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方法論記事

FFPEマウスサンプルにおける頭蓋顔面組織の多重蛍光mRNA の 現地ハイブリダイゼーション

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DOI：

10.3791/71475

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2026年5月8日

 ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

この記事について

サマリー

従来の in situ ハイブリダイゼーションでは、複雑な構造、高い背景、プローブ特異性の制限、感度のため、頭蓋顔面組織のmRNAを可視化するのに苦労しています。本プロトコルは、FFPEマウス胚頭蓋顔面組織における複数のmRNA標的を感度かつ特異的に検出するための多重蛍光RNA のin situ ハイブリダイゼーション法を記述し、従来の制限を克服します。

要約

頭蓋顔面の発達は、多様な専門化された細胞集団が複雑な組織構造内で相互作用し、正常な組織構造と機能を形成・維持する協調的な活動に依存しています。これらの細胞が互いに、また局所的な微小環境とどのようにコミュニケーションを取っているかを理解することは、その形成と恒常性を調節する分子メカニズムを定義するために不可欠です。これらのプロセスの障害は、単独または症候群性疾患の一部として、歯の無形成、口蓋裂、唇裂などの先天性頭蓋顔面疾患を引き起こすことがあります。RT-PCRのような定量的技術は高い感度とダイナミックレンジを提供しますが、均質化された組織からRNAを抽出する必要があり、空間的・細胞的な文脈が失われます。これは特に転写産物の細胞起源が解明できない異質な頭蓋顔面組織にとって重要な制約です。マルチプレックス蛍光RNA のin situ ハイブリダイゼーションは、組織構造を維持しつつ複数のmRNA転写体を感度かつ特異的に検出することで、この制約を克服します。この高度なアプローチにより、細胞レベルでの遺伝子発現の正確な局在化が可能となり、頭蓋顔面生物学における発生過程や疾患メカニズムの空間的調節について貴重な洞察を提供します。

概要

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)は、その高い感度と広いダイナミックレンジにより、遺伝子発現解析のゴールドスタンダードとされています。しかし、均質化された組織からRNAを抽出する必要があるため、空間的および細胞的な文脈が失われます。この制限は特に胚発生期の頭蓋顔面組織のような異質な組織で問題であり、検出された転写本の細胞源が解明できないためです。RNA インシチュ ハイブリダイゼーション(ISH)は、1968年にジョセフ・ギャルとメアリー・ルー・パーデューによって開拓された技術であり、この制約を克服し、完全な組織構造内でmRNA発現を局在させることを可能にします。それにもかかわらず、従来のRNA ISHは技術的に要求が高く、RNAの完全性を保つために最適な組織固定とサンプル準備に大きく依存します。これらの課題は、強力な化学物質や長時間の処理を伴う脱石灰処理を必要とする高度に石灰化組織でさらに悪化し、RNAの劣化を引き起こします。したがって、複雑な細胞タイプの混合からなる頭蓋顔面組織のRNA ISHは、慎重な最適化と技術的専門知識を必要とし、時間がかかり、最適でない染色のリスクも大きいです。mRNA発現の可視化は、非常に複雑な構造と組成を持つ歯組織でさらに顕著です。歯はエナメル質、象牙質、セメント質、周囲の骨などの鉱物化成分に加え、歯髄や歯周靭帯などの柔らかい組織で構成されています。これらの組織には、歯の発達に重要な役割を果たす多様な細胞タイプが存在します。これらの機能は信頼性の高い信号検出を確保するために慎重な標準化が必要です。その結果、このプロトコルは歯の形成の発生期および出生後の段階における遺伝子発現の調査に特に適しています。

空間RNA検出には、プローブを用いた増幅RNAFISH 5,6,7,8,9、ハイブリダイゼーション連鎖反応FISH 6、単一分子RNA FISH10、交換反応によるシグナル増幅FISH 5、MERFISH11やseqFISH12のような高多重化FISHプラットフォームなど、空間RNA検出のための多重蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)技術が存在します。13. これらの中で、多重蛍光RNA ISH 7,8,9は、2つの隣接するZプローブ設計による単一のRNA分子を検出する高感度から広く使われています。この設計では、2つの隣接するプローブが標的配列にハイブリダイズして信号増幅を開始する必要があります。この二重認識設計により特異性が大幅に向上し、オフターゲット信号が低減されます。この手法は2〜4個の標的の多重検出(同様の技術で最大12個以上の標的まで拡張可能)をサポートし、組織形態を保持し、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)7,8,9、新鮮凍結組織、選定された石灰化組織と互換性があり、頭蓋顔面や歯科の発達で見られる複雑なサンプルに適しています。この手法は標準化され、再現可能で、確立されたプローブライブラリによって支えられ、広く検証されているため、さまざまな研究室でアクセス可能で信頼性の高い結果が保証されています。

