初期老化ヒト線維芽細胞へのテロメラーゼmRNA導入のための最適化されたリバース・トランスフェクション・プロトコル

サマリー

本論文では、老化ヒト線維芽細胞へヌクレオシド修飾ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）mRNA（hTERT mRNA）を効率的に導入するための最適化されたリバース・トランスフェクションプロトコルを提示します。培養表面にhTERT mRNA-脂質複合体をあらかじめコーティングすることで取り込みが促進され、テロメラーゼの活性化、テロメアの伸長、および部分的な若返りが可能になります。培養細胞は、最終的には不死化することなく、再び老化またはクライシスに陥ります。

要約

細胞老化は、膜流動性の低下、エンドソーム輸送の障害、エンドサイトーシス能の減弱、そして細胞外RNase活性の上昇など、細胞生理に深刻な変化をもたらし、これらすべてが効率的なmRNA送達を妨げます。これらの障壁により、老化細胞におけるRNAベースの手法の適用、特に大きな治療用転写物の導入が制限されてきました。本プロトコルでは、老化ヒト線維芽細胞に修飾メッセンジャーRNA（mRNA）を効率的に導入するための、最適化されたリバース・トランスフェクション法について解説します。モデル転写物としてヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）mRNAを使用していますが、このワークフローは他のmRNAにも幅広く適用可能です。RNA-脂質複合体を細胞接着後に培地へ添加する従来のトランスフェクション法とは異なり、リバース・トランスフェクションでは細胞播種前に複合体を培養表面に配置するため、接着する細胞とトランスフェクション複合体が直接相互作用することが可能になります。トランスフェクション効率を最大化するために、本プロトコルでは、シュードウリジンおよび5-メチルシチジンを含むヌクレオシド修飾mRNA、伸長させたpoly(A)テール、最適化した複合体形成タイミング、RNase抑制、クロロキンによるエンドソームpHの一時的な上昇、細胞播種密度の向上、およびインキュベーション期間の延長を取り入れています。この手法を用いて、5 kbのhTERT mRNA転写物を導入したところ、老化線維芽細胞において約50%–80%のトランスフェクション効率を達成しました。テロメラーゼ活性のピークはトランスフェクション後24–48 hに検出されました。1回のトランスフェクションサイクルで測定可能なテロメア伸長が認められ、3回連続のトランスフェクションでは、大幅ながらも限定的なテロメア伸長がもたらされました。老化関連β-ガラクトシダーゼ活性の低下、p16およびp21発現の減少、細胞形態の回復、および複製寿命の延長を含む、老化関連表現型の部分的な回復が72–96 h以内に検出されました。導入されたhTERT mRNAは72–96 h以内に分解され、不死化は観察されませんでした。本プロトコルは、老化細胞への一過的なmRNA導入のための実用的なアプローチを提供し、幅広い細胞型や種に適応可能です。

概要

リバーストランスフェクション法は、老化細胞が標準的なトランスフェクション法において示す根本的な障壁を克服するための、重要な手法上の適応である。細胞をあらかじめ播種して接着させた後にトランスフェクション複合体を添加するフォワードトランスフェクションとは異なり、リバーストランスフェクションでは、あらかじめ形成したhTERT mRNA-脂質複合体の上に、懸濁状態の細胞を直接添加する。この手法は、膜のリモデリングが最も活発に行われる重要な接着相において、トランスフェクション複合体への曝露を最大化させることで、老化細胞におけるトランスフェクション効率を劇的に向上させる。

本プロトコルの核心となる概念的な転換は、老化細胞を単に形質導入しにくい若年細胞としてではなく、明確に異なるデリバリー上の課題として扱うことです。老化においては、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロールを含む膜脂質組成の全体的な変化が、膜の流動性、曲率、およびタンパク質-脂質相互作用を変化させると同時に、老化関連分泌表現型（SASP）に寄与します^1,2,3。また、老化細胞では、amphiphysin-1のダウンレギュレーションやcaveolin発現の代償的な変化が部分的に原因となり、クラスリンおよびカベオラ介在性の受容体エンドサイトーシスが減少し、エンドサイトーシスの経路が変化します。これにより、受容体介在性の取り込みとシグナル伝達が抑制されます^4,5,6。並行して、Rab7によって制御される後期エンドソーム-リソソーム軸およびより広範なエンドソーム-オートファジー-リソソーム（EAL）ネットワークが機能不全に陥ります。Rab7はエンドリソソームの成熟とオートファゴソーム-リソソーム融合のマスターコントローラーとして機能していますが、これらは加齢や神経変性において摂動を受けます⁷。

老化細胞は一般的に、TFEB/TFE3駆動型のリソソームバイオジェネシスやシャペロン介在性オートファジーを含む、リソソーム処理・適応システム（LYPAS）の複数の構成要素をアップレギュレートし、それによってリソソーム量を増加させます。しかし、個々のリソソームでは、しばしば内腔pHの上昇、膜損傷、およびタンパク質分解能の変化が見られ、リソソーム量が増加しているにもかかわらず、リソソーム機能不全に寄与しています^8,9,10,11。総じて、これらの変化により、取り込まれた物質が分解性のエンドリソソームコンパートメントにより効率的に送られるようになり、輸送されたRNAやタンパク質が生産的な細胞質への放出前に分解される可能性が高まります^9,10,11。リバース・トランスフェクションは、接着中の膜のリモデリングが行われる極めて早い段階を直接標的とすることで、細胞とmRNA-脂質複合体との間の持続的で高親和性の接触を強制し、完全に接着した老化細胞における定常状態のエンドサイトーシスの不全を少なくとも部分的に回避します^4,5,6,12。

RNA設計の面では、老化という文脈において、単純なキャップ＋テールという基準だけでは不十分であると本プロトコルでは想定しています。翻訳をエンドソームのToll様受容体による感知およびI型インターフェロンの誘導から切り離すために、完全なヌクレオシド修飾（例えば、シュードウリジンまたはN1‑メチルシュードウリジンに5‑メチルシチジンを加えたもの）が不可欠な条件として扱われます。基礎的な研究により、修飾ヌクレオシドをRNAに組み込むことでTLR3、TLR7、およびTLR8の活性化が抑制され、樹状細胞のサイトカイン産生が著しく減少することが示されており、これが現在のヌクレオシド修飾mRNAプラットフォームにおける先天性免疫原性の低減というメカニズムの根拠となっています¹³。mRNA–LNPワクチンおよびmRNA医薬品に関するより最近のレビューでは、先天性免疫の活性化を最小限に抑えつつ、in vivoでの安定性と翻訳を向上させるため、5′キャップ、UTR、コーディング配列、およびポリ(A)テールの協調的なエンジニアリングが強調されています¹⁴。特に、ポリ(A)テールの長さと構造は、in vitro転写されたmRNAの安定性と翻訳出力の重要な決定要因であることが明らかになっており、治療用mRNAにおける延長またはエンジニアリングされたポリ(A)設計を促進する要因となっています¹⁵。

