方法論記事

ヘキサメチルジシロキサン促進拡散法およびイオン選択性電極測定法を用いたマウスモデルにおける血清、骨、および歯中のフッ化物定量

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10.3791/71488

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2026年8月28日

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1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、ヘキサメチルジシロキサン（HMDS）を用いて拡散を促進させたディッシュの調製方法と、それに続くイオン選択性電極測定によるマウスの血清、骨、および歯中のフッ化物イオン量の定量化について説明します。本手法は、生物学的試料におけるフッ化物の蓄積を評価するための、校正に基づいた高感度なアプローチを提供します。

要約

生体組織におけるフッ化物レベルの定量は、フッ化物の曝露、代謝、および毒性を理解するために不可欠です。本プロトコルでは、ヘキサメチルジシロキサン（HMDS）促進拡散に続き、イオン選択性電極（ISE）分析を用いることで、血清、骨、および歯の中のフッ化物イオン量を測定する、感度が高く再現性のある方法について記述します。制御されたフッ化物処理を施したマウスから、血清、大腿骨、および下顎切歯を含む生物学的試料を採取します。骨および歯の試料は灰化、粉砕、および水和を行い、血清は直接処理します。各試料を超純水を含む拡散皿に移し、フッ化物トラップとして機能する水酸化ナトリウム液滴を付着させた、ペトロラタム塗布済みの蓋で密封します。HMDS飽和硫酸を注入してフッ化物の放出と拡散を開始させ、放出されたフッ化物イオンをトラップ内で定量的に回収します。一晩の拡散後、フッ化物トラップの液滴を単一のサンプルにまとめ、必要なpH範囲に酸性化し、ISE測定用に規定の容量に調整します。既知のフッ化物量で調製した校正用拡散皿を用いて定量のための標準曲線を作成し、品質管理サンプルによって電極の安定性を検証します。0 ppmまたは125 ppmのフッ化物に曝露した若齢マウスおよび成熟マウスからの代表的な結果は、血清、骨、および歯におけるフッ化物レベルの年齢および用量依存的な差異を検出できる本法の能力を証明しています。本プロトコルは、多様な生物学的マトリックス中のフッ化物を定量するための堅牢な校正ベースのアプローチを提供し、マウスモデルにおけるフッ化物曝露、組織蓄積、および毒性学的結果を調査する研究に適しています。本法の大きな利点は、拡散プロセスによって放出されたすべてのフッ化物が100 µL未満の測定可能なサンプル量に濃縮されるため、個々のマウス切歯から得られる3–5 mgの灰などの極めて小さな試料中のフッ化物を正確に定量できることです。

概要

フッ化物は天然に存在するアニオンであり、最適なレベルのフッ化物はう蝕の予防に有効です1,2,3,4,5。米国（U.S.）では、う蝕の発生率を低下させ、口腔健康を増進するための公衆衛生戦略として、0.7 ppmの地域上下水道フッ化が実施されています6。しかし、過剰なフッ化物を長期的に摂取すると、複数の組織に悪影響を及ぼす可能性があります。高濃度のフッ化物への曝露は、エナメル質形成を阻害し7,8,9、骨形成を変化させ10、骨格の完全性を損なわせます11

細胞レベルでは、フッ化物への曝露は、酸化ストレス12、小胞体ストレス13、遺伝子発現を変化させるエピジェネティックな修飾14、およびエナメル芽細胞におけるアポトーシス15,16,17,18を含む、いくつかの代謝障害を誘発します。世界的に、地下水中のフッ化物濃度の低下（>1.5 ppm）は、重大な健康上の懸念となっています。最近の予測モデリング研究では、世界中で約1億8,000万人が過剰なフッ化物曝露の影響を受けている可能性があると推定されており、特にアジアとアフリカでその負担が最も大きいことが示されています1。飲料水以外にも、食品（例：シーフード；~1.9 ppm）、飲料（例：茶；0.5–6 ppm19）、および歯磨き粉などの歯科製品20（1,000–1,500 ppm）を通じてフッ化物への曝露が起こります。

したがって、フッ化物の曝露、代謝、および組織への蓄積を理解することは、その治療上の利点と潜在的な毒性学的影響の両方を評価するために不可欠である。尿、血清、骨、歯などの生物学的試料中のフッ化物を正確に定量することは、この研究における極めて重要な要素である。しかし、フッ化物の化学的性質およびカルシウムに富むマトリックスに対する強い親和性のため、その測定は分析的に困難である。体内のフッ化物の約99%は、骨や歯などの石灰化組織に存在する21。これらの課題に対処するため、イオン選択性電極（ISE）電位差法、イオンクロマトグラフィー、比色分析、滴定法、および核種または放射化に基づく方法など、さまざまな分析技術が開発されてきた22。これらのうち、ヘキサメチルジシロキサン（HMDS）促進拡散法とフッ化物選択性電極測定を組み合わせた手法は、その感度、再現性、および多様な試料タイプとの適合性から、生物学的マトリックスにおいて最も信頼性が高く、広く用いられているアプローチの一つとなっている23,24,25,26,27,28,29。

複数の分析法が存在しますが、それぞれのアプローチには実験的または臨床的研究における使用を制限しうる限界があります。イオンクロマトグラフィーは高い感度と選択性を備えていますが、専用の装置と広範な試料調製が必要です30,31。SPADNS（ナトリウム 2-(パラスルホニルフェニルアゾ)-1,8-ジヒドロキシナフタレン-3,6-ジスルホナート）法などの比色分析法は簡便で安価ですが、濁度や内因性発色団による干渉を受けやすく、複雑な生物学的試料における信頼性が制限されます22,32,33。滴定法は費用対効果が高く簡単ですが、ほとんどの生物学的検体における微量レベルのフッ化物検出に必要な感度が不足しています34。核分析または放射化に基づく手法は極めて高い感度を提供しますが、原子炉や加速器ベースの中性子源へのアクセスが必要であり、日常的な研究室での使用には不向きです35。対照的に、HMDSによる拡散促進に続くISE測定は、軟組織と石灰化組織の両方からフッ化物を完全に遊離させつつ、感度、コスト、およびアクセスのしやすさの現実的なバランスを提供します。これは、組織の利用可能性が限られており、マウス切歯のような石灰化構造から得られる灰分が1歯あたり 3–5 mg に過ぎない小動物を用いた研究において特に有利です。

