miR-486-3pを強制的に過剰発現させると、A549およびH358肺腺がん細胞において、増殖関連活性、コロニー形成能、創傷治癒、およびMatrigel浸潤が抑制されます。これらの効果に伴い、WNT5B、DVL1、β-catenin、およびBCL-2の発現が低下しており、直接的な標的関係やパスウェイの因果関係は立証されていないものの、in vitroにおいてWnt関連の変化との関連があることが示されています。
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研究記事
* These authors contributed equally
miR-486-3pを強制的に過剰発現させると、A549およびH358肺腺がん細胞において、増殖関連活性、コロニー形成能、創傷治癒、およびMatrigel浸潤が抑制されます。これらの効果に伴い、WNT5B、DVL1、β-catenin、およびBCL-2の発現が低下しており、直接的な標的関係やパスウェイの因果関係は立証されていないものの、in vitroにおいてWnt関連の変化との関連があることが示されています。
肺腺がん（LUAD）は非小細胞肺がんの主要な組織学的サブタイプであり、依然として高い罹患率と死亡率に関連しています。先行研究では、LUADにおけるmiR-486-3pの腫瘍抑制機能が明らかにされていますが、WNT5B、DVL1、およびβ-cateninに関連する発現変化との関係は明確に定義されていません。本研究では、それぞれの日常的な培養条件下で維持されたA549およびH358 LUAD細胞におけるmiR-486-3pの基底発現量を検討し、Beas-2b気管支上皮細胞と比較しました。レンチウイルス導入により、miR-486-3pを安定的に過剰発現させるモデルを作製しました。細胞増殖に関連する活性、コロニー形成能、創傷閉鎖、およびMatrigelコーティング膜の透過性を、Cell Counting Kit-8、コロニー形成アッセイ、創傷治癒アッセイ、およびTranswellアッセイを用いて評価しました。WNT5B、DVL1、β-catenin、およびBCL-2のタンパク質量はウェスタンブロッティングにより評価し、さらにWNT5B、DVL1、CTNNB1、およびBCL2のmRNAレベルをRT-qPCRにより検討しました。使用した培養条件下において、miR-486-3pの発現量はBeas-2b細胞よりもA549細胞およびH358細胞で低く、レンチウイルス導入により両方のLUAD細胞株で安定的な過剰発現が誘導されました。miR-486-3pの強制的な過剰発現は、CCK-8シグナル、コロニー形成、創傷閉鎖、およびMatrigelコーティング膜の透過性を減少させ、それに伴いWNT5B、DVL1、総β-catenin、およびBCL-2のタンパク質量が低下しました。さらにRT-qPCRにより、miR-486-3pの過剰発現後、両方のLUAD細胞株においてWNT5B、DVL1、CTNNB1、およびBCL2の転写産物量が低下することが示されました。これらの知見は、miR-486-3pの強制発現、いくつかの悪性細胞指標の減弱、およびWnt関連発現の変化との間にin vitroでの関連があることを支持していますが、miRNAとターゲットの直接的な結合、パスウェイの活性、または因果的な線形シグナル伝達メカニズムを確立するものではありません。
肺腺がん（LUAD）は非小細胞肺がん（NSCLC）の最も一般的な組織学的亜型であり、世界的に肺がんに関連する罹患率および死亡率の大きな要因となっています1,2,3,4,5。分子分類と標的療法により、特定の患者群における転帰は改善されましたが、進行したLUADは依然として治療が困難であり、生物学的な不均一性を有しています1,2,3,4,5。したがって、悪性細胞の挙動に寄与する調節プロセスを定義することは、検証可能な治療仮説の開発において引き続き重要です。
Wntシグナリングは、増殖、生存、極性、および運動性を制御するβ-catenin依存性およびβ-catenin非依存性の経路で構成されています6,7,8,9。WNT5Bは、受容体や細胞のコンテキストによって生物学的効果が異なりますが、多くの場合、非標準的シグナリングに関連しています10,11。DVL1は、複数のWnt経路で共通して利用される細胞質内の信号伝達タンパク質であり、肺がんにおけるβ-catenin関連の挙動との関連が報告されています12。したがって、WNT5B、DVL1、およびβ-cateninの同時に起こる変化のみをもって、単一の線形経路の証拠であると解釈すべきではありません。
マイクロRNA（miRNA）は、標的となる転写物と配列依存的な相互作用を通じて遺伝子発現を調節する短鎖の非コードRNAである13,14,15。1つのmiRNAが複数のRNAに影響を及ぼし得るため、miRNAの存在量の変化は多様な腫瘍関連表現型に影響を与える可能性がある13,14,15,16,17,18。いくつかのmiRNAは肺がんの増殖、運動性、およびシグナル伝達に関連しており、miRNAとWnt関連ネットワークとのクロストークが複数の癌のコンテキストで報告されている16,17,18,19,20。
