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方法論記事

緑色蛍光タンパク質標識トリプルネガティブ乳がん細胞の抗体誘導性マクロファージ食作用のタイムラプスイメージング

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DOI:

10.3791/71461

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2026年8月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、末梢血単核球由来マクロファージと自動顕微鏡を用い、緑色蛍光タンパク質で標識したトリプルネガティブ乳がん細胞の抗体依存性マクロファージ貪食を可視化するためのタイムラプス生細胞イメージング法について解説します。

要約

抗体依存性細胞貪食（ADCP）は、マクロファージが抗体でオプソニン化されたがん細胞を貪食するための重要なメカニズムです。本プロトコルでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識され、CD24を発現するトリプルネガティブ乳がん細胞のマクロファージによる抗体依存性貪食を可視化するための、タイムラプス生細胞イメージング法について解説します。マクロファージはヒト末梢血単核細胞から誘導し、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）で分化させ、さらにインターフェロンガンマ（IFN-γ）とリポ多糖（LPS）を用いて極性化させることで、前炎症性表現型を誘導します。がん細胞は、規定のエフェクター対ターゲット比でマクロファージと共培養する前に、抗CD24モノクローナル抗体でオプソニン化させます。貪食イベントは、生理的条件を維持するための環境制御装置を備えた自動顕微鏡を用いて、16時間にわたり記録します。イメージングは明視野および蛍光チャンネルを用いて行い、がん細胞の特定とそのマクロファージによる内部取り込みのモニタリングを可能にします。代表的なタイムラプス画像により、蛍光がん細胞が時間の経過とともに段階的に取り込まれる様子が示されます。定量的な評価を可能にするため、同一の共培養条件下で並行してエンドポイントアッセイを実施し、イメージング前に内部に取り込まれていないがん細胞を除去することで、貪食イベントの正確な測定を行います。本手法は、in vitroにおける抗体主導のマクロファージ貪食を可視化するための、標準化され再現性のあるアプローチを提供します。特に、タイムラプスイメージングとエンドポイントベースの定量化を統合することで、貪食のキネティクスと規模の両面から相補的な評価が可能になります。本プロトコルは、制御されたin vitro環境における治療用抗体およびマクロファージ標的がん免疫療法の評価を支援するものです。

概要

乳がんは世界中の女性において最も頻繁に診断される悪性腫瘍であり、年間約230万件の新規症例が発生しています1。この疾患は臨床的に不均一であり、ホルモン受容体であるエストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）の状態と、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）オンコジーンの発現に基づいて、少なくとも4つの主要な分子サブタイプに分類されます2。ルミナルA型腫瘍はHER2の過剰発現を伴わずERおよび/またはPRを発現し（ER/PR+かつHER2−）、ルミナルB型腫瘍はER/PRとHER2を共発現します（ER/PR+かつHER2+）。HER2+腫瘍はホルモン受容体の状態にかかわらず高いHER2発現を特徴とし、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）はこれら3つのマーカーすべてが欠損しています（ER−、PR−、およびHER2−）2,3。これらのサブタイプの中で、TNBCは臨床的に最も困難な形式であり、全乳がんの約15%～20%を占めています。TNBC患者は、従来の化学療法への反応が悪く、効果的な標的療法が存在しないため、最も侵襲的な疾患経過を辿り、予後が悪く、5年生存率が最も低いことが知られています3,4。さらに、TNBCは内臓転移、特に診断から5年以内の肺転移を起こす傾向が著しく高く、進行または転移性TNBC（mTNBC）患者の生存期間中央値が2年を超えることは稀です5,6。これらの統計は、TNBCに対する新しい治療戦略への切実かつ未充足のニーズを強調しています。

腫瘍微小環境（TME）は、乳がんの進行と免疫逃避において極めて重要な役割を果たしています。腫瘍関連マクロファージは、TME内で最も豊富に存在する免疫細胞の一つであり、近年、自然抗腫瘍免疫の重要な媒介者として認識されています7,8,9。従来、TAMは炎症促進的な「M1」型と腫瘍促進的な「M2」型に分類されてきましたが、この二分法的なモデルでは、マクロファージの不均一性の実態を十分に捉えることはできません。むしろ、TAMは動的な機能スペクトラムを占めており、TME内の多様な生化学的シグナルに応じて進化します。この複雑な環境において、がん細胞はさまざまな免疫逃避戦略、特に「don't eat me（私を食べるな）」シグナルの過剰発現を通じて、マクロファージの活性を積極的に妨害します。この文脈において、CD47/SIRPα軸は、最初に同定された自然免疫チェックポイントでした6,10。そして最近では、CD24が新規かつ強力な抗食作用シグナルとして浮上しています11,12。CD24は、糖鎖が豊富に付加された小型のムチン型糖タンパク質であり、グリコシルホスファチジルイノシトール結合を介して細胞膜に固定されています13。生理的条件下ではさまざまな免疫細胞系譜で発現していますが、乳がん、卵巣がん、膵がん、大腸がんを含む固形腫瘍で頻繁に過剰発現しています14。腫瘍細胞上のCD24は、マクロファージに発現している抑制性受容体であるシアリ酸結合免疫グロブリン様レクチン10（Siglec-10）と結合します。この相互作用により、Siglec-10の細胞質領域にある免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ITIM）ドメインのリン酸化が誘発され、SHP-1およびSHP-2ホスファターゼが活性化されて、下流の食作用シグナルが抑制されます11。モノクローナル抗体を用いたCD24/Siglec-10相互作用の遮断は、マクロファージによるCD24発現ヒト腫瘍の食作用を強力に増強することが示されています。また、我々の最近の研究では、マウスのトリプルネガティブ乳がんモデルにおいて、乳がん細胞のCD24aをノックアウトすると、マクロファージの食作用に対する感受性が高まることが示されました9。

