スペクヌエジェニドは、Nrf2、A20/NF-κB、腸内細菌叢 の調節を通じて db/dbマウスの糖尿病性腎症を緩和します

サマリー

スペクヌエジェニドはdb/dbマウスの糖尿病性腎症を緩和し、腎機能の改善、腸の関門の健全性、炎症および酸化ストレスの軽減と関連しています。

要約

糖尿病性腎症(DN)の病因は多因子的であり、炎症、酸化ストレス、腸・腎軸を関与させます。スペクヌエジェナイドは リグストリ・ルチディ・フルクトゥスの 主要な有効成分であり、抗腫瘍性、抗酸化作用、抗炎症作用を示します。しかし、そのDNへの影響の分子メカニズムについてはさらなる研究が必要です。したがって、本研究はSpecnuezhenideのDNに対する分子メカニズムを調査することを目的としています。db/dbマウスを用いてDNマウスモデルを構築し、8週間にわたりスペクヌエジェナイドを投与しました。これらのマウスに対するスペクヌエゼナイドの効果は血清グルコースおよび腎機能評価によって評価されました。組織病理学的変異はヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて評価されました。酵素結合免疫吸着アッセイを用いて炎症性サイトカインレベルを定量化しました。Nrf2経路およびA20/NF-κB経路はウェスタンブロッティング(WB) で 解析され、腸内タイトジャンクションタンパク質の発現はWBおよび免疫蛍光法で評価されました。腸内細菌叢の変化は、ハイスループット16S rRNAシーケンスによって調査されました。モデル対照群と比較して、スペクヌエジェナイドはdb/dbマウスの腎機能を改善し、高用量群では血糖値を37.13 mmol/Lから28.96 mmol/Lに、血中尿素窒素を18.27 mmol/Lから15.15 mmol/Lに、尿タンパク(28.5 mgから20.41 mg)を低下させました。一方、腸内細菌叢の解析では、スペクノエジェニド投与後に微生物の個体量が増加し、リポ多糖レベルの低下が認められました。一方、スペクヌエジェニドは腸のタイトジャンクションタンパク質の発現をアップレギュレートし、腸のバリアの完全性を高めることができます。スペキュヌエジェニドはNrf2およびA20の発現をアップレギュレーションし、NF-κBの発現をダウンレギュレーションすることができます。さらに、スペクヌエジェニドはNrf2およびA20/NF-κB経路を調節しながら腎機能障害を改善できます。

概要

糖尿病は腎臓病の主な原因であり、糖尿病患者数の増加に伴い有病^率も上昇しています。糖尿病性腎症(DN)の従来の治療法は、慢性腎疾患の進行を遅らせることが示されています^。しかし、DNの予防と治療により効果的な薬剤の特定は依然として必要です。DNの病因は多面的で、炎症、酸化ストレス、腸・腎軸¹を関与します。多標的アプローチにより、伝統中国医学(TCM)は慢性代謝疾患の治療において顕著な効果を示しています。さらに、DNの予防と治療におけるTCMの研究が進んでいることで有望な成果が示されています。³.

糖尿病は複雑な代謝障害であり、腸が代謝器官との相互作用を通じてその病態生理に中心的な役割を果たし^ます。宿主と腸内細菌叢の相互作用は宿主の恒常性維持に不可欠です。健康な微生物叢の構造が乱されると腎臓を損傷する毒素が生じる^{可能性があり、腎}クリアランスの障害は微生物の代謝や組成を変化させる可能性があります^5,6。腸の障壁は化学的および物理的な防御として機能し、上皮のタイトジャンクションとムシン⁵からなる粘液層によって維持されています。証拠は、DNと腸関^{門機能障害}7との相関関係を示唆しており、これは毒素やリポ多糖(LPS)などの細菌副産物の^血流への転座を可能にするものです^8,9。LPSが損傷した障壁を越えて移動すると、適応免疫および自然免疫応答の調節障害を引き起こし、炎症促進サイトカイン^7,10の産生を刺激し、最終的にはDN11,12に特徴的な慢性炎症状態を引き起こします。