拡散ーISE法により、放出されたすべてのフッ化物を小さく規定された体積に濃縮できるため、極めて少量の試料であっても正確な定量が可能です。このため、本法は毒性動態研究、用量反応実験、および発達段階におけるフッ化物代謝の調査に適しています。小型齧歯類、特にC57BL/6Jマウスは、フッ化物の影響を研究するための動物モデルとして広く用いられています7,9,12,29,36。

本プロトコルでは、高濃度のフッ化物（125 ppm）に曝露させたマウスと未処理の対照群から採取した血清、骨、および歯の中のフッ化物を定量するため、HMDS促進拡散法およびフッ化物選択電極法を適用します。さらに、若齢マウス（処置開始時で6週齢）と成熟マウス（処置開始時で18週齢）におけるフッ化物の蓄積を比較し、フッ化物の代謝および組織への沈着における年齢依存的な差を評価します。げっ歯類の切歯は絶えず萌出しており、約7週齢までに萌出と咬合摩耗の定常状態のバランスに達するため、代表的な歯科組織として下顎切歯を選択しました。この持続的な成長パターンにより、エナメル質形成の一定かつアクセス可能なグラデーションが得られるため、マウスの切歯はエナメル質形成および歯科フッ素症を研究するための、広く利用され検証済みのモデルとなっています。

プロトコル

本プロトコルに記載されているすべての手順は、国際実験動物ケア評価認定協会（AAALAC）の認定を受けているノバ・サウスイースタン大学の動物実験委員会（IACUC）によって承認された脊椎動物の使用に関するガイドラインおよび規制（プロトコル番号 2023.02.MSuz1）に従って実施されました。すべての動物実験は、実験動物の飼育および使用に関するガイドライン、および米国獣医学会（AVMA）の動物の安楽死に関するガイドラインに準拠しています。本研究で使用したすべての材料は、材料表に記載されています。

1. 動物および マウスモデルにおけるフッ化ナトリウムの調製と投与

  1. 動物：雄のC57BL/6Jマウスを、処置開始時に思春期（6週齢）と成熟期（18週齢）の2つの年齢カテゴリーに割り当てる。
    1. 各群に、フッ化物不含の脱イオン水（0 ppm F⁻）またはフッ化ナトリウム添加飲料水（125 ppm F⁻）を6週間の曝露期間にわたって提供する。
    2. 各年齢および処置条件に5匹の動物を組み入れる（N = 5/群）。
    3. 曝露期間の終了後、血清、大腿骨、および下顎切歯を採取し、収集したすべての検体を後続の分析用に調製する。
      ​注：検体：灰化した骨、灰化した歯、および血清などの処理済み材料。
  2. 動物の飼育および飼料：マウスを標準的なラボ条件下で飼育し、餌と水を自由摂取（ad libitum）させる。
    1. バックグラウンドのフッ化物レベルを最小限に抑えるため、歯、骨、および血清の採取の1週間前からフッ化物不含の飼料を提供する。
  3. フッ化ナトリウム飲料水
    1. フッ化物添加飲料水を調製するには、フッ化ナトリウム（NaF）を脱イオン水に溶解させ、目的のフッ化物濃度（例：125 ppm F⁻）にする。
    2. 溶液を0.2 µmの真空フィルターでろ過し、オートクレーブ済みボトルに入れる。2日ごとに新しい溶液を調製する。
      注意：NaFは摂取すると毒性があり、皮膚や目に刺激を与える可能性がある。白衣、ニトリル手袋、および保護メガネを着用し、ドラフトチャンバー内で取り扱うこと。
  4. フッ化物不含の対照水については、脱イオン水を0.2 µmの真空フィルターでろ過し、オートクレーブ済みボトルに入れる。2日ごとに新しい水を用意する。
  5. フッ化物処置の目的の期間中、フッ化物添加飲料水またはフッ化物不含飲料水を自由摂取（ad libitum）させる。毎日水位を監視し、2日ごとにボトルを交換する。
  6. 曝露期間の終了後、二酸化炭素（CO₂）吸入に続いて断頭により動物を安楽死させる。安楽死処置は、AVMA（米国獣医師会）の動物の安楽死に関するガイドラインに従って実施され、施設内のIACUCプロトコルの一部として承認されたものである。
    注意：CO2は窒息剤である。換気の良い場所で処置を行い、チャンバーが適切に機能していることを確認すること。直接の吸入曝露を避けること。

