方法論記事

マウス脳領域における形態学的観察およびRNA・タンパク質共抽出のための半球分離プロトコル

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DOI：

10.3791/71465

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2026年9月1日

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1College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, 2The Transvascular Implant Instrument Research Institute, 3The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 4College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、マウスの脳を二等分します。片方の半球を形態学的染色に用い、もう片方をRNAおよびタンパク質抽出に使用します。この戦略により、動物の使用数を削減し、3R原則に準拠し、個体間の変動を最小限に抑えることができます。

要約

日常的な神経科学研究において、形態学的染色と核酸・タンパク質の分子アッセイには通常、別々の実験動物が必要となり、動物の使用数が増えるため、動物福祉の3R原則に整合しません。本プロトコルでは、単一の個体から形態学的解析と分子解析をペアで実施可能にする、マウス脳組織の組織分配ワークフローを確立します。0.9%生理食塩水で経心腔的に灌流した後、脳を2つの半球に二分します。一方の半球は、免疫組織化学および免疫蛍光染色のために4%パラホルムアルデヒドで固定します。ショ糖-エチレングリコール-ポリビニルピロリドン（PVP）溶液に保存された切片は、最大7年間、信頼性の高い染色品質を維持します。対側の半球は、RNAとタンパク質の同時抽出のために-80 °Cで凍結保存し、その収量は下流のqPCRおよびWestern Blotに十分な量となります。9–10 mgの嗅内皮質パンチサンプルで検証した結果、この方法はRNAまたはタンパク質を個別に抽出する場合よりも収量は低くなりますが、回収されたバイオ分子は分子検出に十分な量で維持されます。このワークフローにより、動物の使用数が削減され、ペアとなる形態学的解析と分子解析の間の個体差が排除されます。本手法は、マウス脳の特定の亜領域における多次元的なプロファイリングのための、実用的な組織調製法を提供します。

概要

神経科学研究はここ数十年の間に飛躍的に拡大し、ヒトの脳生理学、神経疾患の発症、および治療法開発を制御する主要なメカニズムが解明されてきました。神経科学的探究において、動物モデルは不可欠なままであり、神経発達、生理機能、および病理学的プロセスを探索するための、制御可能で再現性のあるプラットフォームを提供しています。マウスを用いた実験的操作および組織学的観察により、研究者は神経シグナル伝達、神経回路の形成、および神経と行動の関連性を特徴づけることが可能です。技術的な進歩と並行して、動物実験の倫理が中心的な懸念事項となっています。3Rの原則（Replacement：代替、Reduction：削減、Refinement：改善）は、現在、すべての動物研究における世界的な標準規格となっており1,2、研究者は信頼性の高い実験結果を維持しつつ、動物の使用を最小限に抑えることが求められています。

条件付きノックアウトシステムなどの革新的なツールにより、マウス脳の特定のサブ領域内における精密な遺伝子操作が可能になりました3。こうした進歩により、学習、記憶、および気分を調節する海馬のCA1、CA3、およびDGなどのマイクロスケールの脳区画に関する集中的な研究が促進されています4。これら微小な脳領域の高次機能を解明するには、形態学的、転写レベル、およびタンパク質レベルでの協調的な測定が必要です。しかしながら、組織量が極めて少ないため、並行的なマルチインデックス検出において大きな技術的障害となっています。

形態学的染色、RNA定量、およびタンパク質の免疫検出は、神経科学における3つの標準的な主要リードアウトです。従来の研究設計では、これら3種類の検査を完了するために、マウスの個体を3つの別個のコホートに分ける必要がありました。この手法は動物の使用数を大幅に増加させ、個体間の生物学的変動を著しく導入するため、組織学的データセットと分子データセットの間の比較可能性を低下させます。1匹の動物から一致した形態学的信号および分子信号を取得する統合ワークフローは、これら2つの重大な制限を大幅に解消し、3RのReduction（削減）原則により適切に準拠することになります。

ここでは、マウス脳組織における再現性のある脳半球分離プロトコルを報告します。全身的な生理食塩水灌流後、全脳を2つの半球に分割します。一方の半球は形態学的検査のために固定し、対側半球はRNAとタンパク質の同時共抽出のために凍結保存します。ショ糖-エチレングリコール-ポリビニルピロリドン（PVP）保護緩衝液で固定・保存した組織は、免疫組織化学および免疫蛍光染色のための安定した高品質な染色シグナルを最大7年間維持します。我々は、海馬や前頭前皮質などの一般的に調査される領域よりも組織重量が軽い、わずか9–10 mgの嗅内皮質パンチを用いてこの方法を検証しました。この微小な組織サンプルの検出に成功したことは、視床下部や扁桃体などのより小さな脳亜領域もこのワークフローに適合することを示しています。本プロトコルで得られるRNAおよびタンパク質濃度は、単一目的の専門的な抽出キットよりも低くなりますが、単離されたバイオ分子は、標準的な下流のqPCRおよびWestern blot解析をサポートするのに十分な品質を備えています。このワークフローにより、動物の使用数を削減でき、形態学的解析と分子解析のペア間における個体差を排除することが可能です。本手法は、マウス脳の離散的な亜領域における多次元プロファイリングのための、実行可能な組織調製法を提供します。

