精液の長時間曝露による時間依存性の精子運動性とDNA完全性の劣化

サマリー

射精後の精液長時間曝露では精子DNA断片化が増加し、運動性が有意に低下しました。14の正常サンプルでは、DNA断片化がそれぞれ1時間、2時間、4時間で5.5%、11.5%、16.1%増加し、運動性は低下しました。これらの発見は、オフサイトでの精液採取と処理の遅延を最小限に抑えることを支持しています。

要約

精子DNA断片化は精子の質に悪影響を及ぼすことが知られており、補助生殖技術(ART)サイクルに悪影響を及ぼす可能性があります。精液中の精子DNA断片化(SDF)を時間経過とともに調べることで、長期間精液曝露が精子DNAの完全性に与える影響についての洞察が得られます。本予備研究では、14件の正常精液サンプルに対して精子クロマチン分散アッセイを用いて、異なる時間点でSDFアッセイを用いて、サイト外の精液採取状況をシミュレートしました。アッセイ期間中のDNA断片化率の統計的解析により、射精から精液解析までの精液の長期停滞がDNA断片化を有意に増加させることが示されました。平均精子運動率は1時間で7.4%、2時間で14.5%、4時間で18.7%有意に低下し、平均SDFは精液採取後1時間で5.5%、2時間で11.5%、4時間後に16.1%有意に増加しました。この精子質の低下は、特に男性学検査室の外で精液採取を行う場合、ARTサイクルのための精子準備を検討する際に不妊クリニックのプロトコルに影響を与える可能性があります。検査機関は、オフサイト採取から精液を受け取るための許容可能な時間基準を設定することを検討するかもしれません。

概要

世界保健機関(WHO)は、世界の人口の6人に1人、すなわち人口の17.5%が生涯のいずれかの時点で不妊を経験していると認定しています¹.不妊症例の約20%は単独で男性因子不妊と診断されており、さらに30〜40%のケースが男性因子を二次診断としています²。健康な男性でも、精液パラメータは個人差で大きく異なり、濃度、運動性、形態、活力の変動など^{が含まれます。}したがって、臨床現場で適切な治療を提供するためには、男性の生殖能力を損なう具体的な要因を理解することが重要です。

研究の発展分野として、精子DNAの完全性が補助生殖技術(ART)サイクル^{4、5、6、7、8、9、10、11、12}、¹³に与える影響があります。WHOのヒト精液検査・処理に関する実験室マニュアル第5版では、精子DNA断片化(SDF)(単鎖または二本鎖断裂による)が胚の発生、着床、妊娠結果に影響を与える可能性があると述べています¹⁴。MurielらはSDFの解析を行い、SDFの増加がARTサイクルにおける受精率、胚の質、着床率の低下をもたらすことを発見しました¹⁰。しかし、DNA断片化の原因についての理解はより深まっています。

過去の研究では、酸化ストレスが精子の運動能力の低下、酵素産生および機能の障害、そして最も重要なDNA損傷を引き起こすことが報告されています^。このようなDNA損傷には、遺伝子欠失、誤訳、SDFなどが含まれますが、これらに限定されません。現在、SDFアッセイは精子DNAの完全性を評価するために使用されています。研究では凍結保存、媒体取り扱い、酸化ストレスがSDFと相関していますが、射精から分析^4,5までの期間におけるSDFについてはほとんど知られていません。これは、ARTサイクル¹⁵における精子準備のための自宅精子採取の増加を踏まえ、精子寿命において重要な時期です。COVID-19パンデミックの間、患者との直接接触を制限し、快適さと利便性を高めることで、自宅での回収はますます人気が高まりました。しかし、射精から自宅採取までの最適な時間を示す具体的なガイドラインはありません。したがって、本研究の主な目的は、停滞精液におけるSDFが時間とともに変化するかどうか、そしてその変化がARTサンプル取り扱いに関連しているかどうかを理解することでした。

