シルクフィブロインスポンジを用いた3D細胞培養ベースのハイブリッドバイオアナリティカルプラットフォーム(光学イメージング用)

サマリー

本記事では、流れ制御条件下で4T1-iRFP720乳がん細胞のシルク足場生成および培養のためのシンプルでアクセスしやすく再現可能な方法論を説明し、動的培養を支援しています。細胞の成長と移動は、生体内の光学イメージング機器を主要な非侵襲的読み取りとして概念実証として評価しました。

要約

私たちは、細胞特性の前臨床評価を目的とした革新的なバイオアナリティカルハイブリッドプラットフォームを提案します。このシステムは、人工細胞外マトリックス上で培養した三次元(3D)細胞培養と、クロマトグラフィーに着想を得たアレイ構成を組み合わせています。構造タンパク質であるシルクフィブロインから作られたスポンジは、生体模倣的な細胞外マトリックスであると同時に、定常相としても機能します。シルクフィブロインスポンジは、生糸繊維から固有セリシンタンパク質を除去し、その後フィブロイン溶液を溶解・透析して精製し、有機溶媒に溶解し、塩床鋳造を経て500〜800μmの管理された多孔性・孔径を持つ絹ベースのスポンジを生成する多段階の工程で製造されました。遺伝子組み換え乳がん細胞株4T1-iRFP720および4T1-wt(非蛍光対照)は、ポンプによる連続培地フローを用いてシルク足場内で培養し、その細胞の成長と特性を光学イメージング技術(in vivo 光学イメージング機器)を用いて非侵襲的に解析しました。クロマトグラフィーシステムの主要な利点(自動化、再現性)と高度な3D細胞培養の生物学的関連性を融合させることで、このプラットフォームは組織様構造や形態の in vitro モデリングを可能にしつつ、動的な細胞挙動のモニタリングを促進します。同時に、医療画像技術の応用により、細胞の移動や成長のリアルタイムかつ長期的なモニタリングなどが可能になります。このアプローチは、層流に似たシステムにおける細胞挙動をマクロスケールで調査する大きな可能性を提供します。in vitro モデルの生理学的関連性を向上させることで、この方法はin vivo 研究への翻訳ギャップを埋める助けとなり、動物実験におけるreduce, replacement, refine(3R)フレームワークとも整合しています。

概要

生体組織では、細胞の移動と増殖は三次元で異質な細胞外マトリックス(ECM)内で行われ、間質液の流れや細胞間相互作用などの生物理的・生化学的手がかりによって導かれます。これらの因子は細胞極性、機械伝達、協調運動を調節し、組織修復やがん侵入などの重要な生物学的プロセスを支えています1,2,3,4。

重要性にもかかわらず、スクラッチやトランスウェルアッセイなどのほとんどのin vitro移動アッセイは、平坦で静的な基質上での単細胞移動を評価します。シンプルでコスト効率は高いものの、これらの2D手法は生体内マイクロ環境の構造的・動的特徴を十分に再現できません^5,6。この制限は、がん転移の文脈で特に重要であり、腫瘍細胞は機械的・化学的に多様な組織マトリックスを集団移動^します。2Dスクラッチアッセイは実施が容易なため依然として人気がありますが、ECMの複雑さや流体^フロー6の影響を反映していません。トランスウェルベースのアプローチは定量的な読み取りを提供しますが、固定されたエンドポイントでのみ行われ、移動の連続観察を妨げ^ます。

最近の研究では、間質性の流れが転移性の可能性を高める一方で、ECMの剛性と組成は上皮-間葉質の移行と集団移動を促進することが示されています^4,10。球状体やオルガノイドなどのより高度な3Dシステムは、ネイティブECM環境をより正確に近似します。しかし、その利用はしばしば変動性、実験のアクセスの限界、標準化解析の困難さによって制約を受けています(^11,12)。マイクロ流体プラットフォームは機械的および流体的条件に対する優れた制御を提供しますが、専門的な製造方法や装置に依存しているため、^{その広範な利用}は制限されています。したがって、これらの統合された手がかりを、制御されやすく、アクセスしやすく、非侵襲的かつコスト効率の高い方法でin vitroで再現することは、依然として^{大きな課題となっています5,14}。

