方法論記事

nodC破壊によるMesorhizobium ciceriのCRISPR-Cas9ゲノム編集：ひよこ豆の共生研究に向けて

0 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/71513

⸱

2026年9月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Root Nodule Symbiosis Laboratory, National Institute of Plant Genome Research, 2Microbial Engineering Laboratory, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、相同組換え修復とGFPベースのスクリーニングを用いて、Mesorhizobium ciceriのnodC遺伝子座をCRISPR-Cas9で破壊し、ヒヨコ豆共生リゾビアの機能ゲノミクス研究に向けた共生不全変異体を作製する方法について記述します。

要約

Mesorhizobium ciceri、ヒヨケマメの窒素固定共生菌である（Cicer arietinum）、従来の相同組換え法を用いた遺伝子操作は、手間がかかる上に好ましくない選択マーカーが残ることが多く、依然として困難な課題となっている。本プロトコルでは、広宿主範囲のCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）関連タンパク質9（Cas9）システムを適合させた、効率的なゲノム編集戦略について述べる。 *M. ciceri*本手法の有効性を、～を標的とすることで実証します。 nodC、これは共生分子間コミュニケーションに関与する主要なシグナル分子であるNodファクターのキチン主鎖合成に必要なN-アセチルグルコサミン転移酵素をコードしている。本プロトコルでは、シングルガイドRNA（sgRNA）の体系的な設計およびホモロジー指示修復（HDR）テンプレートの構築について詳述する。HDRテンプレートは、〜を挟む緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターの部位特異的な組み込みを促進するように設計された。 nodC 切断部位。両親交配によるCas9/sgRNA/HDR構築物の導入後、蛍光ベースのスクリーニング法を用いて推定変異体を同定した。1.3 kbの領域の破壊に成功し、 nodC 結節形成（nodulation）領域内の遺伝子座（locus）結節カセットの導入は、まず蛍光顕微鏡を用いて変異株コロニーにおけるGFP発現を可視化することでスクリーニングした。その後、制限酵素消化、ゲノムDNAからの組み込みカセットの増幅、およびサンガーシーケンシングにより、破壊を確認した。さらに、逆転写定量PCRを用いてGFP発現量を定量化した。変異による機能的影響を検証するため、ヒヨコ豆感染アッセイを実施したところ、以下の菌株を接種した植物において根粒形成能の低下が認められた。 Δ*M. ciceri* nodC 野生型株と比較して。全体として、本プロトコルは、～における精密な遺伝子破壊および機能ゲノミクス研究のための、効率的で再現性のある枠組みを提供する。 メゾリゾビウム.

概要

もともと原核生物の適応免疫機構として同定されたClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) ヌクレアーゼシステムは、効率的で信頼性の高いゲノム編集ツールとして応用されています1,2。このシステムは、合成ガイドRNA (sgRNA) を用いて、ワトソン・クリック塩基対形成により標的DNA配列を特定します。sgRNAは、プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列NGGに隣接するゲノム領域に相補的な20ヌクレオチドで構成されています。Cas9は、標的配列内の特定部位、通常はPAM部位の3塩基対 (bp) 上流において二本鎖切断 (DSB) を誘導します1。生じたDSBは、非相同末端結合またはドナーテンプレートを用いた相同組換え修復 (HDR) によって修復されます3,4。この戦略は、細菌における遺伝子破壊、ノックイン、およびノックアウトの手法に広く適用されてきました5,6,7,8。本プロトコルの主な目的は、広宿主範囲CRISPR-Cas9システムを用いて、Mesorhizobium ciceri のための効率的なゲノム編集法を開発することです。

M. ciceriは、ヒヨケマメ（Cicer arietinum）の不可欠な窒素固定共生菌として機能するグラム陰性土壌細菌である9。ある株であるM. ciceri CC1192は高い根粒形成能を示し、そのゲノムが解読されている10。農業上の重要性があるにもかかわらず、Mesorhizobium種の遺伝子操作は依然として限定的である。CRISPRベースのシステムは、Rhizobium etliにおけるCRISPR干渉（CRISPRi）11、Sinorhizobium melilotiにおけるゲノム編集12、およびS. melilotiにおける塩基編集13など、他の根粒菌で導入されてきた。しかし、M. ciceriのための堅牢なゲノム編集プラットフォームは報告されていない。従来のアプローチは自殺プラスミドを介した相同組み換えに依存しており、これは労力がかかり、複数回の選択操作が必要であり、またゲノムに抗生物質耐性マーカーが瘢痕として残ることが多い14。

これらの制限に対処するため、もともとPaenibacillus polymyxa用に開発されたpCasPPベクターシステムを、M. ciceriで使用できるよう適合させた15。pCasPPフレームワークは、高GC含有量の放線菌用にコドン最適化されたStreptococcus pyogenes Cas9を利用しており、構成的プロモーターgapdhの下でsgRNAクローニングのブルーホワイトスクリーニングを行うためのlacZカセットを含んでいる8。編集ベクターを導入するために、ドナーであるEscherichia coli株とレシピエントであるMesorhizobium株との間で二親交配を行った16。スクリーニング効率を高めるため、もともとBradyrhizobium diazoefficiens用にコドン最適化された緑色蛍光タンパク質（GFP）変異体であるbjGFPを、HDRドナーテンプレートに組み込んだ16。この蛍光ベースのスクリーニング戦略を、細菌とヒヨケマメとの間の共生シグナル伝達の初期段階に必要な必須遺伝子であるnodC遺伝子座を標的とするために適用した17,18。

本プロトコルは、ランダムな化学的または紫外線（UV）誘発変異導入法に代わる、精密かつ効率的な手法を提供する。検証実験において、回収されたコロニーの80%以上がGFP蛍光を示し、代表的な編集済みコロニーについてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびサンガーシーケンシングによるさらなる確認を行った。得られたΔnodC M. ciceri変異体は、共生シグナル伝達および宿主・微生物相互作用を研究するための有用なリソースとなる。総じて、この枠組みはリゾビウム研究コミュニティに対し、Mesorhizobiumにおける機能ゲノミクス研究のための効率的で拡張可能なアプローチを提供する。

プロトコル

植物の育成、微生物の接種、および遺伝子組み換え細菌の取り扱いを含むすべての実験プロトコルは、機関のガイドラインおよび規制に従って実施されました。植物の栽培および細菌の接種は、制御された育成チャンバー条件下で行われました。本研究で使用したM. ciceri株は、バイオセーフティレベル1（BSL-1）の微生物に分類されています。すべての実験は、野外放出を伴わない封じ込められた研究室条件下で実施されたため、機関のバイオセーフティ方針に基づき、正式な機関のバイオセーフティ承認は不要でした。本研究中に発生したすべての生物学的廃棄物は、廃棄前にオートクレーブ処理されました。

1. コンピテントセルの調製

化学的コンピテントE. coli DH5αおよびE. coli S17-1λpir細胞を、Supplementary File 1に記載の手順に従って調製し、検証した。