プロトコル

倫理声明

本研究で行われたすべての動物実験は、中華人民共和国の大連医科大学動物ケアおよび使用委員会（ラット実験：承認番号AEE18026、マウス実験：承認番号AEE24261）の承認を得て実施されました。すべての実験プロトコルは、実験動物に関する倫理ガイドラインに従って実施され、動物実験における3R原則（Reduction：削減、Replacement：代替、Refinement：改善）を完全に遵守しました。全実験過程を通じて、動物の苦痛とストレスを効果的に軽減するために厳格な措置が講じられました。また、実験動物の数は、統計分析結果の信頼性と妥当性を確保するために必要な最小限の量に制限されました。本プロトコルで使用した試薬、消耗品、および装置の完全なリストについては、材料表をご参照ください。

1. 実験動物の準備および経心腔灌流手術

  1. 麻酔および術前準備
    1. 本プロトコルでは、特定無菌（SPF）グレードの成体雄性Sprague-DawleyラットまたはC57BL/6マウスを使用する。動物は、温度制御された（22 ± 2 °C）環境で、12時間の明暗サイクルで飼育する。滅菌した飼料と水は、自由摂取（ad libitum）とする。
    2. 麻酔を導入するため、ラットには80 mg/kg、マウスには50 mg/kgの用量でナトリウムペントバルビタールを腹腔内投与する（図1参照）。
  2. 経心腔灌流の手順
    1. 麻酔した動物を、手術台の上に仰臥位で固定する。
    2. 直剪刀を用いて、剣状突起から恥骨結合まで正中線に沿って腹壁を切開する。心臓を完全に露出させるため、胸壁の側方を両側から切開する。
    3. 氷冷した0.9%生理食塩水を用いて、一定の流速で灌流を行う。ラットでは10–15分かけて100–150 mL、マウスでは5–8分かけて20–30 mLとする。
  3. 脳の採取および半球の分離
    1. 灌流完了後、大型の手術用鋏で動物を断頭する。正中線に沿って頭皮を切開し、頭蓋骨を露出させる。
    2. 滅菌スパチュラを用いて、頭蓋腔から脳を慎重に持ち上げる。全脳を速やかに、氷上に置いた滅菌シャーレに転写する。
    3. 滅菌済みRNaseフリーのカミソリを用いて、矢状縫合に沿って脳を左右の半球に左右対称に分割する。
    4. 固定のため、左半球を直ちに10 mLの氷冷4%パラホルムアルデヒド溶液を含む15 mL遠心チューブに移す。右半球はラベル付きのRNaseフリー凍結保存チューブに移し、液体窒素で急速凍結させ、RNAおよびタンパク質抽出まで-80 °Cで保存する。

2. 脳組織の固定、切片作成および長期保存

  1. 固定および脱水
    1. 左半球を4%パラホルムアルデヒド溶液に完全に浸し、4 °Cで24時間、組織を固定する。固定完了後、脳半球を30%スクロース溶液を含む15 mL遠心チューブに移し、4 °Cで組織を脱水する。
    2. 脳組織がチューブの底に沈むまで、24時間ごとに30%スクロース溶液を交換する。
  2. 凍結切片の作製
    1. 脱水した脳半球をスクロース溶液から取り出し、滅菌フィルターペーパーで余分な液体を静かに拭き取る。
    2. OCTコンパウンドを用いて、脳半球をクライオスタットの試料台に固定する。
    3. クライオスタットを用い、脳を冠状面に30 µmの厚さで連続切片として切断する。連続切片を、滅菌済みの0.01 M PBSを含む24ウェルプレートに回収する。
  3. 脳切片の長期保存
    1. 脳切片用凍結保護保存液をあらかじめ調製する：100 mLの0.01 M PBSに、2 gのPVP400、60 gのスクロース、および60 mLのエチレングリコールを加える。すべての成分が完全に溶解するまで室温で撹拌し、使用まで4 °Cで保存する。

3. TRIzolを用いたRNA抽出

  1. 組織のホモジナイズおよび相分離
    1. 超微細ホモジナイザーを用い、1 mLのTRIzol試薬中で嗅皮質組織をホモジナイズし、ホモジネートを氷上で15分間インキュベートする。4 °Cで8,000 × gにて5分間遠心分離する。
    2. 200 µLのクロロホルムを加え、10秒間ボルテックスする。4 °Cで5,600 × gにて15分間遠心分離する。その後、上層の水相をRNaseフリーチューブに移す。500 µLのイソプロパノールを加え、-20 °Cで一晩インキュベートしてRNAを沈殿させる。再度遠心分離を行う。
  2. RNAの沈殿、洗浄および品質評価
    1. 上清を捨て、1 mLの75%エタノールでRNAペレットを洗浄する。4 °Cで5,600 × gにて5分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを10分間風乾させ、20 µLのDEPC処理水にRNAを溶解させ、10分間静置する。
    2. 分光光度計を用いてRNA濃度および純度（A260/A280）を測定する。以降の解析まで、RNAを-80 °Cで保存する。

