炎症シグナルが遺伝的に感受性の高い生物の神経発達にどのように影響するかをモデル化するために、ゼブラフィッシュ幼虫のキューヴィエ管(共通主静脈)にIL-6を微量注射するプロトコルを提示し、炎症の制御された誘導と結節性硬化症複合体(TSC)における発生影響の評価を可能にします。
この記事について
サマリー
要約
結節性硬化症複合体(TSC1/TSC2変異)を持つ患者は自閉症スペクトラム障害(ASD)の発現度が変動し、母体の免疫活性化がASDリスクを高めることが知られています。インターロイキン6(IL-6)は、免疫調節、炎症、神経炎症過程においてよく知られた役割を持つ多面性サイトカインです。感染や組織損傷に反応して複数の免疫細胞タイプによって産生され、一般的に炎症促進メディエーターとして特徴付けられています。特にIL-6は血脳関門を通過でき、自閉症スペクトラム障害(ASD)や知的障害(ID)を含む神経炎症および炎症関連の神経精神疾患に関与していることが示唆されています。ここでは、IL-6をキュビエ管に注入して血流に送ることでゼブラフィッシュに全身性炎症シグナル伝達を誘導するプロトコルを説明します。このアプローチにより、初期発生における炎症による変化を研究するための制御され再現性の高い炎症反応が可能になります。このプロトコルは、IL-6の調製、顕微注射、そして病気や神経炎症のゼブラフィッシュモデルにおける下流の実験的応用の重要なステップを詳述しており、遺伝子と環境の相互作用を探る研究も含まれます。全身性炎症シグナル伝達の制御された誘導を可能にすることで、このアプローチは遺伝的感受性と炎症曝露がどのように交差して発達結果を形成するかを検証する多様なプラットフォームを提供します。
概要
炎症信号が初期神経発達をどのように形成するかを理解することは、特に遺伝的に感受性が高い文脈において神経発達障害のメカニズムを解明するために不可欠です。このプロトコルの主な目的は、インターロイキン6(IL-6)をキュービエ管(共通主静脈)に直接顕微注射することで、ゼブラフィッシュ幼虫の全身炎症シグナル伝達を誘導する正確かつ再現性の高いアプローチを提供することです。
結節硬化症複合体(TSC)は、このような遺伝子と環境の相互作用の例です。TSCは、TSC1またはTSC2の変異によって引き起こされるまれな遺伝性疾患で、それぞれハマーチンとチューベリンという複合体を形成し、通常mTORC1シグナルを抑制する複合体を形成します。この抑制を失うとmTORC1経路が過剰活性化され、異常な細胞増殖や自閉症スペクトラム障害(ASD)を含む幅広い臨床症状が現れます1,2。ASDは先進国で平均診断年齢が約3歳の個人の約1.5%に影響を及ぼすと推定されています。3.ASDは反復行動、社会的相互作用の障害、認知的柔軟性の低下を特徴とし、患者はしばしば不安、うつ病、知的障害などの追加の神経行動的課題を呈します。特筆すべきは、TSC患者の40%〜60%がASD関連の特徴を示すことですが、症状の重症度は類似の変異を持つ患者でも大きく異なり、環境要因が遺伝的リスクを調節していることが示唆されています。
その一例が炎症です。ASDの病因はほとんど不明ですが、複数の脳領域にわたる神経炎症は長らく関与していると考えられています。前臨床および臨床的証拠の増加は、母体免疫活性化(MIA)によって引き起こされる胎児神経炎症とそれに伴うサイトカインシグナルの上昇がASD6の病因に有意に寄与する可能性を示しています。したがって、TSCのような遺伝的に感受性の高いシステムにおける炎症性サイトカイン曝露をモデル化することは、免疫信号が乱れたmTORC1調節とどのように交差し、早期脳の発達にどのように影響を与えるかを探る強力な枠組みを提供します。