2. ガイドRNAの設計

  1. ガイドRNAの設計
    1. Benchlingプラットフォーム（https://benchling.com/）を開きます。既存のBenchlingアカウントでサインインするか、新しいアカウントを作成してください。
    2. 新規プロジェクトを作成し、CRISPRガイド設計ツールを開きます。
    3. ガイドRNA設計のため、完全な標的DNA配列をアップロードまたは貼り付けてください。「Single Guide」設計オプションを選択し、ガイド長を20 bpに設定します。
    4. 利用可能なオプションからゲノムリファレンスを選択してください。ガイドRNA設計の標的として *M. ciceri*, 参照ゲノムとしてBradyrhizobium diazoefficiens USDA 110を選択する。Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) の活性に必要なプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列としてNGGを使用する。
    5. Hsuら（の研究）を使用してください。19 予測オフターゲット切断頻度を算出するためのアルゴリズム。参照ゲノム背景における非特異的切断を最小限に抑えるため、閾値スコアを50以上に維持する。
    6. Doench-Rootアルゴリズムを使用する20 予測オンターゲット効率スコアを算出します。標的遺伝子座において良好な予測Cas9切断効率を持つガイドを特定するため、ターゲット選択しきい値を60以上に設定します。
    7. 「完了」をクリックして、候補となるガイドRNAのリストを生成します。
  2. ガイドRNAの選択
    1. ガイドRNA出力パネルを開きます。
    2. 翻訳開始コドン（ATG）から100 bp以内に二本鎖切断を誘導すると予測される候補sgRNAを優先的に選択し、非機能的タンパク質が生成される可能性を高めます。
    3. オフターゲットスコアとオンターゲットスコアを評価してください。意図しないオフターゲット切断のリスクを低減するため、オンターゲットスコアがわずかに高いことよりも、オフターゲットスコアが高いことを優先してください。
    4. すべての選択基準を満たす1つまたは2つの候補シングルガイドRNA（sgRNA）を選択してください。
  3. gRNAオリゴヌクレオチドの調製
    1. 選択したガイドRNAの逆相補配列を生成します。
    2. 配列5を追加してください′5'末端に-ACGC′ ガイドRNAの末端に、配列5を付加する′5'末端に-AAAC′ 相補逆鎖の末端。
    3. 両方のオリゴヌクレオチドを5'末端で注文してください。′ 25 nmol合成スケールにおけるリン酸化およびPAGE精製。
  4. gRNAオリゴヌクレオチドのアニーリング
    1. 7.15 gのHEPES遊離酸を約800 mLの蒸留水に溶解し、30 mM HEPES緩衝液を調製する。水酸化ナトリウムを用いてpHを7.8に調整し、最終容量を1 Lとする。
    2. 各リン酸化オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼフリー水で再懸濁し、最終濃度を以下に調整する。 100 µM結合させる 5 µL 各オリゴヌクレオチドを～を用いて 90 µL 滅菌済みのマイクロ遠心チューブに入れられた30 mM HEPES緩衝液。
    3. 短時間ボルテックスし、遠心分離して液体を回収する。サーモサイクラーを用い、以下の温度でインキュベートしてオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる。 95°C 5分間、その後〜まで冷却し 4°C 昇温速度（または降温速度）で 0.1°C/秒
    4. アニールさせたオリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼフリー水を用いて10倍に希釈する。
  5. gRNAのpCasPPベクターへの組み込み
    1. Rüteringらによって以前に記述されたpCasPPベクターを入手する。15.
    2. プラスミド配列はJochen Schmidから提供され、本研究で使用した構築物はSyed Shams Yazdani博士（ICGEB）を通じて入手した。  
    3. 100 ngのpCasPPベクターを含むGolden Gate反応液を調製し、 0.3 µL アニール済みオリゴヌクレオチドインサート 2 µL 10× T4 DNAリガーゼバッファー、 1 µL T4 DNAリガーゼ、 1 µL BbsI制限酵素、およびヌクレアーゼフリー水を最終容量まで加え、 20 µL.
    4. インサートをヌクレアーゼフリー水に置き換えて、陰性対照反応を準備します。
    5. 反応液を穏やかに混合し、短時間遠心分離する。
  6. ゴールデンゲートアセンブリのサイクリング条件
    1. 反応チューブをサーモサイクラーにセットする。以下の内容で9サイクル行う。 37°C 10分間、その後 16°C 10分間。
    2. 反応液を～でインキュベートする 50°C 5分間、その後で 65°C 20分間。反応液を以下の温度で保持する。 4°C 使用時まで。
  7. アセンブリ反応の変換
    1. 解凍 50 µL コンピテント Escherichia coli DH5αα 細胞を氷上で10～15分間静置する。
    2. 追加 3 µL 各Golden Gateアセンブリ反応液をコンピテントセルに添加する。陰性対照反応も並行して処理する。混合液を氷上で30分間インキュベートする。
    3. 細胞を以下の条件でヒートショック処理する。 42°C 45秒間遠心分離し、直ちにチューブを氷上に置いて2分間静置する。次に、添加する。 950 µL カタボライト抑制を伴うスーパーオプティマルブロス（SOC）培地。
    4. 0.5%酵母エキス、2%トリプトペプトン、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgClを含むSOC培地を調製する。₂, 10 mM MgSO4₄、および20 mMのグルコース。フィルター滅菌した培地を、以下の方法で使用する。 0.4 µm 無菌条件下でのシリンジフィルターによるろ過。
    5. 培養物を以下でインキュベートします。 37°C 180 rpmで1時間。
  8. 陽性形質転換体の選別
    1. 以下を添加したLB寒天培地プレートを調製する 50 µg/mL ネオマイシン、0.2 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) および 32 mg/L 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル β-D-ガラクトピラノシド (X-gal) プレート 100 µL の回復培養液を選択プレートに播種する。プレートを以下の条件で培養する。 37°C 12～16時間。
    2. 白色コロニーを選択し、青色コロニーは廃棄する。陰性対照プレートのコロニー数が5個未満であることを確認する。
  9. 陽性クローンのスクリーニングおよび拡大培養
    1. 3〜4個の独立した白色コロニーを、新鮮な選択性LB寒天培地にパッチしてください。
    2. プレートを以下の条件でインキュベートします。 37°C 12〜16時間。単一コロニーを、以下の成分を添加した10 mLのLB培地に接種する。 50 µg/mL ネオマイシン
    3. 後続のワークフロー全体を通じて、各ガイドRNAコンストラクトを個別に処理してください。
  10. pCasPP-gRNAコンストラクトの検証
    1. 遠心分離により細菌培養物を回収する。シリカカラム式プラスミド精製キットを用いてプラスミドDNAを単離する。
    2. 適切な反応バッファーを用いて、単離したプラスミドDNAをXbaIおよびEcoRIで1時間、以下の温度で消化します。 37°C.
    3. 1%アガロースゲルを用いて消化産物を分離します。× 最終濃度が（以下）のエチジウムブロマイドを含むTris-酢酸-EDTA (TAE) 緩衝液 0.5 µg/mL.
    4. 色素前線がゲルの長さの約70～80%まで移動するまで、90～110Vで電気泳動を行う。UVトランスイルミネーターを用いてDNA断片を可視化する。
    5. 1,280 bpの断片を検出することで陽性クローンを確認し、1,630 bpの断片を検出することで空ベクターコントロールを特定する。空のpCasPPベクターは約9,663 bpであり、lacZ遺伝子を含んでいる。24 bpのgRNAオリゴヌクレオチドを挿入するとlacZ断片が除去され、より小さいgRNA含有pCasPPコンストラクトが生成される。lacZ領域に隣接するXbaIおよびEcoRI制限酵素部位を、gRNAクローニングの診断的確認に使用する。
  11. グリセロールストックの調製
    1. 選択性LB培地で、陽性と確認されたクローンを培養する。
    2. 混合してグリセロールストックを調製します。 700 µL ～を用いた対数増殖期培養 300 µL 滅菌済み50%グリセロール。混合液を滅菌済みクライオバイアルに移す。グリセロールストックを−で保存する。80°C.
      注：凍結融解の繰り返しを避けてください。プラスミドの安定性と細菌の生存率を維持するため、あらかじめ複数分に分注して調製してください。完了したGolden Gateアセンブリ反応液は、以下で保存可能です。 4°C 一晩、または−で20°C 形質転換の1〜2週間前から。