4. Minuteキットを用いた全タンパク質抽出

  1. 組織の溶解および均質化
    1. スピンカラムと回収チューブを氷上で冷却しておく。超微細ホモジナイザーを用いて、100 µLの細胞溶解バッファー中で組織を均質化する。ホモジナイザーをさらに100 µLの細胞溶解バッファーで洗浄し、溶解液を合わせる。
  2. タンパク質の回収および定量
    1. 均質化物をスピンカラムに移し、室温で2分間インキュベートする。
    2. 11,000–14,300 × gで2分間遠心分離する。
    3. 遠心分離後、直ちに回収チューブを氷上に置き、スピンカラムを廃棄する。BCAアッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。

5. 嗅内皮質（9–10 mg）からのRNAおよびタンパク質の同時抽出

  1. 実験前準備および試薬調製
    1. すべての抽出ステップにおいて、DNA/RNA/タンパク質キットを使用する。認定済みのRNase-freeおよびDNase-freeの消耗品のみを使用すること（図2参照）。
    2. ライシスバッファーは使用直前に調製する。キット付属のライシスバッファーにプロテアーゼ阻害剤カクテルを1:100の希釈率で添加する。
  2. 組織溶解および相分離
    1. -80 °Cで保存していた凍結右脳半球を取り出し、氷上に置く。滅菌済みのRNase-freeパンチを用いて、標的の脳領域から9–10 mgの組織を採取する。
    2. 電気式組織ホモジナイザーを用い、目に見える組織断片がなくなるまで、氷上で組織を完全にホモジナイズする。完全な溶解を確実にするため、ホモジネートを氷上で10分間インキュベートする。
    3. ホモジネートに、キット付属の分離試薬を200 µL添加する。チューブを30秒間激しくボルテックスし、室温で3分間インキュベートする。4 °Cで8,000 × g、15分間遠心分離し、完全に相分離させる。
  3. RNA精製および溶出
    1. RNase-freeピペットチップを用いて、上層の水相を慎重に回収する。回収した水相を新しい1.5 mL RNase-freeチューブに移す。回収した水相に等量の100%エタノールを添加し、混合する。
    2. 混合液700 µLを、キット付属のRNA精製カラムに移す。室温で5,600 × g、1分間遠心分離する。
    3. キット付属のRNA洗浄バッファー1を500 µL、カラムに添加する。室温で5,600 × g、1分間遠心分離する。
    4. 次にキット付属のRNA洗浄バッファー2を500 µLカラムに添加し、再度遠心分離する。カラムメンブレンから残留エタノールを完全に除去するため、空のカラムを室温で8,000 × g、2分間遠心分離する。
    5. カラムを新しいRNase-free 1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。RNase-free water（60 °Cに予熱したもの）を30–50 µL、カラムメンブレンの中央に直接添加する。室温で2分間インキュベートする。室温で8,000 × g、1分間遠心分離し、RNAを溶出させる。
  4. タンパク質沈殿および溶解
    1. RNA抽出用の水相を除去した後、元のチューブに残っている有機相と中間相にイソプロパノールを750 µL添加する。タンパク質を沈殿させるため、混合物を-20 °Cで30分間インキュベートする。
    2. 4 °Cで8,000 × g、10分間遠心分離する。上清を捨て、チューブ底部のタンパク質ペレットをそのまま保持する。
    3. タンパク質ペレットに95%エタノールを1 mL添加する。チューブを短時間ボルテックスしてペレットを洗浄する。4 °Cで8,000 × g、5分間遠心分離し、上清を捨てる。この洗浄ステップをさらに2回繰り返す。
    4. ペレットが半透明になり、残留エタノールが見えなくなるまで、室温で5–10分間、タンパク質ペレットを風乾させる。
    5. 乾燥したペレットに5–10% SDS溶液を50–100 µL添加する。チューブを1分間激しくボルテックスし、氷上で10分間インキュベートしてタンパク質を完全に溶解させる。4 °Cで8,000 × g、5分間遠心分離する。上清を最終的なタンパク質抽出液として回収する。

6. 免疫組織化学（IHC）染色

  1. 切片の前処理および内因性酵素の不活性化
    1. -20 °Cの凍結保存液から脳切片を取り出す。ガラスニードルを用いて、0.01 M PBS (pH 7.4)を入れた24ウェルプレートに切片を移す。
    2. シェーカーを用い、室温で0.01 M PBSによる洗浄を3回（各5分間）行う。
    3. 内因性ペルオキシダーゼ活性を不活性化するため、3%過酸化水素ペルオキシダーゼブロッキング剤を用いて室温で10分間インキュベートする。ブロッキング後、再度洗浄工程を繰り返す。
  2. 透過処理および非特異的ブロッキング
    1. 細胞膜の透過性を高めるため、0.5% Triton X-100中で室温にて30分間、シェーカーを用いてインキュベートする。その後、洗浄工程を繰り返す。
    2. 4%ウシ血清アルブミン中で室温にて30分間インキュベートし、続いて非特異的染色抑制剤を用いて室温でさらに30分間インキュベートする。
  3. 一次抗体および二次抗体のインキュベーション
    1. 一次抗体を1% BSA溶液で、以下の最適化された希釈倍率で希釈する：doublecortin (DCX, 1:4000)、neuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000)、ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000)、およびglial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000)。
    2. 希釈した一次抗体溶液を各ウェルに200 µLずつ加え、切片が完全に浸るようにする。
    3. ビオチン標識二次抗体を各ウェルに200 µLずつ加える。室温で30分間インキュベートする。
    4. 0.01 M PBSで3回（各5分間）洗浄する。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体を各ウェルに300 µLずつ加える。室温で30分間インキュベートし、インキュベーション後に再度洗浄工程を繰り返す。
  4. 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) 発色処理およびカバーガラス封入
    1. DAB作業溶液を各ウェルに200 µLずつ加える。光学顕微鏡下で発色反応を観察する。
    2. ガラスニードルを用いて、切片をゼラチンコートガラススライドにマウントする。室温でスライドを完全に風乾させる。
    3. 段階的なエタノール系列（50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100%エタノール、各5分間）で脱水し、続いてキシレンで2回（各5分間）透徹させる。