プロトコル

この研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、大学病院の機関審査委員会(STUDY20201371)によって承認されました。研究に関与したすべての被験者からインフォームド・コンセントが得られました。オハイオ州北東部の単一の学術不妊治療センターの患者から14点の精液サンプルが選ばれました。この実験で分析されたすべてのサンプルは、当施設の現地で採取されました。精子クロマチン分散検査は、製造元の指示に従い、完全に訓練を受けた男性科医によって精液サンプルに対して実施され、対人関係の差異を最小限に抑えました。このキットでは、未固定の新鮮な精子を不活性なアガロースマイクロゲルに浸し、事前処理したスライドに浸し、4°Cで5分間冷却してマイクロゲルを固化させました。初期の酸処理は、断片化されたDNAを用いた精子細胞のDNA変性に用いられ、核タンパク質を除去するために溶解バッファー溶液を適用しました。蒸留水で洗浄した後、スライドは段階化されたエタノール溶液で脱水され、空気乾燥されました。キット付属の染色液で染色した後、光学顕微鏡で観察したところ、断片化のない精子は核直径の3分の1を超える大きな分散ハローを持つヌクレオイドを示し、断片化のある精子は小さなハロー(コア直径の1/3未満)またはハローが存在しませんでした。DNA断片化した精子の割合は、断片化・分解された精子の数として計算され、パーセンテージで表されました。合計300個の精子がスライドでカウントされ、大きさまたは中程度の分散ハローを持つか、分散ハローが存在しないかに分類されました。このカウントは技術的な変動を評価するために2回再現され、2つのカウントを平均化しました。キットの診断感度と特異度は93%であり、各実験には陽性・陰性の両方の対照が含まれていました。精液サンプルは0、1、2、4時間(0時間は液化期間37°Cで15分後と定義)に評価され、室温(22〜25°C)で維持されました。

各サンプルに対して0、1、2、4時間の追加運動解析が行われました。運動性評価は、経験豊富な男性科医が使い捨て計数チャンバーを用いたカウントプロトコルで実施しました。1グリッドあたり300個の運動性精子が数えられ、その数は2回再現されました。2つの重複カウントに基づいて、運動性精子の平均濃度が計算されました。

統計解析は反復測定のANOVAを用いて各時間群を比較しました。有意な全体効果が検出された場合、Tukeyの誠実に有意差(HSD)検定を適用して後処理ペアワイズ比較を行いました。p値<0.05は統計的に有意とされました。材料に関する詳細な情報は 材料表にまとめられています。

結果

精液の運動性およびDNA断片化に対する長期曝露の影響を評価するため、採取から4つの時点で合計14点の正常動物精子症患者サンプルを分析しました。分析されたサンプルはWHO第5^版14によれば精液分析パラメータが「正常」とみなされました。すべてのサンプルは、各時点で分析パラメータの精度を最適化するために、当院の不妊治療センターで現地で採取されました。患者の平均年齢は35.4歳(24〜45歳)でした。グループの初期精液パラメータ結果では、すべてのサンプルで平均精液量3.7 mL、平均濃度42.2百万/mL、平均運動率46.9%、平均正常形態4%、質的検査による白血球は陰性でした(表1)。

時間とともに精子の運動性が徐々に低下していることが観察されました。基準(0時間)と比較して、平均精子運動率は1時間で7.4%(範囲3–16%)、2時間で14.5%(範囲4–31%)、4時間で18.7%(範囲8–37%)低下しました。精子の運動率は時間とともに徐々に低下し、ベースラインの58.6%から曝露4時間後には42.5%に減少しました(図1)。全体として、運動性の低下は時間間で統計的に有意でした(p = 0.0001585)。同時に、精漿での長期インキュベーションでSDFは有意に増加しました。平均SDFはベースラインの15.6%から1時間で21.1%、2時間で27.1%、4時間で31.7%に増加しました。基準値と比較して、SDFは1時間で5.5ポイント(範囲4〜8ポイント)、2時間で11.5ポイント(範囲8〜16ポイント)、4時間で16.1ポイント(範囲13〜22ポイント)増加しました。SDFは、ベースラインと比較してすべての以降の時点で統計的に有意に増加が認められました。これには1時間(p = 0.021129)、2時間(p < 0.00001)、および4時間(p = 0.000018)が含まれます(表2)。