これらの課題に対応し、従来の2Dアッセイと複雑な in vivo モデルのギャップを埋めるために、シルクフィブロインスポンジスキャフォールドに基づくシンプルなフロー対応型3Dセルラープラットフォームを開発しました。このシステムは、機械的特性を調整可能なシルクスポンジをECMのような足場として用いています。シルクはその多孔質構造が選ばれ、穏やかな灌流を可能にし、生理学的に重要な間^{質流をサポートします}。その生体適合性と生体医工学および組織工学での確立された利用により、この用途に適した材料となっています。最近の出版物では、足場の環境持続可能性と^{リサイクルの可能性が}さらに示されました。別の研究では、陽電子放出断層撮影など異なる画像手法に対する適応性をさらに示^{しました。}この先行研究は、本研究の方法論記述の基礎となり、同じプラットフォームコンセプトを基に、より簡略化された in vivo 光学イメージング構成で構築しています。これらの研究は、工学的組織構造のマルチモーダルイメージング評価の可能性を示し、異なるがん細胞モデル間で in vitro 培養および in vivo 関連指標を統合する多用途な実験プラットフォームとしての利用を支持しています。

概念実証として、2つの低せん断応力流条件下で足場内でiRFP720標識4T1三陰性乳がん細胞を5日間培養しました。非侵襲 的なin vivo 光学イメージングモニタリングでは、静的対照と比較して明確な流れ指向型成長パターンと細胞集団動態の有意な変化が明らかになりました。工学的単純性と再現性を重視することで、このモデルは2Dアッセイと in vivo 研究の間に実用的な架け橋を提供し、研究者が生理学的に関連しつつアクセスしやすい形で、マクロスケールかつ非侵襲的にフロー媒介細胞特性を調べることを可能にします。従来の手法が破壊的なエンドポイント解析に依存したり、標準化されたシーディング基準を欠いたりするのに対し、このプロトコルは足場生成の最適化と、その後の細胞シーディングおよび画像診断のための体系的な枠組みを導入します。このアプローチは実験的な堅牢性を高め、3D行列内の集合細胞動態をより包括的かつ縦断的に見せるため、成長と移動の監視における既存の手法に比べて大幅に洗練されています。

プロトコル

最初のセクションは、先行の研究¹⁶に基づく絹フィブロイン足場の準備方法を示しています。以下のセクションでは、細胞シーディング密度の最適化、フローの統合、細胞の動きと成長のモニタリングのための光学イメージングの統合について説明しています。本研究は確立されたマウス乳がん細胞株(4T1-wtおよび4T1-iRFP720)のみを使用し、ヒト参加者、患者サンプル、一次組織、または生きた動物は含まれていません。機関および国家のガイドラインに従い、倫理的承認は必要ありませんでした。ワークフローの概要は 図1に示されています。