これに加え、本プロトコルでは、複合体形成および取り込み時における細胞外およびエンドソーム内RNaseからの保護を明示的に組み込んでおり、さらにクロロキン^16,17のような一過性のリソゾーム親和性薬剤を用いて、定義されたエンドソーム脱出ウィンドウを設けています。クロロキンは、エンドソームバリアの機能的プローブとして長年使用されており、エンドソーム膜の破壊と核酸カーゴの細胞質への脱出を促進することで、siRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドによる標的結合能およびサイレンシング効率を著しく向上させることができます¹⁸。同時に、LNPで送達したmRNAのライブセルイメージングおよび超解像イメージングにより、有効な送達は初期/リサイクルエンドソームからの稀な脱出イベントで厳しく制限されており、初期の取り込み自体よりもそこがボトルネックとなっていることが示されており、mRNA治療薬において意図的にエンドソーム脱出ステップを設計することの重要性が強調されています¹⁹。

総括すると、膜ダイナミクス、エンドサイトーシス輸送、リソソーム処理、および自然免疫活性化におけるこれらの細胞老化に伴う変化は、効率的なmRNA導入に対する大きな障壁となります。本稿で述べるリバース・トランスフェクション戦略は、最適化されたmRNAエンジニアリング、RNase保護、エンドソーム脱出の強化、および接着細胞をあらかじめ形成したmRNA-脂質複合体に直接曝露させる手法を組み合わせることで、これらの制限を解消するために開発されました。モデル貨物としてhTERT mRNAを使用していますが、このワークフローは、老化細胞や導入困難な細胞集団への他の大きな治療用mRNA転写物の導入に幅広く適用可能です^20,21,22。

プロトコル

1. hTERT mRNAのin vitro転写

1. in vitro ARCAおよびΨUTPを用いた転写（in vitro 転写）
   1. 指示に従って、20 µLのIVT反応液を調製する。 表1より多くの収量が必要な場合は、反応を線形にスケールアップしてください。
   2. T7 RNAポリメラーゼを除くすべての反応成分を、RNaseフリーチューブに混合します。最後にT7 RNAポリメラーゼを加え、静かに混ぜた後、チューブを短時間遠心分離します。
   3. 反応液を37 °Cで0.5～4時間インキュベートする。
      注：テンプレートの長さに応じてインキュベーション時間を調整してください。短めのテンプレート（約500 bp）を含む反応は、約30分間インキュベートし、長めのテンプレート（約4 kb）を含む反応は、3～4時間インキュベートしてください。
2. DNase処理
   1. RNaseフリーのDNase Iを1 µL、IVT反応液に直接添加する。
   2. 37 °Cで15分間、反応をインキュベートする。
      注意：DNase処理は、合成したmRNAを事前に精製することなく、IVT反応液に直接加えて行う必要があります。
3. mRNA精製
   1. 反応混合物を希釈するため、ヌクレアーゼフリー水（nuclease-free H₂O）を115 µL加える。
   2. 製造元の指示に従い、RNAクリーンアップキットを用いてmRNAを精製する。
   3. 精製したmRNAを20～30 µLのヌクレアーゼフリー水で溶出する。
   4. 分光光度法によりmRNAの純度を測定し、1.0～1.5%の変性アガロースゲルまたは低濃度ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によりRNAの完全性を確認する。
4. ポリ(A)テール付加
   1. 以下に従って、50 µLのpoly(A)テール付加反応液を調製する。 表2反応成分を静かに混ぜ合わせ、37 °Cで30～60分間インキュベートする。
      注：投入するRNA量に応じて、インキュベーション時間を調整してください。
   2. 0.5 M EDTA (pH 8.0)を2 µL添加して、反応を停止させる。
5. 最終精製および品質管理
   1. メーカーの指示に従い、RNAクリーンアップキットを用いてpoly(A)テイル付きmRNAを精製する。
   2. 精製したmRNAを20～30 µLのヌクレアーゼフリー水で溶出させる。
   3. トランスフェクションに進む前に、mRNAの品質を評価する
      1. 260 nmでmRNA濃度を測定し、A260/A280およびA260/A230の比率を用いて純度を決定する。A260/A280値が約2.0で、A260/A230値が2.0より大きいmRNA調製物を使用すること。
      2. メーカーの指示に従い、ゲル電気泳動またはRNA分析システムを用いてmRNAの完全性を評価します。
      3. RT-PCRまたはBioanalyzer解析により、ポリ(A)テールの長さを確認する。ポリ(A)テールの長さが120から200ヌクレオチドの間であることを検証すること。
      4. 精製したmRNAを分注し、凍結融解サイクルを最小限に抑えるため、分注したサンプルを−80 °Cで保存する。

