このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

初期老化ヒト線維芽細胞へのテロメラーゼmRNA導入のための最適化されたリバース・トランスフェクション・プロトコル

126 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/71538

⸱

2026年8月18日

 , 
1Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本論文では、老化ヒト線維芽細胞へヌクレオシド修飾ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）mRNA（hTERT mRNA）を効率的に導入するための最適化されたリバース・トランスフェクションプロトコルを提示します。培養表面にhTERT mRNA-脂質複合体をあらかじめコーティングすることで取り込みが促進され、テロメラーゼの活性化、テロメアの伸長、および部分的な若返りが可能になります。培養細胞は、最終的には不死化することなく、再び老化またはクライシスに陥ります。

要約

細胞老化は、膜流動性の低下、エンドソーム輸送の障害、エンドサイトーシス能の減弱、そして細胞外RNase活性の上昇など、細胞生理に深刻な変化をもたらし、これらすべてが効率的なmRNA送達を妨げます。これらの障壁により、老化細胞におけるRNAベースの手法の適用、特に大きな治療用転写物の導入が制限されてきました。本プロトコルでは、老化ヒト線維芽細胞に修飾メッセンジャーRNA（mRNA）を効率的に導入するための、最適化されたリバース・トランスフェクション法について解説します。モデル転写物としてヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）mRNAを使用していますが、このワークフローは他のmRNAにも幅広く適用可能です。RNA-脂質複合体を細胞接着後に培地へ添加する従来のトランスフェクション法とは異なり、リバース・トランスフェクションでは細胞播種前に複合体を培養表面に配置するため、接着する細胞とトランスフェクション複合体が直接相互作用することが可能になります。トランスフェクション効率を最大化するために、本プロトコルでは、シュードウリジンおよび5-メチルシチジンを含むヌクレオシド修飾mRNA、伸長させたpoly(A)テール、最適化した複合体形成タイミング、RNase抑制、クロロキンによるエンドソームpHの一時的な上昇、細胞播種密度の向上、およびインキュベーション期間の延長を取り入れています。この手法を用いて、5 kbのhTERT mRNA転写物を導入したところ、老化線維芽細胞において約50%–80%のトランスフェクション効率を達成しました。テロメラーゼ活性のピークはトランスフェクション後24–48 hに検出されました。1回のトランスフェクションサイクルで測定可能なテロメア伸長が認められ、3回連続のトランスフェクションでは、大幅ながらも限定的なテロメア伸長がもたらされました。老化関連β-ガラクトシダーゼ活性の低下、p16およびp21発現の減少、細胞形態の回復、および複製寿命の延長を含む、老化関連表現型の部分的な回復が72–96 h以内に検出されました。導入されたhTERT mRNAは72–96 h以内に分解され、不死化は観察されませんでした。本プロトコルは、老化細胞への一過的なmRNA導入のための実用的なアプローチを提供し、幅広い細胞型や種に適応可能です。

概要

リバーストランスフェクション法は、老化細胞が標準的なトランスフェクション法において示す根本的な障壁を克服するための、重要な手法上の適応である。細胞をあらかじめ播種して接着させた後にトランスフェクション複合体を添加するフォワードトランスフェクションとは異なり、リバーストランスフェクションでは、あらかじめ形成したhTERT mRNA-脂質複合体の上に、懸濁状態の細胞を直接添加する。この手法は、膜のリモデリングが最も活発に行われる重要な接着相において、トランスフェクション複合体への曝露を最大化させることで、老化細胞におけるトランスフェクション効率を劇的に向上させる。

本プロトコルの核心となる概念的な転換は、老化細胞を単に形質導入しにくい若年細胞としてではなく、明確に異なるデリバリー上の課題として扱うことです。老化においては、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロールを含む膜脂質組成の全体的な変化が、膜の流動性、曲率、およびタンパク質-脂質相互作用を変化させると同時に、老化関連分泌表現型（SASP）に寄与します1,2,3。また、老化細胞では、amphiphysin-1のダウンレギュレーションやcaveolin発現の代償的な変化が部分的に原因となり、クラスリンおよびカベオラ介在性の受容体エンドサイトーシスが減少し、エンドサイトーシスの経路が変化します。これにより、受容体介在性の取り込みとシグナル伝達が抑制されます4,5,6。並行して、Rab7によって制御される後期エンドソーム-リソソーム軸およびより広範なエンドソーム-オートファジー-リソソーム（EAL）ネットワークが機能不全に陥ります。Rab7はエンドリソソームの成熟とオートファゴソーム-リソソーム融合のマスターコントローラーとして機能していますが、これらは加齢や神経変性において摂動を受けます7。