多重蛍光RNA ISHは、同じ転写産物の異なる領域を標的とする複数のプローブと、強化されたシグナル増幅を組み合わせて、低存在量や部分分解されたmRNAに対しても高感度かつ特異的な検出を可能にします14,15。多重蛍光RNA ISHは脱鈣骨サンプルに成功裏に適用されており、複雑な頭蓋顔面組織での利用も報告されています7,8,9;しかし、この文脈での応用を説明する詳細なステップバイステッププロトコルはまだ報告されていません。

頭蓋顔面構造は、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、アメロ芽細胞、歯芽細胞、線維芽細胞、幹細胞、免疫細胞、血管、感覚ニューロンなど多様な細胞種を持つ複雑な組織構造から成り、これらの空間的に協調された相互作用は組織形成、機能、再生、免疫学的保護に不可欠です4.したがって、これらの組織における局在遺伝子発現の研究は極めて重要であり、多重蛍光RNA ISHはこの種の解析における先進的なアプローチを示しています。

本研究では、RNAスコーププローブと技術を用いた多重蛍光RNA ISHを複雑な頭蓋顔面組織の研究に応用する方法を説明しました(図1)。さらに、RNAの完全性を保ち、高品質で空間的に解析可能な遺伝子発現解析を可能にする最適化されたFFPE切片ワークフローを確立しました。

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プロトコル

すべての動物処置は、国立衛生研究所(NIH)国立児童健康・人間発達研究所動物ケア・利用委員会(IACUC)の動物研究プロトコル#24-031のもとで承認されました。

1. タイミング付き交配と胚組織採取

  1. タイミングを決めた交尾を決めましょう。
    1. 健康で繁殖可能なオスとメスのMus musculusを午後遅くにペアにしましょう。翌朝、膣プラグの有無を確認してください。プラグが観察される日を胚発生日(E)0.5と指定します。
  2. 妊娠中のメスを安楽死させてください。
    1. 望ましい発達段階で、施設の動物ケアガイドラインに従い、CO₂吸入後に子宮頸部脱臼を施して妊娠中のメスマウスを安楽死させます。
    2. マウスを無菌の吸収面に仰向けに置きます。腹部を切開部位に沿って70%エタノールで消毒します。
  3. 子宮角を露出させて隔離してください。
    1. 無菌外科用ハサミで腹部の正中切開を行い、顕微外科用ハサミで腹膜壁を開けて子宮角を露出させます。
    2. 鈍い鉗子を使って子宮鎖を優しく外側に出してください。子宮組織を筋組に沿って解放し、卵管と子宮中央角の付着部を切断して胚を分離します。
  4. 胚全体を移植する。
    1. すぐに子宮鎖を胚を含む10cmのペトリ皿に移し、氷のように冷たく無菌の1×PBS(pH 7.4)を入れます。
  5. 個々の胚を解剖してください。
    1. 各胚を周囲の子宮、羊膜、絨毛膜から慎重に分離してください。
    2. 洗浄した胚を、氷のように冷たく滅菌されたPBSを含む新鮮な10cmの皿に移します。
  6. マウスの胚の頭部を解剖する。
    1. 滅菌手術用刃を使い、頭部を解剖し、氷のように冷たいPBSで一度だけ洗い流してからさらに処理します。
      注意:動物プロトコルに従い、望ましい発達段階で新生マウスを採取・解剖してください。