2. リバース・トランスフェクション

1. Day −1: トランスフェクション前準備
   1. 老化表現型の検証
      1. 代表的な細胞サンプルを用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）染色を行う。70%以上の細胞が陽性であることを確認する。
      2. qRT-PCRまたは免疫蛍光染色により、老化マーカー（p16およびp21）の発現を確認する。
      3. 細胞生存率を測定し、生存率が90%を超えていることを確認する。
   2. 試薬の準備
      1. 完全培地を37 °Cに予温する。
      2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を37 °Cに予温する。
      3. 新鮮なOpti-MEM I培地を準備する。
         注意：使用前にOpti-MEM IにRNase阻害剤を加えないこと。
2. Day 0: トランスフェクション当日
   注意：試薬の準備からトランスフェクトした細胞のインキュベーションまで、約3時間で完了させること。
   1. hTERT mRNAの準備
      1. hTERT mRNAを氷上で解凍する。mRNA濃度を測定し、0.5～1.0 µg/µLの濃度の調製物を使用する。
      2. 使用する培養形式（表3）に従い、必要な量のhTERT mRNAをOpti-MEM Iで希釈する。最終濃度が0.5–1.0 U/µLとなるようにRNase阻害剤を添加し、穏やかに混ぜる。
      3. 複合体形成まで、希釈したmRNAを氷上で保持する。
         注意：RNase阻害剤は使用直前に添加すること。冷凍後に活性が低下するため、RNase阻害剤を加えた状態でmRNAを保存しないこと。
   2. トランスフェクション試薬の準備
      1. 滅菌済みのRNaseフリーチューブに、トランスフェクション試薬 6.0 µLとOpti-MEM I 100 µLを合わせる。ピペッティングにより穏やかに混ぜる。
      2. 混合液を室温で5分間インキュベートする。
         注意：大きなhTERT mRNAコンストラクト（~5 kb）の場合、試薬とmRNAの比率をmRNA 100 ngあたり0.4～0.6 µLの試薬となるよう最適化する。
   3. mRNA-脂質複合体の形成
      1. 希釈したトランスフェクション試薬溶液（106 µL）に、希釈したhTERT mRNA溶液（100 µL）を加える。5～6回ピペッティングして穏やかに混ぜる。
      2. 混合液を室温で15～20分間インキュベートする。
      3. 複合体形成時間は30分を超えないようにする。
      4. 溶液がわずかに白濁したことを確認し、複合体が正常に形成されたことを検証する。
         注意：複合体形成の待ち時間中に細胞の準備を行う。
   4. リバーストランスフェクションのための細胞準備
      1. 老化細胞の培養液を吸引して除去する。
      2. 予温したPBS（6ウェルプレートの1ウェルあたり2 mL）で細胞を1回洗浄する。
      3. 1ウェルあたり0.05% trypsin-EDTAを500 µL加える。
      4. 細胞を37 °Cで3～5分間インキュベートする。
      5. 血清を含む完全培地 3 mLを加え、トリプシンを中和する。
      6. 細胞を穏やかにピペッティングし、単一細胞懸濁液を得る。
      7. 血球計数器または自動細胞計数機を用いて細胞数を決定する。
      8. 完全培地中で1ウェルあたり2.0–2.5 × 10⁵個の細胞を含む懸濁液を準備する。
         注意：老化細胞は機械的ストレスに非常に弱いため、長時間のトリプシン処理は避けること。細胞は懸濁状態で保持し、リバーストランスフェクション前に播種しないこと。
   5. リバーストランスフェクション
      1. 培養プレートの準備
         1. 6ウェルプレートの各ウェルに0.01% poly-L-lysine 500 µLを加え、室温で30分間インキュベートする。
         2. 使用直前にコーティング溶液を吸引して除去する。
         3. 各ウェルの中央にhTERT mRNA-脂質複合体を200 µL加える。
         4. プレートを37 °C、5% CO₂条件下で30分間インキュベートする。
            注意：プレートのコーティングは、複合体形成および細胞準備と並行して行う。
      2. 細胞懸濁液の準備
         1. 2.0–2.5 × 10⁵個の細胞を、抗生物質を含まない完全培地 1800 µLに懸濁させる。
         2. 細胞を穏やかに再懸濁し、均一な単一細胞懸濁液を得る。
            注意：トランスフェクション中は抗生物質を含まない培地を使用すること。
      3. 複合体への細胞播種
         1. あらかじめ形成したhTERT mRNA-脂質複合体の上に、細胞懸濁液 1800 µLを直接加える。
         2. プレートを各方向に2～3回穏やかに傾け、細胞を均一に分散させる。
            注意：細胞添加後に懸濁液をピペッティングしないこと。mRNA-脂質複合体が破壊される可能性がある。
      4. 細胞のインキュベーション
         1. 5% CO₂を含む加湿インキュベーター内、37 °Cで細胞を6～8時間インキュベートする。
         2. トランスフェクションの2～3時間後に、光学顕微鏡で細胞の接着状態を観察する。
         3. 細胞が均一に分布し、培養表面に接着し始めていることを確認する。
            注意：浮遊細胞や細胞破片が過剰に存在する場合は、トランスフェクションに伴う細胞毒性の可能性がある。

3. 細胞毒性の軽減

1. 細胞の脱落が20%を超える場合は、トランスフェクションの曝露期間を48 hに短縮してください。
2. 細胞生存率を向上させるため、トランスフェクション期間中に10 µMのROCK阻害剤Y-27632を培地に追加してください。
3. トランスフェクションから6–8 h後、部分的に接着している細胞への影響を最小限に抑えながら、トランスフェクション培地を慎重に吸引します。各ウェルに約100 µLの残液を残してください。
4. 15% FBSを添加した、あらかじめ加温した新鮮な完全増殖培地を各ウェルに1 mLずつ加えます。
5. 培地交換直後に、クロロキンを最終濃度10–20 µMになるように添加します。
6. 5% CO₂を含む加湿インキュベーター内で、37 °Cでさらに2 hインキュベートします。
7. クロロキン含有培地を、新鮮な完全増殖培地と交換します。
8. 培養細胞をインキュベーターに戻し、増殖を継続させます。
   注：回復期間中、細胞の形態と生存率をモニタリングしてください。過度な細胞の脱落やデブリの発生は、トランスフェクションに伴う細胞毒性を示している可能性があります。

4. トランスフェクション後の解析

1. トランスフェクションの24～48時間後にTERTタンパク質の発現を評価します。
2. 標準的なラボプロトコルに従い、ウェスタンブロッティングまたは免疫蛍光染色によりTERTタンパク質レベルを測定します。
3. 適切なテロメラーゼ活性測定法を用い、同時間内においてテロメラーゼ活性を測定します。
   注：一過性に導入されたhTERT mRNAは分解されるため、テロメラーゼ活性は通常48時間後に低下します。
4. トランスフェクションの48～72時間後に、モノクローム・マルチプレックス定量的PCR（MMqPCR）または同等のテロメア長解析法を用いてテロメア長を評価します。
   注：hTERT mRNAの導入に成功すると、検出可能なテロメアの伸長が観察されることがあります。
5. トランスフェクションの7日後に、細胞老化および若返りに関連する表現型を評価します。
   1. 老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）活性を測定します。
   2. p16およびp21の発現レベルを測定します。
   3. Ki67の発現を評価します。
   4. 光学顕微鏡により細胞形態を観察します。
      注：処理した培養細胞を、未処理または模擬トランスフェクションを行った老化コントロールと比較し、老化関連表現型および増殖特性の変化を評価します。

5. 反復投与プロトコール（任意）

1. セクション2–4に記載されている方法で、初回の手法でトランスフェクションを行う。
2. 以下のスケジュールに従ってトランスフェクションを繰り返す：0日目：1回目、5日目：2回目、10–12日目：3回目のトランスフェクション。
3. 細胞は接着培養状態で維持し、次回のトランスフェクション前にトリプシン処理を行わない。
4. セクション2.2.1–2.2.3に記載されている方法で、新鮮なhTERT mRNA–リピッド複合体を調製する。
5. 各ウェルから培地を吸引して除去する。
6. hTERT mRNA–リピッド複合体 200 µLを各ウェルに直接添加する。
7. 複合体の添加直後に、新鮮な完全F-10培地 800 µLを添加する。
8. 5% CO₂を含む加湿インキュベーター内、37 °Cで4–6 h間、細胞をインキュベートする。
9. トランスフェクション培地を新鮮な完全培地と交換する。
   注：累積的なトランスフェクションに伴う細胞毒性を最小限に抑えるため、処理は最大3サイクルまでに制限すること。