1. シルクフィブロインスポンジの調製

1. 繭の掃除と脱脂。
   1. 安全メスを使ってカイコ( Bombyx mori L. )の繭を切り開きます。
   2. 幼虫を取り出し、標準的な解剖針を使って最も内側の繭層(幼虫腔を直接囲む緻密な層)を抽出します。
   3. ビーカーに1.6リットルの二重蒸留水(ddH_2O)を満たします。
   4. 磁気かき棒を加え、かき混ぜながら水を沸騰させます。加熱を早め、水分損失を減らすためにアルミホイルでビーカーを覆います。
   5. 水温が約70°Cに達したら、Na_2CO3を3.4g加えます。
   6. 混合物が沸騰し始めたら、4gの準備済み繭を溶液に入れ、ガラス棒でかき混ぜます。
   7. 繭を30分間煮込み、10分ごとにガラス棒でかき混ぜて適切な露出を保ちます。
   8. 溶液からシルクを取り出し、水道水で何度も洗い流して残ったセリシンを除去します。
   9. 過剰な水を絞り出し、絹の繊維を準備されたアルミホイル皿に広げます。
   10. 絹繊維を予熱したオーブンで50°Cで完全に乾かすまで(約18時間)乾燥させます。
2. 溶解と透析
   1. 次の工程では絶対エタノールと無水_CaCl2 を使用します。溶解マトリックスはCaCl₂の1部、エタノールの2部、ddH₂Oの8部から成ります。乾燥脱膠シルクと溶解マトリックスの比率は1:10[w/w]です。
   2. 乾燥した絹を秤にかけ、溶解マトリックスに適した成分量を計算します。
   3. 攪拌棒付きの丸底フラスコに、それぞれの量の_CaCl2 を満たします。
   4. 必要なエタノール量とddH_2Oを測定し、それらを組み合わせます。
   5. かき混ぜながら、エタノール-ddH_2Oの混合物をCaCl₂ に加えます。
   6. リフラックス装置を設置し、油浴で混合物を100°Cまで加熱し、_CaCl2 を溶かして混合物を沸騰させます。
   7. 混合物が沸騰し始めたら、乾燥したシルクを加え、逆流で45分間加熱します。
   8. 長さ15cmの3.5 kDaセルロース透析管を水で何度もすすぎて水を補充し、片方の端をガラス棒にシールクリップで固定します。
   9. 沸騰後、熱い絹溶液をチューブに移し、反対側をクリップで密封し、液体と密封クリップの間に2〜3cmの隙間を残し、空気の封じ込めはありません。
   10. 充填された透析チューブをddH_2Oを入れた2リットルのビーカーに入れ、室温で72時間透析を行い、効果的な浄化のために1日2回水を交換します。
   11. 溶液を4500 × g で室温で10分間遠心分離します。
   12. ペレットを乱さずに上清液を優しく遠心分離機管に注ぎ、チューブを-20°Cで保存します。
       注意:遠心分離機のチューブは容量の半分以下まで満たし、水平に冷凍してください。
3. 凍粉化
   1. 真空ポンプを20分間予熱し、メーカーの指示に従って凍乾剤を操作してください。
   2. 冷凍した遠心分離機のチューブを冷凍庫から直接、丸底のフラスコに入れます。
   3. フラスコを冷凍乾燥器に取り付け、24時間凍結乾燥します。
   4. 再使用まで、凍乾した絹フィブロインは乾燥した室温の場所で保管してください。
4. 溶媒鋳造と粒子浸出
   1. 尿サンプル容器の排気フード下で、必要な量の凍乾シルクを1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)に加え、最終体積30 mLの16%[w/v]溶液を得て、蓋をして容器を蓋をします。
      注意:HFIPは吸入、摂取、皮膚を通じて吸収されると腐食性かつ有害です。溶媒をフームフード内で取り扱い、適切な個人用防護具(PPE)を着用し、皮膚や目、蒸気との接触を避けてください。こぼれた場合は、吸収材を使って液体を回収し、影響を受けた部分を清掃してください。汚染物質を指定された有害廃棄物容器に移送します。
   2. 容器をしっかり密封し、70回転/分の軌道シェーカーに18時間置いてシルクを溶かします。
   3. 異なるメッシュを用いてNaClをふるいにかけ、500〜800μmの割合を除外します。
   4. ペトリ皿(直径9cm、底径8.5cm)にふるいにかけた塩100g(500〜800μmの割合)を入れ、高さ1.2cmにします。表面が均等に水平になっていることを確認してください。
   5. 用意した絹溶液25.5mLを塩床(スポンジ孔形成のためのポロゲン)に優しく注ぎます。
   6. ペトリ皿に蓋をして、70回転/分の軌道シェーカーに10分間置き、絹溶液が塩床に均一に浸透します。
   7. 蓋を閉じたまま37°Cで1時間抱卵します。その後、蓋を開けて37°Cでさらに18時間抱卵します。
   8. ベータシート形成を誘導するには、絹複合材をメタノール入りのビーカーに20分間浸し、その後取り出して50°C(約1時間)のオーブンで乾燥させます。
      注意:メタノールは非常に有毒です。適切なPPEを着用した状態でフルームフード内で取り扱い、皮膚との接触や蒸気曝露を避けてください。こぼれた場合は、吸収材を使って液体を回収し、影響を受けた部分を清掃してください。汚染物質を指定された有害廃棄物容器に移送してください。
   9. 絹複合材を温かい水道水を入れたビーカーに少なくとも3時間浸し、20〜30分ごとに水交換を行い、硬い部分が残りなくなるまで、柔らかくスポンジのような質感になるまで、ポロジェンNaClを除去します。
   10. シルクスポンジは4°Cの消毒と短期保存のために70%エタノールに保管してください。
       注:HFIP含有溶液はハロゲン溶媒廃棄物として収集され、メタノール廃棄物は非ハロゲン有機溶媒廃棄物として別途処分され、機関の化学物質安全ガイドラインに従い処理されました。使用後の除染のために、HFIPやメタノールにさらされた容器や作業面は、適合する溶剤で洗浄し、洗剤溶液で洗浄されました。初期のすすぎと汚染された消耗品は化学的有害廃棄物として収集されました。

