを添加した培地15 mLすべてを元の培養皿に戻す際、接着したマクロファージを乱さないよう、皿の内壁に沿って緩やかにピペッティングする。
    4. 37°C、5% CO₂条件下で48時間（8日目から10日目まで）インキュベートする。
      注：オートクリン/パラクリン因子を保持するため、条件培地（古培地）を使用する。このIFN-γとLPSの組み合わせは、マクロファージを前炎症性表現型に分極させるために用いられる。本プロトコルで使用したIFN-γ (100 ng/mL) およびLPS (1 µg/mL) の刺激条件下では、マクロファージは活性化した前炎症状態に一致する伸長したラメリポディアなどの特徴的な形態変化を示すとともに、CD11bおよびCD80を発現する。
      警告：LPSは暴露により炎症反応を引き起こす可能性のある生物活性エンドトキシンであるため、適切な実験室安全手順に従って取り扱うこと。

4. フローサイトメトリーによるIFN-γおよびLPS刺激マクロファージの炎症性表現型マーカーの確認

  1. 細胞の回収
    1. 表現型解析のため、10日目に分極化マクロファージの一部を回収する。
    2. PBSで調製した10 mM EDTAを加え、37°Cで10–15分間インキュベートする。
    3. 緩やかなピペッティングにより細胞を剥離させる。
      注：細胞が接着したままの場合は、37°Cでさらに30分間EDTAによるインキュベーションを延長し、再度緩やかなピペッティングを行う。細胞生存率と表面マーカーの完全性を維持するため、激しいピペッティングや機械的なスクレイピングは避けること。
  2. 抗体染色の準備
    1. CD11b（汎マクロファージ系譜マーカー）、CD80（炎症性マーカー）、およびCD206（炎症性表現型同定のための陰性除外マーカーとして使用される抗炎症性マーカー）に対するフルオロクロム標識抗体で細胞を染色する。
  3. 染色手順
    1. 剥離させたマクロファージ 5 × 105個を、冷PBS 100 µLを含むフローサイトメトリーチューブに移す。
    2. CD11b-FITC、CD80-PE、およびCD206-PerCP-Cy5.5抗体を、それぞれ最終濃度 1 µg/mLとなるように加える。
    3. 緩やかなピペッティングにより細胞懸濁液を混合する。
    4. 遮光下、氷上で1時間インキュベートする。
    5. サンプルを 4°C、300 × g で1分間遠心分離する。
    6. 上清を注意深く吸引除去する。
    7. 冷PBS 0.5 mLを加え、細胞ペレットを洗浄する。
    8. サンプルを 4°C、300 × g で1分間遠心分離する。
    9. 上清を捨てる。
    10. 細胞ペレットを冷PBS 200 µLで再懸濁する。
    11. DAPIを最終濃度 1 µg/mLとなるように加える。
      注：適切なアイソタイプコントロールおよび生存細胞染色剤（例：DAPIまたはViobility 405/452 Fixable Dye）を含めること。
  4. フローサイトメトリー解析
    1. フローサイトメーターを用いて染色済みサンプルを測定する。
    2. マクロファージ集団におけるCD11bおよびCD80の発現を確認する。
    3. 炎症性表現型と一致するマーカー発現が確認された場合のみ、食作用アッセイに進む。
  5. フローサイトメトリーの測定および設定
    1. 装置の設定
      1. フローサイトメーターを以下のチャネルで構成する：Pacific Blue/V450 (DAPI)、FITC (CD11b)、PE (CD80)、およびPerCP-Cy5.5 (CD206)。
      2. 定義された親ゲート内で、1サンプルあたり10,000イベントを収集するように測定パラメータを設定する。
    2. 閾値およびゲインの校正
      1. x軸にFSC、y軸に1つのフルオロクロムチャネルを表示する4つのドットプロットを開く。
      2. 各フルオロクロムに対応するアイソタイプコントロール抗体で染色した細胞を準備する。
      3. アイソタイプコントロールサンプルを測定する。
      4. 各チャネルのゲインを調整し、アイソタイプコントロール集団がログスケール上の101以下に位置するようにする。
      5. この閾値を用いてバックグラウンド信号レベルを定義する。
        注：バックグラウンドと特異的信号を確実に分離させるため、101から101·5のログスケール範囲を使用する。
    3. コンペンセーション（補正）
      1. 1.5 mLマイクロセントリフュージチューブにコンペンセーションビーズを1滴加える。
      2. 対応するフルオロクロム標識抗体を最終濃度 1 µg/mLとなるように加える。
      3. 遮光下、氷上で30分間インキュベートする。
      4. 400 × g で1分間遠心分離する。
      5. 上清を捨てる。
      6. ビーズを冷PBS 200 µLで再懸濁する。
      7. シングルカラーコントロールを測定する。
      8. スペクトルコンペンセーションを適用し、フルオロクロムの漏れ込み（spillover）を補正する。
    4. ゲーティング戦略
      1. 生存細胞の選択
        1. y軸にPacific Blue/V450 (DAPI)、x軸にFSCを表示する。
        2. DAPI陰性イベント（101以下）をゲートし、生存細胞を選択する。
      2. マクロファージの同定
        1. 生存細胞集団を親ゲートに設定する。
        2. y軸にFITC (CD11b)、x軸にFSCを表示する。
        3. CD11b⁺イベント（101以上）をゲートする。
      3. 炎症性表現型の同定
        1. CD11b⁺集団を親ゲートに設定する。
        2. y軸にPE (CD80)、x軸にPerCP-Cy5.5 (CD206)を表示する。
        3. 両軸の101.5でクアドラントゲートを適用する。
        4. 左上象限（Q1）のCD80⁺CD206⁻細胞を同定する。
  6. 判定基準
    1. CD11b⁺親ゲート内の細胞の90%以上がCD80⁺CD206⁻であることを確認する。
    2. この閾値が達成された場合のみ、食作用アッセイに進む。
    3. サンプルがこの基準を満たさない場合は、PBMCの分離、M-CSFによる分化、およびIFN-γ/LPS刺激を繰り返す。