このプロトコル開発の根拠は、サイトカイン媒介炎症(IL-6シグナル伝達を含む)が遺伝的脆弱性と相互作用し、神経発達の軌跡に影響を与える可能性があるという認識の高まりに由来しています。サイトカインは免疫系内のコミュニケーションを調整する低分子量の糖タンパク質です。ASDでは、複数の研究で炎症促進サイトカインのレベルが一貫して報告されており、末梢血中のIL-6を含む7,8,9,10が含まれており、IL-6シグナル伝達の調節不全がこの障害に特徴的な神経発達的および行動的特徴に寄与しているという仮説を支持しています。IL-6は、感染や組織損傷に応答して多様な免疫細胞タイプが産生する免疫活性化の重要な媒介体です。IL-6は血液脳関門を通過し、ニューロン、アストロサイト、ミクログリアに直接影響を与えるため、このサイトカインの持続的な上昇は神経発達経路、シナプス可塑性、神経免疫恒常性の変化に関与していると考えられており、これらのメカニズムはASDの病態生理学でますます探求されています(11,12)。これらの関連性は、妊娠中の母体IL-6の上昇が胎児の脳の発達を妨げ、ASD関連リスクを高めるMIA研究によってさらに強化されています13。しかし、既存の脊椎動物モデルは、病原体関連分子や母体曝露パラダイムによる全身免疫刺激に依存することが多いため、変動が生じたり、複数の免疫経路を同時に活性化したり、IL-6の特異的寄与を単離する能力が制限されることがあります。ゼブラフィッシュへの直接IL-6マイクロ注射は、透明で遺伝的に扱いやすい生物体内の単一のサイトカインを標的操作可能にすることで、これらの制約を克服します。
ゼブラフィッシュはサイトカイン駆動の発生効果の研究にいくつかの利点を提供します。光学的透明性により、免疫や神経反応のリアルタイム可視化が可能です。その急速な開発により、ハイスループット実験が可能となり、また、保存されたサイトカインシグナル伝達経路により、炎症機構を解剖する強力な脊椎動物モデルとなっています(14,15,16,17,18)。実験研究では、外因性物質(細菌、がん細胞、DNA、ナノ粒子など)をゼブラフィッシュの幼虫に送達する必要があります。一つの方法は、幼虫を対象物質を含む溶液にさらし、皮膚、えら、消化管を通じて受動的に取り込むことです。2つ目でより直接的な方法は顕微注射で、外部材料を細かいガラス針19,20,21を用いて特定の胚または幼虫区画に送り込みます。重要なのは、キュビエ管への微小注射が全身への送達の信頼できる経路を提供し、全身免疫刺激による混絡影響なしにIL-6を循環全体に迅速に分布させることを保証することです。
本プロトコルでは、注射注射器の準備から、受精後2日および3日(dpf)にシブラフィッシュ幼虫のキュビエ管を経由してIL-6を血流に注入するまでの段階的な手順を提示します。この方法は、特定の炎症性手が初期の発達過程にどのように影響するか、神経発達や免疫関連障害のモデルにおける遺伝子と環境の相互作用、生 体内でのサイトカイン曝露による細胞および分子的影響、遺伝子変異と炎症シグナル伝達経路の相互作用を調査する研究者に特に有用です。制御されたサイトカイン特異的かつ発生的に精密なアプローチを提供することで、IL-6および関連する免疫信号が初期の免疫、神経、行動の結果をどのように形成するかを探るための多用途なプラットフォームを提供します。
プロトコル
ここで述べる手順では、tsc2vu242/+ ゼブラフィッシュライン22,23が使用されました。実施されたすべての実験は関連法令に従って実施されており、発達段階(<5 DPF)が義務的な倫理審査の範囲外であるため、追加の倫理委員会承認は必要ありません。図1はプロトコルの回路図を示しています。
1. マイクロピペットの引き抜き
- ホウケイ酸ガラス毛細血管からマイクロピペットプラーを用いてマイクロインジェクション針を準備し、確立された手順に従って24。
- 長さ10cmのホウケイ酸ガラス毛細血管(外径1.0mm、壁薄く)を使い、マイクロピペットプラーに注入します。
- 毛細管をプラーキャリッジ内に慎重に配置し、指定された溝内で正確に位置を合わせ、引きながら動かないように計器用クランプでしっかりと固定してください。
- 毛細管を加熱フィラメントの中心に調整し、引く領域に沿って均一な加熱を保ち、針状の形成を均一にします。
- 最適化パラメータ(例:サッター機器では熱:533、引き:50、速度:60、遅延:90、圧力:200)を使って引き込みプログラムを開始し、細かい先端のマイクロインジェクション針を生成します。
