本プロトコルでは、ICU患者における下気道感染症の原因となる15種類の病原体を1時間以内にPOC（ポイントオブケア）検出することを可能にする、完全に統合されたマイクロ流体チップベースのLAMP法について解説します。
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方法論記事
ICU患者における下気道感染症病原体の迅速ポイントオブケア検出
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
下気道感染症（LRTI）は、重症患者における臨床状態の悪化および死亡の主要な原因の一つです。集中治療室（ICU）において、原因病原体を適時に特定することは適切な抗菌薬治療に不可欠ですが、従来の培養法は3〜5日を要し、特に真菌において陽性率が不十分であるという課題があります。PCRなどの分子生物学的アプローチはターンアラウンドタイムを短縮しますが、依然として手動の核酸抽出とサーマルサイクリングに依存しているため、ベッドサイドでの使用には適していません。本プロトコルでは、磁気ビーズによる核酸精製とループ介在等温増幅法（LAMP）を組み合わせた、完全に統合されたディスク型マイクロ流体チップ（CDチップ）を中心とするポイントオブケア・ワークフローについて解説します。簡便な手動の液状化および溶解ステップの後、処理済みの検体を2つのパッケージ済み試薬バイアルと共にチップにロードします。その後、装置が自動的に抽出、65 °Cでの増幅、およびリアルタイム蛍光読み取りを行い、11種の細菌、3種の真菌、1種の非定型病原体の計15ターゲットの定性結果を、装置動作時間45分以内（手動の前処理ステップを含むサンプルから結果までの全ワークフローで約1時間）で返します。ここでは、喀痰、気管吸引液、および気管支肺胞洗浄液を含む10例のICU検体からの検出データを提示し、単一病原体および1枚のチップ上で最大7種類の菌が関与する多菌性共感染の両方を含めて検証します。密閉型カートリッジ設計によりエアロゾル汚染のリスクが最小限に抑えられ、ロード工程が一度のみであるため専門的なトレーニングを必要とせず、本システムはICUチームにとって実用的なベッドサイド診断ツールとなります。
概要
ICUの重症患者において、人工呼吸器関連肺炎（VAP）を筆頭とする下気道感染症は、罹患率の向上、機械的換気期間の延長、および過剰死亡の持続的な要因となっている1,2。ICUで発生した下気道感染症（LRTI）の微生物学的状況は、市中感染症とは著しく異なる。多剤耐性グラム陰性菌（Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter baumannii）が主流であり、多くの場合、経験的治療を困難にする混合感染の形態をとる3,4。日和見真菌は、さらに複雑さを増大させる。かつては高度な免疫不全の指標と考えられていた侵襲性肺アスペルギルス症が、現在では、特に重症インフルエンザやCOVID-19後の非好中球減少性ICU患者において、より高い頻度で認められるようになっている5。アスペルギルス症の既存の診断アルゴリズムは、感度の低い培養法とガラクトマンナン（GM）抗原検査を組み合わせて行われるが、GMアッセイは、十分に立証されている診断上のタイムウィンドウや、非好中球減少性宿主における感度の変動という制約がある6。敗血症に対する適切な抗菌治療の開始が1時間遅れるごとに、死亡率は有意に上昇する7。以上のことから、ICU感染症の迅速性と複雑さには、臨床的な緊急性に見合った診断ツールが必要とされている。
標準的な微生物培養は、薬剤感受性試験には不可欠であるものの、根本的に速度制限がある。具体的には、結果判明までに3〜5日を要し、要求性の高い微生物は見逃されやすく、真菌培養の陽性率も低いままである8。メタゲノム次世代シーケンシング（mNGS）は、バイアスのない代替手段となるが、コスト、24〜48時間の処理時間、バイオインフォマティクスパイプラインへの依存、およびポイントオブケアでの実現可能性が限られているため、臨床への導入が妨げられている9。PCRベースのパネルは、時間的なギャップを縮小させたが、依然として多段階の核酸抽出、サーマルサイクラー、そして従来形式では増幅後の電気泳動が必要である10。これらのプラットフォームのいずれも、1時間未満という速度、最小限の手作業時間、真菌を含むマルチプレックスな病原体カバー範囲、および非検査担当者でも運用可能な簡便性という、ICUにおける複合的な要求を完全に満たすものではない。