データの利用可能性
解析に使用された患者レベルの運動率およびSDFデータは 補足表S1に記載されています。

図1。射精後の精子の運動性の変化。 精子の運動性はベースラインおよび1時間、2時間、4時間の精液曝露後に評価されました。運動率は曝露時間が長くなるにつれて徐々に低下しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

パラメータ	平均	標準偏差
患者年齢	35.4(範囲、24〜45歳)	6.22
精液量	3.7 mL	2.18
集中	4220万/mL	33.45
運動性	46.9%	18.77
白血球	否定(全員)	—
形態	4.0%	0.77

表1:研究サンプルのベースライン精液特性。 精液パラメータは液状化後および時間依存的な精子DNA断片化および運動性評価前に記録されました。

時間	0 h	1時間	2時間	4時間
0 h*からの平均精子運動低下	—	-7.4%	-14.5%	-18.7%
平均SDF	15.6%	21.1%	27.1%	31.7%
標準偏差	5.28%	5.27%	5.31%	4.80%
P値と0 h	—	p = 0.021129	p < 0.00001	p = 0.000018
*Tukey HSDの事後比較を用いた反復測定ANOVA。

表2:精子DNA断片化および運動性の時間依存性変化。 精子DNA断片化および運動性は、ベースラインおよび1時間、2時間、4時間の精液曝露後に評価されました。値は著者による報告通りに示され、統計的比較が基線と比較されています。

補足表S1。患者レベルの精子運動差および精子DNA断片化指数の値。 値は比率で表されます。100を掛けてパーセンテージに換算します。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

本実験に含まれるサンプルでは、SDFは時間とともに増加し、運動性は同期間に減少しました。これは、精液が射精から分析や処理まで長期間停滞すると、精子DNAの完全性が低下する可能性を示唆しています。分析前にサンプルが停滞している時間を延ばすことで、酸化ストレスに関連する条件への曝露が増加する可能性があります。前述の通り、酸化ストレスは精子DNAの質に悪影響を及ぼし、高いレベルのDNA断片化を引き起こすことがある^6,8,13。本研究の結果は、ARTサイクルにおける精液処理に影響を与える可能性があります。

まず、クリニックが従来の精液分析パラメータに加え、ARTサイクルで使用する前に精子DNAの質を確認することが有益かもしれません。精子の質を最適化することは、凍結胚の数の増加、染色体正常率の増加、陽性妊娠や出生率の増加など、転帰の改善につながる可能性があります(以前の研究で報告されています¹⁶)。

第二に、これらの結果は自宅での精液採取がARTの結果に与える影響についての洞察を提供します。COVID-19パンデミックの間、多くのクリニック^{が患者にとって}より安全な選択肢として自宅精液採取を導入し^{始めました。}診療所がこの変化を始めると、患者はCOVID曝露を減らすだけでなく、自宅のプライバシーの中で採取を行う機会も与えられました。しかし、私たちの研究結果は、これらの実践の変化が精子の質や場合によってはARTの結果に関連するトレードオフを伴う可能性を示唆しています。

自宅採取キットを用いた以前の研究では、男性因子診断が異なる男性や、通常「正常」な精液サンプルを出す男性で精液分析結果に大きな変動があることが示されています¹⁸。この変動は、特に精液サンプルを一晩送る際に、自宅からクリニックへの輸送過程で精子が停滞することによる可能性があります。他の研究も、凍結・解凍された精子¹⁹ または新鮮な精子²⁰の精子調製後、5%CO2、37°Cで潜伏後の最初の3〜4時間でSDFが急速に増加するという結果を支持しており、精子準備後はARTのためにできるだけ早く精子を使用するべきであることを示唆しています。