6. フォワードトランスフェクションプロトコル（2 µg/mL、6ウェルフォーマット）

1. -1日目：細胞播種
   1. 0.05%トリプシン-EDTAを用いて、老化または老化初期の線維芽細胞を剥離させる。
   2. 完全培地を用いてトリプシンを中和します。
   3. 細胞数および生存率を決定する。
   4. 細胞を6ウェルプレートに2.0～2.5 × 10^5 cells/wellの密度で播種する。⁵ ウェルあたりの細胞数。
   5. 細胞を、5% CO₂を含む加湿インキュベーター内にて37 °Cで一晩、コンフルエンスが約60～80%に達するまでインキュベートする。
2. 0日目：hTERT mRNA–試薬複合体の調製
   1. 氷上でヌクレオシド修飾hTERT mRNAのアリコートを融解する。
   2. 滅菌済みのRNaseフリーチューブ（チューブA）内で、hTERT mRNAをOpti-MEMで希釈し、最終濃度を2 µg/mLにする。
   3. チューブAにRNaseインヒビターを最終濃度0.5–1.0 U/µLとなるように加え、緩やかに混ぜ合わせる。
   4. 2本目のRNaseフリーチューブ（チューブB）内で、mRNA 100 ngあたり0.4〜0.6 µLの割合でトランスフェクション試薬をOpti-MEMに希釈します。
   5. 緩やかに混ぜながら、チューブBの内容物をチューブAに滴下して加えてください。
   6. 混合物を室温で15～20分間インキュベートする。
3. 0日目：前方へのトランスフェクション
   1. 細胞のコンフルエンシーが60～80%であり、形態が健全であることを確認する。
   2. 培地を吸引除去する。
   3. あらかじめ加温したPBS 1～2 mLで、細胞を1回洗浄します。
   4. 各ウェルに、あらかじめ温めておいた完全培地または血清低減培地を0.5 mLずつ加えます。
   5. 必要に応じて、クロロキンを最終濃度10–20 µMになるように添加する。
   6. ステップ6.2.6で調製したhTERT mRNA-試薬複合体を、各ウェルに0.5 mLずつ加える。
   7. プレートを緩やかに揺すぶり、複合体を均一に分散させる。
   8. 5% CO₂を含む加湿インキュベーター内で、37 °Cで4〜6時間細胞をインキュベートする。
      ​注：必要に応じて、老化細胞のインキュベーション時間を6〜8時間に延長してください。
   9. トランスフェクション培地を吸引して除去する。
   10. 各ウェルに、新鮮な完全培地を2.0 mLずつ加えます。
   11. セクション4に記載されている通り、トランスフェクション後の解析を行う。
       注：順方向および逆方向のトランスフェクション条件を比較する場合は、同一バッチのhTERT mRNA、トランスフェクション試薬、および名目投与量を使用してください。

結果

d2EGFP-T2A-hTERT modRNAは、不安定化EGFP（d2EGFP）レポーターが自己切断型T2Aペプチドを介してヒトTERTに連結されたハイブリッドオープンリーディングフレームとして設計されました。すべてのコンストラクトの完全なヌクレオチドおよびタンパク質配列は、Supplementary File 1に記載されています。翻訳効率とmRNA安定性を向上させるため、コーディング配列の両端には合成5′非翻訳領域（UTR）およびヒトβ-グロビンの3′ UTRを配置しました（Figure 1A）。また、この発現カセットには、T7ポリメラーゼのプロセッシビティを向上させ、早期の転写終結を抑制するために設計された合成酵素安定化配列（Es）および合成転写増強配列（TEs）が含まれています。T7プロモーターの下流にクローニングした後、アンチリバースキャップアナログ（ARCA）および修飾ヌクレオチド（m5CTPおよびΨUTP）を用いてin vitro転写を行い、続いて酵素的なポリ(A)テール付加（約120–200 nt）を行うことで、キャップ付きでポリアデニル化された高完全性のd2EGFP-T2A-hTERT modRNAを生成しました（Figure 1A）。

自動電気泳動RNA解析により、転写物の効率的な合成が確認され、複数の投入量において分解産物が最小限である期待サイズのRNA種が支配的であることが明らかになりました。これは、フルレングスのmodRNAが正常に生成されたことと一致しています(Figure 1B)。早期老化LF1線維芽細胞に2 µg/mLのd2EGFP-T2A-hTERT modRNAをトランスフェクションしたところ、24 h以内にhTERTタンパク質が検出され、48–96 hにわたって高発現が維持されており、合成転写物が持続的に翻訳されていることが示されました(Figure 1C)。連結したd2EGFPレポーターの解析では、リバーストランスフェクション後に強力な蛍光が認められた一方、フォワードトランスフェクション後には著しく低い蛍光が観察されました(Figure 1D,E)。これらの結果は、早期老化LF1線維芽細胞において、リバーストランスフェクション法を用いることでhTERT modRNAの導入効率と発現が向上することを示しています。

初期老化LF1線維芽細胞にd2EGFP-T2A-hTERT modRNAを5日おきに繰り返しフォワードトランスフェクション（FT）したところ、モノクロームマルチプレックス定量的PCR（MMqPCR）による測定の結果、擬似トランスフェクション対照群と比較して平均テロメア長（rT/S）が漸増することが示された（図 2A）。rT/S比はFTサイクルの回数を重ねるごとに上昇し、統計的有意性は*P < 0.05から**P < 0.01へと向上した。

リバーストランスフェクション（RT）を用いて同一の投与スケジュールを適用したところ、テロメア長のより顕著な増加が認められた。rT/S比はRTサイクルごとに増加し、擬似トランスフェクション（mock-transfected）コントロールと比較して極めて有意な差を示した（*P < 0.05から****P < 0.0001）（Figure 2B）。3回の処理サイクル後のFTとRTを直接比較した結果、両アプローチともに擬似トランスフェクションコントロールに対してrT/S値を有意に増加させたが、同一の投与量およびタイミング条件下では、RTの方がFTよりも大きな増加をもたらした（*P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001）（Figure 2C）。

長期的な増殖解析により、hTERT modRNAの繰り返し投与が複製寿命を延長することがさらに実証されました（図 2D）。1回、2回、または3回の治療サイクルを受けた細胞は、擬似トランスフェクション（mock-transfected）コントロールと比較して、累積細胞分裂回数が段階的に増加しました。hTERT modRNA治療を3回受けた培養細胞、特にRTによる投与を受けた細胞は、約250日間にわたってコントロールの増殖曲線から最大の乖離を示しました（最大で ****P < 0.0001）。細胞分裂回数の計算は補足ファイル 2に示されています。

d2EGFP-T2A-hTERT modRNAを導入した早期老化LF1線維芽細胞では、導入48時間後に強いTRAPラダリングが認められたが、モック導入およびeGFP-modRNA導入細胞ではバックグラウンド信号のみが認められた。これにより、テロメラーゼ活性が外来性hTERTの発現に由来することが示された（図3A）。熱処理による前処理でラダリングパターンが消失したことから、アッセイの特異性が確認された（図3B）。