ループ介在等温増幅法（LAMP法）は、これらの制約のいくつかを解消します。Notomiらによって初めて報告されたこの手法は、ストランド置換活性を持つポリメラーゼを用い、6つの異なる領域を認識する4〜6本のプライマーセットを使用して、65 °Cの一定温度で標的DNAを増幅します11。この反応により、リアルタイム蛍光で検出可能な特徴的なステムループおよびカリフラワー状の増幅産物構造が生成され、閾値到達から数分以内にS字状の曲線が得られます。低テンプレート濃度における感度が高く、またマルチプライマー設計により、偽陽性を抑制する選択性が付与されています12,13。マイクロ流体チッププラットフォームと組み合わせることで、LAMP法は単一の検体ロードから複数の標的に対して並列的に処理することが可能です14。先行研究では、LAMPチップシステムにより、3時間以内という極めて短いターンアラウンドタイムで呼吸器病原体が検出できることが示されています15。しかし、これらのシステムの主な制限は、個別の手動によるDNA抽出に依存している点であり、これが時間、操作の複雑さ、およびコンタミネーションのリスクを増大させています。
ここで述べるシステムは、そのボトルネックを解消します。使い捨てのディスク型マイクロ流体チップ（直径86 mm）を中心に構築されており、検体のロード、磁気ビーズを用いた核酸精製、および16プレックスのLAMP増幅を単一の密閉カートリッジ内に統合しています（図1）。操作者は、専用の処理チューブを用いて簡便な手動の液化・溶解ステップを行うだけで、その後、溶解液と2本の試薬バイアルをチップにロードします（図2）。それ以降は、装置が抽出、65 °Cでの等温増幅、および蛍光検出を自律的に行い、11種の細菌、3種の真菌（Aspergillus spp.、Candida albicans、Pneumocystis jirovecii）、および1種の非定型病原体（Mycoplasma pneumoniae）という、臨床的に重要な15のターゲットについて、45分以内に定性的な判定結果を出力します。内部コントロールとして使用される神経芽腫ブレイクポイントファミリー（NBPF）遺伝子が、各アッセイにおける検体の適切性と反応の完全性を検証します。本プロトコルでは、ICUでの検体採取から前処理、チップへのロード、自動検出、および結果の解釈に至るまで、完全なワークフローの手順を詳しく説明しており、臨床検査技師とICUベッドサイドチームの両方を対象としています。
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プロトコル
すべてのサンプルは、中国医学科学院北京協和医院の倫理審査委員会の承認を得たプロトコル（承認番号：I-24PJ1778）の下で収集されました。検体収集前に、各参加者またはその法的代理人から書面によるインフォームドコンセントを得ました。標的病原体パネルおよび反応ウェルの割り当てを表1に、サンプルの前処理に使用した消耗品を表2に示します。
1. ICUにおける下気道からの臨床検体の採取
- 喀痰の採取
- 食物残渣や口腔内常在菌を除去するため、清潔な水または滅菌生理食塩水で口腔内を3回すすぐ。
- 患者に2〜3回深呼吸をさせた後、強く咳をしてもらい、下気道からの喀痰を滅菌採取カップに直接排出させる。
注： 適切な検体は、気管下からの粘性のある物質、膿性物質、または血染みの混じった物質である。透明な唾液や後鼻腔滴下物は不適切であり、その後の検出能を低下させる可能性がある。
- 気管支吸引液（BAS）の採取
- 非挿管患者の場合、滅菌吸引カテーテル（10–12 Frカテーテルを使用し、吸引源の圧力を−0.0267 MPa［−200 mmHg相当］に設定）を、鼻腔または口腔経路から約30 cmの深さまで挿入する。
- カテーテルを回転させながら吸引を行い、ゆっくりとカテーテルを抜去する。吸引した分泌物を滅菌検体トラップに回収する。
注： 分泌物が少ない場合は、吸引前にカテーテルから約5 mLの滅菌生理食塩水を注入する。 - 機械換気中の患者の場合、気管内チューブのサイズに応じて吸引カテーテルを選択する。7.0–7.5 mmのチューブには10 Frカテーテルを、8.0 mmのチューブには12 Frカテーテルを使用する。
- 吸引前に、100%酸素で30–60 sの間、患者にプレオキシゲネーションを行う。人工呼吸器回路を切り離し、選択したカテーテルを抵抗が感じられるまで人工気道に挿入する。
- −0.0267 MPa（−200 mmHg相当）の陰圧をかけ、肺虚脱と低酸素血症を最小限にするため、1回あたりの吸引時間（および呼吸器切り離し時間）を15 s以内に制限する。吸引後、100%酸素で30–60 sの間、再度患者に酸素投与を行う。