抗体依存性細胞貪食（ADCP）は、抗体がマクロファージに腫瘍細胞の貪食を誘導する重要なメカニズムである15,16。腫瘍発現抗原に結合すると、抗体のFc領域がマクロファージ上のFcγ受容体（FcγR）と結合し、細胞内シグナル伝達カスケードが誘発され、最終的に細胞骨格の再編成、ファゴサイトティックカップの形成、および標的細胞の取り込みに至る17。

本研究では、抗体によって誘導される乳がん細胞のマクロファージによる食作用を測定するためのタイムラプス生細胞イメージングプロトコルを開発し、検証しました。この手法では、健康なヒトドナーから得られた末梢血単核細胞（PBMC）由来のマクロファージを使用し、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）で分化させた後、リポポリサッカライド（LPS）およびインターフェロンガンマ（IFN-γ）で刺激します。フローサイトメトリー分析により、刺激後のCD11b⁺集団においてCD80のアップレギュレーションが確認され（図 1）、古典的に活性化された表現型であることが裏付けられました。この活性化状態は、強力な抗体介在性食作用能を付与するため、抗体依存性細胞食作用（ADCP）の評価に適しています。GFPタグ付きCD24陽性乳がん細胞を標的細胞として用い、共培養前に治療用抗CD24モノクローナル抗体でオプソニン化します。食作用イベントは、制御された環境条件下で自動顕微鏡を用いて16時間の期間にわたって記録されます。動的な可視化と並行して定量的な評価を可能にするため、同一の共培養条件下で別のエンドポイントアッセイを行い、内部に取り込まれなかった標的細胞を除去した後に食作用の厳密な測定を行います。本プロトコルは、抗CD24抗体によって介在されるADCPを評価するための、標準化され、再現性があり、視覚的に情報量の多いプラットフォームを提供します。重要な点として、タイムラプスイメージングと補完的なエンドポイントベースの定量戦略を統合することで、食作用のキネティクス（速度論）と程度の同時評価が可能になります。この手法は、他のマクロファージ標的の免疫療法ターゲットの研究にも適応可能です。本プロトコルは、がん細胞の表面抗原に対する治療用モノクローナル抗体によって介在されるADCPの評価に最適です。また、候補抗体の比較スクリーニング、用量反応特性の解析、および「don't-eat-me」シグナルの遮断（例：CD47–SIRPα）の影響を含むFc–FcγR結合のメカニズム研究に適しています。本アッセイは一次ヒトマクロファージを使用するため、臨床開発前にドナー間の個体差を評価する必要があるトランスレーショナル研究にも適しています。

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図1. 末梢血単核細胞から誘導し、IFN-γ/LPSで刺激したマクロファージの作製およびフローサイトメトリーによる検証。上パネル：健康なドナーから、すべての試薬を20°C ± 2°Cに予備平衡させ、Ficoll溶液を用いて20°Cで400 × g、30分間の密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（PBMC）を分離する。分離したPBMCを、100 ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を添加したImmunoCult-SF培地で7日間培養し、マクロファージへの分化を誘導する（Day 0–7）。なお、Day 5に培地を補充する。Day 8に、分化したマクロファージを100 ng/mLのIFN-γおよび1 µg/mLのLPSで48時間刺激する（Day 8–10）。その後、細胞をフローサイトメトリー解析に供する。下パネル：マクロファージのフローサイトメトリー解析。細胞をCD11b-FITC、CD80-PE、およびCD206-PerCP-Cy5.5からなる表面パネルで染色し、死細胞を除外するため、データ取得前にDAPIを添加した。ゲーティング戦略：まず生細胞（DAPI⁻）をゲートし、次にCD11b-FITC対FSC-AプロットでCD11b⁺を同定してマクロファージであることを確認した。その後、生きたCD11b⁺イベントをCD80対CD206ドットプロットで解析し、IFN-γ/LPS刺激によって誘導されたCD80⁺CD206⁻集団を確認した。右：CD11b-FITC対FSC-Aの代表的なドットプロットであり、ゲートされた細胞の99.8%がCD11b⁺であり、マクロファージであることが確認されたことを示している。左：CD11b⁺細胞の大部分がCD80⁺CD206⁻ゲート（Q1: 95.2%）内にあり、適用した刺激条件下で期待される前炎症性表現型であることを示している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

本手法を適用する際は、いくつかの制約を考慮する必要があります。第一に、PBMC由来マクロファージにおけるドナー間の個体差が、食作用の結果に大きなばらつきをもたらす可能性があるため、複数のドナー（n ≥ 3）を使用し、プールした結果と併せて個々のドナーデータを報告することを推奨します。第二に、2D共培養形式は腫瘍微小環境を再現していないため、臨床的な推論を行う前に、3Dモデルまたはin vivoモデルで結果を検証する必要があります。第三に、16時間のイメージングウィンドウでは初期の食作用イベントは捉えられますが、抗原提示や二次的な免疫活性化などのより長期的なプロセスは反映されません。したがって、リアルタイムイメージングとエンドポイント定量化を組み合わせて使用することで、ADCP測定の解釈可能性と再現性の両方を高める相補的なフレームワークが得られます。