2. 絹足場の準備と平衡

1. 直径6mmの生検パンチで絹フィブロインスポンジを切断し、直径6mm、高さ12mmの円筒形足場を得ます。
   注:準備されたシルクフィブロインスポンジスキャフォールドは、70%エタノールで4°Cで最大4か月間保存可能です。長期保存の場合は、定期的に新しいエタノールに交換することが推奨されます。平衡化された足場は、細胞培養培地で4°Cの温度で最大1か月間保存することができます。
2. サンプルを70%エタノールの入った遠心分離機に入れて消毒します。
3. 認証済みの生物学的安全キャビネットで以下の手順を行い、汚染防止を行います。
4. ピペットでエタノールを吸引しながら、ピンセットでスポンジを押さえます。
5. スポンジを10〜20mLのロズウェルパーク記念研究所(RPMI)-1640培地を補充したペトリ皿に入れて完全に浸します。
6. メディアを3回交換し、それぞれの交換の間に少し揺らぎをつけます。
7. 3回目の洗濯後、新しいメディアを加え、蓋をしっかり閉めてパラフィンフィルムで包みます。
8. スポンジは細胞培養使用前に、少なくとも1週間は4°Cの冷蔵庫で保存してください。この間、メディアを4〜5回交換します。
   注意:残留エタノールは細胞毒性があり、細胞の付着や生存能力を損なうため、エタノールを完全に除去してください。

3. 背景測定および画像最適化

1. 空の光学透明ろ過管および未シードシルク足場を含む光学透明ろ過管を生 体内 光学イメージングへ運搬します。
   注:画像は2Dエピフルオレッセンスモードの 生体内 光学イメージングを用いて行われました。
2. 異なるフィルターペア(励起:675 nm、745 nm;発光:720 nm、800 nm)、露光時間(4–60秒)、絞り値(1–8)、視野角(13.5–22.5 cm)、および異なるランプレベル(低・高)でイメージングを行います。
3. 細胞シードスキャフォールドを使用する前に、同一条件下で両プラットフォームをイメージングして自己蛍光を評価する。
4. イメージング専用セットアップでは、オスルアーロックインレットをカットオフメスルアーロックコネクタに交換し、オスルルアーロックコネクタから発生する高強度の自己蛍光アーティファクトを除去します。すべての実験で材料が同じであれば、このステップは一度だけ必要です。
    

4. 細胞懸濁液の準備および絹フィブロイン足場へのシーディング

注意:以降のすべての手順は生物安全キャビネット内で無菌状態で行ってください。これらの手順には生細胞および細胞含有サンプルの取り扱いが含まれます。

1. 4T1野生型(4T1-wt)および4T1-iRFP720のマウス三陰性乳がん細胞を定期的に観察し、iRFP720発現の安定性を調査します。
2. RPMI-1640培地に10%胎児の子牛血清、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補足し、加湿インキュベーター(5%_CO2)で4T1-wtおよび4T1-iRFP720を37°Cで維持します。
3. 約80%コンフルエンスで、標準的な無菌培養手順に従い、0.25%トリプシン-EDTAを用いるパスセージ細胞。
4. すべての比較実験において、4T1-wtおよび4T1-iRFP720細胞に対して同一の通過番号と培養条件を用いてください。
5. 細胞シーディング密度を5 × 10 4から5 × 10⁷ cells/mLの範囲(1 × 10 4 〜 10 ×⁷ cell /mLの範囲に相当します)。画像解析用に以下の濃度を準備し、異なる細胞密度間での信号強度を評価し最適な濃度を決定する:5 × 10⁴、3.38 ×^{10 5}、6.25 × 10⁵、1.25 × 10⁶、2.5 × 10⁶、3.75 × 10⁶、5 × 10⁶、1.25 × 10⁷、2.5 × 10⁷、および5 × 10⁷ 細胞/mL。
6. 4T1-wt細胞の4T1-wt細胞を非蛍光対照群として準備します。
7. セクション2で準備された個別の足場を無菌で未処理のペトリ皿に設置します。
   注意:未処理のペトリ皿を使用して、細胞のプラスチック表面への付着を最小限に抑え、絹の足場への細胞の付着を促進してください。
8. 各足場の周囲や足場から余分な媒体をピペットで取り除き、構造が変形しないように注意してください。
9. 適切なセル懸濁液200μLを各足場の表面に直接ピペットで注ぎ、全体の体積が足場に吸収されるようにします。
10. 5%_CO2 を含んだ加湿インキュベーターで、37°Cで4時間キャフォールドを培養し、皿を乱さずに細胞の付着を許可します。
11. 4時間後、各細胞シードされた足場を慎重に、1mLの予熱済み完全培地を含む24ウェルプレートのウェルに移します。
12. スキャフォールドを5%_CO2の加湿インキュベーターで37°Cで16〜24時間(16〜24時間)培養します。