7. 免疫蛍光（IF）染色

  1. 切片の前処理および透過処理
    1. -20 °Cの凍結保存液から脳切片を取り出す。切片を0.01 M PBS (pH 7.4)を含む24ウェルプレートに移す。
    2. シェーカーを用い、室温で0.01 M PBSで3回洗浄する（1回あたり5分）。
    3. 0.5% Triton X-100中で、室温で30分間シェーカーを用いてインキュベートする。
    4. 透過処理後、0.01 M PBSで3回洗浄する（1回あたり10分）。
  2. ブロッキングおよび一次抗体インキュベーション
    1. 4% BSAと非特異的染色抑制剤を含むブロッキング溶液中で、室温の加湿チャンバー内で1時間インキュベートする。
    2. ブロッキング溶液を吸引して除去する。一次抗体を1% BSA溶液を用いて最適濃度に希釈し、希釈した一次抗体溶液300 µLを各ウェルに加える。加湿された遮光チャンバー内で4 °Cで一晩インキュベートする。
  3. 二次抗体インキュベーション
    1. 翌日、遮光下で室温にて1時間温める。一次抗体溶液を回収し、遮光下のシェーカーで0.01 M PBSを用いて3回洗浄する（1回あたり10分）。
    2. 蛍光標識二次抗体を、メーカーの推奨希釈倍率に従い1% BSA溶液で希釈する。二次抗体溶液300 µLを各ウェルに加える。遮光下、室温で1～2時間インキュベートする。
    3. 遮光下で0.01 M PBSを用いて5回洗浄する（1回あたり5分）。

8. 定量リアルタイムPCR（qPCR）分析

  1. RNAからのgDNA除去および逆転写
    1. 逆転写キットを用い、反応系20 µLあたり1 µgの全RNAを用いて逆転写を行い、cDNAを合成する。サーマルサイクリングプログラムは、メーカーの推奨に従い、25 °Cで5分、50 °Cで15分、85 °Cで5分とし、その後4 °Cで保持する。
    2. 合成したcDNAをRNase-free waterで1:5に希釈する。qPCR増幅まで、cDNAを-20 °Cで保存する。
  2. qPCR系の調製および増幅
    1. 専用のRNase-free PCRフード内で、氷上でqPCR反応系を調製する。20 µLの反応系は、qPCR Master Mix 10 µL、フォワードプライマー (10 µM) 0.4 µL、リバースプライマー (10 µM) 0.4 µL、希釈したcDNAテンプレート 2 µL、RNase-free water 7.2 µLで構成される。
    2. 以下のプログラムを用いてqPCR増幅を行う：初期変性を95 °Cで30秒、続いて95 °Cで10秒および60 °Cで30秒を40サイクル繰り返し、最後に60 °Cから95 °Cまで5秒ごとに0.5 °Cずつ上昇させ解離曲線分析を行う。

9. ウェスタンブロット

  1. タンパク質定量および試料調製
    1. BCAアッセイの結果に基づき、5–10% SDS溶液を用いてタンパク質抽出物を等濃度に希釈する。
  2. SDS-PAGE電気泳動およびタンパク質転写
    1. 標準的な分子生物学プロトコルに従い、10% SDS-PAGE分離ゲルおよび5% スタッキングゲルを調製する。
    2. 各ウェルに20 µgの総タンパク質をロードする。濃度勾配ロード実験では、1ウェルあたり15 µg、30 µg、および45 µgのタンパク質をロードする。
    3. タンパク質マーカーが分離ゲルに進入するまで80 Vで30分間電気泳動を行い、その後、ブロモフェノールブルー染料がゲルの下端に達するまで120 Vで60–90分間電気泳動を行う。
    4. 以下の順序（陰極から陽極へ）で転写サンドイッチを組み立てる：スポンジ、ろ紙、ゲル、PVDF膜、ろ紙、スポンジ。ゲルと膜の間に気泡が残っていないことを確認する。
    5. 氷上で300 mAの定電流で90分間、ウェット転写を行う。
  3. メンブレンブロッキングおよび抗体インキュベーション
    1. 転写完了後、PVDF膜をTBSTバッファーで短時間すすぐ。非特異的結合部位をブロックするため、メンブレンを5% BSA中で室温で2時間、シェーカーを用いてインキュベートする。
    2. 一次抗体を最適化された濃度で5% BSA溶液に希釈する。メンブレンを一次抗体溶液とともに4 °Cで一晩、シェーカーを用いてインキュベートする。
    3. 翌日、シェーカーを用いてTBSTバッファーで3回（1回10分間）メンブレンを洗浄する。
    4. ホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) 標識二次抗体を、製造元の推奨希釈倍率で5% 脱脂スキムミルク溶液に希釈する。メンブレンを二次抗体溶液とともに室温で2時間、シェーカーを用いてインキュベートする。
    5. 二次抗体のインキュベーション後、TBSTバッファーで3回（1回10分間）メンブレンを洗浄する。メンブレンをECL基質溶液とともに暗所で1–2分間インキュベートする。