2. フッ化物測定のための検体調製

  1. 採血
    1. マウスをCO₂吸入により安楽死させ、直ちに1 mL結核用シリンジを用いて心尖穿刺により採血する。血液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。使用済みの針およびシリンジはすべて、施設指定の鋭利物廃棄容器に廃棄すること。
      注意：シリンジの針は鋭利であり、刺傷の原因となる可能性があるため、取り扱いに注意すること。
    2. 血液を室温で30分間静置した後、2,000 × gで10分間遠心分離する。
    3. 上清（血清）をマイクロ遠心チューブに移し、−80 °Cで保存する。
      注意：超低温フリーザーは凍傷の危険がある。チューブを取り扱う際は断熱手袋を着用し、冷たい表面に長時間皮膚を接触させないこと。
  2. 骨
    1. 大腿骨の抽出：安楽死後、股関節で後肢を解剖する。
    2. 大腿骨からすべての軟組織を慎重に取り除く。組織を脱イオン水で3回洗浄する。骨は次工程まで-80 °Cで保存する。除去した軟組織および汚染された材料は、施設指定の生物学的廃棄物として廃棄すること。
      注意：組織を70%エタノールで長期保存する場合、2%スクロースを含む4%パラホルムアルデヒドで12〜16時間固定してもよい。この固定手順は、その後のフッ化物定量分析の正確性に影響を与えない。
    3. 骨を脱イオン水で十分にすすぐ。糸くずの出ないペーパータオルで余分な水分を吸い取る。
    4. 蒸発させるため、蓋を開けた状態で骨を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、乾燥機にて60 °Cで12〜16時間乾燥させる。
      注意：乾燥機による火傷の恐れがある。サンプルを取り扱う際は耐熱手袋を着用すること。
    5. 骨の灰化：乾燥させた骨をアルミナ製るつぼに移す。るつぼをマッフル炉に入れ、150 °C/hの昇温速度で600 °Cまで加熱し、その後6時間保持する。るつぼを取り出す前に、炉内を200 °C以下まで冷却させる。残留した骨片や汚染された消耗品は、施設指定の生物学的廃棄物として廃棄すること。
      注意：マッフル炉およびるつぼは極めて高温になり、深刻な火傷を負う危険がある。るつぼを取り扱う前に必ず炉を冷却させること。るつぼを取り出す際は、白衣、保護メガネ、耐熱手袋を着用し、熱い表面に直接触れないよう長いピンセットを使用すること。
      重要ステップ：灰化が不十分な場合、後続の分析に影響を及ぼす。次工程に進む前に、骨材が完全に酸化状態にあることを確認すること。炭素が残留していると、その後の測定に干渉する。
      ​注意：適切に灰化された骨は、均一な淡灰色から白色に見える。暗色の粒子、特に黒色や炭のような残留物がある場合は、不完全燃焼を示している。変色が見られる場合は、有機物が完全に除去されるまで灰化時間を延長すること。
    6. 灰化した骨の保存：灰化後直ちに、骨を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。チューブをParafilmで密封し、使用時まで真空デシケーター内で保存する。
  3. 歯
    1. 下顎切歯の抽出：顎関節の高さで水平に切開し、下顎を上顎から分離する。
    2. 正中矢状面に沿って切開し、上顎と下顎の両方を左右に分割する。
    3. 組織を脱イオン水で3回洗浄し、下顎切歯を慎重に抽出する。抽出した切歯は、次工程まで-80 °Cで保存する。抽出した軟組織および汚染された消耗品は、施設指定の生物学的廃棄物として廃棄すること。
      注意：顎関節および正中矢状面の切開を行う際は、怪我を防ぐため鋭利な解剖器具を慎重に使用すること。手袋、白衣、保護メガネなどの適切な個人用保護具（PPE）を着用すること。
      注意：組織を70%エタノールで長期保存する場合、2%スクロースを含む4%パラホルムアルデヒドで12〜16時間固定してもよい。この固定手順は、その後のフッ化物定量分析の正確性に影響を与えない。
    4. 灰化のための歯の調製：歯を脱イオン水で十分にすすぎ、1%過酸化水素（H₂O₂）に12〜16時間浸漬する。使用済みの過酸化水素溶液は、有害化学廃棄物として廃棄すること。
    5. 再び脱イオン水ですすぎ、糸くずの出ないティッシュで短時間吸水させた後、蓋を開けた状態で1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。チューブを乾燥機にて60 °Cで12〜16時間乾燥させる。
      注意：過酸化水素は酸化剤であり、皮膚および眼に刺激を与える可能性がある。白衣、ニトリル手袋、保護メガネを着用し、ドラフトチャンバー内で取り扱うこと。可燃性物質との接触を避けること。
    6. 歯の灰化：乾燥させた歯をアルミナ製るつぼに移し、マッフル炉にて150 °C/hの昇温速度で、保持温度600 °Cで20時間灰化させる。
    7. 炉が200 °C以下に冷却された後のみ、るつぼを取り出す。
      注意：マッフル炉およびるつぼは極めて高温になり、深刻な火傷を負う危険がある。るつぼを取り扱う前に、炉を200 °C以下まで冷却させること。るつぼを取り出す際は、白衣、保護メガネ、耐熱手袋を着用し、熱い表面に直接触れないよう長いピンセットを使用すること。
      重要ステップ：完全に酸化させること。炭素が残留していると、その後の分析に干渉する。
      注意：灰化した歯材は、均一な淡灰色から白色に見える。黒色の残留物がある場合は、再度灰化を行うこと。
    8. 灰化した歯試料の保存：灰化後直ちに、歯を2 mLラウンドボトムマイクロ遠心チューブに移す。
    9. チューブをParafilmで密封し、使用時まで真空デシケーター内で保存する。