タイムコース解析により、テロメラーゼ活性はトランスフェクション後24時間から48時間の間にピークに達し、その後低下して、72～96時間までにほぼベースラインレベルに戻ることが示された（図 3C）。hTERT modRNAの濃度を50から3,000 ng/mLまで増加させると、TRAPシグナルの強度がそれに比例して増加し、用量依存的なテロメラーゼ活性化が実証された（図 3D）。

野生型、触媒不活性型（CI）、および核局在化シグナル欠損型（ΔNLS）のhTERT構築物を用いた機能解析により、野生型hTERTのみが強力なテロメラーゼ活性を生成することが示された。CIおよびΔNLSの両変異体は、同様の導入条件下であったにもかかわらず、同等の活性を誘導できなかった（図 3E）。これらの知見と一致して、MMqPCR解析では、野生型hTERT modRNAを導入した細胞においてのみ、平均テロメア長の大幅な増加（rT/S ≈ 1.4）が認められた。CI-hTERT、ΔNLS-hTERT、またはモック処理を施した細胞は、ベースラインに近いレベルにとどまった（rT/S ≈ 0.3; ****P < 0.0001）（図 3F）。

hTERT modRNAを用いた5日間隔の3回連続の逆トランスフェクションにより、老化関連β-ガラクトシダーゼ陽性細胞の割合が有意に減少しました。最終トランスフェクションから15日後、陽性細胞の割合は、モック処理した培養細胞の約85%から、hTERT処理した培養細胞では約40%に減少しました(***P < 0.001) (図 4A)。

共焦点免疫染色の結果、モック処理した対照群と比較して、3回のhTERTリバーストランスフェクションを受けた細胞ではKi67の発現が増加しており、増殖活性が高まっていることが示された(Figure 4B)。さらにRT-qPCR解析により、hTERT処理後に細胞老化関連マーカーであるp16およびp21の発現が減少することが示された。モック処理した初期老化細胞と比較して、p16の発現は約2.3倍から0.7倍に減少し、p21の発現は約11倍から6倍に減少した(**P < 0.01; ****P < 0.0001) (Figure 4C,D)。Supplementary Figure 1では、クロロキン(CQ)またはY-27632のみの処理では、モックトランスフェクション細胞におけるp16またはp21の発現を著しく変化させないことがさらに示されている。対照的に、3回のhTERTリバーストランスフェクション中にCQとY-27632を併用したところ、hTERTリバーストランスフェクション単独またはいずれかの薬剤単独での処理と比較して、p16およびp21の両方の発現が最も大きく減少した。一方、単一薬剤による処理では中間的な効果が得られた。これらの結果は、CQとY-27632の併用が、hTERT mRNAリバーストランスフェクション後の細胞老化関連マーカーの発現減少を増強したことを示している。以上の知見をまとめると、hTERT mRNAの反復的なリバーストランスフェクションは、初期老化LF1線維芽細胞においてテロメア伸長を促進し、細胞老化関連マーカーを減少させ、増殖特性を向上させることが実証された。

図1: 初期老化LF1線維芽細胞におけるd2EGFP‑T2A‑hTERT mRNAの設計、合成、および機能検証。 (A) hTERTと不安定化EGFPを同時に発現させるため、T2Aペプチドで連結したd2EGFPカセットを含むハイブリッドhTERT mRNA構築物の概略設計。d2EGFP-T2A-hTERT ORFは、ヒトβグロビン遺伝子（HBB）の3’ UTRと合成5’ UTRによって挟まれている。mRNAは修飾ヌクレオチドを用いて合成され、最後にポリ(A)テールが付加された。 (B) 自動電気泳動RNA分析により解析した、in vitro転写を用いた高完全性d2EGFP-T2A-hTERT mRNAの効果的な合成。 (C) 2 µg/mLのd2EGFP-T2A-hTERT mRNAを導入後、自動キャピラリーベース免疫アッセイを用いて解析したhTERTタンパク質発現の時間経過分析。 (D) 初期老化一次二倍体線維芽細胞（LF1）において、順方向導入（FT）と逆方向導入（RT）の間でEGFP発現により評価したd2EGFP-T2A-hTERT mRNA導入の効率と発現を確認した。スケールバー = 10 µm。 (E) 順方向または逆方向導入後のeGFPシグナルの平均蛍光強度（MFI）の定量。各条件につき、5つの生物学的繰り返しから4つの異なる領域を含む、計20枚の個別の画像を解析した。データは平均値 ± SDを示す。 **P < 0.01; ウェルチの補正を用いた対応のないt検定により評価。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図2早期老化LF1線維芽細胞における、hTERT mRNAの反復的な順方向および逆方向へのトランスフェクション後のテロメア長の動態および増殖寿命 (A平均テロメア長（rT/S）をTelomere MMqPCRを用いて算出した。早期老化線維芽細胞に対し、Population Doubling（PD）#76から5日おきに3回、d2EGFP-T2A-hTERT mRNAをフォワードトランスフェクション（FT）した。エラーバーはSEMを示す。n = 5 生物学的反復。*P < 0.05, **P < mockのみで処理した細胞と比較して0.01でした。（B）と同様に（A）、早期老化細胞に対して、Population Doubling（PD）#76から5日おきにd2EGFP-T2A-hTERT mRNAを3回連続で導入（RT）した際のrT/Sを評価した。エラーバーはSEMを示す。n = 7（生物学的反復回数）。*P < 0.05, ****P < mockのみで処理した細胞と比較して0.0001（C5日おきに計3回の順方向および逆方向のトランスフェクションを連続して行った後、またはモックのみの場合の平均テロメア長（rT/S）の比較。エラーバーはSEMを示す。n = 10（生物学的反復数）。*P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. (D) ～を transfection した LF1 線維芽細胞の増殖曲線 2 µg/ml d2EGFP-T2A-hTERT mRNAまたはmockのみを、PD# 76から開始し、5日おきに1回、2回、または3回連続で投与した。黒色の矢印は投与タイミングを示す。増殖曲線は3回繰り返し作成し、各個体群は3連（triplicate）で培養した。生物学的サンプルあたり3つのテクニカルレプリケートを用い、データは平均値を示す。 ± 標準偏差 (SD)P < 0.05, **P < 0.01; ****P < 0.0001（Brown-Forsythe検定およびWelchのANOVA検定により評価） この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3触媒活性を持ち核に局在するhTERT mRNAは、用量依存的に一過性のテロメラーゼ活性の上昇を誘導し、これだけで初期老化状態にあるLF1線維芽細胞において測定可能なテロメア伸長を促進するのに十分である。 (A早期老化細胞に、mock、eGFP、またはd2EGFP-T2A-hTERT mRNAをトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、20,000個の細胞から細胞抽出液を調製し、TRAPアッセイに供した。反応産物をネイティブPAGEで電気泳動し、SYBR Greenで染色した。BTRAPアッセイを用いて測定した、熱によるテロメラーゼの不活性化。ChTERT mRNAを導入した初期老化LF1細胞におけるテロメラーゼ活性の経時的解析の結果、活性は72時間以内にベースラインに戻っており、酵素の活性化が一時的であることが示された。D早期老化LF1細胞に、異なる量のd2EGFP-T2A-hTERT mRNA（0～3,000 ng/mL）を導入したところ、投与量に比例してテロメラーゼ活性の上昇が認められた。E) の送達 2 µg/ml TERTは、初期老化LF1細胞においてテロメラーゼ活性を上昇させた。 ΔNLSは、細胞質で作用するが核へ移行しないため、テロメアの伸長を誘導することなくテロメラーゼ活性を部分的に増強したが、一方でCI TERT mRNAはこの効果を誘発せず、機能的な結果が異なることが示された。F) 機能的TERT、および核局在化シグナル欠損（Δ核局在化シグナル（NLS）、および触媒不活性型（CI）TERTのリバーストランスフェクションが、初期老化LF1細胞の平均テロメア長（rT/S）に及ぼす影響であり、テロメア伸長における核局在化した触媒活性TERTの重要性を示している。エラーバーはSDを表す。n = 7 生物学的反復；****P < Welch補正を伴う一元配置分散分析（one-way ANOVA）による評価の結果、mockのみで処理した細胞と比較して0.0001であった。各レーンの下部には、RTA%（相対テロメラーゼ活性：対照の%）が記載されている。各レーンにおけるTRAPサンプルラダーとITASバンド（内部対照-IC）の強度レベルの比は、以下の式を用いて算出した：活性 _{標準化された} = ラダー強度 / IC強度 とし、各サンプルは以下の数式を用いて陽性対照（陽性対照：H1299細胞 2,500個）に対するパーセンテージとして標準化した：相対活性 (%) = 活性 _{正規化された} (サンプル)/活性 _{正規化された} （参考文献）。各ステップにおいて背景減算を行った。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4: 最適化したhTERT mRNAのリバーストランスフェクションにより、初期老化LF1線維芽細胞において老化関連表現型が部分的に解消され、増殖マーカーが回復した。 (A) 5日おきに3回連続で修飾hTERT mRNAをトランスフェクションした後の、β-galを発現する初期老化LF1細胞の代表的な画像。スケールバー = 100 µm。β-galの発現は、最後のトランスフェクションから15日後に解析した。実験は3回行われ、1サンプルあたり100個以上の細胞を、手動でスコア化した。(B>) 増殖マーカーKi67で染色した初期老化LF1細胞の代表的な共焦点画像（20倍率）。スケールバー = 100 µm。hTERTのリバーストランスフェクションを3サイクル行った後、Ki-67の発現が有意に増加した。Ki67陽性核の割合は、3× hTERT (RT) 後に有意に増加した。グラフは、Mockトランスフェクション条件で正規化したKi67陽性核数の平均 ± SDを示す。各条件について、合計18枚の画像を解析し、各生物学的反復から6つの異なる視野を選択し、合計 n = 3 生物学的反復とした。****P < 0.0001。(C>) RT-qPCR (n = 6) により評価した、3× hTERT媒介の部分的な若返り後の老化マーカー発現。すべてのデータは平均 ± SDを示す。**P < 0.01; ****P < 0.0001（Welchの補正を用いた対応のないt検定による評価）。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