リグストリ・ルチディ・フルクトゥスは糖尿病性腎症(DN)¹³の治療に臨床的に用いられており、スペクヌエゼニドは主要な有効成分¹⁴として特定されています。スペクヌエジェニドは独特のセコイリドイド糖体¹⁵であり、抗炎症、抗酸化、免疫調節特性を示します(16,17,18,19)。db/dbマウスは、持続性高血糖、アルブミン尿、メサンギウムマトリックス拡張など、主要な人間のDN特徴を再現する確立された自発的タイプ2 DNモデル^です。以前の研究では、スペクヌエジェナイドがDNラットに腎保護効果を発揮したと報告されています²¹;しかし、分子メカニズムは依然としてほとんど解明されていません。特に、スペクヌエジェニドは経口バイオアバリアビリティが約1.93^%と低いため、直接吸収だけで薬理学的効果を説明するのは困難です。新たな証拠は、スペクエジェニドが腸内細菌叢によって急速に代謝され、その薬理学的活性が腸内細菌叢依存性経路を介して媒介される可能性を示唆しています¹⁹。これらの考察に基づき、スペクヌエゼニドは腸内細菌叢および下流の炎症・酸化ストレス経路を調節することでDNを緩和すると仮説が立てられました。この仮説を検証するために、Specnuezhenideの用量依存的な効果をdb/dbマウスで評価し、予備実験と過去の薬理学的研究に基づいて用量を選定しました。

したがって、本研究はDNの文脈におけるスペクヌエジェニドの潜在的な影響とメカニズムを評価することを目的とし、特に腸・腎軸 を通じた 腎炎症および酸化ストレスの緩和能力に焦点を当てました。本研究は、スペクヌエジェナイドがDNの予防および治療にどのように寄与するかのメカニズムを明らかにすることに貢献します。

プロトコル

山西中医大学倫理委員会はこの研究を承認しました(2022DW167)。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

動物実験

生後8〜9週のオスのdb/dbマウスは市販の入手先から採取されました。マウスは山西中国医薬大学実験管理センターのSPFレベル動物室に収容され、湿度は55%±5%、快適な環境は25°C±1°C、12/12時間の明暗 サイクルと自由 な食事・水の利用で管理されました。実験前は、すべてのマウスが7日間慣れていました。人道的エンドポイント:体重>20%減少、死亡状態、または食物や水に到達できないマウスは、予定されたエンドポイント前に人道的に安楽死処分されました。安楽死:すべてのマウスは、機関で承認されたプロトコルに従い、ペントバルビタールナトリウム腹腔内注射と子宮頸部脱臼で安楽死させられました。

db/dbマウスは遺伝的に自然発生型糖尿病モデル(誘導モデルではありません)。モデルの成功は生後9週で空腹時血糖値(≥16 mmol/L)と尿マイクロアルブミン(陽性)を測定することで確認されました。すべてのdb/dbマウスは基準を満たし、除外された動物はなかった。DNモデルがdb/dbマウスで確立されると、マウスはコンピューター生成のランダムシーケンスを用いてランダムにグループに割り当てられました。実験を行った研究者はグループ割り当てを盲検していました。各ケージは交差汚染を避けるため、1つの処理グループのみを収容していました。マウスは無作為に4つのグループに分けられました(各グループあたりn=10匹)、モデル対照群(MC)、イルベサルタン群(Irb)、低用量スペクヌエゼニド群(Spe-L)、高用量スペクヌエゼニド群(Spe-H)で、正常対照群はdb/mマウス(n=10)が使用されました。NCグループとMCグループには蒸留水が投与されました。対照的に、Irb、Spe-L、Spe-H群は、それぞれ43.75 mg/kgのイルベサルタン、57 mg/kgのスペクヌエゼナイド、114 mg/kgの経口ガバジを8週間にわたり受けました。ガベージ用量は体重増加に比例して増加させました。投与8週間後、すべてのマウスは安楽死前に一晩(12時間)断食され、水は自由に利用され、血清(15分~1500 x g で遠心分離し、上清液を採取)、尿(代謝ケージで24時間の尿を採取)、便、腸および腎組織を安楽死直後に液体窒素で速凍しました。 分析まで-80°Cで保存されます。データ収集後、盲検を解除して統計解析を行いました。

血液および尿の指標

LPS、SCr、BUNの血清レベルは製造元の指示に従って測定されました。24時間の尿アルブミン濃度はキットの指示に従って検出されました。血清グルコースレベルは自動生化学分析装置を用いて測定されました。

ELISA検出

マウス血清中のTNF-α、IL-6、IL-1βの濃度は、製造元の指示に従い352モデルのマイクロプレートリーダーを用いて測定されました。

マウス腎臓組織の病理的観察

腸と腎臓組織は4%パラホルマルデヒド溶液に48時間固定され、その後洗浄、脱水、パラフィン埋め込みが行われました。4μm厚さの切片はパラフィンミクロトームを用いて取得されました。脱硫黄抽出後、切片はヘマトキシリンおよびエオシン(HE)で染色され、デジタル病理スライドスキャナーでスキャンされました。