3. HMDS促進拡散ディッシュの調製

  1. 試薬および材料
    1. 6 N 硫酸：拡散皿を準備する少なくとも2日前に、6 Nのストック溶液を作成する。 N 硫酸
      注：拡散ディッシュ（Diffusion dish）：処理済み生物材料から放出された成分を、蓋に固定された化学トラップで捕捉するために設計された、制御された密閉環境を構築する密閉容器。密閉設計により外気との交換が防止され、放出された分析物が測定用のトラップへと確実に導かれる。
    2. 1を配置します。 マグネチックスターラー上のプラスチックビーカーにマグネチックスターバーを入れ、416を添加する mLの超純水。
    3. 50を使用し、 84 mLのセロロジカルピペットを用いて、ゆっくりと加える 36 mLの N H₂SO₄ 絶えず撹拌しながら水に加えます。溶液が発熱するため、室温まで冷却してください。. 未使用または使用済みの硫酸溶液は、すべて有害化学廃棄物として、機関の化学廃棄物処理ルートに従って廃棄してください。
      注意：硫酸は強い腐食性があります。耐酸性手袋、白衣、保護メガネを着用し、ドラフトチャンバー内で取り扱ってください。皮膚や目に付着した場合は、直ちに大量の水で洗い流してください。
    4. HMDS飽和6 N硫酸：6 N硫酸を転送し、 2 N 硫酸 分液漏斗を用い、15を添加する mLのヘキサメチルジシロキサン（HMDS）。
    5. ストッパーとコックが確実に閉まっていることを確認し、分液漏斗を横向きに保持して、微細なHMDSの液滴が見えるまで激しく振ってください。
    6. ストッパーを開けて現像ガスを放出し、この工程をさらに2回繰り返します。
    7. ストッパーを数時間、わずかに開けたままにしておく。6を含む分液漏斗を保存する。 化学薬品用ドラフト内のスタンドに、HMDS飽和硫酸を設置する。HMDSを含む硫酸および汚染物質は、有害化学廃棄物として廃棄すること。
      注意：HMDSは可燃性であり、吸入による毒性があります。白衣、手袋、保護メガネを着用し、ドラフトチャンバー内で取り扱ってください。火気厳禁です。
    8. 0.05 N 水酸化ナトリウム：1を溶解させる 25gのNaOHペレットを mLの超純水を加え、1の溶液を調製します。 Nストック溶液
    9. 混合液2 1のmL 38のN NaOHストック溶液 超純水をmL加え、0.05を得る N NaOH溶液
    10. 0.05を分注する 1.5にN NaOHを 1回使い切りのmLマイクロ遠心チューブを使用し、蓋をパラフィルムで密閉して真空デシケーター内で保存することで、CO2の混入を最小限に抑えます。₂ 吸収。未使用または使用済みの水酸化ナトリウム溶液は、有害化学廃棄物として廃棄すること。
      注意：水酸化ナトリウムは腐食性が非常に高く、深刻な化学火傷を引き起こす可能性があります。白衣、手袋、および保護ゴーグルを着用してください。溶液が飛散しないよう、慎重に取り扱ってください。
    11. 0.2 N 酢酸：575を添加する µL 超純水に氷酢酸を加え、最終容量を50まで調整する 0.2を調製するためのmL N 酢酸。酢酸溶液は有害化学廃棄物として廃棄すること。
      注意：酢酸は腐食性があり、皮膚、目、および呼吸器系を刺激する可能性があります。白衣、手袋、および保護メガネを着用し、化学薬品用ドラフトチャンバー内で取り扱ってください。
    12. ・白色ワセリン：約100gを融解させる 60℃で〇gのペトロラタム °C オーブン内で加熱します。液体ペトロラタムを10（mlなどの単位）分、吸引します。 mLシリンジに入れ、冷却して凝固させる。ペトロラタムを充填したシリンジは、室温で数週間保存することが可能である。
    13. シャーレ：60 mmのものを使用する × 15 拡散ディスク作製用の未処理ペトリ皿（mm）。
    14. 加熱した18G注射針を用いて、シャーレの蓋に小さな穴を開けます。
    15. 10ゲージの注射器を用いて、蓋の内側の縁にペトロラタムによる連続的なシールを施します。 14G鈍針を装着したmLシリンジ G針。使用済みの針はすべて、機関で承認された鋭利物廃棄容器に廃棄してください。
      注意：注射針は鋭利であり、刺傷を負う可能性があります。取り扱いには十分注意し、承認された鋭利物廃棄容器に廃棄してください。針を加熱する際は、火傷を防止するため、耐熱手袋および保護メガネを着用してください。
    16. 校正用拡散皿のためのNaFストック溶液。4.19を溶解させる。 1gのNaFを1 100 [単位]を調製するために超純水を使用します。 mMストック溶液を10 mL調製します。 mM, 100 µM、および10 µM 100倍濃縮液を10倍段階希釈してストック溶液を調製します。 mM溶液。
      注：NaF 1モルあたり19 g F⁻したがって、1 µL 10件中 µM NaFは0.19を含有しています。 ng F⁻ および 1 µL 10件中 190 mMのNaFを含む ng F⁻.
      ​注：校正用拡散ディッシュ：既知量のフッ化物イオン（F-）を用いて校正するために特別に使用される拡散ディッシュ¯).
  2. 検体別拡散皿の調製
    1. 血清拡散皿：ペトリ皿の底に超純水3 mLをピペットで分注し、次を添加する 75 µL 血清。血清で汚染された器具や材料は、施設内のバイオハザード廃棄物として廃棄すること。手順3.4に進む。
    2. 骨拡散ディッシュ
      1. 骨灰の粉砕：マイクロスパチュラを用いて、1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の灰化した骨を微粉末になるまで研磨する。粉砕した骨灰の処理は直ちに開始すること。骨灰で汚染された消耗品は、施設内の化学廃棄物処理フローに従って廃棄すること。
      2. 骨灰の計量および水和
        1. 読取限度が0.1mg以上の分析天秤の計量皿の上に、空のペトリ皿の底を置く。 mg
        2. 粉砕した骨灰を2から移します。 静電気による帯電を最小限に抑え、粉末の飛散を防ぐため、mLマイクロ遠心チューブから小さな磁器皿に移します。
        3. マイクロスパチュラを使用して、約5を添加します。 皿に骨灰を〇〇 mg加え、直ちに粉末を3 mLの～で覆います。 灰の飛散を防ぐため、分析天秤からディッシュを取り出す前に、超純水を〇〇mL加える。
        4. 各骨灰試料の正確な重量を記録する。次のステップに進む。 3.4.
    3. 歯用拡散皿
      1. 灰化歯の切削加工
        1. 灰化した切歯を2に転送します。 mLラウンドボトムマイクロ遠心チューブを用意し、5を添加する 各チューブに直径mmのステンレス製ビーズを入れます。チューブを閉じ、蓋をParafilmで固定します。
        2. 灰化した切歯をビーズビーターを用い、2,500rpmで粉砕する。 10分間、〇〇rpmで回転させる 粉砕した歯の処理を直ちに開始してください。
      2. 灰化させた歯の計量および水和
        1. ステンレス製ビーズを含むチューブの内容量すべてを、分析天秤の計量皿上に配置した拡散皿の底に注ぎ入れます。歯灰を含む汚染された消耗品は、機関の化学廃棄物処理フローに従って廃棄してください。
        2. 皿からステンレス製ビーズを取り出し、歯の灰の正確な重量を記録する（通常は3〜4 （下顎切歯1本あたり〇〇mg）。
        3. 直ちに3を加えてください。 静電気による灰の飛散を防ぐため、シャーレを天秤から取り出す前に、歯の灰が浸るまで超純水をmL加えます。続いてステップへと進みます。 3.4.
  3. 拡散ディスクの校正および品質管理
    1. 検体拡散皿と並行して、5〜6点のキャリブレーションを行うためのキャリブレーション拡散皿を2セットと、ブランクを含む同様の品質管理拡散皿を1セット準備する。
      注：品質管理用拡散皿：校正用拡散皿と同一の手順で調製し、電極の安定性を定期的に検証して、一貫した測定性能を確保するために使用する。
    2. ピペット 3 11個または13個のペトリ皿それぞれに超純水を〇〇mL加え、予想されるF（フッ化物）濃度を網羅するようにNaFストック溶液を添加します。¯ 検体サンプルにおける質量範囲。次のステップに進みます。 3.4. 拡散ディッシュアセンブリの完了37.
  4. 拡散ディッシュ組み立ての完了
    1. フッ化物トラップ堆積物を構築するには、 50 µl 0.05 N NaOHを、ペトリ皿の蓋の縁から十分に離れた内壁に3滴加える。
      注：フッ化物トラップ（F¯ トラップ）：拡散皿の構成要素であり、Fを捕捉する。¯、具体的には水酸化ナトリウム（NaOH）です。
    2. NaOHの液滴を乱さないように蓋を反転させ、ペトロラタムを用いてディッシュの底部にしっかりと密閉します。
    3. 3 N HMDS飽和硫酸溶液を調製するには、6 N HMDS飽和硫酸と超純水を等量ずつ混合する。保存が不可能なため、使用直前に調製すること。
    4. 20 Gの針を装着した10 mLシリンジを用い、蓋の穴から、調製した3 N HMDS飽和硫酸3 mLをディフュージョンディッシュ底部の水中に注入します。シリンジの針を挿入または抜去する際、蓋の内面に酸が飛び散らないように注意してください。
    5. HMDS促進フッ化物拡散：注射孔を、開口部を完全に覆う量のペトロラタムで直ちに封止し、拡散用ディッシュを低速に設定した可変ロッカー上に置く。室温で一晩インキュベートする（図1).