結果

RNA濃度の評価、アガロースゲル電気泳動、およびqPCR

図に示したように、DNA/RNA/protein kitを用いて、嗅結皮質（9–10 mg）パンチから全RNAとタンパク質を共抽出しました。TRIzol（RNA）またはタンパク質抽出キットで処理した並行サンプルをコントロールとして使用しました。このプロトコルによる収量は235 ± 12 ng µL⁻1 RNAであり、TRIzolよりも36 %低い結果となりました（p < 0.05）（Figure 3A）。それにもかかわらず、アガロースゲルでは明瞭な28Sおよび18S rRNAバンドと5Sシグナルが認められ、RNAが分解されていないことが示されました（Figure 3B）。CD86、IL-1β、TNF-α、およびIL-6のqPCRでは、単一で対称的な解離曲線が得られ（Figure 3C）、同グループにおいてより低いCt値が観察されました（Figure 3D）。ただし、これらの差異がRNA品質の向上によるものか、あるいは抽出効率によるものかを判断するには、RNA整合性解析を含むさらなる検討が必要です。RNA収量はTRIzol抽出で得られた量よりも低かったものの、明確な28Sおよび18S rRNAバンドと特異的なqPCR増幅曲線が得られたことから、抽出されたRNAはダウンストリームのqPCR解析に十分な品質であることが示されました。

タンパク質濃度の評価、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析

RNAのデータと一致して、二重抽出プロトコルで得られた全タンパク質濃度は、タンパク質抽出キットよりも低かった（p < 0.05）。それにもかかわらず、ウェスタンブロットでは、調べたすべての標的について、免疫反応性バンドが著しく強く現れた（図 4A）。RNA定量結果と同様に、RNA-タンパク質共抽出プロトコルで回収される全タンパク質は、専用の単一目的タンパク質キットよりも少なく、これはCBB全タンパク質染色で確認できる（図 4B–C）。ハウスキーピングタンパク質であるβ-Tubulinは、両方の抽出法において、同等の信号強度で明確かつ安定したバンドを示した。低発現のULKタンパク質も、共抽出サンプルにおいて正常に検出された。特筆すべきは、PSD-95、p-ERK、およびp-NFκB p65のバンド信号が、単一タンパク質抽出キットと比較して、共抽出群で著しく強かったことである。15 µgから45 µgまでタンパク質を段階的にロードしたところ、両群のすべての検出標的において、用量依存的なバンドの勾配が生成された。総じて、二重抽出ワークフローの全タンパク質収量は低いものの、そのタンパク質品質は標準的なウェスタンブロット分析に十分であり、全体的な検出性能は従来の単一タンパク質抽出キットに劣らない。

免疫組織化学および免疫蛍光染色

0.5～7年間保存した脳切片の免疫組織化学染色により、形態と繊維が維持されたDCX⁺新生ニューロン、AVP⁺分泌細胞、およびMAP2/NeuN⁺ニューロンの強力な標識が認められた（図5A）。5～7年間保存した切片の免疫蛍光染色の結果、GFAP⁺アストロサイト、Iba-1⁺ミクログリア、およびFosB⁺活性化ニューロンが明確に示された（図5B）。0.5～7年間保存した代表的な切片において、テストした条件下で検出可能な免疫組織化学的および免疫蛍光的シグナルが保持されていた。したがって、この保存液は組織の完全性と抗原性を維持し、信頼性の高い長期保存を可能にする。