注意:ガラス毛細血管から引き抜くマイクロニードルは壊れやすく、ひび割れや詰まり、注入量を変化させる不規則な先端形状ができることがあります。使用前に各針を立体顕微鏡で確認し、硬い表面に先端を触れさせないようにし、抵抗、漏れ、滴の大きさの不均一が確認された場合はすぐに針を交換してください。
注意:引き抜きの工程の後、毛細血管の両端にテーパー状の針先が形成されます。使用前に、先端を立体顕微鏡の下で細かい鉗子で優しく割って、マイクロインジェクションに適した望ましい開口径を得る必要があります。
2. バッファーおよびストック溶液の準備
- E3胚培地の60 ×ストック溶液を準備します( 表1参照)。溶液をオートクレーブで滅菌し、4°Cで保存します。 使用時には、ストック溶液を超純水で希釈して1× E3作動溶液を得る。
注:E3胚培地の60×液は4°Cで長期保存可能です。 - 表1に記載された20倍のストック溶液(MS-222)を準備します。溶液は4°Cの暗闇で保存し、劣化を防ぎます。使用前にE3培地で1×の作業濃度に希釈します。
注意:トリカインストック溶液のpHを1 M Tris pH 9.0を用いて7.5に調整してください。この溶液は分割して-20°C(凍結)で長期保存するか、4°Cで保存することができます。 トリカインはRTや光の下で毒性化合物に分解されます。
注意:トリカイン(MS-222)を麻酔に使用する場合は、過少・過剰曝露が幼虫の生理や行動に悪影響を及ぼす可能性があるため、特に注意が必要です。過剰な曝露は心機能低下や後の行動変化を引き起こし、不十分な麻酔はマウント時の損傷リスクを高めます。最低限の有効濃度と持続時間のみを使用し、行動分析を行う前に新鮮胚培地で完全に回復させてください。 - 1%(w/v)のアガロース溶液をE3培地で加熱し、完全に溶けるまで準備します。
注意:事前に準備されている場合、溶液は4°Cで保存し、使用前に再加熱することができます。実験当日には、早期固化を防ぐためにアガロースを55〜60°Cの液体状態に保ちます。 - 0.9%(w/v)のNaCl溶液を準備し、室温で最大1週間保存、または4°Cで長時間保存します。使用前に、溶液を室温に均等化するか、胚の生理的条件に合わせて28.5°Cで培養してください。
- 0.9%のNaClで2 pg/nLのIL-6溶液を準備します。繰り返しの凍結融解サイクルを避けるために溶液を分割し、-20°Cで保存します。 使用前に解凍し、アリコートを室温に移します。
- 超純水で調製した20 mg/mLのストック溶液から、E3培地中のプロナース作動液を0.5 mg/mL作動液を準備します。
3. 2 DPFまで胚を入手・育てること
- 複数の tsc2vu242/vu242 成体のゼブラフィッシュを産卵水槽に入れてグループスポーンを設定しましょう。
注意:オスとメスは、早期産卵を防ぐために隔て板を使って夜間に分けることができ、翌朝には分離器を取り外して同期交尾を促します。あるいは、光が制御された環境で仕切りを使わずに魚を飼育することもでき、暗い(夜)から明るくなる(朝)への移行が産卵の合図となります。 - 翌日は(使う場合)仕切りを外し、約1時間スポーンを待ちます。
- 受精胚は速やかに採取し、40mLのE3胚培地を含む100mmペトリ皿に移し、1皿あたり最大~60個の胚密度を保ち、最適な発育を確保します。
- 胚は28.5°Cで、14時間の明暗と10時間の暗い制御された昼周期で培養します。
- 1 dpfと2 dpfで、立体顕微鏡で胚を観察し、死んだ胚、未受精卵、残骸を除去して培養品質を維持します。
- E3培地を新鮮な溶液に置き換えて老廃物の蓄積を最小限に抑え、正常な胚発生をサポートします。
4. マイクロ注射および脱胆毛のためのアガロースプレートの準備
- E3培地に1%(w/v)のアガロース溶液を準備し、アガロースが完全に溶けて透明になるまで加熱します。
- 溶液を短時間冷やした後、約30mLを100mmのペトリ皿に注ぎ、表面に均一な層を保ちます。
- アガロースがまだ液体のまま固まり始めている間に、シリコーンの型を優しく表面に置いて均一な溝を作ります。