3. ホモロジー方向修復テンプレートの構築

  1. 緑色蛍光タンパク質（GFP）インサートの調製
    1. 蛍光レポーターカセットを含むプラスミドpRJPaph-bjGFPを入手する16 (Table 1)10,15,16,21,22,23。このプラスミドはHans-Martin Fischer教授（スイス、ETHチューリッヒ）より提供されたものであり、Addgene（Plasmid #67032）を通じて入手可能である。
    2. Supplementary File 2 (Step 3.1) に記載されている通り、SacIおよびKpnIによる制限酵素消化により、pRJPaph-bjGFPからgfpカセットを切り出す。pRJPaph-bjGFP内のgfp配列は、Bradyrhizobium diazoefficiens用にコドン最適化された合成bjGFP遺伝子である。
    3. 目的の1081 bpのgfpフラグメントを精製する。
  2. pUC18-gfpの構築
    1. pUC18バックボーン（Addgene plasmid #50004）を入手する21。
    2. Supplementary File 2 (Step 3.2) に記載されている通り、SacIおよびKpnIを用いてpUC18を直線化する。
    3. Supplementary File 2 (Step 3.2) に記載されている通り、精製したgfpフラグメントを直線化したpUC18ベクターにライゲーションする。
    4. Step 2.7に記載されている形質転換手順を用いて、コンピテントE. coli DH5α細胞に形質転換する。なお、Golden Gateアセンブリ反応の代わりに、Step 3.2.3で作成したライゲーション混合液を使用する。
    5. 陽性形質転換体を選択し、Supplementary File 2 (Step 3.2) に記載されている通り、コロニーPCRによりgfpの挿入を確認する。
  3. ホモロジーアームの増幅
    1. M. ciceriゲノムDNAから、約400–500 bpの上流（UHA）および下流（DHA）ホモロジーアームを増幅するためのプライマーを設計する（Table 2）。
    2. UHAプライマーにはSacI/EcoRI制限酵素サイトを、DHAプライマーにはXbaI/KpnI制限酵素サイトを組み込む。UHAの増幅にはプライマーF_nodC_Up_EcoRIおよびR_nodC_Up_SacIを、DHAの増幅にはプライマーF_nodCdown_KpnIおよびR_nodCdown_XbaIを使用する（Table 2）。
    3. Weerakkodyらの方法25に従い、M. ciceriゲノムDNAを単離する。
    4. Supplementary File 2 (Step 3.3) に記載されている通り、UHAおよびDHAフラグメントを増幅および精製する。
  4. pUC18-UHA-gfpの構築
    1. Supplementary File 2 (Step 3.4) に記載されている通り、EcoRIおよびSacIを用いてUHAフラグメントをpUC18-gfpにクローニングする。
    2. XbaIおよびKpnIによる制限酵素消化を行い、プラスミドのアセンブリが正しいことを確認する。アセンブリが成功していれば、約500 bpおよび3725 bpのフラグメントが生成されるはずである。
    3. 確認済みのクローン1つを用いて次へ進む。
  5. pUC18-UHA-gfp-DHAの構築
    1. Supplementary File 2 (Step 3.5) に記載されている通り、KpnIおよびXbaIを用いてDHAフラグメントをpUC18-UHA-gfpにクローニングする。
    2. SacIおよびEcoRIによる制限酵素消化を行い、アセンブリが正しいことを確認する。アセンブリが成功していれば、約400 bpおよび4271 bpのフラグメントが生成されるはずである。
    3. プライマーF_nodC_Up_EcoRI、BjGFP_BP_F1、およびR_nodCdown_XbaI（Table 2）を用いて、5～6個の候補クローンをサンガーシーケンシングで検証する。これらのプライマーで、ホモロジー誘導修復（HDR）カセット配列の大部分をカバーできる。
  6. 最終HDRテンプレートの増幅および精製
    1. プライマーF_FL_nodCgfp_XbaIおよびR_nodCdown_XbaI（Table 2）を用いて、完全なHDRカセットを増幅する。
    2. 目的の2012 bpのHDRフラグメントを精製し、Supplementary File 2 (Step 3.6) に記載されている通り、精製したPCR産物をXbaIで消化する。
  7. pCasPP-gRNAベクターの調製
    1. Step 2で作成したpCasPP-gRNA1およびpCasPP-gRNA2プラスミドを回収する。
    2. Supplementary File 2 (Step 3.7) に記載されている通り、XbaIでプラスミドを直線化し、ベクターバックボーンを脱リン酸化する。
  8. pCasPP-gRNAベクターへのHDRテンプレートのクローニング
    1. Supplementary File 2 (Step 3.8) に記載されている通り、HDRカセットをXbaI直線化pCasPP-gRNA1またはpCasPP-gRNA2にライゲーションする。
    2. コンピテントE. coli DH5α細胞に形質転換し、50 µg/mLのネオマイシンを含むLBアガーで形質転換体を選択する。
  9. HDR含有クローンのスクリーニング
    1. 標準的なGFPフィルターセット（励起 470–488 nm、蛍光 507–510 nm）を備えた蛍光実体顕微鏡を用いて、形質転換体のGFP蛍光をスクリーニングする。
    2. 編集されていない陰性対照コロニーに見られる弱い自家蛍光を明らかに上回る、明瞭で均一な緑色蛍光の有無に基づいて、コロニーをGFP陽性と分類する。
    3. GFP陽性クローンを拡大培養し、プラスミドDNAを単離する。
  10. HDRベクターアセンブリの検証
    1. XbaI制限酵素消化により、HDRの挿入を確認する。
    2. 目的の2012 bpのHDRフラグメントと、約9,300 bpのpCasPP-gRNAベクターバックボーンが放出されることで、アセンブリの成功を検証する。
      注：制限酵素およびホスファターゼを熱不活性化した後、反応混合物は4°Cで一晩、または-20°Cで最大1ヶ月まで保存できる。確認済みのプラスミド構築物は、長期保存のため-20°Cで保存すること。
菌株またはプラスミド概要参考文献
Mesorhizobium ciceri CC1192CRISPR-Cas9ゲノム編集およびヒヨコマメ根粒形成アッセイに使用したレシピエント菌株Haskettら10
pCasPPガイドRNAのクローニングおよびHDRテンプレートの導入に使用されるCRISPR-Cas9ゲノム編集ベクターRüteringら15
pRJPaph-bjGFPGFPカセットのソースとして使用したGFPレポータープラスミド
(Addgeneプラスミド #67032)		Ledermannら16
pUC18HDRテンプレートアセンブリに使用される汎用クローニングベクター
(Addgene プラスミド #50004)		Norranderら21
Escherichia coli S17-1λPIR（パッシブ赤外線センサー）二親交配に使用したドナー株Simonら22
Escherichia coli DH5ααプラスミド増殖に使用されるクローニングホストHanahanら23

表 1: 本研究で使用した細菌株およびプラスミド。本表には、プラスミドの増殖、CRISPR-Cas9を用いたゲノム編集、相同組換え修復（HDR）テンプレートの構築、二親交配、およびMesorhizobium ciceri CC1192の蛍光標識に使用した細菌株およびプラスミドを記載している。

カテゴリー名前配列 (5′ figure-protocol-1 3′）または説明
細菌株大腸菌 DH5ααクローニング宿主株
細菌株Escherichia coli S17-1λpIR（パッシブ赤外線）二親交配用のドナー株
クローニングベクターpUC18クローニングバックボーンベクター
CRISPRベクターpCasPP広宿主範囲 CRISPR-Cas9 ベクター
レポータープラスミドpRJPaph-bjGFPGFPレポータープラスミド
プライマーF_guide1_BbsIpACGCTGTTTACAGAGGCATGCAAG
プライマーR_guide1_BbsIpAAACCTTGCATGCCTCTGTAAACA
プライマーF_guide2_BbsIpACGCGCTTGTTCGGATCCGACCGT
プライマーR_guide2_BbsIpAAACACGGTCGGATCCGAACAAGC
プライマーF_nodC_Up_EcoRIAAAGAATTCCTCATTGCAAGCCAGCAGT
プライマーR_nodC_Up_SacIAAAGAGCTCCGGAAAGCTTGTTTCGGATCC
プライマーF_nodCdown_KpnIAAAGGTACCTCGAGAGCACCGCATAAGAC
プライマーR_nodCdown_XbaIAATTCTAGATGGTTCGGTACTTTCGTGCA
プライマーF_FL_nodCgfp_XbaIAAATTCTAGACTCATTGCAAGCCAGCCAGT
プライマーBjGFP_BP_F1GAAGTTCATCTGCACCACCG
プライマーBjGFP_BP_R1GTCCTTGAACGAGATGGTGC
プライマーBjGFP_BP_F2CCAACTTCAAGATCCGCCAC
プライマーGFP_RCCAACTTCAAGATCCGCCAC
プライマーBjGFP_BP_R2CTTGTACAGCTCGTCCATGC
プライマー16S_F1ATCCTGGCTCAGAACGAACG
プライマー16S_R1ATTCCCACGCGTTACTCACC
プライマー16S_F2AGTCCGAGAGGGTGAGTGG
プライマー16S_R2GTCAGTACCGAGCCAGTGAG
プライマーF1_nodCCGATTTCCAGAACCGTCGTC
プライマーnodC_RCGATTTCCAGAACCGTCGTC
プライマーR1_nodCTCCCCTGCTACAATGAGGAC
プライマーF2_nodCAGTGACTCCGCAATTCCAGA
プライマーR2_nodCTGTCGGTAAAAGTGTTTCCC
プライマーF1_nodBTGGTTCGGTACTTTCGTGCA
プライマーR1_nodBAGTCGCGTGGATCAATGGAC
プライマーF1_nodATGATCGTCGCTGAATTGGGC
プライマーR1_nodACAACTGATGGAGCACTGGGT
プライマーF1_nodDTGGCCTTAAGAGACGTGTCG
プライマーR1_nodDAAATGCCTGACCAGCCGTAA