5. 抗体依存性食作用アッセイ

注：アッセイのセットアップ前に、がん細胞におけるGFPの安定した発現を確認してください。アッセイの前に、標的細胞におけるCD24の発現を確認してください。最適なパフォーマンスを得るためには、CD24陽性率が50%–100%のがん細胞を使用してください。本プロトコルで使用するMDA-MB-468細胞は、100%のCD24陽性を示します。

  1. マクロファージの播種
    1. ステップ4で検証したIFN-γおよびLPS刺激マクロファージを、24ウェル組織培養プレートに1ウェルあたり2 × 105 cellsで播種する。
    2. 細胞を接着させるため、プレートを37°C、5% CO₂の静止条件下で12～16時間インキュベートする（Figure 2A）。
      注：次へ進む前に、マクロファージがしっかりと接着していることを確認すること。接着が不十分なマクロファージは、イメージング中に剥がれる可能性があり、結果に影響を及ぼす。
  2. がん細胞の準備
    1. CD24陽性GFPタグ付き乳がん細胞（MDA-MB-468）を、コンフルエンシーが70%～80%になるまで培養する。
    2. 培地を吸引して除去する。
    3. 細胞単層をPBSで1回洗浄する。
  3. がん細胞の剥離
    1. 培養皿に10 mM EDTA含有PBSを加える。
    2. 細胞を37°Cで5～10分間インキュベートする。
    3. 緩やかなピペッティングにより細胞を剥離させ、完全に遊離させる。
      注：細胞の剥離にトリプシンを使用しないこと。酵素消化により細胞表面からCD24が切断され、抗体結合が損なわれる可能性がある。
  4. がん細胞の回収と計数
    1. 剥離した細胞を遠心チューブに回収する。
    2. 細胞を300 × gで5分間遠心分離する。
    3. 上清を捨てる。
    4. 細胞ペレットを完全RPMI培地で再懸濁する。
    5. 生存細胞数を計数する。
  5. がん細胞の抗体オプソニン化
    1. がん細胞を完全RPMI培地0.5 mLを用いて、2 × 105 cells/mLの密度で再懸濁する。
    2. 抗CD24モノクローナル抗体を最終濃度1 µg/mLとなるように加える。
    3. 緩やかなピペッティングで細胞懸濁液を混ぜ、抗体を均一に分布させる。
    4. 細胞を37°Cの静止条件下で30分間インキュベートする。
      注：抗体依存性食作用の陰性対照として、同濃度のアイソタイプ一致IgGコントロールを併用すること。
  6. 共培養の準備
    1. オプソニン化後に細胞を洗浄しない。
    2. 細胞表面の抗体コーティングを維持するため、そのまま共培養へ進む。
  7. 共培養の設定
    1. マクロファージを含む各ウェルに、抗体オプソニン化したGFPタグ付き乳がん細胞を1 × 105 cellsずつ加える。
    2. エフェクター細胞とターゲット細胞の比率を2:1に維持する。
      注：実験デザインに基づいてエフェクター細胞とターゲット細胞の比率を調整すること。細胞同士の接触頻度を高め、食作用イベントの検出能を向上させるには、上述の2:1よりも高いマクロファージ対がん細胞比（例：3:1または5:1）を使用すること。