Kardtaweeらは、精子採取場所が精子パラメータおよび生殖結果に与える影響についてメタ解析を行いました。自宅とクリニックで採取したサンプルの間に有意な差は示されませんでしたが、分析された研究の多くは観察研究であった¹⁶では顕著な異質性が指摘されました。重要なのは、これらの研究では、自宅で採取したサンプルをいつクリニックに戻して分析すべきかという管理されたタイムラインがなかったことです。しかし、本研究で分析されたデータは複数の時間点にわたるDNA断片化の制御された解析を可能にし、実験結果の精度と一貫性を高めました。

自宅採取は一部の患者にとって選択肢となる場合がありますが、SDFの発生率を理解することで、自宅採取がARTの結果に悪影響を及ぼす可能性のある患者を特定するためのガイドライン作成に役立つかもしれません。Christoforakiらによるシステマティックレビューおよびメタアナリシスでは、精液中の酸化減少電位が男性不妊に悪影響を及ぼすことが示されました²¹。解析対象となるパラメータには精子の濃度、数、運動性、形態が含まれ、これらは高い酸化還元ポテンシャルによって悪影響を受け、精子の質が酸化ストレスによって影響を受ける可能性を示しています。

本研究の強みは新規性であり、精液への長時間曝露時の時間依存性SDF変化を評価する研究はほとんどありません。この研究は、基礎的な精液病理を持たない比較的均質な男性群を対象とした対照的な環境で行われました。しかし、この研究は14人の患者という小さなサンプル数に限定されました。収集されたデータポイントと結論的なコメントの信頼性を最大化するために、さらなる実験を行うべきです。

さらに、SDF率に影響を与える可能性のある変数を調査し、特に精子の質維持に寄与する要因をよりよく理解する必要があります。考慮すべき要素には、精子準備時に使用される培地の取り扱い、自宅からクリニックへの輸送温度、凍結保存方法、男性患者の基礎疾患などが含まれます。SDFに寄与する要因について包括的な洞察を得ることで、クリニックは最終的にガイドラインを最適化し、ARTを受ける患者の治療プロトコルを確立する際により良い意思決定が可能になります。

観察された精子質の悪化は、長期間精液にさらされると運動性が低下しDNA断片化が増加するという明確な時間依存パターンを示しました。特に、保存後2〜4時間後にSDFが30%を超え、運動性がベースラインから約5分の1低下した際、最も顕著な劣化が見られました。これらの発見は、射精と精液処理の間の遅延が精子の機能的完全性に悪影響を及ぼす可能性を示し、補助生殖技術の手術のために異地で採取したサンプルの輸送および取り扱い時間を最小限に抑える重要性を支持しています。男性医学検査室は、特にIUIや体外受精の準備において、院外採取から精液を受け取るための許容可能な時間の閾値を設定し、患者に通知することを検討することがあります。射精から精液分析および準備までの時間は、特に男性科検査室のARTの異所で採取する場合は考慮すべきです。

本研究のサンプル数が小さいため、今後の研究では、異常な精液パラメータを持つ男性を含む、より広範な精液質カテゴリーで長期精液曝露がSDFに与える影響を評価するべきです。さらに、時間依存的なSDFの増加が、受精、胚発生、着床、妊娠、流産、生児率などのARTアウトカムに臨床的に有意な違いをもたらすかどうかを明らかにするために、前向きランダム化比較試験が必要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ANOVA Calculator	Statistics Kingdom		統計分析 https://www.statskingdom.com/anova_manova.html
Halosperm G2	Halotech	HT-HSG2	精子のDNA断片化を測定するためのインビトロ診断キット https://halotechdna.com/en/producto/halosperm-g2/
Microcell	Vitrolife	15423	精液分析用の使い捨てカウントチャンバー https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/
Quality Control for WBC/pH Test Strips	Medical Electronic Systems	A-CA-01752-00	QwikCheck WBCテストストリップのポジティブおよびネガティブコントロール https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/
QwikCheck WBC/pH Test Reagent Strips	Medical Electronic Systems	0700	精液中の白血球（WBC）を判定 https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/