MIR486遺伝子座からは、成熟ストランドであるmiR-486-3pおよびmiR-486-5pが生成されます。miR-486-3pは、口腔癌および膠芽腫において腫瘍抑制活性を示す一方で、皮膚扁平上皮癌においては腫瘍促進効果が報告されています21,22,23,24,25。本研究では、公開されているLUADデータにおける発現量の低下、LUADにおける既報の腫瘍抑制活性、およびWNT関連の候補転写産物との関連を示すバイオインフォマティクス的予測に基づいた仮説駆動型戦略により、miR-486-3pを選択しました。Tomiokaらは、LUADにおいてmiR-486の両ストランドが腫瘍抑制効果を持つことを実証し、ゲノムワイドなターゲットスクリーニングを通じてGINS4を同定しました26。したがって、本研究は抗腫瘍表現型を初めて実証することを目的とするものではありません。むしろ、miR-486-3pの強制発現に伴い、WNT5B、DVL1、およびβ-cateninの量に変化が生じるか、また2つのLUAD細胞株において再現可能な表現型の変化が起こるかを評価します。これらの解析は相関関係を評価するものであり、直接的なターゲティング、パスウェイの活性、または線形なWNT5B/DVL1/β-cateninメカニズムを立証するものではありません。
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使用した試薬および器具は、材料表に記載されています。
細胞培養
ヒト肺腺がん（LUAD）細胞株のA549およびH358と、不死化気管支上皮細胞株のBeas-2bを使用した。A549（KRAS G12S）およびH358（KRAS G12C; STK11欠損）は、異なるKRAS変異背景を持つ一般的に用いられるLUADモデルとして選択し、Beas-2bは非悪性気管支上皮の比較対象として含めた。A549およびH358細胞はRPMI-1640培地で、Beas-2b細胞はDMEMで維持し、各培地には10%胎児牛血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。細胞は、5% CO₂を含む加湿条件下、37 °Cで培養した。腫瘍細胞株と上皮比較細胞株はそれぞれ異なる常用培地で維持されていたため、細胞株間での基底発現の比較結果の解釈には注意を払った。
レンチウイルス導入および安定発現細胞の選別
hsa-miR-486-3p前駆体を搭載したレンチウイルスベクター（LV-miR-486-3p）またはスクランブル陰性コントロール配列（LV-NC）を用い、安定的な機能獲得デザインとした。A549細胞およびH358細胞を6ウェルプレートに5 × 104 cells/wellの密度で播種し、一晩培養した。翌日、8 µg/mLのポリブレン共存下で、感染多重度（MOI）10でレンチウイルスに曝露させた。24時間後、ウイルス接種液を新鮮な完全培地に交換した。導入細胞を2 µg/mLのピューロマイシンで7日間選択した。選択後、生存細胞を回復させ、その後の分子生物学的および機能的アッセイに向けて増幅させた。本研究は安定的な強制過剰発現の効果を評価することを特化した設計であるため、miR-486-3p阻害剤群は含めていない。
注意：細胞生存率における処置に関連した差異を最小限に抑えるため、MOI、ポリブレン（polybrene）の曝露時間、およびピューロマイシン（puromycin）による選択条件は、LV-NC群とLV-miR-486-3p群の間で同一に保つ必要があります。
RT-qPCR
miR-486-3pの発現レベルを決定し、A549およびH358細胞におけるレンチウイルスによる過剰発現の効率を確認するために、RT-qPCRを実施した。全RNAは、製造元の指示に従いTRIzol試薬を用いて単離した。RNAの濃度と純度は分光光度計で評価し、A260/A280比が1.8–2.1の範囲内であれば許容範囲とした。mRNA解析では、製造元のプロトコルに従い、市販のcDNA合成キットを用いて1 µgの全RNAをcDNAに逆転写した。microRNA解析では、miRNA特異的ステムループ逆転写プライマーを用いてcDNA合成を行った。定量PCRは、10 µLの2× SYBR Green Master Mix、各0.4 µMのプライマー、および2 µLのcDNAテンプレートを含む計20 µLの反応系で実施した。増幅プロトコルは、95 °Cで5分間の初期変性後、95 °Cで10秒間の変性と60 °Cで30秒間のアニーリング/伸長を40サイクル繰り返した。その後、増幅の特異性を検証するために融解曲線分析を行った。miRNAの定量には内部コントロールとしてU6 small nuclear RNAを用い、mRNAの標準化にはリファレンス遺伝子としてGAPDHを用いた。相対的な発現レベルは2−ΔΔCq法を用いて算出した。