figure-protocol-1
図1フッ化物抽出およびトラップ用の骨拡散ディッシュの概略図。 図 1は、60mmディッシュ内に組み立てられた骨拡散皿の設計を示しています。 × 15 mmの未処理ペトリ皿。蓋には、ペトロラタムビーズで密封された小さな注入孔がある。蓋の内表面には、フッ化物イオン（F⁻）トラップは、拡散中に蓋から吊り下げられる。蓋はペトロラタムを用いてディッシュの底部に気密シールされる。ペトリ皿の底部には、超純水、ヘキサメチルジシロキサン（HMDS）飽和硫酸、および骨灰が含まれており、これらが合わせてフッ化物放出とその後のトラッピングのための反応環境を形成している。この図は著者らがBiorenderを用いて作成し、CC BYライセンスの下で提供されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. ISEを用いたフッ化物の測定

  1. ISEのセットアップ
    1. ダブルチャンネルフッ化物イオン選択電極に適切な充填液を満たし、電位計に接続して、電極ホルダーに電極を固定する。
    2. 未処理のペトリ皿を、電極の検知面の下にあるシザースジャッキの上に配置する。このとき、検知面がペトリ皿の底面と平行であることを確認し、ペトリ皿が電極にほぼ接触するまでシザースジャッキのテーブルを上げる（図 2）。
  2. 測定サンプルの調製
    注：サンプル：本プロトコルにおいてサンプルとは、拡散後のF¯トラップに酢酸と水を加えた、イオン選択電極（ISE）で測定する最終生成物のみを指す。 
    1. サンプルのpHを5に調整するため、インキュベーション期間後、ロッカーから拡散皿を取り出し、ペトロラタム封印を破って慎重に蓋を持ち上げる。蓋を平らな面に伏せ、3滴のF¯トラップが乱されないようにする。
    2. P20ピペットを用いて、1滴に0.2 N 酢酸を15–20 µL加える。その後、ピペットチップを変えずに3滴すべてを1滴にまとめる。
      注：F¯濃度が高いサンプルは、初期pHが低くなる傾向があるため、F¯含有量が少ないサンプルに比べて、pHを5に調整するために必要な0.2 N 酢酸の量は少なくて済む。電極電位の記録（ステップ 5.3）後の残りのサンプル量は極めて少ないため、残っているサンプルを用いて指示薬紙でpHを確認する。
    3. サンプルの容量を調整するため、P100ピペットを75 µLに設定し、空気が入らないようにF¯トラップの全量を吸引し、超純水を用いてサンプルの量を正確に75 µLに調整する。
    4. フッ化物濃度の計算において正確な容量を確保するため、この操作は慎重に行う。サンプルをピペットチップ内に保持したまま、直ちにステップ4.3へ進む。
  3. 検体、校正、および品質管理サンプルの測定
    1. サンプルの電極電位を測定するため、フッ化物イオン選択電極の検知面とペトリ皿の間にサンプルを分注する。電極の検知面全体が液体に完全に浸かり、かつペトリ皿に直接接触していないことを確認する。電位計が安定するまで待ち、ISEに表示された電位（mV）を記録する。
    2. 最も低いF¯濃度から順に、最も高い濃度まで、校正標準試料の第1セットを順次測定し、校正標準曲線を決定する。
      1. 電極電位（mV）をF¯（ng）の対数に対してプロットし、校正曲線を作成する（図 3）。指数回帰を適用して、標準曲線の式と決定係数（R2）を求める。R2が0.99以上の校正曲線のみを採用する。
    3. 各検体サンプルを測定し、電極電位（mV）を記録する。
    4. 電極の安定性を監視し、アッセイのドリフトを検出するため、各分析ランの間隔をあけて品質管理サンプルを測定する。
      1. 品質管理サンプルの値を対応する校正サンプルと直接比較し、約5%以内で一致することを確認して、経時的な電極性能の安定性を検証する。
      2. サンプルの取り扱いおよび拡散中にフッ化物汚染がなかったことを確認するため、ブランクの拡散皿を定期的に測定する。
  4. 各検体サンプルのF¯（ng）の質量を計算するため、標準曲線の式を使用する。次に、この質量を拡散皿に加えた血清の容量（µL）、または骨または歯の灰の質量（mg）で除す。
    1. 骨灰中のF¯濃度の計算例（ng/mg）
      1. 拡散皿に加えた骨灰の質量：5.1 mg； 75 µL検体サンプルの電極電位：–31.6 mV
      2. ステップ 1：校正式を用いてフッ化物質量を計算する
        1. F⁻質量 (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. F⁻質量 (ng) = 13,641 ng
      3. ステップ 2：骨灰中のフッ化物濃度を計算する
        1. F⁻濃度 =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. F⁻濃度 =  2,675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
図 2: ISE測定セットアップの概略図。図 2は、2チャンネルイオン選択電極（ISE）を用いたフッ化物イオン測定の構成を示している。シャーレをシザーリフト上に配置し、電極に対する高さを精密に調整できるようにしている。ISEを電位差計に接続し、その感応面がシャーレの平面と平行になるように向きを調整し、約1–2 mmの距離を維持する。間隔を設定した後、少量のサンプル（75 µL）を感応面とシャーレの隙間にピペッティングし、測定中にサンプルが電極の感応領域を完全に覆うようにする。この図は著者らがBiorenderを用いて作成し、CC BYライセンスの下で提供されている。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-protocol-3
図3歯牙標本試料中のフッ化物イオン量の定量のための検量線および対応する検量表上段パネル：歯標本試料中のフッ化物イオン質量を決定するために使用した検量線の例。x軸は電極電位（mV、線形スケール）を、y軸はそれに対応するフッ化物イオン質量（ng F⁻）を示す。⁻（対数スケール）。測定された校正点は実線でプロットされ、フィッティングされた指数回帰は点線で示されている。挿入図には、標準曲線の式と決定係数（R2）が表示されている。2 = 0.99)。下パネル：検量線を作成するために使用した数値を含む表。1行目には、校正試料で記録された5つの電極電位（mV）が記載されている。2行目には、対応するフッ化物イオン質量（ng F⁻)を各校正サンプルについて。3行目には容量（µL10 mM NaFストック溶液を校正用拡散ディッシュに添加します。この添加されたフッ化物イオン量は、拡散後に各校正サンプルに捕捉された量に相当します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