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図1脳の形態学的および分子的な検出のための、大脳半球分離統合ワークフロー。 この概略図は、齧歯類の経心腔生理食塩水灌流、摘出した全脳の正中線での二分、免疫組織化学（IHC）/免疫蛍光（IF）染色のための左半球の固定および凍結切片作製、ならびにその後の同時RNA-タンパク質共抽出、qPCR、およびウェスタンブロット分析のための対側半球の凍結保存を含む、実験パイプラインの全工程を示している。マウスのイラストレーションはすべてJimeng AIによって作成された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2凍結 rodent 脳組織からの RNA およびタンパク質の同時共抽出ワークフロー この図は、凍結した脳半球からの標的組織のパンチ採取、組織溶解および三相分離、qPCR用のRNA精製および溶出、ならびにウェスタンブロット検出用のサンプル調製のためのタンパク質沈殿、洗浄、溶解という一連のステップを示しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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図 3: マイクロスケールのラット嗅内皮質サンプルを用いたRNA収量、RNA完全性、およびqPCR互換性の評価。(A) 共抽出キットとTRIzol法で得られたRNA濃度の定量値（平均値 ± SEM）。(B>) 両抽出群において、28Sおよび18S rRNAのバンドが保持されていることを示すアガロースゲル電気泳動図。(C) 単一の融解曲線により、標的炎症性遺伝子および参照遺伝子であるGAPDHの特異的増幅が確認された。(D>) 2つの抽出法において、同一のRNA投入量で検出された炎症性遺伝子のCt値。*p < 0.05, **p < 0.01 vs TRIzol群。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4RNA/タンパク質共抽出プロトコルにより回収したタンパク質のウェスタンブロットによる評価。 (A) 勾配タンパク質ローディング (15/30/45 µg) シナプスタンパク質およびシグナル伝達タンパク質の用量依存的なバンド信号を示している。（B) CBB全タンパク質染色をローディングコントロールとして用いたULK1高分子量タンパク質の検出。(C2つの抽出ワークフロー間における標的タンパク質の等量負荷ウェスタンブロット比較。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図50.5～7年間保存された遊離浮遊脳切片の免疫組織化学的および免疫蛍光染色 (A) 200倍で撮影した明視野免疫組織化学染色の顕微鏡写真× および400× 倍率。マウス組織サンプルではDCXおよびAVP染色を行い、ラット組織サンプルではMAP2およびNeuN染色を行った。（B）ラット組織サンプルから得られた代表的な免疫蛍光染色像。 GFAPはアストロサイトを、IBA-1はミクログリアを標識し、FOSBは神経活動を示します。 このパネルに示すすべての免疫蛍光染色の実験は、神経細胞マーカーの発現および細胞内局在を評価するために、ラット検体を用いて行われました。 200倍の顕微鏡写真× 倍率  この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

マウス研究において、形態学的解析と核酸・タンパク質アッセイでは、調製手順が異なるため、通常は別々の動物サンプルを必要とします。これにより、使用動物数が増加し、個体間の生物学的変動が導入されるため、組織学的データセットと分子データセットの比較可能性が低下する可能性があります。これらの制限を克服するため、我々は同一の動物から組織学的データと分子データの両方を取得できるワークフローを開発しました。

このワークフローの中心的な設計は、0.9% 生理食塩水による経心臓灌流後5,6に脳組織を半球ごとに割り当てることです。一方の半球は免疫組織化学および免疫蛍光染色のために 4% パラホルムアルデヒドで固定し、もう一方の対側半球は、その後の RNA-タンパク質共抽出、qPCR、および Western blotting のために −80 °C で保存します。ただし、選択したリードアウトは、両脳半球間で完全に比較可能ではない可能性があります。げっ歯類の脳において構造的および機能的な側性化が報告されており、このような半球間の差異は、反対側で解析を行った際にばらつきをもたらす可能性があります7,8。したがって、研究者は研究目的に応じて、常に同じ脳半球から組織を選択する必要があります。

この手法の大きな利点は、固定された遊離脳切片を長期的に保存できることです。30% sucroseで脱水後、30 µmの冠状切片をsucrose-エチレングリコール-PVP保存液に保存します。先行研究により、sucrose–エチレングリコール–PVP凍結保護溶液は、長期保存における組織の形態および抗原性の維持に寄与することが示されています9,10。しかし、数年以上にわたる保存期間を評価した研究はほとんどありません。当研究室のデータはこれらの知見を拡張するものであり、最大7年間保存した代表的な切片において、試験条件下で検出可能な免疫組織化学的および免疫蛍光信号が保持されていました。これらの観察結果は、回帰的分析やフォローアップ実験のために、遊離脳切片を数年間保存することが可能であることを裏付けています。

特筆すべきは、このワークフローは、単一の凍結脳半球からRNAとタンパク質を同時に共抽出できるというもう一つの大きな利点を提供することである。この共抽出プロトコルで得られるRNAおよびタンパク質の量は、従来の単一標的抽出法よりもわずかに少ないが、得られたバイオマテリアルは、堅牢なqPCRおよびWestern blot検出を行うのに十分な量である。極めて重要な点として、共抽出により、同一の組織サンプルから転写産物量とタンパク質量を定量化できるため、個別の検体処理から生じる生物学的ばらつきが排除され、非常に一貫性のある統合的な分子プロファイリングが可能になる11,12。さらに、このアプローチでは約 9–10 mg という少量の組織量で済むため、サンプル量が限られている脳の特定の領域に特化したサブポピュレーションの解析に適している。