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プロトコル

本プロトコルでは、健康なドナーの血液サンプルから得られた初代マクロファージを使用します。サンプルの収集および処理は、中国医科大学の施設審査委員会（IRB）のガイドラインに従って実施されました。

1. PBMC由来マクロファージの調製

注意：ヒト血液を用いるすべての手順は、施設内のIRB（例：CMUH IRB）の承認を得て実施してください。採血前に、健康なドナーからインフォームドコンセントを得てください。

注意：すべてのヒト血液製剤は、ユニバーサル・プリコーションを用い、バイオセーフティーレベル2の条件下で取り扱ってください。

  1. 血液採取
    1. 健康なドナーから全血を採取し、10 mLのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）コート済みバキュテイナー管に回収する。
  2. 血液の希釈
    1. 全血を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺-free）で1:1の比率で希釈する（例：全血 10 mL + PBS 10 mL）。
    2. 転倒混和を3〜5回行う。
      注：PBSは使用前に氷上で保持すること。低温に保つことで、処理中の細胞生存率の維持に役立つ。
  3. 密度勾配層の形成
    1. コニカルチューブ内で、希釈した血液をFicoll–Paque PLUSの上に液量比2:1 (v/v) で慎重に重層する（例：15 mLチューブに血液 8 mLをFicoll 4 mLの上に、または50 mLチューブに血液 30 mLをFicoll 15 mLの上に重層する）。
    2. 重層前に、希釈血液とFicoll–Paque PLUSの両方を 20°C ± 2°C に平衡化させる。
    3. Ficoll–Paque PLUSは使用の少なくとも30分前に4°Cの保存庫から出すか、20°C ± 2°C の恒温水槽で短時間加温する。
    4. 冷えた試薬を使用しないこと。Ficollの密度は 20°C ± 2°C で校正されており、温度が逸脱すると分離効率とPBMCの回収率が低下する。
      注：チューブを45°に傾け、界面を明確に保つために、壁面に沿ってゆっくりと血液をピペッティングする。Ficoll層を乱さないこと。
  4. 遠心分離
    1. ブレーキをオフにした状態で、20°C、400 × g で30分間遠心分離する（図1）。
      注：ブレーキをかけると密度勾配が乱れ、PBMCの回収率が低下する。
  5. PBMCの回収
    1. セロロジカルピペットを用い、上の血漿層や下のFicoll層を乱さないように、バフィーコート層（血漿層とFicoll層の間の白色の界面）のみを慎重に吸引する。
    2. 回収した層を新しい50 mLコニカルチューブに移す。
  6. PBMCの洗浄
    1. 50 mLコニカルチューブ内で、PBSを加えて全量を 25 mL にする。
    2. 適切な遠心分離とバランス調整を行うため、50 mLチューブを使用する。
    3. 300 × g で10分間遠心分離する。
  7. 赤血球の溶血
    1. 上清を捨てる。
    2. セロロジカルピペットで穏やかにピペッティングし、ペレットが完全に分散し凝集塊が見えなくなるまで、5 mLの赤血球（RBC）溶血バッファーで再懸濁する。
    3. 室温で5分間インキュベートする。
      注意：均一な溶血を確実にするために完全な分散が必要だが、PBMCを損傷させる可能性があるため、激しいピペッティングやボルテックス処理は避けること。赤血球溶血バッファーによるインキュベーションは5分を超えないようにすること。長時間さらすとPBMCの生存率が低下する場合がある。
  8. PBMCのペレット化
    1. 500 × g で5分間遠心分離し、PBMCをペレット化させ、溶血した赤血球の残渣を除去する。
  9. 最終再懸濁
    1. 上清を捨てる。
    2. ペレットを 5 mL の ImmunoCult-SF マクロファージ培地で再懸濁する。
      注：標準的な条件では、全血 10 mL から通常 1.5–2.0 × 107 個のPBMCが回収される。

2. マクロファージ分化（0〜7日目）

注：単球由来の分化マクロファージを接着によって選択するため、組織培養（TC）処理されていないペトリ皿を使用してください。非接着性のリンパ球は、その後の培養過程で洗浄により除去されます。