2. 組織の固定と処理

  1. ティッシュを直してください。
    1. 解剖した組織をすぐに10%中性緩衝ホルマリンに浸し、室温でシェイカーで一晩固定します。
      注:RNAの適切な保存は、in situハイブリダイゼーション解析の成功に不可欠です。多くの研究により、組織サンプルを10%中性緩衝ホルマリンに固定し、組織の特定のサイズや年齢に応じて6時間から48時間の間固定することが、RNA保存に信頼できる結果をもたらすことが多くの研究で示されています。初期の胚期(E12.5以下)では固定液の浸透が速く、過剰固定を防ぐために固定時間をそれに応じて短縮する必要があります。胚発生日17.5日目(E17.5)以降および出生後のサンプルにおいて、頭部に皮膚が存在し物理的なバリアとして機能するため、固定剤の浸透効率が低下することがあります。したがって、固定液の効率的な浸透を可能にするために、頭部全体から皮膚を取り除く必要があります。脱石化は、0.5% メタノールフリーホルムアルデヒドを含む0.5 M EDTA(pH 8.0)で4°C7で行うことができます。脱石灰の期間は迅速なマイクロCTスキャンで監視でき、石灰化の程度や特定の組織タイプに応じて調整されることがあります。E18.5胚の場合、通常24〜48時間で十分です。
  2. 組織をすすいで処理します。
    1. 固定液を除去し、PBSでサンプルを洗い流します。組織を70%エタノールに移し、4°Cで保存し、さらに処理するまで1〜4週間保存します20。製造元の指示に従い、自動組織処理機を用いて組織脱水、クリアリング、パラフィン浸透を行います。
      注:典型的な組織処理プロトコルは以下の通りです:70%エタノールを30分間投与、その後95%エタノールを30分(2回)、脱水のために100%エタノールを30分(3回)投与;キシレン中に1時間(3回)透明化し、その後パラフィンワックスで60°Cで1時間(3回)浸入し、その後パラフィン組織ブロックに埋め込みます。
  3. 組織を埋め込む。
    1. 頭部をパラフィンに埋め込み、実験要件に応じてコロナ面または矢状面にサンプルを配置します。
    2. 埋め込まれたブロックをパラフィンブロックのコールドプレートに移し、約30分間ワックスを硬化させ、ブロックサイズに応じてタイミングを調整します。
  4. FFPEブロックを保管してください。
    1. パラフィンが完全に固まるまで待ってください。型からブロックを取り出し、ラベル付きの気密容器やジップロック袋に入れ、4°Cで保存して区切の準備をします。
      注:良好に保存されたRNAを持つFFPEブロックは、切片前に数年間保存しても組織の完全性を損なうことはありません。

3. 多重蛍光RNA ISHのためのFFPE組織の処理

  1. RNaseフリーの作業スペースを用意しましょう。
    1. すべての作業面と器具を70%エタノールで消毒してください。RNA分解を最小限に抑えるために、表面、工具、手袋にはRNase除染液を処理してください。
    2. マイクロトームを設置して新しい刃を取り付けてください。クリアランス角度を10°に設定してください。使用前にピンセットやブラシをRNase除染液で処理してください。
      注意:正確な組織スライスを得るためには、切片時は必ず新しい刃を使いましょう。刃の角度は断面品質、組織の完全性、厚さの均一性、形態的特徴の保存に大きな影響を与えます。
  2. 水浴の準備をしろ。
    1. 浮力浴には超純度の実験室用水を入れます。
    2. 胚の段階や組織特性に応じて、温度を40〜43°Cの間で調整してください。
  3. FFPEブロックをトリムして取り付けます。
    1. 埋め込み組織の周りから余分なパラフィンをトリミングしてください。FFPEブロックを氷で冷却し、マイクロトームのコールドステージに取り付けます。
  4. 関心のある領域にトリム。
    1. パラフィンブロックの面をミクロトームブレードに合わせ、12μmステップでトリミングし、冠状切片で関心のある領域(例:臼歯や切歯の隣)が現れるまで続けます。
    2. ブロックとブレードは必要に応じて、左右対称で適切な頭部の冠状または矢状断面の位置を調整します。
  5. 組織を切開してください。
    1. 関心領域に到達したら、5〜7μmの断片を切断します。水浴でセクションを浮かせて、やさしいリラックスと平らな状態にしてからスライドに移します。
  6. セクションを取り付けて乾燥させます。
    1. セクションを正に帯電したガラススライドに取り付けます。スライドを光学顕微鏡で調べて、正しい向きと組織の完全性を確認してください。
    2. 多重蛍光RNA ISHアッセイを行う前に、スライドを40°Cのスライドウォーマーで一晩乾燥させます。