構成要素	容量／最終濃度
PCRテンプレートDNA	200 –1000 ng
10× IVTバッファー	2 μL
ATP (100 mM)	2 μL (最終濃度 10 mM)
GTP (100 mM)	1.5 μL (最終濃度 7.5 mM)
CTP (100 mM)	2 μL (最終濃度 10 mM)
m1Ψ-5′-TP (100 mM)	2 μL （最終濃度10 mM）（m1pseudo-UTPと通常のUTPを1:4〜2:2の比率で混合して導入することで、pseudo-UTPの取り込み率を高めることができます）Ψ-5′-TP:UTP).)
ARCA (10 mM)	4 μL (最終濃度 2 mM)
RNase阻害剤 (40 U/μL)	0.5 μL (20 U)
T7 RNAポリメラーゼ (50 U/μL)	2 μL (100 U)
ヌクレアーゼフリー水₂O	20 μL

表1: ヌクレオシド修飾hTERT mRNA合成のためのin vitro転写（IVT）反応組成。 ARCAキャップ付加IVT合成に使用した反応成分および最終量を記載する。

構成要素	容量／最終濃度
精製mRNA（最大） 5 μg	≤20 μL
10× ポリ(A)テール添加バッファー	5 μL
ATP (10 mM)	5 μL （最終濃度 1 mM）（すでにバッファーに含まれていますが、追加で添加することでポリAの安定化に寄与します。）
ポリ(A)ポリメラーゼ (5 U/μL)	1 μL (5 U)
ヌクレアーゼフリーH2O₂O	合計する 50 μL

表2：hTERT mRNAの転写後修飾に用いられるポリ(A)テール付加反応の組成。 120–200ヌクレオチドのポリ(A)テールを生成するための試薬量および反応条件を示す。

パラメータ	12ウェル形式	6ウェル形式
培養面積	~3.8 cm²	~9.5 cm²
ウェルあたりの培地量	1.0 mL	2.0 mL
細胞播種数	5× 104–6.5× 104 Cells/ml	2.0–2.5 × 10⁵
平均細胞数（コンフルエンス100%時）	5.7× 104–7.2× 104 Cells/ml	2.9–3 × 10⁵
mRNAトランスフェクション量	750 –1000ng	2000–3500 ng
mRNAトランスフェクション試薬量	1.5 – 3.0 µL	4.75 – 7 µL
Opti-MEMにおけるmRNA＋トランスフェクション試薬の最終容量	50 µL	200 µL

表3：6ウェルおよび12ウェル培養形式におけるhTERT mRNA導入の推奨トランスフェクションパラメータ。 フォワードおよびリバーストランスフェクション実験に使用した細胞播種密度、mRNA量、トランスフェクション試薬量、および複合体形成体積をまとめている。