  1. 0日目：細胞播種
    1. 細胞数をカウントし、1 × 107 個のPBMCを非TC処理済みの10 cmペトリ皿に播種する。
    2. 100 ng/mL M-CSFを添加したImmunoCult-SFマクロファージ培地を用いて、全量を10 mLにする（M-CSFストックを、使用直前に完全培地に直接添加し、緩やかに転倒混和させて調製する）。
      注：ドナーによるPBMC回収量の変動に対応するため、1 × 106 cells/mLの播種密度を基準として、プロトコルを比例的に調整することが可能である。
  2. インキュベーションおよびモニタリング
    1. 加湿インキュベーター内、37°C、5% CO₂でインキュベートする。
    2. 浮遊した単球クラスターの形成と、接着細胞の出現を毎日モニタリングする。
      注：分化が進むにつれて、単球は徐々にサイズが大きくなり、クラスターを形成する。一部の単球はプレートに接着し始める。このステップでの操作は不要である。
  3. 5日目：培地の追加
    1. 接着したマクロファージを乱さないよう注意しながら、100 ng/mL M-CSFを添加した新鮮なImmunoCult-SFマクロファージ培地5 mLを皿に緩やかに加える。
    2. さらに2日間（7日目まで）培養を継続する。
      注意：機械的な刺激は分化効率や細胞収量に影響を及ぼす可能性があるため、新鮮な培地は皿の壁面に沿って緩やかに添加すること。
      注：マクロファージの分化を促進するオートクリン/パラクリン因子を保持するため、培地の全交換は避けること。
  4. 7日目：形態学的評価
    1. 倒立顕微鏡下でマクロファージの分化効率を確認する。
    2. 接着細胞は、大きく扁平で不規則な形状をしており、偽足が観察されるという、マクロファージ特有の形態を示す。
    3. 7日目には、十分に分化したマクロファージが観察されるはずである。
      注意：7日目の形態学的評価は、その後のフローサイトメトリーによる検証のための重要な前提条件となる。顕微鏡下で十分に分化したマクロファージが明確に観察され、マクロファージ形態を持つ接着細胞の割合が高いほど、分化効率が高いことを示す（特徴的な形態を持つ接着マクロファージが約70%のコンフルエンシーに達していることが、分化成功の指標とされる）。接着細胞がまばらである場合、細胞が主に円形である場合、または形態学的な分化が不十分な培養物は、信頼性の高いフローサイトメトリーの結果を得られない可能性が高いため、刺激および染色のステップへ進めてはならない。

3. マクロファージの分極化（8〜10日目）

  1. 条件培地の回収および清澄化
    1. 8日目に、接着したマクロファージを乱さないように、培養皿から15 mLの培地を慎重に吸引し、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移す。
    2. 回収した培地を400 × gで5分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化する。
    3. 清澄化した上清を次ステップのために回収しておく。
  2. インターフェロンガンマ（IFN-γ）およびリポポリサッカライド（LPS）刺激
    1. 清澄化した15 mLの上清を新しい滅菌チューブに移し、100 ng/mL IFN-γおよび1 µg/mL LPSを添加する。
    2. 気泡を導入しないように、緩やかなピペッティング（5～10回）で十分に混ぜ、サイトカインを均一に分散させる。
    3. サイトカインを添加した15 mLの培地すべてを元の培養皿に戻す。この際、接着したマクロファージを乱さないよう、内壁に沿って緩やかにピペッティングする。
    4. 37°C、5% CO₂条件下で48時間（8日目から10日目まで）インキュベートする。
      注：オートクリン/パラクリン因子を保持するため、条件（使用済み）培地を利用すること。IFN-γとLPSの組み合わせは、マクロファージを前炎症性表現型に分極させるために使用される。本プロトコルで用いたIFN-γ（100 ng/mL）およびLPS（1 µg/mL）の刺激条件下では、マクロファージは、活性化した前炎症状態と一致する伸長した葉状仮足などの特徴的な形態変化に加え、CD11bおよびCD80の発現を示す。
      警告：LPSは曝露により炎症反応を引き起こす可能性のある生物活性内毒素であるため、適切な実験室安全手順に従って取り扱うこと。