4. 1日目:脱水と水分補給

  1. スライドを焼く。
    1. スライドをFFPE断面で60°Cで1時間焼きます。
      注意:スライドをすぐに使わない場合は、室温(RT)で乾燥剤と一緒に1〜4週間保存してください。長期保存はRNAの劣化を引き起こす可能性があります。
  2. スライドのバランスを取れ。
    1. FFPE組織スライドを室温(RT)で10分間平衡させます。
  3. 部分を脱硫・再水和してください。
    1. スライドをキシレンまたはキシレン代替品に浸し、5〜10分間RTで優しく攪拌します。この工程を一度繰り返し、パラフィンを完全に除去します。
      注意:キシレンの作業は化学煙幕フード内で行うべきです。低毒性のキシレン代替品が使用された場合、化学煙幕の外でも使用可能です。
    2. スライドを100%エタノールに移し、RTで2分間インキュベートします。残留キシレンを除去するために1回繰り返します。切片を70%エタノールで2分間再水和させます。
    3. PBSでセクションを3回洗い流してください。その後、セクション全体をカバーできるほどのPBSを少量加え、すぐに次のステップに進みます。

5. FFPE組織切片における多重蛍光RNA ISHの投与

注:本研究は、製造元の指示に従い、RNAscope技術21を用いてFFPE組織切片に対して多重蛍光RNA ISHを実施しました。

  1. 1日目:前処理とプローブハイブリダイゼーション
    1. 疎水性のバリアを描く。
      1. バリアペンを使って、各組織の切片の周りに疎水性のバリアを描きます。スライドを室温(RT)で約10分間自然乾燥させます。
      2. 組織切片は常にPBSで覆われて乾燥を防ぎましょう。
        注意:糸くずのないワイプ(レンズワイプ)を使って、組織周りのスライドを乾燥させつつ、組織を潤状態に保ってください。バリアペンインクが組織の切片に触れないように注意してください。
    2. 前処理を行いましょう。
      1. カスタムの前処理試薬を塗布して、各セクションを完全に覆います。スライドを40°Cで30分間、ハイブリッドオーブン内の加湿チャンバーで孵化させます。
        注意:スポイトボトルに入った試薬については、バリア内の区画を完全に覆うのに十分な滴を加えてください。すべての試薬は使用前に必ずRTに持ち込まれてください。
    3. セクションをすすいでください。
      1. 切片をPBSで数回洗い、その後RTで新鮮なPBSで2分間培養します。
        注意:5mLのトランスファーピペットを使って、各スライドを個別にPBSで洗浄してください。2分間の洗浄中は、各セクションをPBSで完全に覆い続けてください。
    4. 内因性過酸化物酵素活性の抑制。
      1. 各切片に過酸化水素3%を塗布し、RTで10分間培養して内因性過酸化酵素活性を遮断します。
    5. 洗いを繰り返します。
      1. PBSで2分間RTでスライドを洗い、これを2回繰り返します。
    6. プローブの準備をしろ。
      1. プローブを40°Cで10分間予温します。使用前にプローブをRTまで冷めてください。
    7. プローブ混合物を準備しろ。
      1. C1プローブは1×の動作溶液として供給されます。これを直接使ってください。
      2. 対照的に、C2、C3、C4プローブは50×濃縮液として提供されます。これらのプローブをC1プローブ溶液で希釈します。C1プローブを使用しない場合は、メーカーから供給されたプローブ希釈剤でC2、C3、C4プローブを希釈してください。
    8. プローブをハイブリッド化してください。
      1. 各組織切片に30〜40μLのプローブ混合物を塗布し、完全なカバーを確保します。スライドを40°Cの加湿チャンバーで2時間、ハイブリダイゼーションオーブンで孵化させます。
        注意:RNAscope技術を学ぶ際は、テストラン中に陰性および陽性の両方のプローブを含めることが推奨されます。この方法はアッセイの検証と手技の質の確認に役立ちます。注意すべき潜在的な制限として、一部のメーカー提供のポジティブコントロールプローブは対象組織に発現しない場合があります。これに対処するために、細胞型特異的プローブを用いることができます。例えば、 Col1a1 は結合組織の信頼できる陽性対照群です。 Col1a1 (または他の高発現遺伝子)の染色は、サンプル中のRNA保存と組織形態を評価するための第一段階として実施できます。技術に習熟すると、陰性コントロールは通常、プローブを使わずにスライドを処理し、他のすべての溶液で処理することで行われます。この方法は、すべての検出チャネルにおけるバックグラウンド信号に関する重要な情報を提供します。標準のMultiplex V2キットは、最大4つの異なるプローブの同時染色とイメージングを可能にします。遺伝子発現レベルが事前のトランスクリプトミクス研究で確定した場合、発現率の低い遺伝子をCy5およびCy7チャネルに割り当てることが望ましいです。高発現遺伝子はGFPおよびRFPチャネルに配置し、最適な検出を目指します。プローブのいずれも高発現遺伝子を標的としない場合、GFPチャネルは使用されないようにすべきです。これによりGFPチャネルはRFPチャネルからの背景差算の基準となり、低発幅ターゲットの信号検出精度が向上します。
    9. ウォッシュバッファーですすいでください。
      注:市販の20×ウォッシュバッファーは使用前にRNaseフリーの水で1×に希釈されました。
      1. キット付属の1×ウォッシュバッファーでRTでスライドを2分間洗います。これを2回繰り返します。
    10. 5倍の生理食塩水-シトウムナトリウム(SSC)バッファーで培養します。