5. フリットを用いた校正プラットフォームの組み立て

注意:生物安全キャビネット内の組み立て作業はすべて、滅菌手袋、滅菌ピンセット、滅菌工具を使用して行ってください。

1. 24ウェル板から細胞シードされた絹の足場を滅菌ピンセットで取り外し、各足場を優しく支えて圧縮を防ぎます。
2. 無菌カラムプッシュロッドを使って、光学的に透明な固体相抽出チューブの下部に細胞シードされた足場を1つ挿入します。
3. プッシュロッドを使って無菌ポリエチレンフリットを足場の真上に置きます。
   注意:ポリエチレンフリットは信号最適化時のみ使用してください。ポリエチレンフリットは細胞径より細く、細胞移動やその他の細胞間接触を防ぐためです。これにより信号分離が明確になり、各信号に対応する正確なセル濃度を特定できます。
4. 積み重ねの手順を繰り返し、1つの足場の次に1つのフリットを重ね、5つの細胞シード足場と5つのフリットが挿入されるまで続けます。
5. ろ過管の底部を無菌のメスルアーロックコネクターで閉じます。
6. 抽出チューブの上部は無菌のオスルアーロックコネクターで閉じます。

6. フリットを用いた校正プラットフォームを用いた in vivo 光学イメージング機器による信号最適化(システム検証のため一度のみ)

1. 細胞シードされたプラットフォームを、光の遮断されたダークボックス内のin vivo光学イメージング室に輸送し、光漂白から保護します。
2. 施設の安全および運用手順に従って生 体内 光学イメージングを準備します。
3. 組み立てた細胞シードされたプラットフォームをイメージングステージに置きます。
4. 675 nmの励起と720 nmの放出を用いて2Dエピ蛍光画像を取得し、露光時間、ビニングファクター、f数などのイメージングパラメータを最適化して、線形検出範囲内で最大の信号強度を実現します(補 足図1 および 補足図2参照)。
5. 非蛍光基準対照として、4T1-wt細胞を適合した細胞密度でシードされた足場を含む少なくとも1本の光学的に透明な抽出チューブを含めること。
6. 蛍光強度の定量比較を可能にするため、全サンプルの画像取得は同一の取得設定で取得できます(補 足図3 および 補足図4参照)。
7. 生 体内 光学イメージングソフトウェアを用いて蛍光信号を定量化し、飽和せずに最大信号を得られる最適な細胞シーディング密度(すなわち1スキャフォールドあたり5個×10個の⁶セル)を決定します( 補足図5参照)。
   注:最終的な in vivo 光学イメージングシステム設定は、システムの線形ダイナミックレンジ内で信号取得を確保し、スキャフォールド容量飽和を避け、実験および制御条件下で安定した信号対背景比を維持するために最適化実験に基づいて選定されました。最適化された設定に基づいて、すべての実験用バイオリアクターに5個×^10個の6 セル/足場でシードします。以下の設定で2次元エピフルオレセンスモードでイメージングを行えます:励起:675 nm(帯域幅 30 nm);発光:720 nm(帯域幅 20 nm)、露光時間:10秒、ビニング係数:8、Fナンバー:8。

7. 実験用プラットフォーム組立(フリットなし)

1. 信号最適化後、決定された最適な細胞密度(すなわち5×^10個6セル/200μL、セクション4参照)で実験用足場をシードします。
2. 合計5つのシルクスポンジを用いて実験プラットフォームを組み立てます。細胞の種子付き足場1つと、細胞コミュニケーションを可能にするポリエチレンフリットなしの空の足場4つです。
3. ろ過管の上部は無菌のオスルアーロックコネクターで密封します。
4. 静的または動的培養条件に合わせて培養システムを設定
   1. 静的培養:下部ポートを無菌のメスルアーロックコネクターで密封します。その後、システムはゆるく蓋付きの遠心分離機管に設置されます。
      注:オス型ルアーロックには開口部があるため、この構成は汚染リスクを最小限に抑えつつガス交換を可能にします。この構成では、メディアは1日に1日1つフード内で手動で交換されます。
   2. 動的培養:下部ポートを無菌チューブに接続し、入口ラインを上部ポートのオスルアーロックに接続して灌流培養を可能にします。蠕動ポンプシステム(補足図6)を使って、媒体を継続的に供給・除去します。