老化細胞は一般的に、TFEB/TFE3駆動型のリソソームバイオジェネシスやシャペロン介在性オートファジーを含む、リソソーム処理・適応システム（LYPAS）の複数の構成要素をアップレギュレートし、それによってリソソーム量を増加させます。しかし、個々のリソソームでは、しばしば内腔pHの上昇、膜損傷、およびタンパク質分解能の変化が見られ、リソソーム量が増加しているにもかかわらず、リソソーム機能不全に寄与しています8,9,10,11。総じて、これらの変化により、取り込まれた物質が分解性のエンドリソソームコンパートメントにより効率的に送られるようになり、輸送されたRNAやタンパク質が生産的な細胞質への放出前に分解される可能性が高まります9,10,11。リバース・トランスフェクションは、接着中の膜のリモデリングが行われる極めて早い段階を直接標的とすることで、細胞とmRNA-脂質複合体との間の持続的で高親和性の接触を強制し、完全に接着した老化細胞における定常状態のエンドサイトーシスの不全を少なくとも部分的に回避します4,5,6,12。

RNA設計の面では、老化という文脈において、単純なキャップ＋テールという基準だけでは不十分であると本プロトコルでは想定しています。翻訳をエンドソームのToll様受容体による感知およびI型インターフェロンの誘導から切り離すために、完全なヌクレオシド修飾（例えば、シュードウリジンまたはN1‑メチルシュードウリジンに5‑メチルシチジンを加えたもの）が不可欠な条件として扱われます。基礎的な研究により、修飾ヌクレオシドをRNAに組み込むことでTLR3、TLR7、およびTLR8の活性化が抑制され、樹状細胞のサイトカイン産生が著しく減少することが示されており、これが現在のヌクレオシド修飾mRNAプラットフォームにおける先天性免疫原性の低減というメカニズムの根拠となっています13。mRNA–LNPワクチンおよびmRNA医薬品に関するより最近のレビューでは、先天性免疫の活性化を最小限に抑えつつ、in vivoでの安定性と翻訳を向上させるため、5′キャップ、UTR、コーディング配列、およびポリ(A)テールの協調的なエンジニアリングが強調されています14。特に、ポリ(A)テールの長さと構造は、in vitro転写されたmRNAの安定性と翻訳出力の重要な決定要因であることが明らかになっており、治療用mRNAにおける延長またはエンジニアリングされたポリ(A)設計を促進する要因となっています15。

これに加え、本プロトコルでは、複合体形成および取り込み時における細胞外およびエンドソーム内RNaseからの保護を明示的に組み込んでおり、さらにクロロキン16,17のような一過性のリソゾーム親和性薬剤を用いて、定義されたエンドソーム脱出ウィンドウを設けています。クロロキンは、エンドソームバリアの機能的プローブとして長年使用されており、エンドソーム膜の破壊と核酸カーゴの細胞質への脱出を促進することで、siRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドによる標的結合能およびサイレンシング効率を著しく向上させることができます18。同時に、LNPで送達したmRNAのライブセルイメージングおよび超解像イメージングにより、有効な送達は初期/リサイクルエンドソームからの稀な脱出イベントで厳しく制限されており、初期の取り込み自体よりもそこがボトルネックとなっていることが示されており、mRNA治療薬において意図的にエンドソーム脱出ステップを設計することの重要性が強調されています19。