表 2: 本研究で使用した細菌株、プラスミド、およびオリゴヌクレオチドプライマー。この表には、シングルガイドRNA（sgRNA）の構築、相同組換え修復（HDR）テンプレートのアセンブリ、診断的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、サンガーシーケンシング、および逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）に使用した細菌株、プラスミド、およびオリゴヌクレオチドプライマーを記載しています。プライマー配列は 5′ figure-protocol-2 3′ の方向に示しています。注：BjGFP_BP_F2 と GFP_R は同じオリゴヌクレオチド配列を指しますが、異なる実験アッセイで使用されたため、異なるプライマー名で記載されています。

4. プラスミド導入のための両親交配 *M. ciceri* CC1192

  1. ドナーE. coli細胞の形質転換
    1. Supplementary File 3（ステップ4.1）に記載の手順に従い、pCasPP-gRNA1-HDRまたはpCasPP-gRNA2-HDRコンストラクトをE. coli S17-1λpir細胞に形質転換する。
    2. 50 µg/mLのネオマイシンを含むLB寒天培地で形質転換体をセレクションする。
    3. 励起波長約488 nm、蛍光検出波長約510–520 nmを用いて、形質転換体のGFP蛍光をスクリーニングする。
    4. 同一の顕微鏡設定で観察した際、非形質転換のE. coli S17-1λpirコントロールコロニーには見られず、均一で明瞭な緑色蛍光を示すコロニーをGFP陽性と判定する。
    5. GFP陽性と確認されたドナークローンのグリセロールストックを調製する。
  2. 種菌およびスターター培養の調製
    1. Supplementary File 3（ステップ4.2）に従い、ドナーE. coli S17-1λpirおよびレシピエントM. ciceriのスターター培養を調製する。
    2. スターター培養を、推定細胞密度約1 × 108 CFU/mLに相当するOD₆₀₀ 0.3–0.4まで増殖させる。
  3. 二親交配用サブカルチャーの調製
    1. Supplementary File 3（ステップ4.3）に従い、ドナーおよびレシピエントのサブカルチャーを調製し、必要な対数増殖期まで増殖させる。
    2. Supplementary File 1（ステップ1.2.3）に記載の光学密度測定手順に従い、UV-Vis分光光度計を用いて600 nmにおける光学密度（OD600）を測定する。
  4. 二親交配の手順
    1. Supplementary File 3（ステップ4.4）に従い、メンブレンフィルターを用いた二親交配を行う。
    2. 滅菌済みの0.22 µmポリフッ化ビニリデン (PVDF) メンブレンフィルター（直径47 mm）上に、交配懸濁液を4箇所に分注し、混ざり合わないよう十分な間隔を空ける。
  5. 接合菌の回収およびセレクション
    1. Supplementary File 3（ステップ4.5）に従い、接合菌を回収し、2種類の抗生物質によるセレクションを行う。
    2. 残存プラスミドを排除するため、カルベニシリンのみを含む培地で接合菌を繰り返し継代する。
    3. ネオマイシン含有培地でコロニーが増殖しないこと、および診断的PCRによりpCasPPバックボーンの消失と染色体に組み込まれたHDRカセットの保持が確認できたことで、プラスミドのキュアリングを検証する。
      注：組み込まれた修飾の安定性を検証し、残存するエピソームプラスミドを排除するために、連続的な継代が必要である。
  6. GFP陽性コロニーのスクリーニング
    1. Supplementary File 3（ステップ4.6）に従い、精製した接合菌のGFP蛍光をスクリーニングし、野生型M. ciceriコントロールと比較する。
    2. 蛍光を示すコロニーを、HDR陽性の推定株として選択する。
    3. 同一の顕微鏡設定および露光条件下で、野生型M. ciceriコロニーには見られない均一で明瞭な緑色蛍光を示すコロニーをGFP陽性と判定する。
    4. 下流のバリデーションに進む前に、診断的PCRによりGFP陽性コロニーを確認する。
    5. 確認されたコロニーを、短期保存の場合は酵母マンニトール (YM) 寒天培地で4°Cに、長期保存の場合は20%–25%グリセロールを含むグリセロールストックとして−80°Cで保存する。