注:ここでは、ピラミッド型のパターンを持つシリコーン型(図2)を用いて、マイクロインジェクション中に余分なE3を保持できる井戸を生成します。これらのウェルは、標準的な培養条件外でも乾燥を防ぎ、胚の生存性を確保するために十分な水分を保つことで、取り扱いや注入時に一時的に安定性を提供するよう設計されています。 - アガロースコーティングされたペトリ皿(直径50mm)を準備し、約5mLの溶融した1%(w/v)アガロース溶液を注ぎ、皿を優しく回して表面を均一にコーティングします。
- 余分なアガロースを取り除きましょう。
- アガロースを室温で10〜15分間固めます。セットが完了すると、胚の酵素脱胆処理に使える状態です。
5. 2匹のDPF魚の酵素脱毛
- 約100個の胚を絨毛細胞内の2dpfで移植し、50mmの小さなアガロース被覆ペトリ皿に移植します。
- 酵素溶液の希釈を最小限に抑え、効率的な脱胆を確実にするために、できるだけ多くのE3培地を除去してください。
- 新たに調製したプロナーゼ溶液4mL(ストック濃度:20 mg/mL[超純水で調製]、作動濃度:0.5 mg/mL [E3で希釈])を皿に加え、胚を完全に浸します。
注意:プロナーゼ治療は慎重に管理する必要があります。過剰消化は幼虫組織を損傷し、取り扱い時の脆弱性を高め、生存や行動に影響を及ぼす可能性があります。最小限の有効曝露時間のみを使用し、その後胚を十分にすすぎて酵素活性の継続を防ぎます。 - 室温で3〜5分間培養し、立体顕微鏡で絨毛細胞からの放出を監視します。
- 皿をやさしく回転させたり、間欠的に回したりして、酵素的に絨毛細胞を除去しやすくします。胚の大部分が絨毛膜から解放されるまで続けます。
注意:裸の胚は常に溶液に浸されていることを確認してください。そうしないと卵黄嚢が破裂し、胚が死ぬ可能性があります。 - 脱毛球が達成されたら、胚を新鮮なE3培地で5〜6回交換して徹底的に洗浄します。
注意:裸の胚は常に溶液に浸されていることを確認してください。そうしないと卵黄嚢が破裂し、胚が死ぬ可能性があります。 - 幼虫へのダメージを防ぎ、最適な培養条件を維持するために、すべての絨毛膜およびプロナーゼ残基を除去してください。
- ガラス製パスツールピペットを使い、40mLのE3培地を含む100mmペトリ皿に~50個の脱毛幼虫を移します。
- 幼虫はマイクロ注射されるまで、これらの状態を維持してください。
6. ゼブラフィッシュ胚の注入
- 立体顕微鏡(≥150×倍率)で細かいピンセットを使って、引き抜いたガラス毛細管(セクション1)の先端を慎重に割り、直径約3μmの開口部を持つマイクロピペットを生成します。
注意:適切なマイクロピペットは、先端が細かく開かれ、目に見える平坦化や大きな開口面がないことを確認することで識別できます。先端が大きく折れすぎると魚の皮に効果的に浸透できず、注射が不安定または不安定になる可能性があります。したがって、先端の開口は高倍率の立体顕微鏡下で慎重に行い、毛細管の最先端で最小限かつ制御された断裂を確保する必要があります。 - 0.9%(w/v)NaCl(対照)またはIL-6(2 pg/nL)の注入溶液を0.9% NaClに準備し、注射時の可視化を容易にするために10 μLごとに0.1%トリパンブルーを1 μL加えます。
- マイクロローダーチップを使って、準備済みのマイクロピペットに~3 μLの注入液をバックフィルし、気泡が入らないようにします。
- マイクロインジェクションシステムに接続されたキャピラリーホルダー(図2)に装填済みのマイクロピペットを固定します。
- キャリブレーションスライドに少量のミネラルオイルを置きます。
- 液滴を鉱物油に排出し、0.01mmスケールのキャリブレーションスライド(図2)で直径を測定することで注入量を校正します。注入圧力(300〜500 hPaの間)を調整し、液滴体積を~1 nLにします。
- 幼虫を含むE3培地にトリカイン(MS-222)を最終濃度1×で麻酔を加えます。ストレスを最小限に抑え、安定した鎮静を確保するために、幼虫を少量ずつ使用してください。
- 2個のdpf幼虫を固化したアガロース注射プレートに移します。複数の幼虫(例:最大10匹)は、取り扱い能力に応じて1皿ごとに配置されることがあります。
- 皿を立体顕微鏡の下に置く。ガラスピペットを使い、キュビエ管がはっきり見えてアクセスしやすいように各幼虫を優しく配置します。