総括すると、膜ダイナミクス、エンドサイトーシス輸送、リソソーム処理、および自然免疫活性化におけるこれらの細胞老化に伴う変化は、効率的なmRNA導入に対する大きな障壁となります。本稿で述べるリバース・トランスフェクション戦略は、最適化されたmRNAエンジニアリング、RNase保護、エンドソーム脱出の強化、および接着細胞をあらかじめ形成したmRNA-脂質複合体に直接曝露させる手法を組み合わせることで、これらの制限を解消するために開発されました。モデル貨物としてhTERT mRNAを使用していますが、このワークフローは、老化細胞や導入困難な細胞集団への他の大きな治療用mRNA転写物の導入に幅広く適用可能です20,21,22。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. hTERT mRNAのin vitro転写

  1. in vitro ARCAおよびΨUTPを用いた転写（in vitro 転写）
    1. 指示に従って、20 µLのIVT反応液を調製する。 表1より多くの収量が必要な場合は、反応を線形にスケールアップしてください。
    2. T7 RNAポリメラーゼを除くすべての反応成分を、RNaseフリーチューブに混合します。最後にT7 RNAポリメラーゼを加え、静かに混ぜた後、チューブを短時間遠心分離します。
    3. 反応液を37 °Cで0.5～4時間インキュベートする。
      注：テンプレートの長さに応じてインキュベーション時間を調整してください。短めのテンプレート（約500 bp）を含む反応は、約30分間インキュベートし、長めのテンプレート（約4 kb）を含む反応は、3～4時間インキュベートしてください。
  2. DNase処理
    1. RNaseフリーのDNase Iを1 µL、IVT反応液に直接添加する。
    2. 37 °Cで15分間、反応をインキュベートする。
      注意：DNase処理は、合成したmRNAを事前に精製することなく、IVT反応液に直接加えて行う必要があります。
  3. mRNA精製
    1. 反応混合物を希釈するため、ヌクレアーゼフリー水（nuclease-free H₂O）を115 µL加える。
    2. 製造元の指示に従い、RNAクリーンアップキットを用いてmRNAを精製する。
    3. 精製したmRNAを20～30 µLのヌクレアーゼフリー水で溶出する。
    4. 分光光度法によりmRNAの純度を測定し、1.0～1.5%の変性アガロースゲルまたは低濃度ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によりRNAの完全性を確認する。
  4. ポリ(A)テール付加
    1. 以下に従って、50 µLのpoly(A)テール付加反応液を調製する。 表2反応成分を静かに混ぜ合わせ、37 °Cで30～60分間インキュベートする。
      注：投入するRNA量に応じて、インキュベーション時間を調整してください。
    2. 0.5 M EDTA (pH 8.0)を2 µL添加して、反応を停止させる。
  5. 最終精製および品質管理
    1. メーカーの指示に従い、RNAクリーンアップキットを用いてpoly(A)テイル付きmRNAを精製する。
    2. 精製したmRNAを20～30 µLのヌクレアーゼフリー水で溶出させる。
    3. トランスフェクションに進む前に、mRNAの品質を評価する
      1. 260 nmでmRNA濃度を測定し、A260/A280およびA260/A230の比率を用いて純度を決定する。A260/A280値が約2.0で、A260/A230値が2.0より大きいmRNA調製物を使用すること。
      2. メーカーの指示に従い、ゲル電気泳動またはRNA分析システムを用いてmRNAの完全性を評価します。
      3. RT-PCRまたはBioanalyzer解析により、ポリ(A)テールの長さを確認する。ポリ(A)テールの長さが120から200ヌクレオチドの間であることを検証すること。
      4. 精製したmRNAを分注し、凍結融解サイクルを最小限に抑えるため、分注したサンプルを−80 °Cで保存する。