8. プラットフォーム内のダイナミックな文化

1. ポンプおよび関連チューブの消毒を始め、最大流量で70%エタノールで10分間フラッシュします。
2. ポンプとチューブを滅菌の完全培地で少なくとも10分間すすいで、残留エタノールを除去してください。新しい培地に交換し、完全なシステム平衡を確保するためにさらに10分間灌流を続けてください。
   注意:細胞シーディング前に、すべての成分が培地で完全に満たされ、気泡がないことを確認してください。
3. 組み立て済みリアクターのオスルアーロック入口(上部)を無菌チューブとルーアロックコネクターでポンプの出口ラインに接続します。
4. ポンプの入口を完全な培地を含む無菌リザーバーに接続します。
5. リアクター出口(底部)を媒質リザーバーに接続し、再循環のパーフュージョンループを確立します。この構成により、スキャフォールドを通じて媒質を連続的に灌流しつつ、閉ループシステムを維持します。
   注:このプロトコルでは、灌流はリサーボとリアクター間で継続的に循環させる循環構成で行われます。この方法は、中程度の消費を最小限に抑えつつ、連続的な流れを維持します。
6. ポンプの望ましい流量を、チャネル内部半径( = 3 mm)を用いて、名目壁せん断応力(例:1 dyn/cm^²、4 dyn/cm²)を設定します。これはポワズイユ流量¹⁹の仮定に基づいています。
   
   ここでτは壁のせん断応力(dyn/cm^²)、Qは体積流量(^cm3/s)、 はRPMI-1640培地の流体粘度(0.958×^{3 N·}s/^{m 2} 、37°C)^です。実際のシステムは多孔質の絹の足場を含み、理想化された幾何学から逸脱していますが、計算された値は標準化された運用ベンチマークとして用いられ、流れ条件間の再現可能な比較が可能となりました。対応する流量は0.133 mL/minおよび0.531 mL/minで、培養の灌流条件として使用されました。
7. 灌流を開始し、漏れ、気泡形成、安定した流量の有無を監視してください。
8. 移動阻害剤または試験化合物(例:ククルビタシンE(Cucurbitacin E)を0.05 μmol/Lで完全培地で灌流するか、対照群を除いて灌流を開始し、5%_CO2 の加湿インキュベーターで最大5日間37°Cの環境を維持します。したがって、ポンプ入口を該当する試験化合物を含む完全な培地を含む無菌貯留槽に接続し、これまで使用したのと同様の設定でポンプを起動します。
   注意:定義された媒体洗浄手順を実行し、ポンプおよびチューブからエタノールを完全に除去することを確実にしてください。洗浄後に初期の培地を捨て、セルシードリアクターに接続し、システムが新鮮な培地で満たされ気泡がないことを確認してください。

9. 実験プラットフォームの蛍光イメージング

1. ポンプを停止し、すべてのチューブを切断しつつ、無菌状態を維持してください。
2. SPEチューブの底部をメスのルアーロックコネクターで密封し、システム全体を無菌の50 mL遠心分離機チューブに入れてチューブをしっかりと閉じます。
3. システムをバイオセーフティキャビネットに移し、その後のすべての工程を継続してください。ボンネット内では、オスのルアーロックコネクターを切り離したメスのルアーロックコネクターに交換し、システムを完全に閉じます。
4. 密封されたシステムを無菌の50mL遠心分離機チューブに戻し、輸送のためにチューブをしっかりと閉じます。
   注:実験室の条件によっては、システムが密閉している場合、イメージングのために流れを止める必要はありません。しかし、与えられた実験環境下ではこれは不可能でした。
5. 蛍光細胞を光漂白から保護するため、光密閉型の暗い箱内でin vivo の光学イメージングシステム室に運搬します。
6. リアクターを適切なホルダーの 生体内 光学イメージングシステムステージに設置します。
7. 以前に最適化されたパラメータ(すなわち励起675 nm、発光720 nm、露光時間10秒、ビニング8、fナンバー8)を使って2Dエピフルオレセンス画像を取得します。
8. 各画像セッションごとに4T1-wtシード済み、非シードスキャフォールド、空のリアクター制御組を含めてください。
9. 生 体内 光学イメージング解析を用いて蛍光信号を定量化します。
10. 対照群と治療群の定量的結果をプロットし、比較グラフを作成して試験化合物が測定結果に与える影響を可視化します。