- カテーテルから1–2 mLの滅菌生理食塩水を注入し、3 s待機する。
- 吸引を行い、カテーテルを抜去する。吸引した分泌物を滅菌検体トラップに回収する。検体採取後、直ちに人工呼吸器回路を再接続する。
注： 検体の院内感染による汚染を防ぐため、全工程において厳格な無菌操作が不可欠である。
- 気管支肺胞洗浄液（BALF）の採取
- 胸部画像診断で標的セグメントを確認する。気管支鏡を進め、適切な区域支気管または亜区域支気管に固定する。
- 20–50 mLずつの滅菌生理食塩水を急速に注入し、これを3〜5回繰り返す（合計60–120 mL）。各注入後、穏やかに吸引を行い、回収した液体を滅菌密閉容器に回収する。
注意： ICU患者にBALを行う際は、血行動態および換気状態の継続的なモニタリングが必須である。機械換気中の被験者については、必要に応じて人工呼吸器の設定を調整する。
注： 標準的な回収率は注入量の40–60%である。回収量が少ない場合は、気管支鏡先端の再配置が必要となる場合がある。
2. 液状化および病原体の溶菌
- #2使い捨てピペットを使用して、検体を標線（約1 mL）まで吸引し、液状化チューブに分注します。ピペットのバルブを繰り返し押して、粘性物質をすべて転送し、チューブにキャップをします。
注： BALF（気管支肺胞洗浄液）または水様の痰の場合、十分な病原体量を確保するために、ピペット2回分を採取してください。 - 液状化チューブを手で1分間激しく振ります。検体を視覚的に確認し、目に見える粘液の塊がなくなり、#1使い捨てピペットで抵抗なく検体が流れる（均一で水のような整合性になる）まで振盪を続けます。少なくとも1分間振り、高粘度の検体については、これらの基準を満たすまで時間を延長してください。
- 溶解チューブの密封キャップを開けます。
- #1使い捨てピペットを使用して、均質化されたサンプルを約0.5 mL吸引し、溶解チューブに分注します。
- 密封キャップを閉じ、チップキャップがしっかりと締まっていることを確認します。
- 溶解チューブをサンプル前処理装置（SPデバイス）にセットし、固定されるまで押し込みます。Startボタンを押します。
- SPデバイスによる自動液状化・溶解サイクル（パラメータは表3に記載）が完了するまで待ちます。所要時間は約15分です。
注： 処理中にチューブを開けたり、取り出したりしないでください。
3. チップのロードと自動検出
- 試薬およびサンプルのロード
- CDチップを〜から取り出す 4 °C 保存し、室温（約 25 °C）で10分間。
注：試薬バイアルOおよびB、ならびに前処理済みライセートは室温で使用します。チップ上のLAMP増幅は、以下の温度で実施します。 65 °C （ステップ 3.2.3 を参照し、 表3). - アルミパウチを開け、チップを平らな面に置いてください。
- キャップを反時計回りに回して、チップを開きます。
- バイアルOを軽く叩き、液体をバイアルの底に集めます。
- バイアルOのキャップを取り外し、ノズルをOポートに挿入し、全量をポート内に注入します。
- バイアルOを廃棄します。バイアルBとBポートを用いて、この手順を繰り返します。
- 処理済みのライシスチューブをSPデバイスから取り出し、チップキャップを取り除きます。
- チューブのチップをSポートに合わせて、ライセートの全量をチップ内に分注します。
- 使用済みの溶解チューブを廃棄してください。
- チップキャップを時計回りに回し、「カチッ」という音が2回聞こえて完全に密封されたことが確認できるまで締め付けます。
注：ポートへの充填が不十分な場合、個別のチャンネルで不具合が生じる可能性があります。封印前に、完全に分注されていることを確認してください。不完全な封印および汚染のリスクを避けるため、キャップを封印する際はポリエチレン（PE）手袋を着用せず、代わりにラテックスまたはニトリル手袋の使用を推奨します。
- CDチップを〜から取り出す 4 °C 保存し、室温（約 25 °C）で10分間。
- 装置の操作
- 自動核酸分析装置の電源を入れます。タップして 検出チップのフォイルポーチにあるバーコードをスキャンし、患者の属性情報およびサンプルIDを入力します。
- チップを回転スピンドルに取り付け、カチッという音がして固定されるまで押し下げます。
- タップ ここから開始してください。本装置は、遠心による試薬分注、磁性ビーズによる抽出、およびLAMP増幅を自律的に行います。 65 °C、および蛍光イメージング。ランタイムは約45分です（試薬・サンプルのロードおよび装置のワークフローは、〜にまとめられています）。 図3).