イメージング実験におけるマクロファージとGFP標識細胞の相互作用のタイムラプス図。
図 2. 抗体依存性細胞食作用のタイムラプスイメージング。 (A) 共培養システムとタイムラプスイメージング設定の概略図。イメージングパラメータは、位相差およびGFPチャンネルを備えた10×対物レンズを用い、総取得時間16 h（97フレーム）にわたり10 min間隔で設定した。 (B) 1 hから16 hまでの代表的なタイムラプス画像。時間の経過とともにマクロファージによってGFP陽性がん細胞が内部に取り込まれる食作用のイベントを示している。黄色の破線円は代表的な食作用イベントを強調している。位相差チャンネルでは、取り込まれたがん細胞はマクロファージ細胞質内の位相明視野の細胞内構造として現れる（白矢印）。GFPチャンネルでは、マクロファージ内に局在する蛍光により、内部への取り込みが確認される。 (C) 0、1、4、および16 hにおける代表的な食作用イベントの拡大図。マクロファージによるGFP標識がん細胞の取り込みの連続的なプロセスを示している。画像シーケンスは、マクロファージによる食作用イベントが明確に可視化されている代表的なものを選択した。白矢印は、標的細胞と相互作用し、それを取り込むマクロファージを示している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. タイムラプスイメージング（自動ライブセルイメージングシステム）

注意：アッセイの前に、Lionheart自動ライブセルイメージングシステムおよびGen5自動ライブセルイメージングソフトウェアを使用してイメージングプロトコルを設定してください。正確なセットアップ、最適なパフォーマンス、および安全な使用を確保するため、イメージングシステムを操作する前に適切なトレーニングを受けてください。