16S rRNAシーケンス

細菌ゲノムDNAは、製造元のプロトコルに従い磁気ビーズベースの土壌DNA抽出キットを用いて盲腸中身から抽出されました。DNA濃度はフルオロメーターで測定されました。

16S rRNA遺伝子のV3–V4超可変領域は、プライマー338F(5′-CCTACGGNGGCWGCAG-3′)および806R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)を用いて増幅されました。増幅は以下のサイクル条件下でPCRマスターミックスで実施されました:95°Cで3分間の初期変性;95°Cで30秒、45°Cで30秒、72°Cで30秒の5サイクル。続いて95°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで30秒の20サイクルが続きます。そして最終延長は72°Cで5分間行われます。その後、PCR増幅コンは磁気ビーズベースのDNA精製およびサイズ選択ビーズを用いて精製されました。

ライブラリはIlluminaのアダプターとインデックスを用いて構築され、シーケンスはベンチトップ次世代シーケンス(NGS)プラットフォーム(2×250 bpペアエンド)で行われました。生リードはペアエンドシーケンシングリードマージングソフトウェアを用いて組み立てられ、品質フィルタリングされ、アンプリコン配列解析ソフトウェアを用いて97%の類似度で運用分類単位(OTU)にクラスタリングされました。キメラ配列と単一OTUは除去されました。分類はBLASTによってRDPデータベース(細菌用)とUNITE(菌類用)に対して割り当てられました。

アルファ多様性はMothur v3.8.31を用いて計算されました。ベータ多様性は、Rビーガンパッケージを用いたBray-Curtis距離に基づく主座標解析(PCoA)で評価されました。STAMP v2.1.3およびLEfSe v1.1.0で差別存在可能分析が行われました。機能予測はPICRUSt v1.1.4を用いて実施されました。

免疫蛍光染色

脱ワックス後、サンプルは高温で15分間クエン酸ナトリウムを用いた抗原回収を受け、その後60分間5%BSAを使ったブロックが行われました。その後、閉路組織およびクラウディン1に対する一次抗体(1:500)を回腸組織および大腸組織に適用し、一晩培養した。その後、60分間の二次抗体染色が行われました。10分間のDAPI染色後、サンプルは蛍光消光試薬で保存され、自動蛍光イメージングシステムで免疫蛍光画像を取得しました。

ウェスタンブロッティング

RIPAバッファーを用いて総タンパク質を抽出し、BCAタンパク質アッセイキットで定量しました。サンプル(15 μL/ウェル)は8%–12%分離ゲルに約2時間の電気泳動で投入されました。タンパク質はその後、100Vの冷却条件下で2時間の湿式トランスファーシステムを用いてPVDF膜に移されました。5%脱脂乳でブロッキングした後、膜は一次抗体とともに4°Cで一晩培養されました。 洗浄後、適切な二次抗体を適用し、膜を室温で1時間培養しました。最後に、ECL化学発光を用いて暗室で膜を開発し、ImageJソフトウェアで解析しました。正規化では、NC群の平均値を基準として設定しました。すべての実験群の各サンプルの生データをこの平均値で割り、NCグループの平均は1となり、その他の値はNCに対するフォールド変化として表されました。

統計解析

統計解析はSPSS 26.0ソフトウェアを使用して行われ、実験データは標準差±平均として示されています。生物学的複製(n)はグループごとのマウスを表します(生理的パラメータはn=10、ウェスタンブロットはn=3、16Sシーケンスはn=6)。分析から動物やサンプルは除外されませんでした。サンプルが正規分布と分散の均質性の仮定を満たした場合、分散の一方向解析を用いて複数のグループを比較しました。分散の均質性が確認された際、ペアワイズ比較には最低有意差(LSD)検定が適用されました。それ以外の場合は、ダネットのT3検定が用いられました。研究が探索的性質を持つため、異なるエンドポイント間の複数比較に対して追加の補正は適用されませんでした。Pが0.05 < 時に統計的に有意な差が示されました。

結果

スペキュエジェニド投与はDNマウスの血糖値を下げ、腎機能を改善し、腎損傷を緩和しました

DNモデルマウスは、成功したモデル化後8週間スペクヌエゼナイドで処理されました。MC群のマウスは血清血糖値が著しく上昇したのに対し、スペクヌエジェニド群のマウスは有意に低下しました(図1B)。MC群はNC群と比較して尿アルブミン、SCr、BUNのレベルが有意に高いことが示されました。スペクエジェニド群およびイルベサルタン群は、治療後に尿中アルブミン、SCr、BUNレベルの著しい低下を示しました(図1C–E)。

HE染色された腎組織切片の組織学的検査では、モデル群でNC群と比較して炎症性細胞浸潤が認められました。スペクヌエジェニド投与後、DNマウスにおいて特に炎症性細胞浸潤において糸球体損傷...