2. リバース・トランスフェクション

  1. Day −1: トランスフェクション前準備
    1. 老化表現型の検証
      1. 代表的な細胞サンプルを用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）染色を行う。70%以上の細胞が陽性であることを確認する。
      2. qRT-PCRまたは免疫蛍光染色により、老化マーカー（p16およびp21）の発現を確認する。
      3. 細胞生存率を測定し、生存率が90%を超えていることを確認する。
    2. 試薬の準備
      1. 完全培地を37 °Cに予温する。
      2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を37 °Cに予温する。
      3. 新鮮なOpti-MEM I培地を準備する。
        注意：使用前にOpti-MEM IにRNase阻害剤を加えないこと。
  2. Day 0: トランスフェクション当日
    注意：試薬の準備からトランスフェクトした細胞のインキュベーションまで、約3時間で完了させること。
    1. hTERT mRNAの準備
      1. hTERT mRNAを氷上で解凍する。mRNA濃度を測定し、0.5～1.0 µg/µLの濃度の調製物を使用する。
      2. 使用する培養形式（表3）に従い、必要な量のhTERT mRNAをOpti-MEM Iで希釈する。最終濃度が0.5–1.0 U/µLとなるようにRNase阻害剤を添加し、穏やかに混ぜる。
      3. 複合体形成まで、希釈したmRNAを氷上で保持する。
        注意：RNase阻害剤は使用直前に添加すること。冷凍後に活性が低下するため、RNase阻害剤を加えた状態でmRNAを保存しないこと。
    2. トランスフェクション試薬の準備
      1. 滅菌済みのRNaseフリーチューブに、トランスフェクション試薬 6.0 µLとOpti-MEM I 100 µLを合わせる。ピペッティングにより穏やかに混ぜる。
      2. 混合液を室温で5分間インキュベートする。
        注意：大きなhTERT mRNAコンストラクト（~5 kb）の場合、試薬とmRNAの比率をmRNA 100 ngあたり0.4～0.6 µLの試薬となるよう最適化する。
    3. mRNA-脂質複合体の形成
      1. 希釈したトランスフェクション試薬溶液（106 µL）に、希釈したhTERT mRNA溶液（100 µL）を加える。5～6回ピペッティングして穏やかに混ぜる。
      2. 混合液を室温で15～20分間インキュベートする。
      3. 複合体形成時間は30分を超えないようにする。
      4. 溶液がわずかに白濁したことを確認し、複合体が正常に形成されたことを検証する。
        注意：複合体形成の待ち時間中に細胞の準備を行う。
    4. リバーストランスフェクションのための細胞準備
      1. 老化細胞の培養液を吸引して除去する。
      2. 予温したPBS（6ウェルプレートの1ウェルあたり2 mL）で細胞を1回洗浄する。
      3. 1ウェルあたり0.05% trypsin-EDTAを500 µL加える。
      4. 細胞を37 °Cで3～5分間インキュベートする。
      5. 血清を含む完全培地 3 mLを加え、トリプシンを中和する。
      6. 細胞を穏やかにピペッティングし、単一細胞懸濁液を得る。
      7. 血球計数器または自動細胞計数機を用いて細胞数を決定する。
      8. 完全培地中で1ウェルあたり2.0–2.5 × 105個の細胞を含む懸濁液を準備する。
        注意：老化細胞は機械的ストレスに非常に弱いため、長時間のトリプシン処理は避けること。細胞は懸濁状態で保持し、リバーストランスフェクション前に播種しないこと。
    5. リバーストランスフェクション
      1. 培養プレートの準備
        1. 6ウェルプレートの各ウェルに0.01% poly-L-lysine 500 µLを加え、室温で30分間インキュベートする。
        2. 使用直前にコーティング溶液を吸引して除去する。
        3. 各ウェルの中央にhTERT mRNA-脂質複合体を200 µL加える。
        4. プレートを37 °C、5% CO₂条件下で30分間インキュベートする。
          注意：プレートのコーティングは、複合体形成および細胞準備と並行して行う。
      2. 細胞懸濁液の準備
        1. 2.0–2.5 × 105個の細胞を、抗生物質を含まない完全培地 1800 µLに懸濁させる。
        2. 細胞を穏やかに再懸濁し、均一な単一細胞懸濁液を得る。
          注意：トランスフェクション中は抗生物質を含まない培地を使用すること。
      3. 複合体への細胞播種
        1. あらかじめ形成したhTERT mRNA-脂質複合体の上に、細胞懸濁液 1800 µLを直接加える。
        2. プレートを各方向に2～3回穏やかに傾け、細胞を均一に分散させる。
          注意：細胞添加後に懸濁液をピペッティングしないこと。mRNA-脂質複合体が破壊される可能性がある。
      4. 細胞のインキュベーション
        1. 5% CO₂を含む加湿インキュベーター内、37 °Cで細胞を6～8時間インキュベートする。
        2. トランスフェクションの2～3時間後に、光学顕微鏡で細胞の接着状態を観察する。
        3. 細胞が均一に分布し、培養表面に接着し始めていることを確認する。
          注意：浮遊細胞や細胞破片が過剰に存在する場合は、トランスフェクションに伴う細胞毒性の可能性がある。