  1. 装置の準備
    1. イメージングの少なくとも1時間前に、イメージングシステム、環境制御モジュール、およびCO₂ガス供給装置の電源を入れてください。
    2. 自動ライブセルイメージングソフトウェアの環境制御パネルを開きます。
    3. 温度を設定してください 37°C およびCO₂濃度を5%に。
    4. チャンバー温度が±以内に安定したことを確認してください。 0.2°C プレートに細胞を播種する前に、5.0% ± 0.1%のCO₂条件下で準備する。
  2. プレートのセットアップ
    1. 24ウェルプレートをイメージングシステムのイメージングチャンバーに設置します。
  3. 初期設定
    1. 自動ライブセルイメージングソフトウェアのタスクマネージャーを開きます。
    2. [イメージャー・マニュアルモード]を選択します。
    3. [今すぐキャプチャ]をクリックして、イメージングパラメータを初期化します。
    4. 10倍の対物レンズを選択します。
    5. フィルター設定としてマイクロプレートを選択してください。
    6. 自動ライブセルイメージングソフトウェアのプレートライブラリから、24ウェルプレートを選択します。
  4. フォーカスおよび画像のセットアップ
    1. 位相差チャンネルを選択します。
    2. 代表的なウェル（例：A1）を選択します。
    3. タイムラプス撮影を開始する前に、オートフォーカスを有効にしてください。
    4. カメラアイコンを使用して画像をキャプチャしてください。
    5. 細胞の形態と焦点の品質を確認する。
    6. [処理/分析]に移動します。
    7. [画像セットから実験を作成]を選択して、実験を設定します。
  5. タイムラプス撮影パラメータ
    1. ［手順］設定パネルを開きます。
    2. 温度を～に設定する 37°C およびCO₂濃度を5%に設定する。
    3. [Start Kinetic]の下で、ランタイムを16:00:00に設定します。
    4. イメージング間隔を0:10:00に設定してください。
    5. 総リード数を97に設定してください。
    6. 初期の食作用イベントを捉えつつ、時間分解能と光毒性のバランスを維持するため、イメージング間隔を10〜15分に設定してください。
  6. イメージングチャネル構成
    1. チャンネル1を位相差に設定してください。
    2. チャンネル2をGFP（励起 469/35、蛍光 525/39）に設定してください。
    3. 最適な視野と分解能を得るために、10倍の対物レンズを選択してください。
    4. 照明、積分時間、およびゲインを［自動］に設定するか、手動で調整してください。
    5. 信号の飽和を避けるため、GFPの露光時間は通常100～300 msに設定してください。
    6. すべてのウェルに同一のイメージング設定を適用します。
  7. 撮像位置の設定
    1. ［ビーコンの定義］メニューを開きます。
    2. Zスタック撮影を無効にする。
    3. モンタージュ撮影を無効にする。
    4. 単一の焦点面でイメージングを行う。
    5. 顕微鏡アイコンを使用して、各ウェル内で代表的な、重複しない領域を選択し、イメージング位置を手動で定義してください。
    6. すべてのタイムポイントにおいて、同一の撮像位置を維持してください。
    7. 1ウェルあたり少なくとも4〜6箇所の視野を選択してください。
  8. タイムラプス撮影
    1. [再生]をクリックして、自動タイムラプスイメージングを開始します。
  9. データの書き出しと可視化
    1. データ取得後、保存された実験ファイルを開きます。
    2. イメージング位置を選択する。
    3. タイムラプスデータをMP4形式でエクスポートします。
    4. [プロセスツール]を開きます。
    5. 必要に応じて[画像デコンボリューション]を適用し、可視化を向上させて代表的な食作用イベントを特定してください。
      注意：タイムラプスイメージングは定性的な可視化のみに使用してください。GFP陽性のがん細胞がマクロファージに飲み込まれていない場合でも、重なり合ったり一時的に結合したりすることがあり、偽陽性信号となる可能性があります。定量分析は、別途エンドポイントアッセイを用いて行ってください。

7. エンドポイントにおける食作用の定量

  1. 非内部化細胞の除去
    1. 同一の共培養条件下でアッセイを行う。
    2. 4 hで実験を終了させる。
    3. 培地を除去する。
    4. 10 mM EDTA含有PBSを加える。
    5. 37°Cで5 min間インキュベートする。
    6. PBSで緩やかに洗浄し、内部化していないGFP陽性細胞を除去する。
    7. 新鮮なマクロファージ培地を加える。
  2. 定量のための画像取得
    1. 位相差およびGFPチャネルを用いて画像を取得する。
    2. 1ウェルあたり少なくとも4–6視野を撮影する。
    3. 1条件につき最低3ウェルを解析する。
  3. 食作用イベントの定義
    1. 細胞境界内に完全に囲まれたGFP陽性シグナルを含むマクロファージを特定する。
  4. 画像解析
    1. ImageJソフトウェアで画像を開く。
    2. Cell Counterプラグインを使用する。
    3. マクロファージの総数をカウントする。
    4. 内部化したGFP陽性細胞を含むマクロファージをカウントする。
  5. 食作用インデックスの算出
    1. 以下を算出する：食作用インデックスの数式；総マクロファージ数に対する取り込まれたGFP陽性細胞の比率；方程式。
    2. ブラインド法で解析を行う。
    3. 少なくとも3回の独立した実験で再現性を確認する。
  6. データの提示
    1. 代表的なタイムラプス画像を時系列で提示する（図 2B および 図 2C）。
    2. 代表的なエンドポイント画像を提示する（図 3A および 図 3B）。