      注:市販の20×SSCバッファー(3 M NaCl、0.3 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0)は使用前にRNaseフリーの水で5×に希釈されました。
      1. 洗浄後は、RTの5×SSCバッファーで一晩培養します。
  2. 2日目:信号増幅、蛍光標識、マウント
    1. スライドを洗って。
      1. スライドを1×ウォッシュバッファーで室温(RT)で2分間洗います。これを2回繰り返します。
    2. 増幅の手順を実行してください。
      1. 各区画に増幅試薬1を塗布し、加湿チャンバーで40°Cで30分間培養します。
      2. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      3. 増幅2試薬を塗布し、40°Cで30分間培養します。
      4. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      5. 増幅3試薬を塗布し、40°Cで15分間培養します。
        注意:どのチャンネル(プローブ)が開発されていても、3つの増幅ステップすべてが必要です。
      6. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
    3. ホースラディッシュのペルオキシダーゼ(HRP)とフルオロフォアを開発します。
      1. 必要な蛍光分子の体積(一般的に1枚あたり100〜200μL)を計算し、オパール蛍光素ストックを希釈します。
        注:蛍光分子の推奨希釈範囲は1:300〜1:1500です。これらの実験では、オパール・ポラリス780(蛍光色剤試薬)を抗体希釈剤で1:500希釈し、他のすべての染料をTSAバッファーで1:1000希釈しました。可能な限りスライドへの光の当たりを最小限にしましょう。
      2. HRP-C1試薬を塗布し、40°Cで15分間培養します。
      3. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      4. 各セクションに30〜40μLのオパール染料(例:オパール570またはオパール690)を塗布します。40°Cで30分間培養します。
      5. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      6. HRPブロッカーを塗布し、40°Cで15分間培養します。
      7. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      8. HRP-C2またはHRP-C3試薬を塗布し、40°Cで15分間培養します。
      9. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      10. 2番目のオパール染料を30〜40μL塗布し、40°Cで30分間培養します。
      11. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      12. HRPブロッカーを塗布し、40°Cで15分間培養します。
      13. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      14. HRP-C3またはHRP-C4試薬を塗布し、40°Cで15分間培養します。
      15. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
    4. チラミド信号増幅-ジゴキシゲニン(TSA-DIG)および蛍光色素標識(該当する場合)を実施。
      1. 各切片あたり30–40μLの希釈TSA-DIG試薬を散布し、RTで30分間培養します。
      2. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      3. ブロッキング試薬を塗布し、40°Cで15分間培養します。
      4. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
      5. 希釈した蛍光素試薬30〜40 μLを塗布し、40°Cで30分間培養します。
      6. 1回に2回すすいで×RTで2分間洗浄バッファーを使います。
    5. カウンターステインと取り付けを行います。
      1. 4′6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を塗布し、暗闇でRTで5分間培養します。
      2. DAPIをすすぐ後、アンチフェードマウントでセクションをすぐに取り付け、カバースリップを優しく貼り付け、気泡の閉じ込めを避けてください。ティッシュのカバーサイズに適したカバースリップのサイズを選びましょう。
      3. スライドを暗闇でRTで2時間乾燥させ、その後4°Cで長期保存します。
        注:蛍光は、適切なフェード防止装置を装着して暗闇で4°Cで保存すれば最大1年間保存可能です。
    6. 画像診断を行ってください。
      1. LED照明とフィルターを備えたマルチチャンネル蛍光顕微鏡を用いて画像化を行い、スペクトル分離を行います(図2A)。励起波長と放出波長は以下の通りに用いられます:DAPI(353/465 nm)、FITC(495/519 nm)、Cy3(548/561 nm)、Cy5(650/673 nm)、Cy7(747/773 nm)。特定のフィルターはスペクトルの重なりを最小限に抑え、青、緑、オレンジ、赤、近赤外信号を識別します。
      2. サンプル間で同一の露光と照明設定ですべての画像を取得し、一貫性を確保し信頼できる比較分析を可能にします。