注意:複数の幼虫を扱う際は、乾燥を防ぐためにトリカイン(1×)を含むE3培地を定期的に滴加してアガロース表面を水分補給しておくようにしてください。 - マイクロピペットの先端をキュビエ管の入口( 図3参照)に位置させ、立体顕微鏡で心臓に向かって移動する血球を追跡することで識別できます。
- 準備済み溶液を2滴(それぞれ~1 nL)連続してキュビエ管に注入し、注入間隔は約20秒で適切な分布を確保します。
- 注入後、幼虫をアガロースプレートから新鮮な100mmのペトリ皿(40mLのE3培地を含む)に優しく移します。移送中の機械的負荷を最小限に抑えましょう。
- 幼虫を28.5°Cのインキュベーターに戻し、回復させます。
- 翌日(3 dpf)に、ステップ6.8–6.13で説明されたマイクロインジェクションを繰り返します。
注:単回の注射は短命なシグナル伝達のみを生じ、一貫した行動反応はありませんが、2回目の注射は神経発達に関連する初期幼虫発生期の炎症経路の持続的な活性化を保証し、代表的な結果セクションで述べた行動変化を引き起こします。 - 5dpfで幼虫を行動解析、脳画像診断、免疫蛍光解析などの下流応用に使用します。
結果
IL-6マイクロ注射が幼虫の生理学および行動に与える影響を評価するため、IL-6注入幼虫とNaCl注射対照群を生存期間およびゼブラフィッシュの不安様および反復行動の評価に一般的に用いられる2つの行動指標を比較しました。IL-6マイクロ注射はNaCl注射と比較して幼虫の生存率に影響を与えませんでした(図4A)。5 dpfでの生存率はIL-6注射群とNaCl注入群で区別できず、投与方法が良好に耐容性があり非特異的毒性を生じさせないことを示しています。マイクロインジェクション自体は未注射の兄弟注射と比較してわずかに生存率を低下させ、IL-6曝露とは独立した扱いに関する軽度の影響を示しています。これにより、プロトコルが下流の行動分析に適していることが確認されます。
IL-6微小注射パラダイムが5 dpfで測定可能な炎症反応を誘導することを検証するために、サイトカイン駆動の炎症シグナル伝達の下流メディエーターであるプロスタグランジンE2(PGE2)を定量化しました。tsc2-/-ホモ接合変異体は、IL-6注射なしでも基礎PGE2レベルが上昇し、野生型(WT)のtsc2+/+兄弟株よりも有意に高い数値を示しました(図4B)。ヘテロ接合型tsc2+/-変異株は、WT幼虫と比較して基準PGE2がわずかで有意でない増加を示しましたが、重要なことにIL-6微小注射後にPGE2レベルが急激に上昇しました。このパターンは、遺伝子×環境の相互作用をモデル化するという私たちの目標と一致しています。すなわち、WT幼虫は軽度で一時的なIL-6曝露にほとんど影響を受けないのに対し、遺伝的に感受性の高いtsc2+/-変異体は顕著な炎症反応を示します。
これらの遺伝子型依存的な炎症トーンの違いに沿って、次にIL-6誘導シグナル伝達がオープンフィールドアッセイで測定可能な行動変化に結びついているかどうかを検討しました。5 dpfでのオープンフィールドテスト(前述の22)では、tsc2変異幼虫がWT兄弟姉妹に比べて不安様行動が増加していることが示されました(図4C)。しかし、IL6の微小注射はこの挙動に影響を与えませんでした。具体的には、tsc2+/-およびtsc2-/-幼虫は闘技場の外側ゾーンで著しく多くの時間を過ごし、tsc2+/+に比べて中心探索が減少し、ゼブラフィッシュ幼生における確立された不安関連表現型と一致しました。
IL-6注射は、特にtsc2+/-変異幼生(図4D–E)において、繰り返しで固定観念的な泳ぎパターンを増加させました。これはゼブラフィッシュモデルでASD関連の指標としてよく用いられる行動的特徴です。3回以上の連続的な円形泳ぎと定義される反復ループの詳細な定量化により、NaCl注入対照群と比較してIL-6注入されたtsc2+/-変異体の割合が有意に増加していることが明らかになりました。遺伝的に感受性の高い幼生における反復的な泳ぎの選択的強化は、遺伝子×環境相互作用をさらに支持し、軽度の炎症刺激がtsc2+/-変異体背景におけるASD様行動傾向を明らかにまたは増幅させる。