食作用解析：マクロファージ共培養、抗CD24 mAb；顕微鏡画像、データチャート比較。
図 3. エンドポイント解析による抗体依存性マクロファージ食作用の定量化。(A) GFP標識した乳がん細胞と4時間共培養し、その後EDTA処理を用いて非取り込み細胞を除去したマクロファージの代表的な位相差像およびGFP蛍光像。位相差チャネルとGFPチャネルを統合し、マクロファージおよび内部に取り込まれたGFP陽性標的を特定した。ImageJのCell Counterプラグインを用いて、マクロファージ（カウンター 0）およびGFP陽性標的を取り込んだマクロファージ（カウンター 1）を計数した。IgGコントロール群では食作用は観察されなかったが、抗CD24モノクローナル抗体処理ではマクロファージ内に明らかな細胞内GFP陽性シグナルが認められ、活性な食作用が示された。スケールバー = 200 µm。(B) 食作用インデックス（全マクロファージ数に対する、内部にGFP陽性細胞を取り込んだマクロファージの割合として定義）の定量化。抗CD24モノクローナル抗体は、IgGコントロールと比較して食作用インデックスを有意に増加させた（0.00 ± 0.00% vs. 18.76 ± 4.01%, mean ± SD; n = 各群 6視野; ***p < 0.001, Welch’s unpaired t-test）。データは少なくとも3回の独立した実験の代表値である。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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結果

PBMCからマクロファージの生成および分極が成功したことは、形態学的評価およびフローサイトメトリー分析によって確認されました（図1）。密度勾配遠心法で分離したPBMCをM-CSF補充培地で培養した結果、7日目までにマクロファージ特有の形態を持つ接着細胞が得られました。IFN-γおよびLPSによる刺激後、細胞は適用条件での活性化と一致する表現型を示しました。フローサイトメトリー分析では、ゲート内の細胞の99.8%がCD11b陽性であり、マクロファージへの効率的な分化が確認されました（図1）。CD11b陽性細胞のうち、大部分がCD80⁺CD206⁻画分に位置しており（95.2%）、指定の刺激条件下で分極が成功したことが示されました。これらの結果から、本プロトコルにより、期待されるマーカー発現プロファイルを持つマクロファージを安定して生成できることが確認されました。

タイムラプスイメージングにより、抗体依存性細胞貪食の直接的な可視化が可能となりました（

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ディスカッション

信頼性と再現性のある結果を得るためには、本プロトコルのいくつかのステップが極めて重要です。第一に、PBMC分離の質と純度が、マクロファージの回収量および分化効率に直接影響します。バフィーコート界面を維持するためには、希釈した血液をFicoll密度勾配の上に慎重に層状に重ねることと、ブレーキをオフにした状態で遠心分離することが不可欠です。赤血球の溶血が不十分であるか、あるいは溶血バッファーでのインキュベーション時間が長すぎると、PBMCの生存率が低下します。第二に、 phagocytosisアッセイの前に、フローサイトメトリーによって前炎症性マクロファージへの極性を確認する必要があります。CD80の発現が上昇していないマクロファージは、食細胞能が低下している可能性があり、抗CD24抗体による効果の解釈を妨げる原因となります。第三に、がん細胞の剥離方法が重要です。酵素消化により細胞表面からCD24が切断され、抗体の結合効率が低下する恐れがあるため、トリプシン処理は避けるべきです。表面抗原の完全性を維持できるEDTAを用いた剥離法が推奨されます。

このプロトコルは、異なる実験目的に合わせ...

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開示事項

著者は利益相反がないことを開示します。

謝辞

本研究は、台湾教育省（MOE）の高等教育芽生え計画（Higher Education Sprout Project）の枠組みにおける重点研究センタープログラムを通じて、中国医学大学の癌生物学・精密治療センター（Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University）より支援を受けました（CBPTC-PROJ-5-2）。