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結果

記載されたプロトコル(図1)を用いて、ツァイス顕微鏡プラットフォームでマウスの頭部全体を撮影したマルチプレックス蛍光mRNA ISH転写産物検出を実証しました(図2B)。特定の画像ビューはサイドタブ(黄色いボックス)で選択でき、チャンネルタブ(赤いボックス)から複数のチャンネルを同時に表示できます。ライブ画像の明るさ、ガンマ線、コントラストは、表示タブ(緑のボックス)のコントロールで直接調整でき、重要な特徴の可視性を最適化できます。

また、野生型新生児頭部の矢状切片における転写産物を多重遺伝子パネルで処理し、 Sfrp2、 Dspp、 Dkk1 を検出したものも示します(図2C)。高倍率画像では、下顎切歯および周囲の骨内で遺伝子発現の明確なパターンが明らかになり、各転写産物の正確な空間...

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ディスカッション

インシチュ ・ハイブリダイゼーションは、40年以上にわたり遺伝子発現研究の基礎的なツールであり、継続的に改良されてきました。しかし、従来のISHアプローチは、感度が低く、背景信号が高く、長時間の手間がかかる手順に制約されることが多いです。これらの制約により、特に複雑な頭蓋顔面組織においては、正確な空間分解能と低存在量転写体の検出が不可欠である広範な応用が制限されています。多重蛍光RNA ISHは、独自のプローブ設計とシグナル増幅戦略により、非特異的背景を最小限に抑えつつ、ターゲット特異的シグナルを選択的に増幅することで、これらの多くの課題を克服します。その結果、このアプローチは信号対雑音比を大幅に向上させ、単細胞レベルや細胞下レベルでの転写産物の高解像度局在を可能にします。

多重蛍光RNA ISHは、完全な組織文脈における細胞レベルでの遺伝子発現の空間的質的および定量的解析を大きく進歩させた、非常に感度が高く特異的な技術です。従来のISH法とは異なり...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