これらの大きな利点がある一方で、本手法には認めるべきいくつかの制限事項もあります。第一に、RNAおよびタンパク質の回収量が比較的少ないため、大規模なタンパク質精製や高深度のRNAシーケンシングなど、大量の核酸またはタンパク質を必要とする実験への適用が制限される可能性があります。第二に、切片の長期保存は最大7年間有効ですが、特定の不安定な抗原や核酸は長期間にわたって徐々に分解される可能性があり、染色強度や分子検出感度が低下するおそれがあります。第三に、本手法は現在マウスの脳組織に最適化されており、組織組成や構造的特性は種や臓器によって異なるため、他の組織や別の動物モデルに適用するには修正が必要な場合があります。最後に、5–10% SDSが、質量分析、酵素活性測定、タンパク質間相互作用研究13,14、およびその他のSDSに感受性のあるアプリケーションを妨げる可能性があります。したがって、追加の界面活性剤除去やバッファー交換の手順が必要になる場合があります。

結論として、この半球割当ワークフローにより、動物の使用数と個体間変動を抑えつつ、同一個体から形態学的解析と分子生物学的解析を同時に行うことが可能となります。本ワークフローは、特に組織量が限られている場合に、組織学的解析と分子生物学的解析のペアリングが必要な研究において有用です。また、切片を長期保存できるため、遡及的解析や標準化されたサンプルアーカイブの構築を容易にし、小領域の脳サンプルを使用することで領域特異的な検討を可能にします。主な制限事項としては、RNAおよびタンパク質の回収量の低下、潜在的な半球間非対称性、マウスの脳組織への限定、およびSDS感受性のあるアプリケーションとの適合性の低さが挙げられます。今後の研究では、生体分子の回収率の最適化、他の組織や種におけるワークフローの検証、および追加の分子標的における長期安定性の評価を行う必要があります。