図1:プロトコルの回路図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2:マイクロインジェクションワークステーションのセットアップ。幼生ゼブラフィッシュ注射に使用されるマイクロインジェクションワークステーションの概説。(1) インジェクターホルダーに取り付けられたガラス製マイクロピペット;(2) 幼虫の位置決め用の成形孔を備えたアガロースコーティングのペトリ皿;(3) 校正用の鉱物油;(4) トライパンブルー溶液;(5) 引き抜かれたガラス針;(6) キャリブレーションスライド;(7) 拡張ピペットチップ;(8) パスツールピペット;(9) シリコーン型。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3:キュビエ管への注入。 (A) 幼生ゼブラフィッシュにおけるキュビエ管(共通主静脈)注入部位の概略的表示および5dpfでの代表的な野外運動経路。(B) コントロール(未注射)およびNaClおよびIL-6注射の代表的な画像。スケールバー:250μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
図4:tsc2変異体系統を用いた遺伝子x環境相互作用の代表的な結果。(A) 実験期間中のtsc2vu242幼虫の生存率(%)(未注射群)、NaCl注入群、IL-6注入群の比較。データは5dpf(n=4回の独立した実験複製、各遺伝子型×処理の組み合わせで60〜70匹を含む)±のSEM平均として提示されています。統計解析はANOVAを用いて行われ、その後Tukeyの事後検定でペアワイズ比較を行いました。対照群とIL-6注射群間で有意差が認められました(p = 0.00150)、対照群とNaCl注射群間では(p = 0.00243)。(B) tsc2変異体および兄弟株のPGE2レベルを示すボックスプロット。製造元のプロトコルに従い、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて5dpfで測定(遺伝子型の2因子ANOVA:F=7.4503;P = 0.01234)。各サンプルには20個の表が含まれており(尾は遺伝子型分けに使用されました)。ボックスプロットの点は生物学的な複製を表しています。(C) Tsc2変異魚のオープンフィールド試験の結果のボックスプロット。NaClおよびIL-6注入後、各遺伝子型および未注射対照群の壁際で相対的に過ごす時間を示す(遺伝子型の2項ANOVAはF = 7.021;P = 0.00106)。オープンフィールド試験は、以前に報告されたプロトコルに従い、自動分析室(材料表)を用いて実施されました。(D) NaCl注射後のランダム探索行動とIL-6注射後の反復ループを示す例図。(E) NaClまたはIL-6を注入した後、各tsc2遺伝子型および未注入の対照魚の正常かつ反復ループ行動を示す個体数を示すボックスプロット(遺伝子型の2因子ANOVA:F = 5.7615;P = 0.005849)。この実験には、それぞれの遺伝子型×処理組み合わせで60〜70匹の魚を含む3つの独立した実験複製が使用されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
| 60個のE3ストック解 | ||
| 試薬 | 最終集中 | 金額 |
| NaCl | 297 mM | 17.4 g |
| KCl | 10.7 mM | 0.8 g |
| CaCl2 | 19.6 mM | 2.18 g |
| MgCl2·6H2O | 24 mM | 4.89 g |
| 超純粋H2O | 該当なし | 最大1Lまで充填 |
| 合計 | 該当なし | 1 L |
| トリケインストック溶液 | ||
| 試薬 | 最終集中 | 金額 |
| トリカイン | 15.3 mM | 1 g |
| 1 M トリス-HCl pH 9 | 21 mM | 5.25 mL |
| 超純粋H2O | 該当なし | 244.75 mL |
| 合計 | 該当なし | 250 mL |
表1:E3およびトリケイン溶液の組成。
ディスカッション