補足図1：hTERT mRNAの繰り返し逆トランスフェクション後における、クロロキンおよびY-27632が細胞老化関連のp16およびp21発現に及ぼす影響。 (A) モック処理群および3で処理した群におけるp16 mRNA発現の定量的RT-PCR分析× クロロキン（CQ）、Y-27632、または指示されたそれらの併用処理後のhTERT逆転写（RT）LF1線維芽細胞。B) 同一の実験条件下におけるp21 mRNA発現の定量的RT-PCR解析。転写産物レベルはRpL13aで標準化し、若年対照細胞（PD#12）に対する相対値として示した。個々のデータ点は生物学的レプリケートを表す。データは平均値を示す。 ± n = 2の生物学的反復におけるSD。生物学的反復ごとに5つの技術的反復を実施。統計的有意性は図中に示されており、nsは有意差なしを意味する。*P < 0.05, **P < 0.01, ****P < Brown–Forsythe検定およびWelch's ANOVAにより決定された値は0.0001であった。略語：CQ、クロロキン；RT、逆転写；Y-27632、Rho関連プロテインキナーゼ（ROCK）阻害剤。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 1：hTERT発現コンストラクトのDNAおよびタンパク質配列こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル2：集団倍加（PD）の計算集団倍加（PD）は、PD = log₂ (Nf/N₀) という公式を用いて計算した。ここで、N₀は播種細胞数、Nfは回収された生存細胞数である。累積PDは、継代ごとのPD値を合計することで算出した。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本研究では、細胞老化を増殖生理学の軽微な変異ではなく、明確に異なるデリバリーの問題として再定義し、老化状態の生物物理学的および免疫学的制約に合わせたテロメラーゼmRNAトランスフェクション戦略を開発しました。老化細胞は、剛直化しコレステロールが蓄積した細胞膜とエンドサイトーシス活性の低下を示し、これが核酸の効率的なデリバリーに対する大きな障壁となっています。本プロトコルでは、リバーストランスフェクション法を採用することで、老化細胞が膜のリモデリングを起こし膜の可塑性が高まる一時的な接着期間を利用し、細胞と複合体の接触を吸収能力が高まる時期に同期させます^3,4。代表的な結果は、この戦略が従来のフォワードトランスフェクションと比較してhTERT modRNAのデリバリーと発現を向上させ、より大きなテロメア伸長と、より顕著な若返り関連表現型をもたらすことを示しています。

この手法の核心的な特徴は、老化細胞における3つの主要な障壁、すなわち自然免疫シグナルの亢進、RNA分解の促進、および翻訳能の低下に対処するために設計された多層的なmRNAエンジニアリング戦略である^23,24,25。シュードウリジンおよび5-メチルシチジンの導入により、TLR3、TLR7/8、およびRIG-Iシグナル伝達経路の活性化を抑制すると同時に、転写物の安定性と翻訳効率を高めることができる^13,26。さらに、ARCAキャッピングとpoly(A)テールの最適化により、転写物の安定性と翻訳量が高まり、hTERTの強力かつ一過性の発現が可能になる。先行研究と一致して、これらの修飾は、外来性RNAの導入に伴う自然免疫の活性化を最小限に抑えつつ、効率的なテロメラーゼ発現をサポートする。

また、本プロトコルでは、老化細胞の培養において特徴的なRNaseが豊富な細胞外環境にも対処しています²⁷。ヌクレオシド修飾、脂質複合体の形成、およびトランスフェクション直前のRNaseインヒビターの添加により、RNAの保護能を高めています。さらに、逆トランスフェクションのタイミングを、老化細胞の緩やかな接着キネティクスに合わせて調整することで、細胞接着時の細胞とmRNA-脂質複合体との相互作用時間を延長させています。これらの修正を総合的に行うことで、通常ではトランスフェクションが困難な細胞集団におけるカーゴ取り込みの成功確率を向上させています。

エンドソーム脱出は、老化細胞におけるmRNAデリバリーの2つ目の重要なボトルネックとなります。老化細胞では、リソソーム含有量が増加し、エンドサイトーシスで取り込まれた貨物の分解区画への輸送が亢進しています^17,28。トランスフェクション後の初期段階でクロロキンに一時的に曝露させることで、エンドソーム脱出が促進され、内部に取り込まれたmRNAのリソソームによる分解が抑制されるため、機能的なデリバリーが改善されます。最適投与量および曝露時間は細胞型によって異なる可能性がありますが、本結果は、エンドソーム脱出を促進させることで、老化線維芽細胞におけるデリバリー効率が大幅に向上することを示しています。

機能的なレベルでは、hTERT modRNAの繰り返し投与により、相対的なテロメア長の累積的な増加、複製寿命の延長、および複数の老化関連表現型の減少が認められた。hTERTを繰り返し投与した細胞では、モック導入コントロールと比較して、SA-β-gal活性の低下、p16およびp21の発現減少、Ki67の発現増加、および増殖能の向上が示された。重要な点として、テロメラーゼ活性は一過性であり、導入後数日以内にベースラインに近いレベルまで戻った。この一過性の発現プロファイルにより、恒久的な遺伝子改変を避けつつ、測定可能な生物学的効果を促進させるのに十分なテロメラーゼ活性を提供することができた。ただし、MMqPCRで得られた相対的なテロメア長の測定値は、絶対的なテロメア伸長を直接定量するものではないことに留意すべきである。今後、末端制限断片解析、定量的蛍光in situハイブリダイゼーション、Flow-FISH、またはTeSLA法を組み込んだ研究を行うことで、hTERT mRNA導入後のテロメア長ダイナミクスのより正確な評価が可能になると考えられる。

いくつかの限界について考慮する必要があります。老化細胞集団は本質的に不均一であり、老化誘導の方法、ドナー源、および培養履歴によって、mRNA導入に対する応答性が異なる可能性があります。その結果、トランスフェクション効率および若返りの結果は、実験系によって異なる可能性があります。さらに、テロメラーゼの再活性化は、主に細胞老化のテロメア依存的な側面に作用するものであり、老化のすべての特徴を直接的に修正するわけではありません。エピジェネティックなドリフト、ミトコンドリア機能不全、プロテオスタシスの変化、および慢性炎症シグナリングなどの老化に関連する変化は、テロメアの伸長に成功した後も持続する可能性があります^29,30。したがって、本プロトコルは、包括的な若返り戦略としてではなく、テロメア駆動型の老化を研究し、部分的に的に回復させるためのツールとして捉えるべきです。

本プロトコルで述べているパラメータは、老化ヒト細胞のための実用的なガイドラインとして意図されており、既報の研究および実験経験に基づいた反復的な最適化を通じて策定されました。細胞密度、トランスフェクション試薬とmRNAの比率、複合体形成時間、およびエンドソーム脱出条件などの要因は、個々の細胞種や実験設定に応じて調整が必要な場合があります。したがって、研究者は報告された条件を汎用的な最終決定事項ではなく、最適化のための出発点として検討してください。