生物学的試料中のフッ化物（F-）濃度測定における本プロトコルの適用性を実証するため、制御されたフッ化物投与を行ったマウスから採取した血清、骨、および下顎切歯を用いて検体サンプルを作成した。雄のC57BL/6Jマウスを、若齢（6週齢）と成齢（18週齢）の2つの年齢カテゴリーに分け、フッ化物を含まない脱イオン水（0 ppm F⁻）またはフッ化ナトリウムを添加した飲料水（125 ppm F⁻）を6週間の暴露期間にわたって提供した。各年齢および投与条件につき5匹の動物を用いた。暴露期間の終了後、血清、大腿骨、および下顎切歯を採取し、本プロトコルに従って検体サンプルを調製し、分析を行った。血清、骨、および歯で測定された代表的なフッ化物濃度を以下にまとめる。

figure-results-1
図4血清、大腿骨、および下顎切歯で測定されたフッ化物濃度。 雄のC57BL/6Jマウスを、若年期（6週齢、白抜き棒グラフ）と成熟期（18週齢、塗りつぶし棒グラフ）の2つの年齢カテゴリーに分け、フッ化物不含の脱イオン水（0 ppm F⁻）またはフッ化ナトリウム添加飲料水（125 ppm F⁻）で6週間の曝露期間を設けた。曝露期間の終了後、同一の処置群から（A）血清、（B）大腿骨、（C）下顎切歯におけるフッ化物濃度を測定した。検出限界を下回る血清値（<0.02 ppm) は可視化のためにプロットしたが、統計解析からは除外した。データは平均値として的に表示している ± 標準偏差（SD） 思春期群と成熟群の比較は、多重比較のためのボンフェローニ・ダン補正を用いたマン・ホイットニーのU検定により行った。 *p < 0.05, **p < 0.01（N = 5/群）。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

血清中のフッ化物濃度
0 ppmのフッ化物で処理した若年群および成体群の両方において、血清フッ化物濃度はイオン選択電極の検出限界以下であった（<0.02 ppm）。125 ppm投与群では、血清フッ化物濃度は0.3まで上昇した。 ± 青年グループでは0.2 ppm、そして0.7まで ± 成熟群では0.2 ppm（p = 0.06). 125 ppm処理群における青年期グループと成熟期グループの比較は、多重比較のためのBonferroni–Dunn補正を用いたMann–Whitney U検定により行った。 *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/群)。0 ppmの処理群は統計解析から除外した。図4A, 表1).

大腿骨におけるフッ化物濃度
0 ppm投与群において、大腿骨のフッ化物濃度は成熟個体（896 ± 55 ppm）と比較して若齢個体（292 ± 39 ppm）で有意に低かった（p < 0.01）。対照的に、125 ppm投与群では、若齢個体（4,108 ± 482 ppm）のフッ化物濃度は成熟個体（2,966 ± 612 ppm）よりも有意に高かった（p = 0.04）。若齢群と成熟群の比較は、多重比較のためのBonferroni-Dunn補正を伴うMann-Whitney U検定を用いて行われた。 *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (Figure 4B, Table 1). Figure 5Aは、各年齢群における0 ppm投与時と125 ppm投与時の大腿骨フッ化物濃度の倍率変化を示している。若齢個体では125 ppmにおいてフッ化物レベルが14倍に増加したのに対し、成熟マウスでは3倍の増加を示した。

下顎切歯におけるフッ化物濃度
0 ppm群では、下顎切指のフッ化物濃度は成熟個体（123 ± 23 ppm）と比較して若齢個体（35 ± 4 ppm）で有意に低かった（p = 0.03）。125 ppm投与群では、切歯のフッ化物濃度は若齢個体で5641 ± 955 ppm、成熟個体で4392 ± 1694 ppmまで増加した。若齢群と成熟群の比較は、多重比較のためのBonferroni–Dunn補正を伴うMann–Whitney U検定を用いて行った。 *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/群)。(図4C, 表1)。125 ppmにおける絶対的なフッ化物濃度は年齢群間で有意な差はなかったが、0 ppmから125 ppmへの倍率変化は、成熟マウス（36倍増）よりも若齢マウス（161倍増）で有意に大きかった（図5B）。

figure-results-2
図5若年期のマウスは、成熟マウスよりも骨および切歯におけるフッ化物蓄積の倍率増加が大きい。 若年マウス（白抜き棒）および成熟マウス（塗りつぶし棒）における、フッ化物濃度0 ppmから125 ppmへの処理に伴う比率変化。A) 大腿骨および (B）同一治療群の下顎切歯。データは平均値で表示している。 ± SD。青年群と成人群の比較は、対応のないt検定を用いて行った。* p < 0.05（群あたり N = 5）。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

サンプル血清大腿骨下顎切歯
年齢層思春期成熟した思春期成熟した思春期成熟した
処置群0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192該当なし72711114909
平均値< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
標準偏差該当なし0.2該当なし0.239482556123955231694

表1：血清、大腿骨、および下顎切歯における個別のフッ化物測定値。表1には、0 ppmまたは125 ppmのフッ化物に曝露させた若齢マウスおよび成熟マウスから採取した血清、大腿骨、および下顎切歯検体で測定された個々のフッ化物濃度（ppm F⁻）が示されています。組織型ごとに、若齢 0 ppm、若齢 125 ppm、成熟 0 ppm、成熟 125 ppmの4つの処理群に対応する列にデータが提示されています。各列には、記録された5つの個別の値（N = 5）が含まれ、その後に算出された平均値と標準偏差（SD）が続いています。若齢 0 ppmの血清群では、すべての記録値がイオン選択電極の検出限界（<0.02 ppm）以下でした。この表は、図4に示されている要約値および統計比較の根拠となる生の数値データを提供しています。