4. フローサイトメトリーによるIFN-γおよびLPS刺激マクロファージの炎症性表現型マーカーの確認

  1. 細胞の回収
    1. フェノタイプ解析のため、10日目に分極化したマクロファージの一部を回収する。
    2. PBSで調製した10 mM EDTAを加え、37°Cで10～15分間インキュベートする。
    3. 穏やかにピペッティングして細胞を剥離させる。
      注意：細胞が依然として接着している場合は、37°Cでさらに30分間EDTAによるインキュベーション時間を延長し、再度穏やかにピペッティングを行う。細胞生存率と表面マーカーの整合性を維持するため、激しいピペッティングや機械的なスクレイピングは避けること。
  2. 抗体染色の準備
    1. CD11b（汎マクロファージ系譜マーカー）、CD80（炎症性マーカー）、およびCD206（炎症性フェノタイプ同定のための陰性除外マーカーとして使用される抗炎症性マーカー）に対する蛍光標識抗体で細胞を染色する。
  3. 染色手順
    1. 剥離したマクロファージ 5 × 105 個を、冷PBS 100 µLを含むフローサイトメトリーチューブに移す。
    2. CD11b-FITC、CD80-PE、およびCD206-PerCP-Cy5.5抗体を、それぞれ最終濃度 1 µg/mL になるように加える。
    3. 穏やかにピペッティングして細胞懸濁液を混ぜる。
    4. 遮光し、氷上で1時間インキュベートする。
    5. サンプルを 4°C、300 × g で1分間遠心分離する。
    6. 上清を注意深く吸引して除去する。
    7. 冷PBS 0.5 mLを加え、細胞ペレットを洗浄する。
    8. サンプルを 4°C、300 × g で1分間遠心分離する。
    9. 上清を捨てる。
    10. 細胞ペレットを冷PBS 200 µLで再懸濁する。
    11. DAPIを最終濃度 1 µg/mL になるように加える。
      注意：適切なアイソタイプコントロールおよび生存能染色剤（例：DAPIまたはViobility 405/452 Fixable Dye）を含めること。
  4. フローサイトメトリー解析
    1. フローサイトメーターを用いて染色済みサンプルを測定する。
    2. マクロファージ集団におけるCD11bおよびCD80の発現を確認する。
    3. 炎症性フェノタイプと一致するマーカー発現が確認された後のみ、食作用アッセイに進む。
  5. フローサイトメトリーのデータ収集と設定
    1. 装置の設定
      1. フローサイトメーターを以下のチャンネルで構成する：Pacific Blue/V450 (DAPI)、FITC (CD11b)、PE (CD80)、および PerCP-Cy5.5 (CD206)。
      2. 定義された親ゲート内で、サンプルあたり10,000イベントを収集するように収集パラメータを設定する。
    2. しきい値およびゲインの校正
      1. x軸にFSC、y軸に1つの蛍光色素チャンネルを表示する4つのドットプロットを開く。
      2. 各蛍光色素に対応するアイソタイプコントロール抗体で染色した細胞を用意する。
      3. アイソタイプコントロールサンプルを測定する。
      4. 各チャンネルのゲインを調整し、アイソタイプコントロール集団がログスケール上の 101 以下に位置するようにする。
      5. このしきい値を用いてバックグラウンド信号レベルを定義する。
        注意：バックグラウンドと特異的信号を確実に分離させるため、101 から 101·5 のログスケール範囲を使用する。
    3. コンペンセーション
      1. 1.5 mLマイクロセントリフュージチューブにコンペンセーションビーズを1滴加える。
      2. 対応する蛍光標識抗体を最終濃度 1 µg/mL になるように加える。
      3. 遮光し、氷上で30分間インキュベートする。
      4. 400 × g で1分間遠心分離する。
      5. 上清を捨てる。
      6. ビーズを冷PBS 200 µLで再懸濁する。
      7. シングルカラーコントロールを測定する。
      8. スペクトラルコンペンセーションを適用し、蛍光色素のスピルオーバーを補正する。
    4. ゲーティング戦略
      1. 生存細胞の選択
        1. y軸に Pacific Blue/V450 (DAPI)、x軸に FSC を表示する。
        2. DAPI陰性イベント（101 以下）をゲートして生存細胞を選択する。
      2. マクロファージの同定
        1. 生存細胞集団を親ゲートに設定する。
        2. y軸に FITC (CD11b)、x軸に FSC を表示する。
        3. CD11b⁺ イベント（101 以上）をゲートする。
      3. 炎症性フェノタイプの同定
        1. CD11b⁺ 集団を親ゲートに設定する。
        2. y軸に PE (CD80)、x軸に PerCP-Cy5.5 (CD206) を表示する。
        3. 両軸の 101.5 でクアドラントゲートを適用する。
        4. 左上象限 (Q1) の CD80⁺CD206⁻ 細胞を同定する。
  6. 判定基準
    1. CD11b⁺ 親ゲート内の細胞の 90% 以上が CD80⁺CD206⁻ であることを確認する。
    2. このしきい値が達成された場合にのみ、食作用アッセイに進む。
    3. サンプルがこの基準を満たさない場合は、PBMCの分離、M-CSF分化、および IFN-γ/LPS 刺激を繰り返す。

5. 抗体依存性食作用アッセイ

注：アッセイのセットアップ前に、がん細胞においてGFPが安定して発現していることを確認してください。また、アッセイ前に標的細胞におけるCD24の発現を確認してください。最適な性能を得るには、CD24陽性率が50%–100%のがん細胞を使用してください。本プロトコルで使用するMDA-MB-468細胞は、CD24陽性率が100%です。

  1. マクロファージの播種
    1. IFN-を播種するγおよび、ステップ4で検証したLPS刺激マクロファージを2で × 105 24ウェル組織培養プレートの1ウェルあたりの細胞数。
    2. プレートを〜でインキュベートします。 37°C 5% COを含む静止条件下で₂ 細胞を接着させるため、12～16時間（図2A).
      注意：次へ進む前に、マクロファージが強固に接着していることを確認してください。接着が不十分なマクロファージは、イメージング中に脱落し、結果に影響を及ぼす可能性があります。
  2. がん細胞の調製
    1. CD24陽性GFP標識乳がん細胞（MDA-MB-468）を、コンフルエンシー 70%～80%まで培養する。
    2. 培地を吸引除去する。
    3. 細胞単層をPBSで1回洗浄する。
  3. がん細胞の剥離
    1. 培養皿にPBSで調製した10 mM EDTAを加えます。
    2. 細胞を以下の条件でインキュベートします。 37°C 5～10分間。
    3. 緩やかなピペッティングによって細胞を剥離させ、完全に回収してください。
      注意：細胞の剥離にトリプシンを使用しないでください。酵素消化により細胞表面からCD24が切断され、抗体の結合能が損なわれる可能性があります。
  4. がん細胞の回収および計数
    1. 剥離した細胞を遠心管に回収する。
    2. 細胞を300 x gで遠心分離する × 5分間遠心分離する。
    3. 上澄みを捨てる。
    4. 細胞ペレットを完全RPMI培地で再懸濁してください。 培地
    5. 生存細胞数を計測する。
  5. がん細胞の抗体オプソニン化
    1. がん細胞を密度2で再懸濁する × 105 完全RPMI 0.5 mLあたり〇〇 cells/mL 培地
    2. 最終濃度がになるように、抗CD24モノクローナル抗体を添加する。 1 µg/mL.
    3. 抗体が均一に分布するように、緩やかなピぺッティングで細胞懸濁液を混ぜ合わせます。
    4. 細胞を～でインキュベートします。 37°C 静止条件下で30分間。
      注：抗体依存性食作用の陰性対照として、同濃度のアイソタイプ一致IgGコントロールを含めてください。
  6. 共培養の準備
    1. オプソニン化後、細胞を洗浄しないでください。
    2. 細胞表面の抗体コーティングを維持するため、直ちに共培養に移行してください。
  7. 共培養系の構築
    1. 1を添加する × 105 マクロファージを含む各ウェルに、抗体でオプソニン化したGFPタグ付き乳がん細胞を添加する。
    2. エフェクター細胞とターゲット細胞の比率を2:1に維持してください。
      注：エフェクター細胞と標的細胞の比率は、実験設計に基づいて調整してください。細胞間の接触頻度を高め、食作用の検出能を向上させるには、記載された2:1よりも高いマクロファージ対がん細胞比（例：3:1または5:1）を使用してください。