注： 運転中は蓋を開けないでください。
- 結果の解釈
- 本ソフトウェアは、2次微分最大値解析により各S字状増幅曲線の変曲点を特定し、対応するTP値（陽性確認時間）を算出します。
- 各TP値を、〜に記載されている対応するしきい値と比較してください。 表4TP値が閾値以下のチャネルを陽性、閾値を超えるTP値のチャネルを陰性と分類する。
- 内部コントロールチャネル（ウェル16）が、TP値12分未満のS字状増幅曲線を示すことを確認してください。
- 内部コントロールが不合格となった場合は、そのランを却下してください。新しいチップを使用して再試験を行うか、検体を再採取してください。
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結果
有効なランが完了すると、装置は全16チャンネルのリアルタイム蛍光トレースを表示します。陽性チャンネルでは、自動的に注釈付けされたTP値とともに、期待されるS字型の増幅キネティクスが示されました。一方、陰性チャンネルはベースラインに留まりました。ICチャンネル（ウェル16）では、すべての有効なランにおいてTP < 12 minのS字型曲線が得られました。
本プロトコルのパイロット版としての概念実証（proof-of-concept）として、ICUの実務で遭遇するさまざまな臨床シナリオを例示するため、代表的な検体10件（気管吸引液（BAS）6件、肺胞洗浄液（BALF）2件、深部喀痰（Spt）2件）を選定した。これらの検体は、病原体の有病率を推定するためではなく、単一微生物感染および複雑な多剤耐性・多種混合感染の症例を網羅するように意図的に選択した。10件のうち8件が多種混合感染（それぞれ2〜7種類の標的）であり、2件が単一微生物感染であった。完全なTPデータは表5に提示し、代表的な増幅曲線を図4
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ディスカッション
ICUにおける感染症管理において、病原体の迅速な同定は極めて重要です。本稿で述べるシステムは、通常の培養に要する3〜5日間から、病原体同定に要する時間を1時間未満に短縮します。この時間枠は、第一選択の抗菌薬に関する決定が頻繁に行われるタイミングと一致します7。核酸抽出、精製、および16種類のLAMP増幅を単一の密封チップ内に統合することで、このワークフローは手動のDNA抽出工程を排除しており、これは従来のLAMPチッププラットフォームにおける主要な運用的ボトルネックとなっていました15。その結果、専門的な分子生物学のトレーニングを受けていない担当者でも実行可能な、単一のロード操作のみで完結する手順が実現しました。
いくつかの手順上の注意点について解説します。まず、検体の品質が不可欠です。人工呼吸器を使用している患者では、口腔咽頭からの汚染によって真の病原体シグナルが不明瞭になる可能性があるため、喀出痰よりも気管支吸引液や気管支肺胞洗浄液などの深部呼吸器検体が好ましいとされます。不完全な液...
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開示事項
著者らは競合する利益がないことを宣言します。
謝辞
非感染性慢性疾患-国家科学技術重大专项 (No. 2023ZD0516500)、国家高水準病院臨床研究資金 (2026-PUMCH-A-103)、CMBオープンコンペティションプログラム (24-561)、および北京協和医院人材育成プログラム (No.UGG11571)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 全自動核酸分析装置 | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; 遠心試薬分配、磁気ビーズ抽出、65 °CでのLAMP法、およびリアルタイム蛍光検出を実行（ランタイム約45分） |
| #1 使い捨てパストゥールピペット | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | 使い捨て消耗品; 0.5 mL; 均質化された検体を溶解チューブに転送 |
| #2 使い捨てパストゥールピペット | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | 使い捨て消耗品; 2 mL; 液状化チューブの標線まで検体を吸引 |
| CDチップ | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | 使い捨て消耗品; 直径86 mmのディスクで、中央にロードゾーン（ポートO、B、S）、磁気ビーズ精製ゾーン、および外周に16個の反応ウェル（15の病原体ターゲット + NBPF内部コントロール）を備える |
| LAMP反応試薬 | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | CDチップ内に凍結乾燥ビーズとしてあらかじめ保存されたLAMP反応試薬 |
| 液状化チューブ | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | 使い捨て消耗品; 2 mL/本; 手動均質化用の検体を回収 |
| 溶解チューブ | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | 使い捨て消耗品; 0.5 mL/本; 200 µmフィルター膜を備えた圧縮可能なシリコンボディ; 溶解試薬を充填済み |
| プライマー | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | CDチップの反応チャンバーに組み込まれたプライマー混合物 |
| 試料前処理装置 | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; 自動液状化–溶解サイクル（約15分） |
| 単回投与用バイアル “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | 使い捨て消耗品; パッケージ済みのオンチップ試薬; 1テストにつき1本; 4 °Cで保存し、ロード前に室温（約25 °C）に平衡化させる |
| 単回投与用バイアル “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | 使い捨て消耗品; パッケージ済みのオンチップ試薬; 1テストにつき1本; 4 °Cで保存し、ロード前に室温（約25 °C）に平衡化させる |
参考文献
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