3. 細胞毒性の軽減

  1. 細胞の脱落が20%を超える場合は、トランスフェクションの曝露期間を48 hに短縮してください。
  2. 細胞生存率を向上させるため、トランスフェクション期間中に10 µMのROCK阻害剤Y-27632を培地に追加してください。
  3. トランスフェクションから6–8 h後、部分的に接着している細胞への影響を最小限に抑えながら、トランスフェクション培地を慎重に吸引します。各ウェルに約100 µLの残液を残してください。
  4. 15% FBSを添加した、あらかじめ加温した新鮮な完全増殖培地を各ウェルに1 mLずつ加えます。
  5. 培地交換直後に、クロロキンを最終濃度10–20 µMになるように添加します。
  6. 5% CO₂を含む加湿インキュベーター内で、37 °Cでさらに2 hインキュベートします。
  7. クロロキン含有培地を、新鮮な完全増殖培地と交換します。
  8. 培養細胞をインキュベーターに戻し、増殖を継続させます。
    注：回復期間中、細胞の形態と生存率をモニタリングしてください。過度な細胞の脱落やデブリの発生は、トランスフェクションに伴う細胞毒性を示している可能性があります。

4. トランスフェクション後の解析

  1. トランスフェクションの24～48時間後にTERTタンパク質の発現を評価します。
  2. 標準的なラボプロトコルに従い、ウェスタンブロッティングまたは免疫蛍光染色によりTERTタンパク質レベルを測定します。
  3. 適切なテロメラーゼ活性測定法を用い、同時間内においてテロメラーゼ活性を測定します。
    注：一過性に導入されたhTERT mRNAは分解されるため、テロメラーゼ活性は通常48時間後に低下します。
  4. トランスフェクションの48～72時間後に、モノクローム・マルチプレックス定量的PCR（MMqPCR）または同等のテロメア長解析法を用いてテロメア長を評価します。
    注：hTERT mRNAの導入に成功すると、検出可能なテロメアの伸長が観察されることがあります。
  5. トランスフェクションの7日後に、細胞老化および若返りに関連する表現型を評価します。
    1. 老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）活性を測定します。
    2. p16およびp21の発現レベルを測定します。
    3. Ki67の発現を評価します。
    4. 光学顕微鏡により細胞形態を観察します。
      注：処理した培養細胞を、未処理または模擬トランスフェクションを行った老化コントロールと比較し、老化関連表現型および増殖特性の変化を評価します。

5. 反復投与プロトコール（任意）

  1. セクション2–4に記載されている方法で、初回の手法でトランスフェクションを行う。
  2. 以下のスケジュールに従ってトランスフェクションを繰り返す：0日目：1回目、5日目：2回目、10–12日目：3回目のトランスフェクション。
  3. 細胞は接着培養状態で維持し、次回のトランスフェクション前にトリプシン処理を行わない。
  4. セクション2.2.1–2.2.3に記載されている方法で、新鮮なhTERT mRNA–リピッド複合体を調製する。
  5. 各ウェルから培地を吸引して除去する。
  6. hTERT mRNA–リピッド複合体 200 µLを各ウェルに直接添加する。
  7. 複合体の添加直後に、新鮮な完全F-10培地 800 µLを添加する。
  8. 5% CO₂を含む加湿インキュベーター内、37 °Cで4–6 h間、細胞をインキュベートする。
  9. トランスフェクション培地を新鮮な完全培地と交換する。
    注：累積的なトランスフェクションに伴う細胞毒性を最小限に抑えるため、処理は最大3サイクルまでに制限すること。