予想通り、tsc2ホモ接合変異体は、以前に報告された表現型と一致する高い基準レベルの不安様を示しました22,27。これらの幼虫はすでに重度の行動異常を示しているため、IL-6注射は表現型をさらに悪化させることはありませんでした。対照的に、tsc2ヘテロ接合体はIL-6による明確な変化を示しました。この選択的感受性は、このプロトコルが遺伝子×環境の相互作用を探る上で有用であることを強調しています。ここでは、軽度だが長期にわたる炎症シグナル伝達が遺伝的脆弱性と相互作用し、神経行動の結果を形成します。
LPS曝露はゼブラフィッシュにおいて最も広く用いられている炎症誘発パラダイムであり、強力な炎症誘導サイトカインの誘導、自然免疫細胞のリクルート、用量依存的な死亡率を特徴とする広範で堅牢な免疫応答を確実に生み出します28。強力なLPSは複数のToll様受容体経路を同時に活性化し、28,29,30の相互作用を形成するため、個々のサイトカインの神経発達下流への寄与を特定するのが困難です。これに対し、ここで述べるIL-6マイクロ注射プロトコルは、母体の免疫活性化に中心的であることが知られている単一のサイトカインを増強することで、標的を絞った制御されたアプローチを提供します。重要なのは、IL-6注射はNaCl注射対照群に比べて死亡率を増加させないため、行動的および分子表現型を毒性を交絡させることなく調べられることです。さらに、IL-6微小注射はPGE2値の上昇で示されるように特定の下流炎症シグナルを生み出し、特に遺伝的感受性がサイトカイン曝露と相互作用するtsc2ヘテロ接合幼虫における反復泳動の増加など、測定可能な行動変化を引き起こします。これらの区別は、LPSが全局的な免疫活性化をモデル化する一方で、IL-6マイクロインジェクションが神経発達リスクに関連するサイトカイン特異的メカニズムの精密解析を可能にすることを強調しています。
ここで示した代表的な結果は、tsc2変異体背景下でのIL-6効果を示していますが、プロトコル自体は広く適用可能です。この方法は野生型幼虫やその他の遺伝モデルで容易に適用でき、定義された炎症手がかりが初期神経発達の多様な遺伝的文脈とどのように交差するかを調べることができます。tsc2モデル以外の応用については、サイトカイン感受性や炎症閾値が遺伝子型や実験目的によって異なる可能性があるため、最適なIL-6用量を実証的に決定することを推奨します。
このプロトコルにおける重要な技術的考慮点は注入量の一貫性であり、IL-6の生物学的効果は約1 nLの正確な投与に依存します。液滴の大きさの変動は、針の開口や注入圧力の違いによってよく生じます。液滴が小さすぎる場合は、高倍率で徐々に圧力を上げたり、針先をわずかに広げることで、通常は適切な流れが回復します。逆に、液滴が意図した体積を超える場合は、針の開口部が広すぎることを示しており、その場合は圧力を下げるか、先端を狭くした新しい針を準備する必要があります。正確な注射量を維持することは不可欠であり、逸脱は炎症負荷を変化させ、再現性を損なう可能性があります。時には、針から溶液が抜けない状況に遭遇することもあります。これは主に針先の気泡やゴミ、詰まりが原因です。立体顕微鏡で針を点検し、インジェクターシステムの漏れや緩い接続部をチェックすれば、通常問題は解決します。針先を清潔で妨げることのない状態を保つことは、安定した投与と幼虫を傷つける可能性のある圧力の蓄積を防ぐために不可欠です。
もう一つ重要な要素は、注入量の生理的耐受性です。幼虫は一般的に~1 nLの摂取量に耐えやすいですが、特に複数回連続した注射を行うと死亡率が増加します。繰り返し投与が必要な実験では、機械的ストレスを最小限に抑え、注射間に十分な回復時間を確保し、IL-6濃度を体積ではなく調整して望ましい量を得ることが重要です。これらの考慮事項は、観察される表現型が注射による損傷ではなくサイトカイン曝露を反映していることを確認するのに役立ちます。
最後に、注射関連死亡率はユーザー体験によって大きく異なります。熟練ユーザーは通常5%近くの死亡率を達成しますが、経験の浅いユーザーは50%に達することもあります。ほとんどの損失は、取り付け時の機械的損傷、針の誤った位置、または卵黄嚢や周囲組織の誤った刺し傷に起因します。実験注射を始める前に野生型幼虫でこの手順を練習することで、一貫性が大幅に向上し、死亡率を減少させます。幼虫の適切な位置を合わせてキュヴィエの乳管を明確に確認し、乗馬や回収時の優しい取り扱いを組み合わせることで、手技上の被害をさらに最小限に抑えます。