要約すると、本プロトコルは、細胞老化の生理学的特性に合わせて最適化されたリバーストランスフェクション戦略を用い、修飾hTERT mRNAを老化ヒト細胞に導入するための再現可能な枠組みを提供するものである。この手法により、一過性のテロメラーゼ再活性化、測定可能なテロメア伸長、複製寿命の延長、および老化関連表現型の部分的な回復が可能となる。今後の研究では、本戦略を他の老化細胞型へ適用できるか評価し、相補的な若返り介入を組み合わせたアプローチを検討し、in vivo導入プラットフォームへの展開を模索すべきである。したがって、本手法は、老化研究におけるテロメア生物学、細胞の若返り、および老化メカニズムを調査するための有用なツールとなる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ham's F-10 Nutrient Mix	Thermo Fisher	11550043	細胞培養培地。
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNAキャップ構造アナログ	New England Biolab	S1411L	多くのRNAにおいて、キャップ構造は安定性を向上させ、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を低下させ、mRNA開始複合体の形成を促進する。
5-メチルシチジン-5´-三リン酸 (5-Methyl-CTP)	New England Biolab	N0432S	修飾NTPは、一般的にインビトロ転写RNAの免疫原性を低減するために使用される。
6ウェルプレート	Corning	351146	独立した実験条件下で、中量から大量の接着細胞または浮遊細胞を培養および処理するため。
Anti-Ki67抗体 (SP6)	abcam	ab16667	Ki67は主に増殖細胞で発現する。
細胞老化アッセイキット (SA-beta-gal染色)	cellbiolabs	CBA-230	SA-β-gal染色アッセイによる老化細胞の同定
DNA LoBind 0.5mlチューブ	Eppendorf	022431005	DNAやRNAを損失なく効率的に回収するため
DNA LoBind 1.5mlチューブ	Eppendorf	22431021	DNAやRNAを損失なく効率的に回収するため
DNase I, RNaseフリー (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	RNaseフリーのDNase Iは、一本鎖および二本鎖DNAを消化するエンドヌクレアーゼである。
E. coli Poly(A) ポリメラーゼ	New England Biolab	M0276S	Escherichia coliにおいて、Poly(A) ポリメラーゼ I (PAP I) は主に、RNA分子の3'末端へのアデノシン一リン酸 (AMP) 残基の鋳型非依存的な付加を触媒する機能を持つ。
胎牛血清	Thermo Fisher	A5256701	細胞培養用血清サプリメント
HiScribe T7 ARCA mRNAキット	New England Biolab	E2065S	HiScribe T7 ARCA mRNAキット (テーリング付き) は、ARCAキャップおよびpoly(A)テールを持つmRNAをインビトロで迅速に製造するために設計されている。キャップ付きmRNAは、T7 RNAポリメラーゼを用いてアンチリバースキャップアナログ (ARCA) を共転写的に組み込むことで合成される。
HiScribe T7 mRNAキット (CleanCap Reagent AG含有)	New England Biolab	E2080S	CleanCap Reagent AG含有HiScribe T7 mRNAキットにより、1つまたは複数の転写物を迅速かつ合理的に製造でき、典型的な収量は1反応あたり ≥90 μgとなる。
LongAmp Hot Start Taq DNAポリメラーゼ	New England Biolab	M0534S	LongAmp Hot Start Taq DNAポリメラーゼは、長いアンプリコンにおいて優れた性能を発揮する。
M-MuLV 逆転写酵素	New England Biolab	M0253L	M-MuLV 逆転写酵素は、RNA (cDNA合成) または一本鎖DNAを鋳型として、プライマーから開始して相補的なDNA鎖を合成する。
Monarch Spin RNAクリーンアップキット (50 μg)	New England Biolab	T2040L	Monarch® Spin RNAクリーンアップキット (50 μg) の主な機能は、酵素反応や抽出混合物から最大50 μgの高純度RNAを精製および濃縮することである。
NEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックス	New England Biolab	E2621L	NEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックスにより、断片の長さや末端の適合性に関わらず、複数のDNA断片をシームレスにアセンブリできる。その使いやすさ、柔軟性、およびシンプルなマスターミックス形式により、合成生物学分野だけでなく、複数断片のワンステップクローニングにも利用される。
Opti-MEM 低血清培地	Thermo Fisher	31985070	脂質ペイロード複合体形成時の細胞トランスフェクション効率を最大化するため。標準的な血清補充の必要性を減らしつつ、哺乳類細胞の高い生存性を維持する、最適化され化学的に定義された環境として機能する。
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の主な機能的用途は、哺乳類細胞および生物学的分子に対して安定したpHと浸透圧バランスを維持することである。
PCRストリップチューブ	Thermo Fisher	AB0776	PCRストリップチューブ (通常8連または12連形式) の主な機能的用途は、ハイスループットのサーマルサイクリング中に小容量の液体反応を保持することである。
ポリL-リジン臭化水素酸塩	Millipore Sigma	P4707-50ML	細胞接着のためのポリL-リジン (PLL) 臭化水素酸塩の主な機能的用途は、ガラスやプラスチックなどの負に帯電した固体表面をコーティングし、高接着性の正に帯電した基板を作成することである。
シュードウリジン-5´-三リン酸 (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	シュードウリジン-5´-三リン酸 (Pseudo-UTP) は、一般的にインビトロ転写RNAの免疫原性を低減するために使用される。
リボヌクレオチド溶液セット	New England Biolab	N0450L	ATP, GTP, CTPおよびUTPの4つの独立した溶液
ROCK阻害剤 Y-27632 (二塩酸塩)	Stem cell technologies	72302	Y-27632は、細胞透過性があり、Rho関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) に対して極めて強力かつ選択的な阻害剤である。Y-27632は、触媒部位への結合においてATPと競合することで、ROCK1 (Ki = 220 nM) と ROCK2 (Ki = 300 nM) の両方を阻害する
RT-PCRグレード水	Thermo Fisher	AM9935	RT-PCRグレード水 (多くの場合、ヌクレアーゼフリーウォーターと表記される) の主な機能的用途は、わずかな汚染でもサンプルを分解させたり増幅を阻害したりするような、感度の高い酵素アッセイ用の超純溶媒として機能することである。
SUPERase·In RNase阻害剤	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In RNase阻害剤は、非ヒト由来のタンパク質ベースの阻害剤であり、RNase A, B, C, 1, および T1を含む、最も一般的で厄介なRNaseに非共有的に結合し、それらを阻害する。
SYBR Green I 核酸ゲル染色剤	Thermo Fisher	S7563	SYBR™ Green I 核酸ゲル染色剤の主な機能的用途は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル中の二本鎖DNA (dsDNA) を可視化および定量することである。
TransIT-mRNAトランスフェクションキット	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	大きなRNAのための高効率かつ低毒性のトランスフェクション試薬
TRAPeze テロメラーゼ検出キット	Millipore Sigma	S7700	TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) アッセイは、哺乳類細胞および組織サンプル中のテロメラーゼ活性を検出および測定するために広く使用されている高感度なPCRベースの手法である。これには、テロメラーゼによるテロメア反復配列の伸長、PCRを用いたこれらの産物の増幅、およびその後の検出という3つの主要なステップが含まれる。
Trypsin-EDTA (0.05%), フェノールレッド	Thermo Fisher	25300054	定期的な細胞継代 (サブカルチャー) および回収時に、接着性哺乳類細胞を培養容器から剥離させるため。