5. nodC変異体の検証

  1. nodC遺伝子座におけるGFP組み込みの検証
    1. GFP発現単一コロニーを接種し *M. ciceri* コロニーを、〜を添加した10 mLの酵母マンニトールブロス（YMB）に接種し、 100 µg/mL カルベニシリン24培養物を以下でインキュベートする。 28°C 180 rpmで振とうしながら20～24時間培養する。
    2. 8,000 rpmで遠心分離し、細菌細胞を回収する。 × 10分間、～gで遠心分離する 25°C細胞ペレットを回収し、Weerakkodyらの方法に従ってゲノムDNAを単離する。25.
    3. ゲノムDNAをテンプレートとして診断用PCRを行う（表2）。～を準備します。 10 µL 以下の成分を含むPCR反応液 5 µL 2× PCRマスターミックス 0.2 µM F1_nodBおよびnodC_Rプライマー、またはF1_nodBおよびgfp_Rプライマー、ならびに50 ngのゲノムDNA。
    4. サーモサイクラーを、以下の条件で初期変性するように設定します。 95°C 5分間行い、続いて35サイクルの 95°C 1分間、 62°C 30秒間、そして 72°C 45秒間、最終伸長反応を 72°C 5分間。
    5. 既報の通り、1% (w/v) アガロースゲルを用いてPCR産物を電気泳動し、分離する。F1_nodB/nodC_Rを用いて、野生型（WT）で約430 bp、破壊変異株で約1500 bpの産物が検出されることを確認する。また、F1_nodB/gfp_Rを用いて、変異株で約1000 bpの産物が検出される（WTでは産物なし）ことを確認し、GFPの組み込みを検証する。
    6. PCRバリデーションの際は、適切なコントロールを含めてください。陽性コントロールには標的配列を含むプラスミドDNAを、陰性コントロールにはヌクレアーゼフリー水を用いたテンプレートなしコントロール（NTC）を使用してください。
  2. 逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）によるGFP発現量の定量
    1. WTおよび変異体から全RNAを単離する *M. ciceri* 製造元の指示に従い、TRIzol試薬を用いて培養物から抽出する。
    2. 混入したゲノムDNAを除去するため、製造元の指示に従ってRNAをDNase Iで処理します。qPCRにおいて、逆転写酵素不含（−RT）コントロールを用いて、DNAが完全に除去されていることを確認してください。
    3. から第一鎖cDNAを合成する 1 µg 市販の第一鎖cDNA合成キットを用い、製造元の指示に従って全RNAから合成を行います。次に、以下のものを準備します。 20 µL RNA、oligo(dT)プライマー、dNTPs、反応緩衝液、RNase阻害剤、および逆転写酵素を含む反応液。
    4. cDNA合成反応を以下の条件でインキュベートします。 42°C 60分間反応させた後、以下の温度で熱不活化を行う。 70°C 5分間。cDNAを−で保存する。20°C 使用時まで。
    5. RT-qPCR反応をテクニカル・トリプリケート（技術的三重複）で調製します。組み立ててください。 10 µL 含有する反応 5 µL 2× SYBR Green マスターミックス、 0.2 µM GFP増幅用のBjGFP_BP_F1およびBjGFP_BP_R1プライマー、またはリファレンス遺伝子増幅用の16S_F1および16S_R1プライマー（表2), 2 µL cDNAテンプレート（約20 ng）、およびヌクレアーゼフリー水。
    6. 以下のサイクリング条件でRT-qPCRを実施する：初期変性温度は 95°C 2分間行い、続いて40サイクルの 95°C 15秒間、および 58°C 45秒間行い、続いて～からの融解曲線分析を行う。 65°C へ 95°C.
    7. Bio-Rad CFX96 リアルタイムPCR検出システムを用いてqRT-PCRを行う。増幅プロットおよびCt値を解析する。t Bio-Rad CFX Managerソフトウェアを用いて、値および融解曲線を得た。
    8. 2^-ΔΔCt法を用いて相対的遺伝子発現量を算出する−ΔΔCt値 方法。発現量を16S rRNAリファレンス遺伝子で正規化し、WTを基準として使用する。 *M. ciceri* 校正サンプルとして当該株を使用する。3つの生物学的反復サンプルを解析し、それぞれを技術的3連で測定する。
  3. 根粒形成能の評価
    1. 細菌接種源の調製
      1. 野生型および変異株の単一コロニーを、以下の成分を含む選択的YMB培地に接種する 100 µg/mL カルベニシリン。培養物を以下の条件でインキュベートする。 28°C 180 rpmで30～36時間振とうしながら。
      2. 培養液を新鮮な選択的YMB培地に1:100で希釈し、OD値を測定して増殖をモニタリングする。600 UV–Visible分光光度計を用いて測定します。未接種のYMBで装置のブランク測定を行い、培養液のOD600が0.3～0.4（約1に相当）に達するまで培養を継続します。 × 108 CFU/mL
      3. 標準化した細菌懸濁液を3 mLずつ用い、各植物に接種してください。
    2. ヒヨコマメ植物感染アッセイ
      1. 〜の種子を入手する *C. arietinum* 栽培品種 BDG25618,24 インド、ニューデリーのICAR-インド農業研究所（IARI）より。
      2. 種子を流水で十分に洗浄した後、Milli-Q精製水で洗浄する。1%次亜塩素酸ナトリウム溶液中で5分間振とうして種子の表面滅菌を行い、滅菌精製水で5回すすぐ。
      3. 種子を0.1% Bavistin殺菌剤（50%カルベンダジム水溶性剤）で室温にて2～3時間処理する。処理した種子を滅菌精製水で2回洗浄する。
      4. 滅菌済みのペトリ皿（110 mm）内の湿らせた滅菌フィルターペーパー上に種子を配置する。 × 40 mm）、パラフィルムで密閉し、暗所で以下のようにインキュベートします。 28°C ± 2°C 3日間。
      5. 発芽した苗を、滅菌砂に個別に移植する。砂は以下の条件で滅菌する。 121°C そして、使用前に15 psiで20分間処理します。
      6. 6.0 gのCaSO4を溶解させることで、窒素不含のMcKnight栄養液を調製します。₄, 1.0 g MgSO₄₄·7H₂O、1.0 g KH₂PO₄, 1.5 g KCl, 14.3 mg H₃BO₃, 0.4 mg CuSO4₄·5H₂O, 0.08 mg MnSO₄₄·4時間₂O, 0.45 mg H₂酸化モリブデン₄、および1.1 mgのZnSO4₄·7時間₂滅菌蒸留水を用いて、最終容量を5 Lまで調整する。
      7. 滅菌砂を入れた直径10 cmのポットに、1ポットあたり4株となるように苗を植え付ける。各ポットに、窒素抜きMcKnight溶液20 mLを週2回灌水する。
      8. 以下の制御条件下で植物を維持する。 22°C ± 2°C （日）、 18°C ± 2°C （夜間）、相対湿度55%～60%、明期16時間／暗期8時間の光周期、および以下の光強度で 200 µmol 光子 m⁻2 s⁻1接種前に、苗を6〜7日間育成する。
      9. 各苗に細菌懸濁液3 mLを直接投与する。モック処理対照群には、滅菌済みYMB 3 mLを投与して維持する。処理群ごとに16本の生物学的反復植物を用いる。
      10. 接種から20日後に、根と地上部を回収する。根粒数を手動で計測し、回収直後に生重量を記録する。
      11. 組織を～で乾燥させる 65°C 恒量に達するまで乾燥させる。ここで恒量とは、24時間の間隔で乾燥させた後、2回連続で測定した値の差が以下の範囲内にあることと定義する。 <0.01 gとし、その後、乾燥バイオマス量を記録する。
      12. 結果を平均値として表示する ± 標準誤差（SE）。GraphPad Prismバージョン10.0を用いて、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびそれに続くTukeyの多重比較検定を行い、P値を考慮する。 < 0.05で統計的に有意。
        注：種子の滅菌、発芽、接種、および植物の育成の全過程において、無菌状態を維持すること。
        注意：次亜塩素酸ナトリウムおよび殺菌剤溶液を取り扱う際は、手袋や保護眼鏡などの適切な個人用保護具を着用してください。

結果

本プロトコールでは、nodC遺伝子座を標的とすることで、CRISPR-Cas9ゲノム編集をM. ciceri CC1192に適応させた。機能喪失を促進するため、sgRNAはnodCコード領域の5′末端近傍領域を標的とするよう設計し、初期コード領域内にDSBを導入することで、コードされるタンパク質の翻訳を阻害した(図 1A)。

figure-results-1
図1. Mesorhizobium ciceriのnodC遺伝子座を標的とするシングルガイドRNA（sgRNA）の設計。 (A) CRISPR-Cas9による標的化のために設計された2つの20-bp sgRNAの位置を示すM. ciceri nodC遺伝子座の模式図。sgRNAの標的部位を青色で示す。 (B) nodC遺伝子座を標的とするsgRNA1およびsgRNA2の塩基配列。プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM; 5′-NGG-3′）を赤色で示し、nodCの翻訳開始コドン（ATG）を黄色で強調している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

5′-NGG-3′ PAM配列の直上流に、2つの20 bpのターゲット配列が同定された（図1B）。Hsuら19のアルゴリズムを用いたこれら候補sgRNAのin silico解析では、特異性スコアが100となり、M. ciceriゲノム内で有意なオフターゲット相補性は検出されず、予測されるターゲット特異性が高いことが示された。選択したsgRNAの予測オンターゲット効率スコアにはわずかな差が見られたが（表3）、これを指標として、以降の実験的評価のためのガイド選択を行った。

標的部位
(bp)		鎖sgRNA配列（5'′ figure-results-2 3′)PAM特異度スコア効率スコア
77+TGTTTACAGAGGCATGCAAGCGG10043.58
139+GCTTGTTCGGATCCGACCGTTGG99.747.63

表 3: Mesorhizobium ciceriのnodC遺伝子のCRISPR-Cas9介在性編集用に設計された候補シングルガイドRNA（sgRNA）。候補sgRNAは、Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110を参照ゲノムとして、Benchling CRISPR Guide Design Toolを用いて設計した。予測される特異性とオンターゲット効率スコアに基づいてガイドの順位付けを行い、nodC翻訳開始コドンに近い配列を標的とし、かつStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）に必要なNGGプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含むものを選択した。

HDRおよび想定される変異体の蛍光ベースのスクリーニングを容易にするため、pUC18クローニングベクターを用いてHDRカセットを構築した（図 2）。pRJPaph-bjGFPからSacIおよびKpnI制限酵素消化によりgfpリポーターカセットを切り出し、線形化したpUC18バックボーンにライゲーションした（図 2A）。E. coliに形質転換した後、ブルー・ホワイトスクリーニングにより正のクローンを同定した。pUC18バックボーンへのgfpインサートの組み込みは、遺伝子特異的プライマーを用いたPCR増幅によりさらに検証し、正のクローンにおいて期待される500 bpのアンプリコンが得られた（図 2A）。

figure-results-3
図2. nodC破壊のためのCRISPR-Cas9相同組換え修復（HDR）システムの構築。 (A) pUC18-gfp中間プラスミドの構築と検証。上段は、pUC18バックボーンに緑色蛍光タンパク質（gfp）カセットを挿入して作成したpUC18-gfpのプラスミドマップを示す。中段は、ブルーホワイトセレクション後の代表的なコロニーを示す。下段は、BjGFP_BP_F1およびBjGFP_BP_R2プライマーペアを用いたコロニーPCRによる検証を示す。 (B) pUC18バックボーンにおけるHDRテンプレートの逐次アセンブリ。プラスミドマップおよび制限酵素消化解析により、上流相同腕（UHA）、下流相同腕（DHA）、および完全なUHA-gfp-DHA HDRカセットの挿入が確認された。 (C) UHA-gfp-DHA HDRカセットのpCasPP CRISPR-Cas9ベクターへのクローニングと検証。上段は最終的なpCasPP-HDRプラスミドマップを、下段はHDRカセットの挿入を確認する制限酵素消化の結果を示す。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