figure-protocol-1
図2抗体依存性細胞 phagocytosis（細胞貪食）のタイムラプスイメージング。 (A) 共培養システムおよびタイムラプスイメージング設定の概略図。イメージングパラメータは、合計取得時間16時間（97フレーム）にわたり10分間隔とし、10を× 位相差およびGFPチャンネルを備えた対物レンズ。(B) 1時間から16時間までの代表的なタイムラプス画像。マクロファージによるGFP陽性がん細胞の内部移行を特徴とする、時間経過に伴う食作用のイベントを示している。黄色の破線円は代表的な食作用イベントを強調している。位相差チャンネルでは、取り込まれたがん細胞がマクロファージ細胞質内の位相明像の細胞内構造として観察される（白矢印）。GFPチャンネルでは、マクロファージ内に局在する蛍光により内部移行が確認される。(C) 0、1、4、および16時間における代表的な食作用イベントの拡大図。マクロファージによるGFP標識がん細胞の取り込みの連続的なプロセスを示している。画像シーケンスは、マクロファージ介在性の食作用イベントが明確に可視化されている代表的なものを選択した。白矢印は、標的細胞と相互作用し、それらを内部移行させているマクロファージを示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. タイムラプスイメージング（自動生細胞イメージングシステム）

注：アッセイの前に、Lionheart自動ライブセルイメージングシステムおよびGen5自動ライブセルイメージングソフトウェアを使用してイメージングプロトコルを設定してください。正確なセットアップ、最適なパフォーマンス、および安全な使用を確保するため、イメージングシステムを操作する前に適切なトレーニングを受けてください。

  1. 装置の準備
    1. イメージングシステム、環境制御モジュール、およびCO2インキュベーターの電源を入れてください。₂ イメージングの少なくとも1時間前にガスを供給すること。
    2. 自動ライブセルイメージングソフトウェアの環境制御パネルを開きます。
    3. 温度を〜に設定する 37°C および CO₂ 5%まで。
    4. チャンバー温度が〜以内に安定したことを確認してください。 ± 0.2°C およびCO₂ 5.0%で ± プレートにロードする前に0.1%にする。
  2. プレートのセットアップ
    1. 24ウェルプレートをイメージングシステムのイメージングチャンバー内に設置してください。
  3. 初期設定
    1. 自動ライブセルイメージングソフトウェアのタスクマネージャーを開きます。
    2. [イメージャー・マニュアルモード]を選択します。
    3. [今すぐキャプチャ]をクリックして、イメージングパラメータを初期化します。
    4. 10を選択してください× 目的
    5. フィルター設定としてマイクロプレートを選択してください。
    6. 自動ライブセルイメージングソフトウェアのプレートライブラリから、24ウェルプレートを選択してください。
  4. ピント調整および画像設定
    1. 位相差コントラストチャンネルを選択してください。
    2. 代表的なウェル（例：A1）を選択します。
    3. タイムラプス撮影を開始する前に、オートフォーカスを有効にしてください。
    4. カメラアイコンを使用して画像をキャプチャします。
    5. 細胞の形態とフォーカスの品質を確認する。
    6. [プロセス/分析]に移動します。
    7. [画像セットから実験を作成] を選択して、実験を設定します。
  5. タイムラプス撮影パラメータ
    1. ［手順］設定パネルを開きます。
    2. 温度を〜に設定する 37°C およびCO₂ 5%まで。
    3. [Start Kinetic]で、ランタイムを16:00:00に設定します。
    4. イメージング間隔を0:10:00に設定してください。
    5. 総リード数を97に設定します。
    6. 初期の食作用イベントを捉えつつ、時間分解能と光毒性のバランスを維持するため、イメージング間隔を10～15分に設定してください。
  6. イメージングチャネル構成
    1. チャンネル1を位相差に設定します。
    2. チャンネル2をGFP（励起 469/35、蛍光 525/39）に設定してください。
    3. 10を選択してください× 最適な視野と分解能を得るための対物レンズ。
    4. 照明、積分時間、およびゲインを［自動］に設定するか、手動で調整してください。
    5. 信号の飽和を避けるため、GFPの露光時間は通常100～300 msに設定してください。
    6. すべてのウェルに同一のイメージング設定を適用してください。
  7. イメージングポジションの設定
    1. [ビーコンの定義]メニューを開きます。
    2. Zスタック撮影を無効にする。
    3. モンタージュ撮影を無効にする。
    4. 単一の焦点面でイメージングを行う。
    5. 顕微鏡アイコンを使用して、各ウェル内で代表的な重複しない領域を選択し、イメージング位置を手動で定義します。
    6. すべてのタイムポイントにおいて、同一の撮像位置を維持してください。
    7. 1ウェルあたり少なくとも4〜6つの視野を選択してください。
  8. タイムラプス撮影
    1. [再生]をクリックして、自動タイムラプスイメージングを開始します。
  9. データの書き出しと可視化
    1. データ取得後、保存された実験ファイルを開きます。
    2. イメージングポジションを選択してください。
    3. タイムラプスデータをMP4形式でエクスポートします。
    4. [プロセスツール]を開きます。
    5. 必要に応じて［画像デコンボリューション］を適用し、可視化を向上させ、代表的な食作用イベントを特定してください。
      注意：タイムラプスイメージングは定性的な可視化のみに使用してください。貪食されていないGFP陽性がん細胞がマクロファージと重複したり、一時的に結合したりすることで、偽陽性信号が生じる可能性があります。定量分析は、別のエンドポイントアッセイを用いて実施してください。