ディスカッション

フッ化物イオン選択性電極（ISE）を用いてフッ化物測定を行った。この電極にはランタンフッ化物（LaF₃）結晶膜が組み込まれている38,39。この膜は非常に安定したLa–F結合を形成するため、他のハロゲン化物よりもフッ化物イオンに対して強い選択性を示す。確立された電気化学文献およびメーカーの仕様書によれば、LaF₃膜は塩化物に対する選択係数が非常に低く、本プロトコルで使用した条件下では塩化物イオンが測定可能な干渉を引き起こさないことが示されている。塩化物は歯や骨に天然に存在するが、その活性は電極電位に影響せず、記録された信号は特異的にフッ化物活性を反映している。検出下限の0.02 ppmは、Orionフッ化物選択性電極においてメーカーが検証済みの最小定量濃度に対応している。この限界値は、電極が安定したネルンスト応答を維持し、検量線と線形関係を保つことができる最低のフッ化物濃度を反映している。検出限界は電極の膜特性によって定義され、メーカーによって検証されているため、本プロトコルにおいて追加の実験的な決定は不要であった。しかし、検出上限については、50 µLのNaOHトラップ中のフッ化物量が約38,000 ngを超えると、電極応答が非線形になることが著者らによって観察されており、これは極めて高いフッ化物負荷においては検量線が信頼できなくなることを示している。この非線形性は、ISE自体の固有の上限値を反映しているのではなく、与えられた実験条件下で電極にとって最適なイオン強度および活性範囲を超えたことによる可能性が高い。 この閾値を超えるフッ化物量が含まれると予想される試料については、電極の線形ダイナミックレンジ内で測定を維持するために、NaOHトラップの容量を増やすことが推奨される。

フッ化物含有量が異常に高いサンプルに本プロトコルを適用する場合は、この点を考慮する必要があります。拡散ステップでサンプル全量を消費するため、生物学的サンプルを用いて重複測定やスパイク回収実験を行うことはできませんでした。分析の正確性と精度を確保するため、既知のフッ化物濃度を含む品質管理（QC）標準物質をすべての測定シリーズに含めました。これらのQC標準物質は、実験サンプルと同一の方法で処理および測定されました。すべてのランにおいて、QC標準物質の測定されたフッ化物濃度は、期待値の5%以内に一貫して収まっていました。 10～20個の検体サンプルの各シリーズについて、検体サンプルと並行して5～6個の校正サンプルを2組独立して調製し、各測定セッションの前に校正曲線を記録しました。校正範囲は、検体の種類、拡散皿に添加した物質の質量、および動物の治療群と年齢に依存する、検体サンプルの予想フッ化物量に近似するように、ランごとに調整されました。血清測定の場合、校正標準物質は検体中のフッ化物濃度約0.06–1.20 ppmに相当しました。骨および歯の測定の場合、校正標準物質は検体中のフッ化物濃度約19–7,600 ppmに相当しました。

本プロトコールでは、ヘキサメチルジシロキサン促進拡散とそれに続くISE分析を用いて、血清、骨、および歯におけるフッ化物イオン量を定量するための、感度が高く再現性のある手法を提供します。この手法は、多様な生物学的マトリックスから放出されるフッ化物を確実に捕捉し、制御された曝露後のフッ化物蓄積の定量的な評価を可能にします。若齢マウスおよび成熟マウスからの代表的な結果は、組織間のフッ化物沈着における明確な年齢および用量依存的な差を示しており、生体内（in vivo）でのフッ化物代謝および毒性動態を研究する上での本手法の有用性を強調しています。

本プロトコルの主な強みは、フッ化物放出反応とフッ化物捕捉環境を物理的に分離する拡散ディッシュを使用している点にあります。ペトロラタムで密封された設計により、大気との交換が最小限に抑えられ、蓋上の水酸化ナトリウム液滴によって放出されたフッ化物イオンを効率的に捕捉できます。HMDS飽和硫酸は、骨や歯などの高度に石灰化した構造を含む石灰化組織からフッ化物を放出させるための、強力かつ一貫した駆動力を提供します。その後、拡散条件を合わせた標準試料で校正したISE測定を行うことで、広いダイナミックレンジにわたる正確な定量が可能になります。本アプローチのもう一つの利点は、極めて微量な生物学的試料中のフッ化物を定量できることです。マウスの石灰化組織、特に下顎切歯では、1本あたりの灰分はわずか3–5 mgしか得られません。従来の分析法では、信頼性の高い検出を実現するために、より大きな試料量やより高いフッ化物含有量が要求されることが多くあります。対照的に、この拡散ベースの設計では、検体全体から放出されたすべてのフッ化物を小さな限定された体積に濃縮するため、絶対的なフッ化物量が少ない微小試料であっても正確な定量が可能です。この特徴は、小型動物を用いた研究や、組織の入手量が限られている場合、あるいは微小切除された石灰化構造を扱う研究において特に有用です。

本手法の主な制限は、本研究で使用したISEの検出限界（0.02 ppm）にあります。フッ化物を含まない対照動物の血清サンプルは、この閾値を下回ることが多く、極めて低濃度のフッ化物の定量が困難でした。検出限界付近またはそれ以下の微量濃度を測定する場合、可能であれば拡散ディッシュに加える検体の質量または容量を増やすか、あるいは代替の分析手法が必要となる可能性があります。加えて、本手法では一晩の拡散時間と腐食性試薬の慎重な取り扱いが必要であり、大量のサンプルを扱う研究ではスループットが制限される場合があります。ISEはバルクのフッ化物を感度良く定量できますが、組織内の空間的な分布を評価することはできません。走査電子顕微鏡エネルギー分散型X線分光法（SEM-EDX）や粒子誘起ガンマ線放出分析（PIGE）などの相補的なアプローチを導入することで、マイクロからマクロスケールでのフッ化物分布の可視化およびマッピングが可能です。これらのイメージングベースの手法により、石灰化組織または軟組織における局所的なフッ化物の蓄積を評価でき、これによりISEによる測定を補完し、組織中のフッ化物含有量についてより包括的な評価が可能となります。