次に、gfpカセットの両側にnodCのホモロジーアームを導入することで、HDR構築物を構築した。予測されるCas9切断部位に隣接して配置した500 bpのUHAおよび400 bpのDHAを、制限酵素消化とライゲーションによりpUC18-gfp構築物に順次クローニングした（Figure 2B）。UHA-gfp-DHAカセットの構築は制限酵素消化分析によって確認され、期待通り2012 bpの断片が得られた（Figure 2B）。その後、完全なHDRカセットを広宿主範囲CRISPRベクターpCasPPにサブクローニングした（Figure 2C）。制限酵素消化分析により、最終的な構築物の完全性と、M. ciceri用ゲノム編集導入ベクターの構築が成功したことが確認された（Figure 2C）。

ドナーのE. coli S17-1λpirとレシピエントのM. ciceri株の間で二親交配を行い、pCasPP-gRNA-HDRコンストラクトをM. ciceriに導入した（図 3A）。図 3Bは、nodオペロンの構成と、HDRテンプレートを用いた相同組換えによるnodC遺伝子座のgfpカセットへの置換予測図を示している。二親交配後、まずGFP蛍光スクリーニングによって接合伝達体コロニーを同定した（図 3Bおよび3C）。gRNA2を用いた場合、回収したコロニーの80%以上がGFP蛍光を示し、gRNA1を導入した場合は65%以上のコロニーが蛍光を示した（図 3C）。蛍光スクリーニングだけでは、プラスミド由来のGFP発現とゲノムへの組み込み成功を区別できないため、リポーターカセットが目的の遺伝子座に特異的に挿入されたことを確認するために、後続の分子生物学的検証を行った。

figure-results-4
図3CRISPR-Cas9を介した～の破壊 nodC 〜における遺伝子座 Mesorhizobium ciceri. (A) pCasPP-gRNA-HDRコンストラクトを移 transferred するために用いられた両親交配の模式図 Escherichia coli S17-1λドナー細胞を導入し *M. ciceri* レシピエント細胞 (B) 相同組換え修復（HDR）を介した〜の置換を示す模式図 nodC 〜を持つ遺伝子座 緑色蛍光タンパク質 CRISPR-Cas9による切断後のカセット。HDRテンプレートには、当該領域を挟む約500 bpの上流相同アームおよび400 bpの下流相同アームが含まれている。 緑色蛍光タンパク質 カセット (C) 形質転換共役菌の蛍光ベーススクリーニング M. ciceri コロニー。sgRNA1またはsgRNA2を含むコンストラクトを用いた両親交配後に回収された蛍光陽性トランスコンジュガントの割合とともに、GFP陽性コロニーの代表的な蛍光および明視野実体顕微鏡像を示す。エラーバーは標準偏差を表す。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

nodC遺伝子座へのgfpカセットの組み込みを検証するため、代表的なGFP陽性コロニーを用いてPCR解析を行った。nodBおよびnodCにわたるゲノム領域を増幅したところ、編集クローンではレポーターカセットの組み込みと一致する1511 bpの断片が得られた一方、野生型（WT）株では430 bpの増幅産物が得られた（図 4A）。gfp特異的プライマーおよびnodC隣接プライマーを用いたPCR増幅では、編集クローンにおいて明確な997 bpの断片が生成されたが、WTコントロールでは増幅が検出されず、遺伝子座特異的な挿入が裏付けられた。レポーターカセットの向きはサンガーシーケンシングを用いて確認した。さらに、編集株におけるGFP発現をRT-qPCRを用いて評価したところ、WT株と比較してGFP転写物の蓄積が増加していることが示された（図 4B）。発現値は2−ΔΔCt法を用いて算出し、WT株をコントロールとして参照遺伝子である16s遺伝子で正規化した。データは3つの生物学的レプリケート（n = 3）の平均値 ± SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびそれに続くWTコントロールに対するダネット検定（Dunnett’s test）によって決定した。

本研究の現在の限界は、ベースラインとなる組換え係数を設定するための、空のgRNAを含むpCasPP-HDRのようなコントロールベクターが存在しないことです。今後の研究では、このようなコントロールを含めるべきです。

figure-results-5
図4〜の分子生物学的検証 ΔnodC Mesorhizobium ciceri 変異体 (A) PCRを用いた～の確認 nodC 破壊。左パネルは、F1_nodBおよびnodC_Rプライマーペアを用いた増幅を示している。レーンM：DNAラダー、レーン1〜4： Δ*M. ciceri* の nodC 変異体；WTレーン、野生型 M. ciceri右パネルは、F1_nodBおよびgfp_Rプライマーペアを用いた増幅を示している。レーンM：DNAラダー、レーン1～4： Δ*M. ciceri* nodC 変異体；WTレーン、野生型 *M. ciceri*期待されるアンプリコンサイズを示している。 (B) における相対的な緑色蛍光タンパク質（GFP）発現量 Δ*M. ciceri* nodC 逆転写定量PCR（RT-qPCR）により決定した変異体。遺伝子発現は、〜を用いて標準化した。 *M. ciceri* 16SリボソームRNA（16S rRNA）リファレンス遺伝子を用い、2^−ΔΔCt法を用いて野生型（WT）コントロールに対する相対発現量として算出した。ΔΔCt法。エラーバーは標準偏差を表す。統計的有意性はWTコントロールに対する相対値で判定した。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

nodC欠損の生物学的影響を、ヒヨコ豆感染アッセイを用いて評価した。野生型（WT）のM. ciceriを接種した植物では可視的な根粒が形成されたが、ΔnodC M. ciceriを接種した植物では、根粒形成が著しく減少または消失した（Figure 5A）。非接種の対照植物では根粒が形成されず、実験条件の無菌状態が維持されていたことが裏付けられた（Figure 5A）。植物の成長パラメータの定量分析により、根の長さ、根の生重量、根の乾重量、シュートの長さ、シュートの生重量、シュートの乾重量、および根粒数において、WT接種植物とΔnodC M. ciceri接種植物との間に差があることがさらに示された（Figure 5B）。WT接種植物は、ΔnodC M. ciceri接種植物および非接種対照植物と比較して、根粒数が多く、成長関連パラメータも向上していた。これらの知見は、nodCに関連する根粒形成機能の欠損と一致しており、M. ciceriの機能ゲノミクス研究におけるこのCRISPR-Cas9ベースのワークフローの適用可能性を支持している。処理群間の差異を比較するため、植物の表現型データを定量的に評価した。分析には計90の生物学的反復試行が含まれた（1処理群あたり n = 30 個体）。データは平均値 ± SDで提示している。統計的有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）およびそれに続くTukeyのポストホック多重比較検定を用いて評価した。P < 0.05 を統計的に有意であるとみなした。

figure-results-6
図5. ヒヨコ豆感染アッセイを用いたΔnodC Mesorhizobium ciceri変異株の機能的検証。 (A) 野生型M. ciceri、ΔnodC M. ciceriを接種した、または接種していない対照群の、接種20日後の代表的なヒヨコ豆（Cicer arietinum）植物体。 (B) 根の長さ、根の生重量、根の乾重量、地上部の長さ、地上部の生重量、地上部の乾重量、および根粒数を含む、植物の成長と根粒形成パラメータの定量分析。データは、野生型M. ciceri、ΔnodC M. ciceriを接種した植物、または接種していない対照群について示されている。エラーバーは標準偏差を表す。統計的有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）およびそれに続くTukeyの多重比較検定によって決定した。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足ファイル 1. 化学的コンピテントEscherichia coli細胞の調製および検証の詳細プロトコルこの補足ファイルでは、細菌培養の準備、コンピテント能の誘導、細胞の回収、CaCl₂–グリセロール緩衝液による洗浄、分注、凍結保存、および形質転換効率試験による検証を含む、化学的コンピテントEscherichia coli DH5αおよびE. coli S17-1λpir細胞の調製と検証の完全な手順を説明しています。また、重要な品質管理措置、保存方法、およびコンピテント能の判定基準についても記載しています。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 2. 相同組み換え修復（HDR）テンプレートの構築および CRISPR-Cas9 ゲノム編集ベクターの構築に関する詳細プロトコルこの補足ファイルでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）カセットの切り出し、pUC18-gfp 中間プラスミドの構築、上流および下流の相同アームの増幅とクローニング、完全な相同組み換え修復（HDR）テンプレートの構築、pCasPP-ガイドRNA（gRNA）ベクターの調製、HDR テンプレートの CRISPR-Cas9 プラスミドへの挿入、蛍光ベースのクローン選別、ならびに制限酵素解析およびサンガーシーケンシングによる組換えプラスミドの検証に関する詳細な手順を説明します。 こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル3. 両親交配およびGFPタグ付きMesorhizobium ciceri転接合体の作製に関する詳細プロトコルこの補足ファイルでは、ドナー株およびレシピエント株の調製、メンブレンフィルターを用いた両親交配、転接合体の回収と抗生物質による選択、プラスミドキュリング手順、形光ベースの組換えコロニースクリーニング、ゲノム編集株の分子生物学的確認、および確認済みGFP陽性M. ciceri転接合体の短期的・長期的保存について記述しています。詳細な培養条件、交配パラメータ、および選択手順が提供されています。 こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