7. エンドポイントにおける食作用の定量化

  1. 非内部化した細胞の除去
    1. 同一の共培養条件下でアッセイを行う。
    2. 4 hで実験を終了させる。
    3. 培地を除去する。
    4. PBSで調製した10 mM EDTAを加える。
    5. 37°Cで5 min間インキュベートする。
    6. PBSで穏やかに洗浄し、非内部化したGFP陽性細胞を除去する。
    7. 新鮮なマクロファージ用培地を加える。
  2. 定量のための画像取得
    1. 位相差およびGFPチャネルを用いて画像を取得する。
    2. 1ウェルあたり少なくとも4～6視野を撮影する。
    3. 1条件につき最低3ウェルを解析する。
  3. 食作用イベントの定義
    1. 細胞境界内に完全に包囲されたGFP陽性シグナルを持つマクロファージを特定する。
  4. 画像解析
    1. ImageJソフトウェアで画像を開く。
    2. Cell Counterプラグインを使用する。
    3. マクロファージの総数をカウントする。
    4. 内部化したGFP陽性細胞を含むマクロファージの数をカウントする。
  5. 食作用指数の算出
    1. 以下の式で算出する：figure-protocol-2
    2. ブラインド法で解析を行う。
    3. 少なくとも3回の独立した実験で再現性を確認する。
  6. データの提示
    1. 代表的なタイムラプス画像を時系列で提示する（図2Bおよび図2C）。
    2. 代表的なエンドポイント画像を提示する（図3Aおよび図3B）。

figure-protocol-3
図3エンドポイント解析による抗体依存性マクロファージ貪食能の定量化。 (A) GFP標識乳がん細胞と4時間共培養し、その後EDTA処理により非 engulfment 細胞を除去したマクロファージの代表的な位相差像およびGFP蛍光像。マクロファージおよび内部に取り込まれたGFP陽性標的を同定するため、位相差チャネルとGFPチャネルを統合した。ImageJのCell Counterプラグインを用い、マクロファージ（カウンター0）およびGFP陽性の貪食マクロファージ（カウンター1）を計数した。IgGコントロール群では貪食現象は観察されなかったが、抗CD24モノクローナル抗体処理ではマクロファージ内に明確な細胞内GFP陽性シグナルが認められ、能動的な貪食が行われていることが示された。スケールバー = 200 µm(B) 食細胞指数の定量。食細胞指数は、マクロファージ全数に対する、GFP陽性細胞を取り込んだマクロファージの割合として定義した。抗CD24モノクローナル抗体は、IgGコントロールと比較して食細胞指数を有意に上昇させた（0.00 ± 0.00% 対 18.76 ± 4.01%、平均値 ± SD; 各群 n = 6領域; ***p < 0.001、Welchの不等分散t検定）。データは少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

PBMCからマクロファージの生成および分極が成功したことは、形態学的評価およびフローサイトメトリー分析によって確認されました（図1）。密度勾配遠心法で分離したPBMCをM-CSF補充培地で培養した結果、7日目までにマクロファージ特有の形態を持つ接着細胞が得られました。IFN-γおよびLPSによる刺激後、細胞は適用条件での活性化と一致する表現型を示しました。フローサイトメトリー分析では、ゲート内の細胞の99.8%がCD11b陽性であり、マクロファージへの効率的な分化が確認されました（図1）。CD11b陽性細胞のうち、大部分がCD80⁺CD206⁻画分に位置しており（95.2%）、指定の刺激条件下で分極が成功したことが示されました。これらの結果から、本プロトコルにより、期待されるマーカー発現プロファイルを持つマクロファージを安定して生成できることが確認されました。

タイムラプスイメージングにより、抗体依存性細胞貪食の直接的な可視化が可能となりました（

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ディスカッション

信頼性と再現性のある結果を得るためには、本プロトコルのいくつかのステップが極めて重要です。第一に、PBMC分離の質と純度が、マクロファージの回収量および分化効率に直接影響します。バフィーコート界面を維持するためには、希釈した血液をFicoll密度勾配の上に慎重に層状に重ねることと、ブレーキをオフにした状態で遠心分離することが不可欠です。赤血球の溶血が不十分であるか、あるいは溶血バッファーでのインキュベーション時間が長すぎると、PBMCの生存率が低下します。第二に、 phagocytosisアッセイの前に、フローサイトメトリーによって前炎症性マクロファージへの極性を確認する必要があります。CD80の発現が上昇していないマクロファージは、食細胞能が低下している可能性があり、抗CD24抗体による効果の解釈を妨げる原因となります。第三に、がん細胞の剥離方法が重要です。酵素消化により細胞表面からCD24が切断され、抗体の結合効率が低下する恐れがあるため、トリプシン処理は避けるべきです。表面抗原の完全性を維持できるEDTAを用いた剥離法が推奨されます。

このプロトコルは、異なる実験目的に合わせ...