本プロトコルにおけるフッ化物の拡散および測定の正確性と信頼性に影響を及ぼし得る、いくつかの反復的な技術的要因が存在します。我々の観察結果は、校正準備、拡散皿の密封、pH制御、電極の性能、およびサンプルの取り扱いが、総体としてデータの品質をどのように決定づけるかを浮き彫りにしています。校正曲線が非線形（R2 < 0.99) または組織サンプルの測定値が想定範囲外である場合は、拡散皿に添加したNaFストック溶液量の計算ミス、または校正標準試料の調製時のピペッティングエラーが考えられます。推奨される対策：各ランにつき、少なくとも2セットの独立した校正試料を調製し、1つの校正曲線が想定範囲外となった場合にバックアップセットを利用できるようにしてください。また、拡散皿の密封が不十分な場合、拡散中にフッ化物イオンが失われ、測定値が人為的に低くなることがあります。これは通常、拡散皿の蓋の縁に塗布したペトロラタム（ワセリン）が不十分な場合に起こります。. 推奨される操作: 拡散皿の蓋の縁にワセリンを十分に塗布し、完全に密閉されるように強く押し付けてください。NaOHトラップに酢酸溶液を添加する際のピペッティング誤差により、試料のpHが最適範囲であるpH 5.0から外れ、フッ化物の回収率に不正確さが生じる可能性があります。推奨される対処法: pH試験紙を用いて各サンプルのpHを確認し、pH 5の範囲外にあるサンプルは破棄してください。また、校正サンプルがフッ化物イオン選択性電極の有効測定範囲外となる場合があります。0.02 ppm未満の濃度は、電極の検出限界以下です。推奨される処置: 0.02 ppm未満のフッ化物を含む校正試料は使用しないでください。逆に、フッ化物濃度が高すぎる校正試料は、溶液のイオン強度を変化させ、電極応答に非線形性をもたらす可能性があります。推奨される対応: プロジェクトの開始時に、使用する電極固有の線形動作範囲を決定するため、広範なフッ化物濃度をカバーする校正溶液を調製してください。組織サンプルの濃度がこの線形範囲を超える場合は、組織量を減らすか、NaOHトラップの容量を増やし、それに合わせて酢酸量を調整してpH 5を維持してください。0.02～1 ppmの範囲で線形校正曲線が得られない場合：一般的な原因は電極の経年劣化です。古いフッ化物選択性電極は、極めて低いフッ化物濃度において感度が低下します。推奨される対策：フッ化物選択性電極を交換してください。電位計の読み値が不安定な場合（信号のドリフトや跳ね上がり）：通常、電極の検知面がサンプル溶液に完全に浸かっていないときに発生します。推奨される対策：電極を下げ、検知面が液体サンプルに完全に覆われるようにしてください。

全体として、本プロトコルは、多様な生物学的マトリックス中のフッ化物を定量するための堅牢な校正ベースのアプローチを提供し、マウスモデルにおけるフッ化物曝露、組織への蓄積、および毒性学的転帰を調査する研究に適しています。

開示事項

著者は利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本出版物で報告された研究は、日本学術振興会（JSPS）海外特別研究員 202560528 (S.Y.)、サンパウロ州研究支援財団 (FAPESP) 2024/07452-9 (J.S.T.)、および米国国立衛生研究所 国立歯科・頭蓋顔面研究所 R01DE027648 (M.S.) および K02DE029531 (M.S.) の支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
氷酢酸Sigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
アルミナるつぼアドバリュー・テクノロジー外径 12 mm × 高さ 25 mm, AL-6212AL-6212
分析天秤VWRVWR 124B2, d = 0.1 mg—
ビーズビーターベンチマークBeadBug 6—
鈍針シリンジ針アマゾン工業用鈍端針、14G × 0.5インチX001TT8KX1
二酸化炭素エアガス——
化学薬品用ドラフトチャンバーMott Manufacturingモデル 7421040—
D(+)-スクロースThermo Scientific生化学における99.7%177142500
電極充填液Thermo ScientificOrion IonPlus 充填液900061
エタノール溶液Koptec140プルーフ2401
冷凍庫 −80 °CThermo ScientificRevco RDEシリーズ—
耐熱手袋Fisher ScientificBel-Art Clavies バイオハザード用オートクレーブ手袋H13201
ヘキサメチルジシロキサン (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091 >98%H0091
過酸化水素VWRJ.T. Baker, 30%2204-01
イオン選択電極Thermo ScientificOrion フッ化物イオン選択性電極、ダブルチャンネル9609BNWP
マグネティックスターラーVWR360度攪拌機—
マイクロスパチュラアマゾンワックスカービングスパチュラ #7A、ステンレス製—
マイクロ遠心機Eppendorf5427R5404000131
マッフル炉Thermo ScientificThermolyne 小型卓上マッフル炉, 1.3 L, FB1315MFB1315M
オーブンBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
PBS中パラホルムアルデヒド溶液Thermo ScientificPBS緩衝液中4%パラホルムアルデヒドJ19943-K2
シャーレVWR60 × 15 mm、未処理25384-092
ワセリンThermo Scientific白色純製・ワセリン417090010
pH指示紙Fisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
磁製ディッシュFisher ScientificFisherbrand 坩堝、5 mL、高さ 20 mm、ハイフォームFB-965-B
ポテンショメータThermo ScientificOrion Dual Star pH/ISEメーター2115102
クランプ付きリングスタンドVWRリングクランプ、15 cm470104-526
げっ歯類用飼料Bio-ServF1515, AIN-76A, ½ ペレットF1515
シザーリフトジャッキアマゾンラボ用シザーリフト—
分液漏斗Fisher ScientificEisco社製、ホウケイ酸ガラス、2 LS89285
塩化ナトリウムFisher ScientificACS認定、結晶性S271-1
フッ化ナトリウムFisher ScientificACS認定, 粉末S299-100
水酸化ナトリウムFisher Scientific白色ペレットBP359-500
ステンレス製ビーズFisher ScientificScientific Industries、5 mm、100本SI-CS05
硫酸Fisher ScientificACSグレードA300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlusアプリケーション溶液940909
真空デシケーターFisher ScientificBel-Art Space Saver 真空デシケーター 10インチF42010-0000
真空ろ過装置Fisher Scientificフローボトルトップフィルター、PES、90 mm 0.2 µm597-4520
可変速ロッカMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

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