10. 実験プラットフォームの画像解析

1. 0日目、3日目、5日目に蛍光画像を取得し、画像解析ソフトウェアで解析します。
2. 各画像に対して、解析前に空間キャリブレーションを行います。実験プラットフォームの既知の物理的な長さを線ツールで測定し、対応する実世界距離(85 mm)を「 Analyze > Set Scale 」で入力してピクセルから長さへの変換を定義します。
3. 校正後、フリーハンド選択ツールを使って関心領域(ROI)を手動で描き、蛍光面積を定量化します。
4. ユーザーバイアスを最小限に抑えるために、背景に対する蛍光信号の強度に基づく一貫した視覚基準を用いてROIを区分します。すべての解析は同一の設定で行い、可能な限り単一の訓練を受けたオペレーターに解析を任せてください。
5. 蛍光信号を生 体内 の光学イメージング解析ソフトウェア画像で暗い背景と明確に区別できる明るい領域として識別し、これらの信号を一貫した手動セグメンテーションの指針として用いてください。
6. 選択された地域を Analyze > Measureで測定し、各時刻のエリア値を記録します。この手順をすべての実験群の画像に対して繰り返します。
7. スプレッドシートソフトを使って各サンプルの面積測定値を対応するDay 0値に正規化し、初期サイズの違いを考慮し、結果をベースラインに対するフォールド変化として表します(Day 0 = 1)。

11. 統計解析

1. すべての実験は少なくとも三倍にして行ってください。
2. すべての実験を少なくとも3回(n=3回)繰り返し、平均値と標準偏差(SD)を決定します。
3. 二元ANOVAを用いて統計的有意性を決定し、その後α = 0.05のTukeyの多重比較検定を行います。

結果

このプロトコルは、生理学的に関連性の高い3D環境下で細胞の成長と運動を巨視的に観察するためのユーザーフレンドリーで低コストのプラットフォームを説明しています。この方法は絹フィブロインスポンジをECM模倣として用い、制御された間質流を取り入れて動的組織の状態をモデル化します。シルクスポンジや足場の製造から細胞シード、実験プラットフォームの組み立てまでの手順の略図は図 1に示されています。

当初は絹フィブロイン足場を製造し、エタノールで長期間保存可能でした。シルク、特にシルクフィブロインは組織工学の分野で重要な役割を果たし^{ています。}高強度、優れた生体適合性、調整可能な生分解性、低フロジス反応リスクといった比類なき特性により、シルクフィブロインは研究や医療における多用途な応用に導入