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開示事項

著者は利益相反がないことを開示します。

謝辞

本研究は、台湾教育省（MOE）の高等教育芽生え計画（Higher Education Sprout Project）の枠組みにおける重点研究センタープログラムを通じて、中国医学大学の癌生物学・精密治療センター（Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University）より支援を受けました（CBPTC-PROJ-5-2）。

資金提供および学術的支援をいただいたCancer Biology and Precision Therapeutics Centerに感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) ストック溶液Sigma-Aldrich (または同等品)E7889 (または同等品)細胞剥離用の PBS 中 10 mM EDTA ワーキングソリューションの調製に使用
24ウェル組織培養プレート (TC処理済み)Corning (または同等品)3524食細胞作用アッセイ中のマクロファージとがん細胞の共培養に使用
抗ヒト CD206 抗体 (フローサイトメトリー用)BioLegend (または同等品)321122 (または同等品)代替マクロファージ表現型のマーカー
抗ヒト CD24 モノクローナル抗体Thermo Fisher Scientific (または同等品)MA1-91384 (または同等品)抗体依存性食細胞作用のためのがん細胞のオプソニン化に使用
環境制御チャンバー付き自動ライブセルイメージングシステム (例: Lionheart FX)Agilent Technologies (または同等品)BioTek Lionheart FX 自動顕微鏡制御された温度および 2 条件下での長期タイムラプスイメージングを可能にする
自動ライブセルイメージング用イメージングソフトウェア (例: Gen5)Agilent Technologies (または同等品)N/Aタイムラプスイメージングデータの取得および解析に使用
遠心分離機 (スイングバケットローター)Thermo Fisher Scientific (または同等品)Multifuge X4R Pro (TX-1000 ローター) (または同等品)PBMC 分離および細胞洗浄ステップに使用
2 インキュベーター (37°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (または同等品)Forma Direct Heat 2 インキュベーター (または同等品)細胞培養のための生理的条件を維持
2 ガス供給装置（レギュレーター付き）Agilent Technologies (または同等品)N/Aインキュベーターおよびイメージングシステムの環境制御用に 2 を供給
コニカルチューブ (15 mL および 50 mL)Corning (または同等品)352070 (または同等品)PBMC 分離、洗浄、および遠心分離ステップに使用
EDTA コーティング血液採取チューブ (バキュテイナー)BD Biosciences (または同等品)367863 (または同等品)ドナーからの全血サンプルの採取に使用
Ficoll-Paque PLUSCytiva (または同等品)17144003 (または同等品)PBMC 分離用の密度勾配培地
フローサイトメーター (例: FACSCanto II)BD Biosciences (または同等品)BD FACSCanto II マクロファージの表現型解析に使用
コンペンセーションビーズ (フローサイトメトリー用)Biolegend (または同等品)424602シングルカラーコンペンセーションコントロールに使用
FITC 抗ヒト CD11b 抗体 (フローサイトメトリー用)BioLegend (または同等品)101205 (または同等品)マクロファージの同定に使用するマーカー
PE 抗ヒト CD80 抗体 (フローサイトメトリー用)BioLegend (または同等品)375410 (または同等品)活性化マクロファージ表現型に関連するマーカー
GFP 発現乳がん細胞株 (MDA-MB-468)ATCC (または同等品)HTB-132 (または同等品)食細胞作用アッセイに使用する標的細胞。GFP により可視化が可能
ImmunoCult-SF マクロファージ培地STEMCELL Technologies (または同等品)10961 (または同等品)マクロファージ分化に使用する無血清培地
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific (または同等品)12100046がん細胞の培養および再懸濁に使用
アイソタイプコントロール抗体 (IgG)Bio X Cell (または同等品)BE0297 (または同等品)抗体依存性食細胞作用アッセイの陰性コントロール
リポ多糖 (LPS)Sigma-Aldrich (または同等品)L2630 (または同等品)IFN-γ と併用してマクロファージを活性化させる刺激剤
組換えヒトインターフェロンガンマ (IFN-γ)STEMCELL Technologies (または同等品)78020 (または同等品)マクロファージ活性化に使用するサイトカイン
組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF)STEMCELL Technologies (または同等品)78057 (または同等品)マクロファージ分化に使用する増殖因子
パステゥールピペットまたはセラロジカルピペットJetbiofil (または同等品)GSP010010 (または同等品)PBMC 分離および細胞培養中の液体操作に使用
PBS (Ca2+-/Mg2+- free)Thermo Fisher Scientific (または同等品)BP399-500 (または同等品)細胞洗浄および希釈ステップに使用するバッファー
シャーレ (100 mm, 非–組織培養処理)Corning (または同等品)430591接着選択によるマクロファージ分化に使用
赤血球 (RBC) 溶血バッファーBioLegend (または同等品)420301 (または同等品)PBMC 分離中の赤血球除去に使用
Viobility 405/452 Fixable DyeMiltenyi Biotec (または同等品)130-130-404 (または同等品)フローサイトメトリー解析中の細胞生存率の評価に使用
DAPISigma-Aldrich (または同等品)D9542 (または同等品)フローサイトメトリーにおける死細胞の除外に使用

参考文献

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