miRNAプライマー配列は以下の通りである：ステムループ逆転写プライマー 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′、miR-486-3pフォワードプライマー 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′、共通リバースプライマー 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′、U6フォワードプライマー 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、およびU6リバースプライマー 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。WNT5B、DVL1、CTNNB1、BCL2、およびGAPDHのプライマー配列、ならびにアンプリコン長および増幅効率を表1に示す。mRNAの発現量はGAPDHで標準化し、miR-486-3pの発現量はU6で標準化した。各実験には3つの独立した生物学的反復を含め、各生物学的反復につき3つのテクニカルレプリケートを設けた。
ウェスタンブロッティング
7日間のピューロマイシン選択と回復期間の終了後、プロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファーを用いて細胞を溶解させた。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイを用いて決定した。等量のタンパク質（1レーンあたり20 µg）を10% SDS-PAGEゲルで分離し、300 mAで120分間のウェット転写によりPVDF膜に転写した。膜を、0.1% Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水（TBST）で調製した5%脱脂粉乳で、室温で1時間ブロッキングした。その後、膜をWNT5B (1:1,000)、DVL1 (1:1,000)、β-catenin (1:1,000)、BCL-2 (0.5 µg/mL)、またはβ-actin (1:5,000)に対する一次抗体とともに、4 °Cで一晩インキュベートした。すべての抗体の製造元およびカタログ番号は、材料表に記載されている。TBSTで10分間3回洗浄した後、1:5,000に希釈したHRP標識山羊抗ウサギIgG二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。その後、膜をTBSTで3回洗浄し、化学発光基質を用いてタンパク質バンドを可視化し、ゲルドキュメンテーションおよびイメージングシステムで撮像した。バンド強度はImageJを用いて定量化した。各標的タンパク質の量は、同一の生物学的サンプルから得られた対応するβ-actinのシグナルで標準化した。デンシトメトリ分析には、線形であり飽和していない検出範囲内の露光のみを使用した。3回の独立した生物学的実験を実施した。
Cell Counting Kit-8 アッセイ
LV-NCまたはLV-miR-486-3pを安定的に導入したA549細胞およびH358細胞を、完全培地100 µLを用いて96ウェルプレートに1.5 × 104 cells/wellの密度で播種した。一晩静置して細胞を接着させた後、培地を交換し、Cell Counting Kit-8試薬を添加して直ちに0時間の吸光度を測定した。0 h、24 h、48 h、72 h、および96 hにおいて、1ウェルあたり10 µLの試薬を添加し、37 °Cで1時間インキュベートした後、450 nmで吸光度を測定した。修正タイムコース解析では、各群をそれぞれの0時間の値で正規化してからプロットした。3回の独立した生物学的実験を行い、統計解析の前に各実験内のテクニカルウェルの平均値を算出した。
コロニー形成アッセイ
安定選択されたA549細胞およびH358細胞を、5 × 102 cells/mLの単一細胞懸濁液として調製した。6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を1 mLずつ播種し、続いて完全培地を3 mL加えた。5日ごとに培地を交換しながら、細胞を14日間培養した。コロニーをPBSで洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで20分間固定した後、クリスタルバイオレットで20分間染色し、洗浄して風乾させた。50個以上の細胞を含むコロニーをImageJでカウントした。3回の独立した生物学的実験を行った。
注：細胞の不自然な凝集を防ぐため、均一な単一細胞懸濁液を調製し、コロニー形成時のプレートへの刺激を最小限に抑える必要があります。