M. ciceriにおけるCRISPR-Cas9ゲノム編集システムの構築は、農業的に重要なこの窒素固定共生細菌の遺伝子操作における大きな技術的制限を解消するものです。gfpレポーターとHDRを用いてnodC遺伝子座を破壊することにより、本ワークフローはM. ciceriにおける標的ゲノム改変のための蛍光支援フレームワークを提供します。

根粒菌における従来の遺伝子操作アプローチは、主にTn5ベースのランダム変異導入またはsacB介在性の対立遺伝子交換に依存していました19,26,27。これらの手法は依然として有用ですが、労力がかかり、多くの場合、複数回の逆選択を必要とし、またゲノム内に抗生物質耐性マーカーが残るため、その後の編集ラウンドを複雑にする可能性があります。対照的に、CRISPR-Cas9介在性のゲノム編集は、ゲノム工学においてより標的指向的で効率的な代替案を提供します。最近の研究では、Cas9に関連する毒性を軽減するために、S. melilotiにおいてCRISPR介在性のベースエディティングおよびCas12eベースのシステムが報告されており12,13、一方でR. etliではdCas9介在性の転写抑制が検討されています11。我々の知る限り、本研究はM. ciceriにおけるCRISPR-Cas9介在性の染色体破壊の初の適用のひとつです。本プロトコルでは、sgRNAガイドによる標的化、二親性プラスミド導入、およびHDR介在性組換えを組み合わせて、遺伝子座特異的な編集を行います。HDRカセット内にgfpレポーターを組み込むことで、編集されたと考えられるコロニーの迅速な蛍光ベースのスクリーニングが可能になり、これにより、その後の分子生物学的検証を必要とするコロニー数を削減できます。

このワークフローを正常に実施するためには、いくつかの要因が重要であった。予測特異性の高いsgRNAを選択することで、M. ciceriゲノム内における潜在的なオフターゲット効果を最小限に抑え、ホモロジーアームの完全性を維持することでHDR介在性の組換え効率を向上させた。さらに、二親交雑時のドナーおよびレシピエントの生育条件を最適化したことで、接合伝達体の回収率が向上した。蛍光ベースのスクリーニングにより、推定変異体の迅速な同定が可能となったが、レポーターカセットが目的の遺伝子座に組み込まれているかを確認するには、PCRおよびサンガーシーケンスを用いた分子生物学的な検証が依然として必要であった。今後の研究では、空のgRNAを含むpCasPP-HDRベクターをコントロールとして使用することで、ベースラインとなる組換え係数を定量化できると考えられる。

手法の進歩にとどまらず、本プラットフォームは、ヒヨコマメ共生リゾビアにおける共生シグナル伝達および機能ゲノミクスを調査する今後の研究を支援する可能性があります28。ヒヨコマメ（Cicer arietinum L.）は、世界的に重要なマメ科作物であり、持続可能な農業システムへの主要な貢献因子となっています29,30。本研究で作製したΔnodC M. ciceri株は、宿主と微生物の適合性および根粒形成に関連するシグナル伝達経路を調査するための、潜在的に有用な遺伝的背景を提供します。先行研究では、sRNAが根粒共生の初期段階において調節エフェクターとして機能することが示唆されています31。したがって、ここで述べた根粒形成欠損ΔnodC M. ciceri株は、根圏でのコミュニケーションおよび窒素固定共生の根底にある分子メカニズムに焦点を当てた今後の研究を促進すると考えられます。

開示事項

著者らは、競合する経済的利益または利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、Nandita Pasari博士に対するDepartment of Biotechnology (DBT)-MK Bhan Grant HRD-16016/15/2023-AFS-DBTによる支援を受けています。また、本研究は、インド、ニューデリーのNational Institute of Plant Genome ResearchからSenjuti Sinharoy博士に提供されたコアグラントによっても支援されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースGenetixPG-40005ゲル電気泳動
アルミホイルRolia’sGF83048115一般的なラボ使用
細菌学用アガーHiMediaGRM026培地調製
Benchling CRISPR ガイド設計プラットフォームBenchlingN/AガイドRNA設計
ホウ酸HiMediaPCT0102McKnight’s溶液の調製
ホウケイ酸ガラス製三角フラスコSigmaCLS5100500培養調製
ホウケイ酸ガラスチューブSigmaDWK73500-1075培養調製
塩化カルシウム二水和物HiMediaMB034コンピテントセルの調製
硫酸カルシウム二水和物HiMediaGRM328McKnight’s溶液の調製
カルベニシリン二ナトリウムDuchefa BiochemieDUC-C0109.005-18100 µg/mLで使用
cDNA合成キットThermo Fisher ScientificAB1543AcDNA合成
ラップフィルムOA10954049一般的なラボ使用
クローニングキット/T4 DNAリガーゼThermo Fisher ScientificK1422ライゲーション反応
コンゴーレッドHiMedia573-58-0微生物培養操作
硫酸銅(II)五水和物HiMediaPCT0104McKnight’s溶液の調製
培養チューブBorosil9800U08一次細菌培養の培養；15 cm × 2.5 cm
デジタルpHメーターEutech InstrumentsEC PH TUTOR DSpH調整
リン酸二カリウムHiMediaTC596MYMB調製
DNAラダーBIO-HELIXDM015-R500ゲル電気泳動
DNase除去キットInvitrogenAM1907単離RNAからのDNA除去
dNTPミックスThermo ScientificR0181PCR増幅
エタノールSigma-Aldrich1.00983.051175%で使用
エチジウムブロマイドSigma-AldrichE1510DNAゲル染色
FastAP 温度感受性アルカリホスファターゼThermo Fisher ScientificEF0651クローニング中のベクターの脱リン酸化
FastDigest バッファーThermo Fisher ScientificB64制限酵素消化
塩化鉄(III)無水物HiMediaTC583McKnight’s溶液の調製
蛍光実体顕微鏡NikonSMZ25GFPスクリーニング
殺菌剤、BavistinCrystal Crop ProtectionBavistin Carbendazim 50% WP種子処理
ゲル抽出キットQIAGEN28704DNA精製
グリセロールThermo Fisher ScientificQ24505コンピテントセル/グリセロールストック
オービタルシェーカー付き培養インキュベーターMRCLOM-150細菌培養
使い捨て手袋Kimtech97612個人用保護具
HEPESHiMediaMB016オリゴヌクレオチドアニーリング
IPTGG BiosciencesRC1113Dブルーホワイトスクリーニング
層流クリーンベンチBiolinkBL-H1300無菌操作
LBアガーHiMediaM1151細菌培養プレート
LBブイヨンHiMediaG1245細菌培養
硫酸マグネシウムHiMediaGRM1281-500GYMB調製
硫酸マグネシウム七水和物HiMediaPCT0008McKnight’s溶液の調製
硫酸マンガン(II)四水和物Sigma-AldrichM3634McKnight’s溶液の調製
マンニトールHiMediaMB198YMB調製
McKnight’s溶液ラボ内調製N/A植物栄養液
マイクロチップ、0.2–10 µLTarsons521000液体分注
マイクロチップ、2–200 µLTarsons521010液体分注
マイクロチップ、200–1000 µLTarsons521020X液体分注
マイクロ遠心チューブ、0.5 mLTarsons500000サンプル処理
マイクロ遠心チューブ、1.5 mLTarsons500010サンプル処理
マイクロ遠心チューブ、2.0 mLTarsons500020サンプル処理
モリブデン酸Sigma-Aldrich232084McKnight’s溶液の調製
NanoDrop分光光度計Thermo Fisher Scientific13-400-519DNA/RNA定量
ネオマイシンDuchefa BiochemieM013550 µg/mLで使用
ヌクレアーゼフリーウォーターHiMediaML064-100ML分子生物学用
PCRマスターミックスThermo Fisher ScientificK01712× マスターミックス
PCRチューブストリップ、0.2 mLTarsons610040PCRセットアップ
シャーレ、90 mmPSC2041アガープレート
ピペット、0.1–2.5 µLEppendorfN10178M液体分注
ピペット、0.5–10 µLEppendorfH40069L液体分注
ピペット、2–20 µLEppendorfH30046M液体分注
ピペット、10–100 µLEppendorfI00395M液体分注
ピペット、20–200 µLEppendorfM38186M液体分注
ピペット、100–1000 µLEppendorfN20610M液体分注
プラスミドDNA抽出キットQIAGEN12143プラスミド単離
塩化カリウムHiMediaTC010McKnight’s溶液の調製
リン酸二水素カリウム無水物HiMediaTC011MMcKnight’s溶液の調製
PVDFメンブレンフィルター、0.22 µm, 47 mmMilliporeSigmaGVWP04700二親交雑
定量リアルタイムPCR機Bio-RadCFX96RT-qPCR
冷却ベンチトップ遠心機Eppendorf04-987-373細胞回収
制限酵素、BbsIThermo Fisher ScientificER1011gRNAクローニング
制限酵素、EcoRIThermo Fisher ScientificFD0274クローニング
制限酵素、KpnIThermo Fisher ScientificFD0524クローニング
制限酵素、SacIThermo Fisher ScientificFD1133クローニング
制限酵素、XbaIThermo Fisher ScientificFD0684クローニング
RNaseフリーDNaseQIAGEN79254RNAクリーンアップ
砂Ram SuratSand植物生育基質
シーケンサーApplied BiosystemsABI3730xl DNA Analyzerサンガーシーケンシング
SOC培地ラボ内調製N/A形質転換後の回復
塩化ナトリウムHiMediaTC046培地調製
水酸化ナトリウムHiMediaPCT1325HEPESのpH調整
滅菌外科用メスMedicare Surgical16020ゲルの切り出し/組織処理
滅菌シリンジHMD Dispovan10ml syringe without needle滅菌ろ過
滅菌シリンジフィルター、0.22 µmMerck Millex Durapore12766842フィルター滅菌
SYBR GreenマスターミックスNew England BiolabsM3003ERT-qPCR
テトラサイクリンDuchefa BiochemieT010505 µg/mLで使用
サーマルサイクラーApplied BiosystemsA24811PCR増幅
ティッシュロールRolia’s07AAECR4885K1ZT一般的なラボ使用
TRIzol試薬Invitrogen15596026RNA単離
UVトランスイルミネーターAnalytik JenaTW-43ゲルの可視化
UV-Vis分光光度計EppendorfD30OD600測定
VisキュベットEppendorf30079345OD600測定
ボルテックスミキサーNeuationiSWIX-VTサンプルの混合
X-galG BiosciencesRC1233ブルーホワイトスクリーニング
酵母エキスHiMediaRM668-500G培地調製
硫酸亜鉛七水和物Sigma-AldrichZ0251McKnight’s溶液の調製