開示事項
著者たちは何も明かすことはありません。
謝辞
tsc2vu242/+魚の提供をいただいたケビン・エス氏とリリアナ・ソルニカ-クレゼル氏(ヴァンダービルト大学)氏、そして成魚の支援をいただいたIIMCB ZCFに感謝します。この研究は、ポーランド国立科学センターからのJZへのSONATA BIS助成金番号2023/50/E/NZ3/00252によって支援されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ボロシリケートガラス毛細管（外径1.0mm/内径0.75mm） | Sutter Instrument | BF150-75-10 | |
| CaCl2 （塩化カルシウム） | Chempur | 118748703 | |
| キャリブレーションスライド（1/100mm） | Bresser | 5916710 | |
| 毛細管ホルダー（グリップヘッドセット4サイズ0） | Fertilart Sp. z o.o | 5196082001 | |
| フレイミング/ブラウンマイクロピペットプーラー | Sutter Instrument | P-1000 | |
| HCl | Chempur | 115752837 | |
| ヒトIL6 | Thermo Fischer Scientific | 200-06-20UG | ストック濃度：10 µg/mL、使用濃度：2 pg/nL（0.9％NaClで希釈） |
| インジェクターポンプFemtoJet 4i | Eppendorf | E5252000021 | |
| KCl（塩化カリウム） | Chempur | 117397402 | |
| MgCl2·6H2O（塩化マグネシウム六水和物） | Chempur | 116120500 | |
| Femtojetマイクロインジェクター用Femtotipsマイクロローダーチップ | Eppendorf | EPE 5242956003 | |
| マイクロスコープLeica M165 FC 1983倍率 | Leica Microsysytems | https://www.leica-microsystems.com/products/ light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/ | |
| ミネラルオイル | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| NaCl（塩化ナトリウム） | Chempur | 117941206 | |
| プロナーゼ | Sigma-Aldrich | P5147-1G | ストック濃度：20 mg/mL（超純水で調製）、使用濃度：0.5 mg/mL（E3で希釈） |
| トリカイン | Sigma-Aldrich/Merck | A-5040 | |
| トリスベース | Carl Roth | 4855.3 | |
| トリパンブルー | Thermo Fischer Scientific | 15250061 | |
| 超純低融点アガロース | Thermo Fischer Scientific | 16520050 | |
| ZebraBox拡張 - フォトモーター応答EZBPMR | Animalab | https://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system | |
| Zebrabox | ViewPoint | https://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebrabox | 自動分析チャンバー |
参考文献
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