6. フォワードトランスフェクションプロトコル（2 µg/mL、6ウェルフォーマット）

  1. -1日目：細胞播種
    1. 0.05%トリプシン-EDTAを用いて、老化または老化初期の線維芽細胞を剥離させる。
    2. 完全培地を用いてトリプシンを中和します。
    3. 細胞数および生存率を決定する。
    4. 細胞を6ウェルプレートに2.0～2.5 × 10^5 cells/wellの密度で播種する。5 ウェルあたりの細胞数。
    5. 細胞を、5% CO₂を含む加湿インキュベーター内にて37 °Cで一晩、コンフルエンスが約60～80%に達するまでインキュベートする。
  2. 0日目：hTERT mRNA–試薬複合体の調製
    1. 氷上でヌクレオシド修飾hTERT mRNAのアリコートを融解する。
    2. 滅菌済みのRNaseフリーチューブ（チューブA）内で、hTERT mRNAをOpti-MEMで希釈し、最終濃度を2 µg/mLにする。
    3. チューブAにRNaseインヒビターを最終濃度0.5–1.0 U/µLとなるように加え、緩やかに混ぜ合わせる。
    4. 2本目のRNaseフリーチューブ（チューブB）内で、mRNA 100 ngあたり0.4〜0.6 µLの割合でトランスフェクション試薬をOpti-MEMに希釈します。
    5. 緩やかに混ぜながら、チューブBの内容物をチューブAに滴下して加えてください。
    6. 混合物を室温で15～20分間インキュベートする。
  3. 0日目：前方へのトランスフェクション
    1. 細胞のコンフルエンシーが60～80%であり、形態が健全であることを確認する。
    2. 培地を吸引除去する。
    3. あらかじめ加温したPBS 1～2 mLで、細胞を1回洗浄します。
    4. 各ウェルに、あらかじめ温めておいた完全培地または血清低減培地を0.5 mLずつ加えます。
    5. 必要に応じて、クロロキンを最終濃度10–20 µMになるように添加する。
    6. ステップ6.2.6で調製したhTERT mRNA-試薬複合体を、各ウェルに0.5 mLずつ加える。
    7. プレートを緩やかに揺すぶり、複合体を均一に分散させる。
    8. 5% CO₂を含む加湿インキュベーター内で、37 °Cで4〜6時間細胞をインキュベートする。
      ​注：必要に応じて、老化細胞のインキュベーション時間を6〜8時間に延長してください。
    9. トランスフェクション培地を吸引して除去する。
    10. 各ウェルに、新鮮な完全培地を2.0 mLずつ加えます。
    11. セクション4に記載されている通り、トランスフェクション後の解析を行う。
      注：順方向および逆方向のトランスフェクション条件を比較する場合は、同一バッチのhTERT mRNA、トランスフェクション試薬、および名目投与量を使用してください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

d2EGFP-T2A-hTERT modRNAは、不安定化させたEGFP（d2EGFP）レポーターを自己切断性T2Aペプチドを介してヒトTERTに連結させたハイブリッドオープンリーディングフレームとして設計されました。すべてのコンストラクトの完全なヌクレオチドおよびタンパク質配列は、Supplementary File 1に記載されています。翻訳効率とmRNAの安定性を高めるため、コーディング配列の両端には合成5′非翻訳領域（UTR）およびヒトβ-globinの3′ UTRを配置しました（Figure 1A）。また、この発現カセットには、T7ポリメラーゼのプロセッシビティを向上させ、早期転写終結を抑制するために設計された合成酵素安定化配列（Es）および合成転写エンハンサー配列（TEs）が含まれています。T7プロモーターの下流にクローニングした後、アンチリバースキャップアナログ（ARCA）および修飾ヌクレオチド（m5CTPおよびΨUTP）を用いてin vitro転写を行い、続いて酵素的なポリ(A)テイル付加（約120–200 n...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究では、細胞老化を増殖生理学の軽微な変異ではなく、明確に異なるデリバリーの問題として再定義し、老化状態の生物物理学的および免疫学的制約に合わせたテロメラーゼmRNAトランスフェクション戦略を開発しました。老化細胞は、剛直化しコレステロールが蓄積した細胞膜とエンドサイトーシス活性の低下を示し、これが核酸の効率的なデリバリーに対する大きな障壁となっています。本プロトコルでは、リバーストランスフェクション法を採用することで、老化細胞が膜のリモデリングを起こし膜の可塑性が高まる一時的な接着期間を利用し、細胞と複合体の接触を吸収能力が高まる時期に同期させます3,4。代表的な結果は、この戦略が従来のフォワードトランスフェクションと比較してhTERT modRNAのデリバリーと発現を向上させ、より大きなテロメア伸長と、より顕著な若返り関連表現型をもたらすことを示しています。