開示事項

著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼす可能性のある、既知の競合する金銭的利益または個人的な関係がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、CQ Liu教授に授与された遼寧省教育局（一般研究プロジェクト JYTMS20230571）および大連医科大学の2023年「健康とウェルネスのための中西医統合」イニシアチブ（H0.2XY2023KY10）からの助成金、ならびにYK Liに授与された2025年遼寧省学部生イノベーション＆アントレプレナーシップ訓練プログラム（S202510161061）および大連医科大学の学部生革新的人材育成・教育改革基金（112307010209）による支援を受けて実施されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL RNaseフリーマイクロ遠心チューブAxygenMCT-150-C-S組織パンチの採取およびRNA/タンパク質抽出分画。
15 mL コニカル遠心チューブバイオフィルムCFT010150固定、ショ糖による脱水、および溶液の保存。
24ウェル細胞培養プレートNEST702001遊離浮遊脳切片の回収、染色、および長期保存
30% ショ糖溶液ラボにて調製提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。凍結切片作成前の固定済み脳半球の凍結保護。
4%パラホルムアルデヒド溶液BiosharpBL539A形態観察用に指定した脳半球の浸漬固定。
5× タンパク質ローディングバッファーBeyotime BiotechnologyDL101SDS-PAGE用のタンパク質試料の調製。
アガロースSolarbioカテゴリー：A8201アガロースゲル電気泳動によるRNA整合性の評価
抗ダブルコーティン抗体Abcamab18723ダブルコルチン免疫組織化学用一次抗体。
抗ERK抗体BeyotimeAB2014全ERKウェスタンブロッティング用一次抗体。
抗GFAP抗体Abcamab10062グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）免疫蛍光染色のための一次抗体。
抗Iba1抗体和光NCNP24イオン化カルシウム結合アダプター分子1（ICAM1）免疫蛍光染色のための一次抗体。
抗NeuN抗体MilliporeA60神経細胞核抗原染色のための一次抗体。
抗NF-κBκB p65抗体HUABIOET1603-12NF-用一次抗体κB p65ウェスタンブロッティング
抗リン酸化ERK抗体BeyotimeET1610-13リン酸化ERKウェスタンブロッティング用一次抗体。
抗PSD95抗体HUABIOET1602-20PSD95ウェスタンブロッティング用一次抗体。
抗ULK1抗体HUABIOET1704-63ULK1ウェスタンブロッティング用一次抗体。
抗-β$\alpha$-チューブリン抗体ABclonalAC021ウェスタンブロッティング用ローディングコントロール一次抗体。
抗退色蛍光封入剤BeyotimeP0126-5免疫蛍光染色切片用封入剤。
ビオチン-ストレプトアビジンペルオキシダーゼ検出キット福州邁新生物科技有限公司KIT-9720DAB免疫組織化学染色のための二次検出系。
ウシ血清アルブミンQiansheng Biotech Co., Ltd.QO3000免疫染色およびウェスタンブロッティング用ブロッキングバッファー。
C57BL/6マウスLiaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD4週齢のC57BL/6マウスマウス脳組織採取に使用する実験動物（含まれる場合）。
化学発光イメージングシステム株式会社クリンクスサイエンスインストゥルメンツChemiScope 6200 Touchウェスタンブロット化学発光シグナルの検出。
共焦点レーザー走査顕微鏡Leica Microsystems CMS GmbHSN: 591974免疫蛍光染色切片の画像取得。
凍結保護剤保存液ラボで調製該当なし遊離浮遊脳切片の長期保存における −20 °C.
クライオスタットLeicaCM1950〜の調製 30 μm 脳の冠状断切片。
DAB発色基質キットシグマSLBP7387V免疫組織化学における発色展開。
DAPI核染色溶液クーラーバーSL7100免疫蛍光染色のための核対比染色。
デジタル光学顕微鏡Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.モデル NE910+FL-900DAB発色のモニタリングおよび明視野染色切片のイメージング。
DNase IVazymeR223-01逆転写前の残留ゲノムDNAの除去。
ドンキー抗ウサギIgG, 488標識Thermo Fisher ScientificA21206免疫蛍光染色のための蛍光二次抗体。
ロバ抗ウサギIgG, 594標識Abcamab150076免疫蛍光染色のための蛍光二次抗体。
E.Z.N.A. DNA/RNA/Protein KitOmega Bio-TekD3892-01
電気泳動用電源Bio-Rad1645050アガロースゲル電気泳動およびSDS-PAGE用電源装置。
エチレングリコール国药集团化学试剂有限公司10009828凍結保護保存液の成分。
ゲルイメージングシステムClinx Science Instruments Co., Ltd.ChemiScope 6200 TouchRNA品質評価のためのアガロースゲル画像化。
ゼラチンコートガラススライドCITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD参照番号: 10127105P 部品番号: 80312-2101DAB染色した遊離脳切片の封入。
画像解析ソフトウェア米国国立衛生研究所ImageJ/Fijiウェスタンブロットバンドのデンシトメトリー分析および画像処理。
イソプロパノールSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.80109218有機相/界面画分からのタンパク質沈殿。
冷却遠心機（マイクロセントリフュージ）盐城凯特实验室设备有限公司TGL16MRNA/タンパク質抽出および洗浄ステップにおける遠心分離。
Minute Protein Extraction Kit発明するMS-026
中性バルサム封入剤 Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.、中国、上海カタログ番号 S30509、CAS 96949-21-2脱水したDAB染色の切片のカバーガラス封入。
OCT包埋剤サクラ4583固定済み脳半球の凍結切片作成用包埋剤。
光学qPCRプレートまたはチューブAxygenPCR-0208-CqPCR増幅用反応容器
パラフィルムamcorPM996長期的な切片保存のためのマルチウェルプレートの密封。
ペントバルビタールナトリウムHualan Bio57-33-0経心腔灌流前の麻酔剤。
シャーレBiosharpBS-90-D氷上での脳の取り扱いおよび脳半球の分離。
フェノール/グアニジニウムRNA抽出試薬SparkladeAC0101-BRNA抽出コントロール実験用の比較試薬。
ホスファターゼ阻害剤カクテルAPExBIOK1015-100タンパク質抽出時におけるリン酸化の保持
リン酸緩衝生理食塩水BiosharpBL601A洗浄バッファー、ショ糖溶液溶媒、および凍結保護剤溶媒。
ポリビニリデンフルオリド膜MilliporeIPVH08100ウェスタンブロット転写用メンブレン。
ポリビニルピロリドン K40シグマ9003-39-8凍結保存液の成分。
プロテアーゼ阻害剤カクテルBeyotimeP1045組織溶解時におけるタンパク質分解の抑制。
タンパク質抽出キット考案するMS-026全タンパク質抽出コントロール実験用コンパレーターキット。
リアルタイムPCRシステムアモルアレイMA6000定量PCR増幅および融解曲線分析。
ドデシル硫酸ナトリウムBioFroxx3250GR500タンパク質ペレットの溶解およびSDS-PAGEサンプルの調製。
滅菌済みカミソリブレードBiosharpBS-RB-11氷上での脳半球の分離および組織のトリミング。
ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体福州邁信生物科技有限公司KIT-9720DAB免疫組織化学染色用シグナル増幅・検出試薬
スクロースフーシ57-50-1凍結保護溶液および凍結保護保存液。
SYBR qPCRマスターミックスVazymeQ711-02定量PCR増幅。
移送装置Bio-Rad1703930SDS-PAGEゲルからメンブレンへのタンパク質のウェット転写
Tween 20含有Tris緩衝生理食塩水ラボで調製翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳対象のテキストを入力してください。ウェスタンブロット膜洗浄バッファー
Triton X-100Sinopharm9002-93-1免疫染色のための脳切片の透過処理
TrizolSparkladeAC0101-B
超高感度SP免疫組織化学検出キット（マウス/ウサギ一次抗体用）福州市邁信生物科技有限公司KIT-9720DAB免疫組織化学染色のための二次抗体／検出試薬。
ウィスターラットLiaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD280-320 g、雄ラット脳組織採取に使用する実験動物（該当する場合）。
キシレン国化集団化学試剤有限公司10023418カバーガラスをかける前に行うDAB染色スライドの透視処理。
中性バルサム封入剤 Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.（中国、上海）カタログ番号 S30509、CAS 96949-21-2脱水されたDAB染色切片の封入。
ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体福州邁信生物科技有限公司KIT-9720DAB免疫組織化学染色用信号増幅・検出試薬。
Triton X-100Sinopharm9002-93-1免疫染色のための脳切片の透過性処理
超高感度SP免疫組織化学検出キット（マウス/ウサギ一次抗体用）福州邁信生物科技有限公司KIT-9720DAB免疫組織化学染色のための二次抗体／検出試薬。
キシレンSinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.10023418カバーガラス封入前のDAB染色スライドの透視処理。

参考文献

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