ディスカッション

このプロトコルで記述されたシルクスポンジの生産工程は標準化されており、^{以前の研究で}報告されているように、再現可能な足場の製造が保証されています。塩床の高さ・量、絹溶液の体積、メタノールの培養など、完全に標準化された条件下でのスポンジの生産は、均一で比較可能なスポンジを得るために不可欠です。生産されたスポンジは、先に発表された品質管理プロトコルの基準に従う^{必要があります。}短期的には、スポンジは床高12mm、孔径500〜800μm、直径6mmのサンプルの乾燥重量(10〜15mg)、硬いトップの不在、SEMを用いて均一な多孔質構造を決定する必要があります。スポンジの孔径を標準化するため、欧州薬局に基づきサイズ排除メッシュを用いてポロジェンをふるいにかけ、500〜800μmの割端のみを取った。検証のためにSEM画像が処理され、画像解析ソフトウェアで孔径が測定されました(以前に発表された^論文16)。シルク溶液の体積は、硬いトップの形成を最...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	注意: 危険。凍結乾燥したシルクの溶解に使用
24ウェルプレート	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	インキュベーション中の細胞播種された足場の保存
4T1-iRFP720マウスの三重陰性乳癌細胞	マクロモレキュラーがん治療学研究所（MMCT）、ウィーン大学	N/A	細胞培養実験; 4T1-iRFP720は、親の4T1（ATCC: CRL-2539）から院内で派生
4T1-wtマウスの三重陰性乳癌細胞	マクロモレキュラーがん治療学研究所（MMCT）、ウィーン大学	ATCC: CRL-2539	細胞培養実験
Bruker Alpha Compact FTIR with Platinum-ATRサンプリングモジュール	Bruker	A220/D-01	FT-IR分析
塩化カルシウム、無水、≥93%試薬グレード	Sigma-Aldrich	902179	溶解マトリックスの調製用
セルトレイフラスコ、T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	消耗品; 細胞培養用
セルトレイフラスコ、T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	消耗品; 細胞培養用
遠心分離機5804 R	Eppendorf	5805000010	サンプルの分離に遠心分離で使用
コンビストッパー（メスルアーロックコネクタ）	Braun Melsungen AG	4495101	プラットフォーム組立に使用
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	細胞移動阻害剤
皮膚生検パンチャー、ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	円筒形スポンジ足場の取得に使用
透析チューブ（3.5 kDa、セルロース）	Spectra/Por by Spectrum Labs	SPEC132724	シルクフィブロイン溶液の透析用
Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	D8537	細胞の維持用
エタノール、無水	Merck	1.07017	溶解マトリックスの調製用
Excel	Microsoft	v2604	データの整理、基本的な計算、プロット
胎児ウシ血清（FCS）熱不活性化	Biowest	S181H-500	細胞培養培地用サプリメント
Fiji（旧ImageJ）	オープンソース（https://imagej.net/software/fiji/）	N/A	画像処理と分析
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	統計分析とグラフの生成
HPLCポンプHitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	組立プラットフォームの動的培養条件用
IVIS 200 Spectrum CTシステム	PerkinElmer	128201	CT機能を備えた光学イメージングシステム
IVIS Living Imageソフトウェア	PerkinElmer	v4.5.2	IVISイメージングデータの取得、可視化、定量分析用ソフトウェア
JEOL JSM-6510走査型電子顕微鏡	JEOL GmbH	JSM-6510	SEM画像
L-グルタミン、200 mM溶液、細胞培養に適する（L-Glu）	Sigma-Aldrich	G7513	細胞培養培地用サプリメント
凍結乾燥機Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	シルクフィブロインの凍結乾燥用
メスルアーロックコネクタ	Supelco（Sigma-Aldrich）	57020-U	サンプル貯留所用アダプター
メタノール、≥99.9 %, HPLCグラデントグレード	Carl Roth	7342.1	注意: 毒性。シルク複合体のベータシート形成の誘導
光学的に透明な固相抽出（SPE）チューブ（フリットなし）	Sigma Aldrich	57240-U	プラットフォーム組立用
OPUS分光学ソフトウェア	Bruker	v7.5	FT-IR分析
軌道およびリニアシェーカーMI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	均一分布/混合
パラフィルムPM996	Sigma-Aldrich	P7793	プレートと容器を密閉/ラップして保存用（例：冷蔵）
ペニシリン-ストレプトマイシン、液体、細胞培養に適する（P/S）	Sigma-Aldrich	P0781	細胞培養培地用サプリメント
ペトリ皿、9 cm	VWR	391-0598	塩床スポンジ鋳造用; シルク足場に播種用
1 mL SPEチューブ用ポリエチレンフリット	Supelco（Sigma Aldrich）	57244	プラットフォーム組立用
RPMI-1640培地、細胞培養に適する	Sigma-Aldrich	R0883	補充された培地は、シルクスポンジの平衡、細胞培養の維持、および関連実験に使用
生理用ピペット、10 mL	Sarstedt	86.1254.025	消耗品; 細胞の維持用
生理用ピペット、25 mL	Sarstedt	86.1685.020	消耗品; 細胞の維持用
生理用ピペット、5 mL	Sarstedt	86.1253.025	消耗品; 細胞の維持用
Bombyx mori L.のシルクコクーン	Vratsa、ブルガリアの蚕糸農業実験所	N/A	シルクフィブロインスポンジ生産の原料
炭酸ナトリウム、無水、≥99.5% ACS	VWR	11552.A3	化学的デガミング（セリシンの除去）に使用
塩化ナトリウム、≥98%、技術用	VWR	27788.366	塩床スポンジ鋳造用
SPEカラムプッシュロッド	Carl ROTH	36P9.1	プラットフォーム組立用
ステンレス製分析用ふるい、500 µm（ISO 3310-1）	ATECHNIK GmbH	2