この手法の核心的な特徴は、老化細胞における3つの主要な障壁、すなわち自然免疫シグナルの亢進、RNA分解...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

J.M.S.はTransposon Therapeuticsの共同創設者およびSAB委員長です。

謝辞

本研究は、米国国立衛生研究所（NIH）の助成金 P01 AG051449、R01 AG016694、および R01 AG078925（JSへの配分）による支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Ham's F-10 Nutrient MixThermo Fisher11550043細胞培養培地。
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNAキャップ構造アナログNew England BiolabS1411L多くのRNAにおいて、キャップ構造は安定性を向上させ、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を低下させ、mRNA開始複合体の形成を促進する。
5-メチルシチジン-5´-三リン酸 (5-Methyl-CTP)New England BiolabN0432S修飾NTPは、一般的にインビトロ転写RNAの免疫原性を低減するために使用される。
6ウェルプレートCorning351146独立した実験条件下で、中量から大量の接着細胞または浮遊細胞を培養および処理するため。
Anti-Ki67抗体 (SP6)abcamab16667Ki67は主に増殖細胞で発現する。
細胞老化アッセイキット (SA-beta-gal染色) cellbiolabsCBA-230 SA-β-gal染色アッセイによる老化細胞の同定
DNA LoBind 0.5mlチューブEppendorf 022431005DNAやRNAを損失なく効率的に回収するため
DNA LoBind 1.5mlチューブEppendorf22431021DNAやRNAを損失なく効率的に回収するため
DNase I, RNaseフリー (1 U/μL)Thermo FisherEN0521RNaseフリーのDNase Iは、一本鎖および二本鎖DNAを消化するエンドヌクレアーゼである。 
E. coli Poly(A) ポリメラーゼNew England BiolabM0276SEscherichia coliにおいて、Poly(A) ポリメラーゼ I (PAP I) は主に、RNA分子の3'末端へのアデノシン一リン酸 (AMP) 残基の鋳型非依存的な付加を触媒する機能を持つ。
胎牛血清Thermo FisherA5256701細胞培養用血清サプリメント 
HiScribe T7 ARCA mRNAキットNew England BiolabE2065SHiScribe T7 ARCA mRNAキット (テーリング付き) は、ARCAキャップおよびpoly(A)テールを持つmRNAをインビトロで迅速に製造するために設計されている。キャップ付きmRNAは、T7 RNAポリメラーゼを用いてアンチリバースキャップアナログ (ARCA) を共転写的に組み込むことで合成される。
HiScribe T7 mRNAキット (CleanCap Reagent AG含有)New England BiolabE2080SCleanCap Reagent AG含有HiScribe T7 mRNAキットにより、1つまたは複数の転写物を迅速かつ合理的に製造でき、典型的な収量は1反応あたり ≥90 μgとなる。
LongAmp Hot Start Taq DNAポリメラーゼNew England BiolabM0534SLongAmp Hot Start Taq DNAポリメラーゼは、長いアンプリコンにおいて優れた性能を発揮する。
M-MuLV 逆転写酵素New England BiolabM0253LM-MuLV 逆転写酵素は、RNA (cDNA合成) または一本鎖DNAを鋳型として、プライマーから開始して相補的なDNA鎖を合成する。
Monarch Spin RNAクリーンアップキット (50 μg)New England BiolabT2040LMonarch® Spin RNAクリーンアップキット (50 μg) の主な機能は、酵素反応や抽出混合物から最大50 μgの高純度RNAを精製および濃縮することである。
NEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックスNew England BiolabE2621LNEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックスにより、断片の長さや末端の適合性に関わらず、複数のDNA断片をシームレスにアセンブリできる。その使いやすさ、柔軟性、およびシンプルなマスターミックス形式により、合成生物学分野だけでなく、複数断片のワンステップクローニングにも利用される。 
Opti-MEM 低血清培地Thermo Fisher31985070脂質ペイロード複合体形成時の細胞トランスフェクション効率を最大化するため。標準的な血清補充の必要性を減らしつつ、哺乳類細胞の高い生存性を維持する、最適化され化学的に定義された環境として機能する。
PBS, pH 7.4Thermo Fisher10010023pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の主な機能的用途は、哺乳類細胞および生物学的分子に対して安定したpHと浸透圧バランスを維持することである。
PCRストリップチューブThermo FisherAB0776PCRストリップチューブ (通常8連または12連形式) の主な機能的用途は、ハイスループットのサーマルサイクリング中に小容量の液体反応を保持することである。
ポリL-リジン臭化水素酸塩Millipore SigmaP4707-50ML細胞接着のためのポリL-リジン (PLL) 臭化水素酸塩の主な機能的用途は、ガラスやプラスチックなどの負に帯電した固体表面をコーティングし、高接着性の正に帯電した基板を作成することである。
シュードウリジン-5´-三リン酸 (Pseudo-UTP- ΨUTP)New England BiolabN0433Sシュードウリジン-5´-三リン酸 (Pseudo-UTP) は、一般的にインビトロ転写RNAの免疫原性を低減するために使用される。
リボヌクレオチド溶液セットNew England BiolabN0450LATP, GTP, CTPおよびUTPの4つの独立した溶液