資金提供および学術的支援をいただいたCancer Biology and Precision Therapeutics Centerに感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) ストック溶液Sigma-Aldrich (または同等品)E7889 (または同等品)細胞剥離用の PBS 中 10 mM EDTA ワーキングソリューションの調製に使用
24ウェル組織培養プレート (TC処理済み)Corning (または同等品)3524食細胞作用アッセイ中のマクロファージとがん細胞の共培養に使用
抗ヒト CD206 抗体 (フローサイトメトリー用)BioLegend (または同等品)321122 (または同等品)代替マクロファージ表現型のマーカー
抗ヒト CD24 モノクローナル抗体Thermo Fisher Scientific (または同等品)MA1-91384 (または同等品)抗体依存性食細胞作用のためのがん細胞のオプソニン化に使用
環境制御チャンバー付き自動ライブセルイメージングシステム (例: Lionheart FX)Agilent Technologies (または同等品)BioTek Lionheart FX 自動顕微鏡制御された温度および 2 条件下での長期タイムラプスイメージングを可能にする
自動ライブセルイメージング用イメージングソフトウェア (例: Gen5)Agilent Technologies (または同等品)N/Aタイムラプスイメージングデータの取得および解析に使用
遠心分離機 (スイングバケットローター)Thermo Fisher Scientific (または同等品)Multifuge X4R Pro (TX-1000 ローター) (または同等品)PBMC 分離および細胞洗浄ステップに使用
2 インキュベーター (37°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (または同等品)Forma Direct Heat 2 インキュベーター (または同等品)細胞培養のための生理的条件を維持
2 ガス供給装置（レギュレーター付き）Agilent Technologies (または同等品)N/Aインキュベーターおよびイメージングシステムの環境制御用に 2 を供給
コニカルチューブ (15 mL および 50 mL)Corning (または同等品)352070 (または同等品)PBMC 分離、洗浄、および遠心分離ステップに使用
EDTA コーティング血液採取チューブ (バキュテイナー)BD Biosciences (または同等品)367863 (または同等品)ドナーからの全血サンプルの採取に使用
Ficoll-Paque PLUSCytiva (または同等品)17144003 (または同等品)PBMC 分離用の密度勾配培地
フローサイトメーター (例: FACSCanto II)BD Biosciences (または同等品)BD FACSCanto II マクロファージの表現型解析に使用
コンペンセーションビーズ (フローサイトメトリー用)Biolegend (または同等品)424602シングルカラーコンペンセーションコントロールに使用
FITC 抗ヒト CD11b 抗体 (フローサイトメトリー用)BioLegend (または同等品)101205 (または同等品)マクロファージの同定に使用するマーカー
PE 抗ヒト CD80 抗体 (フローサイトメトリー用)BioLegend (または同等品)375410 (または同等品)活性化マクロファージ表現型に関連するマーカー
GFP 発現乳がん細胞株 (MDA-MB-468)ATCC (または同等品)HTB-132 (または同等品)食細胞作用アッセイに使用する標的細胞。GFP により可視化が可能
ImmunoCult-SF マクロファージ培地STEMCELL Technologies (または同等品)10961 (または同等品)マクロファージ分化に使用する無血清培地
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific (または同等品)12100046がん細胞の培養および再懸濁に使用
アイソタイプコントロール抗体 (IgG)Bio X Cell (または同等品)BE0297 (または同等品)抗体依存性食細胞作用アッセイの陰性コントロール
リポ多糖 (LPS)Sigma-Aldrich (または同等品)L2630 (または同等品)IFN-γ と併用してマクロファージを活性化させる刺激剤
組換えヒトインターフェロンガンマ (IFN-γ)STEMCELL Technologies (または同等品)78020 (または同等品)マクロファージ活性化に使用するサイトカイン
組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF)STEMCELL Technologies (または同等品)78057 (または同等品)マクロファージ分化に使用する増殖因子
パステゥールピペットまたはセラロジカルピペットJetbiofil (または同等品)GSP010010 (または同等品)PBMC 分離および細胞培養中の液体操作に使用
PBS (Ca2+-/Mg2+- free)Thermo Fisher Scientific (または同等品)BP399-500 (または同等品)細胞洗浄および希釈ステップに使用するバッファー
シャーレ (100 mm, 非–組織培養処理)Corning (または同等品)430591接着選択によるマクロファージ分化に使用
赤血球 (RBC) 溶血バッファーBioLegend (または同等品)420301 (または同等品)PBMC 分離中の赤血球除去に使用
Viobility 405/452 Fixable DyeMiltenyi Biotec (または同等品)130-130-404 (または同等品)フローサイトメトリー解析中の細胞生存率の評価に使用
DAPISigma-Aldrich (または同等品)D9542 (または同等品)フローサイトメトリーにおける死細胞の除外に使用

参考文献

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