NICHD動物施設のスタッフの皆様、動物の管理と繁殖にご協力いただき感謝いたします。蛍光イメージングの支援をしてくださった顕微鏡・イメージングコア(NIH/NICHD)のヴィンセント・シュラム博士に感謝いたします。現在の原稿は、NIH/NIDCRからM.B.へのRO1DE033520、学内研究プログラム、国立児童保健・人間発達研究所(NICHD)からE.M.への資金、および国立小児保健・人間発達研究所(NICHD)研究助成金識別子ZIA HD009015の資金によって支援されています。資金提供者は研究設計、データ収集・分析、出版決定、原稿作成に関与していません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1×PBSサーモ・フィッシャー10010023Use ワークフロー中にウォッシュを行うために
20回以上;SSCサーモ・フィッシャーJ60839。K21&Acuteを作るために使います。ウォッシュバッファー
50 mL円錐形チューブ(Ambion)RNAseフリーサーモ・フィッシャーAM12502サンプルを異なる溶液で保存するために使用
高度軌道シェーカーVWR6683-470インキュベーション中に固定液中の組織を振る際に使用
アルコール70%、フィッシャーブランド、ヒストプレップフィッシャー・サイエンティフィックHC-1000-1GL作業スペースの清掃と消毒に使う
抗体希釈剤 アコヤ・バイオサイエンスARD1001EATSA-DIG用の希釈剤
自動真空組織プロセッサーライカ・バイオシステムズASP300Sサンプルのクリアリング、脱水、再水和、ワックス浸透に使用します
ガラスのカバー厚さ:1.5、25 mm x 25 mm コーニング2850-25Visium HDワークフローにおけるスライドの取り付けに使用
カスタム前処理試薬ACD、バイオテクネ300040組織透過性の最適化とターゲットアクセスの促進
EDTAミリポール・シグマ03690石灰化組織の脱石化に使用
エタノール 100%エアロベース・グループ6505001050000処理中にキシリンを除去し、サンプルを再水和させるために使用します
ヒストコア水浴ライカ・バイオシステムズHIS232640-43 & degの区画をフロートにしてください;CはFFPEのセクションのしわを取り除くため、nbsp;
HybEZ加湿用紙ACD、バイオテクネ310015HybEZオーブン内で湿度を維持し、ハイブリダイゼーション中の組織断片の乾燥を防ぐために使用してください
HybEZオーブン、トレイ、ラックACD、バイオテクネ310011, 310012, 310014ハイブリッド化および培養段階での温度、湿度、適切なスライド位置の制御に使用します。
ImmEdge 疎水性バリアペンベクター研究所H-4000染色作業中に試薬を組織切片に閉じ込めるために、スライドに疎水性の境界線を描くために使用します。
ロープロファイル使い捨てブレード DB80LXライカ・バイオシステムズ14035843496FFPEブロックを区切るために使います。
中性緩衝ホルマリン 10%アザー・サイエンティフィックNBF-4-G組織を直すために使う
オパール520試薬パックアコヤ・バイオサイエンス株式会社FP1487001KT蛍光標識による標的RNAシグナルの増幅および検出。
OPAL 570試薬パックアコヤ・バイオサイエンス株式会社FP1488001KT蛍光標識による標的RNAシグナルの増幅および検出。
オパール620試薬パックアコヤ・バイオサイエンス株式会社FP1495001KT蛍光標識による標的RNAシグナルの増幅および検出。
オパール690試薬パックアコヤ・バイオサイエンス株式会社FP1497001KT蛍光標識による標的RNAシグナルの増幅および検出。
オパール・ポラリス780試薬パックアコヤ・バイオサイエンス株式会社FP1501001KT蛍光標識による標的RNAシグナルの増幅および検出。
プロロンド・ダイヤモンドサーモ・フィッシャーP36970蛍光信号を保存し、画像撮影中にRNAscope信号を保護するためのアンチフェードマウント媒体
RNAscope 4-Plex 補助キット専用 UIACD、バイオテクネ323120RNAscope多重蛍光v2アッセイで使用される追加材料
RNAscopeのDAPIACD、バイオテクネ320858細胞核を可視化するためにRNAscopeアッセイで用いられる蛍光核染色
RNAscopeマルチプレックス蛍光試薬キットv2ACD、バイオテクネ323100マルチプレックス蛍光インシチューハイブリダイゼーションの実施
RNAscope多重性TSAバッファACD、バイオテクネ322810RNAscopeでオパール染料を希釈するためのバッファー
RNAscopeウォッシュバッファ試薬ACD、バイオテクネ310091アッセイ中にスライドの組織切片を洗浄するために使用してください
RNaseZap RNase 除染溶液サーモ・フィッシャーAM9782RNaseの洗浄と除去に使用してください
半自動ロータリーミクトミーライカ・バイオシステムズRM2245ガイドラインで報告された通り、FFPEブロックを区切るために使用してください。
スライド・ブライト電子顕微鏡科学23401-01RNAscope処理前の脱焦化工程のために。
カバー付きスライドウォーマープレミア XH2004異なる温度でのスライドのキュベーションに使用
Superfrost Plus スライド フィッシャー・サイエンティフィック12-550-15 Vsium HD用のセクションを取り付けるために使用
サージパス・パラプラストライカ・バイオシステムズ39601006組織の浸潤および組織埋め込みを行うために使用
組織培養皿 100 X 20 MM 500/CSフィッシャー・サイエンティフィック8772221&急性期のサンプル採取および解剖に使用;PBS
キシレンフィッシャー・サイエンティフィック6.81001E+12アルコールを除去し、組織を透明にするためのクリアリング剤として使用されます

参考文献

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