ディスカッション

糖尿病の持続的な微小血管合併症であるDNは、尿中アルブミン排出の増加と腎機能障害を特徴とします²⁴。アルブミン尿はDN進行の初期臨床指標としてよく用い^{られます。}DN患者はSCrおよびBUNレベルが有意に増加していることから、腎機能に異常を示す可能性があります²⁶。本研究では、スペクエジェニド群が尿中のアルブミンが著しく減少し、血清SCrおよびBUNレベルが有意に低下しました。病理学的検査により、スペクヌエジェニドはdb/dbマウスの腎損傷を炎症浸潤を減少させることで減少することが明らかになりました。したがって、スペクヌエジェニドはDN治療に有益である可能性があります。

多くの研究で、腸内細菌叢の発生と腸軸の密接な関係が示されており、腸内細菌叢の不全は糖尿病の進行と相関しています²⁷。腸内微生物とその代謝物はDNの病因に重要な役...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルブスティックス	広州華都高爾博生物技術有限公司	20211203
分析バランス	北京薩特利爾斯器材有限公司	CPA
抗体 A20	Cell Signalling Technology	5630s	(1:1000)
抗体 Bax	Cell Signalling Technology	2772s	(1:1000)
抗体 Bcl-2	Cell Signalling Technology	3498s	(1:1000)
抗体 claudin 1	Abcam	EPR25359-48	(1:1000)
抗体 COX2	Proteintech Group	12375-1-AP	(1:2000)
抗体 GAPDH	Abcam	EPR16891	(1:10000)
抗体 GCLC	Proteintech Group	12601-1-AP	(1:10000)
抗体 HO-1	Proteintech Group	10701-1-AP	(1:10000)
抗体 IκBα	Cell Signalling Technology	4812s	(1:1000)
抗体 Myd88	Abcam	EPR21824	(1:1000)
抗体 NF-κB p65	Cell Signalling Technology	8242s	(1:1000)
抗体 NLRP3	Proteintech Group	68102-1-Ig	(1:5000)
抗体 NQO1	Proteintech Group	11451-1-AP	(1:5000)
抗体 Nrf2	Proteintech Group	16396-1-AP	(1:5000)
抗体 occludin	Cell Signalling Technology	91131S	(1:1000)
抗体 p-IκBα	Cell Signalling Technology	2859s	(1:1000)
抗体 p-NF-κB p65	Cell Signalling Technology	3033s	(1:1000)
抗体 TAX1BP1	Proteintech Group	14424-1-AP	(1:2000)
抗体 TLR4	GeneTex	GTX75742	(1:1000)
抗体 TRAF6	Santa Cruz Biotechnology	sc-8409	(1:1000)
抗体 ZO-1	Proteintech Group	21773-1-AP	(1:10000)
自動血糖測定用生化分析装置	バイオベースバイオダストリー（山東）有限公司	BK-280
血中尿素窒素	南京健誠生物工程研究所	C03-2-1
遠心機	湖南湘儀実験機器開発有限公司	HI650
db/db マウス（8〜9週齢のオス）	常州カベンス動物実験有限公司	SCXK（蘇）2021-0013
IL-1β ELISAキット	武漢ファインバイオテク株式会社	EM0109
IL-6 ELISAキット	武漢ファインバイオテク株式会社	EM1158
イルベサルタン	浙江華海製薬有限公司	0000019353
LPS	江蘇美棉工業有限公司	MM-0634M1
顕微鏡	オリンパス株式会社	BX53
マイクロトーム	ライカバイオシステムズナスロックGmbH	RM 2016
整理されたピザ切り機	武漢駿捷電子有限公司	JK-6
パラフィン切断機	RWD生命科学有限公司	S710
病理スライドスキャナー	寧波康風生物信息科技有限公司	KFBIO PRO-005
血清クレアチニン	南京健誠生物工程研究所	C011-2-1
スペクヌエゼニド	国家食品薬品監督管理総局	39011-92-2	純度 >98%
SPSS統計 26.0
組織埋め込みセンター	武漢駿捷電子有限公司	JB-P5
組織処理装置	武漢駿捷電子有限公司	JT-12J
TNF-α ELISAキット	武漢ファインバイオテク株式会社	ER1393
尿タンパク	武漢ファインバイオテク株式会社	EM0632