ROCK阻害剤 Y-27632 (二塩酸塩)Stem cell technologies72302Y-27632は、細胞透過性があり、Rho関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) に対して極めて強力かつ選択的な阻害剤である。Y-27632は、触媒部位への結合においてATPと競合することで、ROCK1 (Ki = 220 nM) と ROCK2 (Ki = 300 nM) の両方を阻害する 
RT-PCRグレード水Thermo FisherAM9935RT-PCRグレード水 (多くの場合、ヌクレアーゼフリーウォーターと表記される) の主な機能的用途は、わずかな汚染でもサンプルを分解させたり増幅を阻害したりするような、感度の高い酵素アッセイ用の超純溶媒として機能することである。
SUPERase·In RNase阻害剤 Thermo FisherAM2694SUPERase In RNase阻害剤は、非ヒト由来のタンパク質ベースの阻害剤であり、RNase A, B, C, 1, および T1を含む、最も一般的で厄介なRNaseに非共有的に結合し、それらを阻害する。
SYBR Green I 核酸ゲル染色剤Thermo FisherS7563SYBR™ Green I 核酸ゲル染色剤の主な機能的用途は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル中の二本鎖DNA (dsDNA) を可視化および定量することである。
TransIT-mRNAトランスフェクションキットMirusbio/ Millipore SigmaMIR 2250大きなRNAのための高効率かつ低毒性のトランスフェクション試薬
TRAPeze テロメラーゼ検出キットMillipore Sigma S7700 TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) アッセイは、哺乳類細胞および組織サンプル中のテロメラーゼ活性を検出および測定するために広く使用されている高感度なPCRベースの手法である。これには、テロメラーゼによるテロメア反復配列の伸長、PCRを用いたこれらの産物の増幅、およびその後の検出という3つの主要なステップが含まれる。
Trypsin-EDTA (0.05%), フェノールレッドThermo Fisher25300054定期的な細胞継代 (サブカルチャー) および回収時に、接着性哺乳類細胞を培養容器から剥離させるため。

参考文献

  1. Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
  2. Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
  3. Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
  4. Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
  5. Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
  6. Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
  7. Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
  8. Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
  9. Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
  10. Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
  11. Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
  12. Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
  13. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  14. Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
  15. Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
  16. Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
  17. Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
  18. Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
  19. Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
  20. Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
  21. Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
  22. Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
  23. Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
  24. Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
  25. Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
  26. Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
  27. Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
  28. Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
  29. Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
  30. Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

老化線維芽細胞hTERT mRNAヌクレオシド修飾mRNARNase阻害エンドソームpH調節テロメア伸長複製寿命
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。