参考文献

  1. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology. 2013;31(3):233-9.
  3. Bertrand C, Thibessard A, Bruand C, Lecointe F, Leblond P. Bacterial NHEJ: a never ending story. Molecular microbiology. 2019;111(5):1139-51.
  4. Loureiro A, da Silva GJ. Crispr-cas: Converting a bacterial defence mechanism into a state-of-the-art genetic manipulation tool. Antibiotics. 2019;8(1):18.
  5. Altenbuchner J. Editing of the Bacillus subtilis genome by the CRISPR-Cas9 system. Applied and environmental microbiology. 2016;82(17):5421-7.
  6. Wang Y, et al. Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology. 2016;5(7):721-32.
  7. Oh J-H, van Pijkeren J-P. CRISPR–Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic acids research. 2014;42(17):e131-e.
  8. Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS synthetic biology. 2015;4(6):723-8.
  9. Wanjofu EI, et al. Nodulation and growth promotion of chickpea by Mesorhizobium isolates from diverse sources. Microorganisms. 2022;10(12):2467.
  10. Haskett T, et al. Complete genome sequence of Mesorhizobium ciceri strain CC1192, an efficient nitrogen-fixing microsymbiont of Cicer arietinum. Genome Announcements. 2016;4(3):10.1128/genomea. 00516-16.
  11. Bellahsen O, Díaz-Méndez R, Romero D. Genomic engineering in Rhizobium etli: implementation and evaluation of systems based on dCas9. Frontiers in Microbiology. 2025;16:1604430.
  12. Liu G, et al. An efficient CRISPR/Cas12e system for genome editing in Sinorhizobium meliloti. ACS Synthetic Biology. 2023;12(3):898-903.
  13. Wang L, Xiao Y, Wei X, Pan J, Duanmu D. Highly efficient CRISPR-mediated base editing in Sinorhizobium meliloti. Frontiers in Microbiology. 2021;12:686008.
  14. Schäfer A, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69-73.
  15. Rütering M, et al. Tailor-made exopolysaccharides—CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synthetic Biology. 2017;2(1):ysx007.
  16. Ledermann R, Bartsch I, Remus-Emsermann MN, Vorholt JA, Fischer H-M. Stable fluorescent and enzymatic tagging of Bradyrhizobium diazoefficiens to analyze host-plant infection and colonization. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2015;28(9):959-67.
  17. Göttfert M. Regulation and function of rhizobial nodulation genes. FEMS microbiology reviews. 1993;10(1-2):39-63.
  18. Kant C, Pradhan S, Bhatia S. Dissecting the root nodule transcriptome of chickpea (Cicer arietinum L.). PLoS One. 2016;11(6):e0157908.
  19. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 2013;31(9):827-32.
  20. Doench JG, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology. 2016;34(2):184-91.
  21. Norrander J, Kempe T, Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 1983;26(1):101-6.
  22. Simon R, Priefer U, Pühler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/technology. 1983;1(9):784-91.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. [4] Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods in enzymology. 1991;204:63-113.
  24. Alexandre A, et al. Natural populations of chickpea rhizobia evaluated by antibiotic resistance profiles and molecular methods. Microbial Ecology. 2006:128-36.
  25. Weerakkody LR, et al. A rapid, inexpensive and effective method for the efficient isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria. Molecular Genetics and Genomics. 2024;299(1):26.
  26. Selbitschka W, Niemann S, Pühler A. Construction of gene replacement vectors for Gram− bacteria using a genetically modified sacRB gene as a positve selection marker. Applied microbiology and biotechnology. 1993;38(5):615-8.
  27. Yadav A, Singh RP, Singh AL, Singh M. Identification of genes involved in phosphate solubilization and drought stress tolerance in chickpea symbiont Mesorhizobium ciceri Ca181. Archives of microbiology. 2021;203(3):1167-74.
  28. Dicenzo GC, et al. Multidisciplinary approaches for studying rhizobium–legume symbioses. Canadian Journal of Microbiology. 2019;65(1):1-33.
  29. Calia C, et al. A bibliometric analysis of chickpea agronomic practices in the world during 45 years of scientific research. Legume Science. 2024;6(1):e219.
  30. Sandhu J, Tripathi S, Chaturvedi S. Chickpea nutritional status and value chain for sustainable development.  Sustainable food value chain development: Perspectives from developing and emerging economies: Springer; 2023. p. 175-83.
  31. Ren B, Wang X, Duan J, Ma J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 2019;365(6456):919-22.

再版と許可

タグ

CRISPR-Cas9ゲノム編集相同組換え修復GFPリポーター蛍光顕微鏡観察サンガーシーケンシングヒヨコ豆感染アッセイ機能ゲノミクス

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。