細胞遊走アッセイ
安定的に導入されたA549およびH358細胞を6ウェルプレートに播種し、コンフルエントな単層が形成されるまで培養した。滅菌済みの10 µLピペットチップを用いて直線的なスクラッチを作成し、剥離した細胞を除去した後、同じマークした視野を0 h、24 h、48 h、72 hで画像化した。ImageJで傷の面積を測定し、傷の閉鎖率を（0 hの面積 − 指定した時点の面積）/ 0 hの面積 × 100%として算出した。3回の独立した生物学的実験を行った。薬理学的な増殖抑制剤は使用していないため、このアッセイは遊走特異的な読み出しではなく、傷の閉鎖の測定として解釈した。
注意：スクラッチは一定の幅と圧力で作成し、タイムコースを通じて同一の視野を追跡してください。
細胞浸潤アッセイ
Transwell浸潤アッセイは、孔径8 µmの24ウェルポリカーボネート膜インサートを用いて実施した。各インサートの上面に、無血清DMEMで1:8に希釈したMatrigel基底膜マトリックス100 µL（最終タンパク質濃度は約1 mg/mL）をコーティングし、37 °Cで4時間インキュベートした。A549細胞およびH358細胞を、それぞれ8 × 105 cells/mLおよび4 × 105 cells/mLの密度で無血清RPMI-1640培地で再懸濁した。細胞懸濁液200 µLを上部チャンバーに加え、インサート1個あたり1.6 × 105個のA549細胞または8 × 104個のH358細胞とした。下部チャンバーには、化学誘引物質として20%胎児牛血清を含むRPMI-1640培地500 µLを満たした。5% CO₂を含む加湿雰囲気下、37 °Cで48時間インキュベートした後、膜の上面に残った非浸潤細胞を綿棒で優しく除去した。膜を浸潤した細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、室温で0.1%クリスタルバイオレットを用いて20分間染色した。各インサートにつきランダムに選択した5つの顕微鏡視野を撮影し、浸潤細胞数をImageJを用いて定量化した。5つの視野の平均細胞数を各インサートの1つの値とし、個々の顕微鏡視野ではなくインサートを実験単位として扱った。独立した生物学的実験を3回実施した。
注：メンブレンを損傷させたり、下層に遊走した細胞を剥がしたりしないよう、非浸潤細胞を慎重かつ均一に取り除いてください。
統計解析
特に指定がない限り、データは平均値 ± SD で示し、n は独立した生物学的実験回数を表します。テクニカルレプリケートまたは同一実験単位からの複数の顕微鏡視野は、推論統計検定の前に平均化しました。3つの細胞株の比較には、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、続いて Tukey の補正によるペア比較を行いました。CCK-8 および創傷閉鎖のタイムコースでは、二元配置反復測定分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）を用いて、処理、時間、および処理×時間の相互作用による影響を評価し、続いて個々の時点において Šídák の補正による比較を行いました。2群間の比較は、両側非ペア Student の t-tests を用いて分析しました。統計解析およびデータの視覚化は、統計解析およびグラフ作成ソフトを用いて行いました。正確な p 値は、図パネルまたはソースデータテーブルに記載しています。統計的有意性は p < 0.05 と定義しました。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。
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TCGA/starBase解析によりLUADにおけるmiR-486-3pの発現量減少が示され、TargetScanにより候補結合部位が同定された
starBase v3.0を通じてアクセスしたTCGA由来の発現データにより、miR-486-3pの存在量は、20例の非腫瘍肺サンプルよりも512例の肺腺癌（LUAD）サンプルにおいて有意に低いことが示された（Wilcoxon順位和検定、p = 3.2 × 10⁻5; Figure 1）。TargetScanHumanにより、DVL1の3′非翻訳領域（3′ UTR）の468–474番目の位置に、保存性の低いmiR-486-3pの候補7mer-m8サイトが同定され、context++スコアは−0.23、context++スコアパーセンタイルは80であった。また、WNT5Bの3′ UTRの913–920番目の位置に、保存性の低い候補8mer...
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本機能獲得研究では、A549およびH358肺腺癌（LUAD）細胞におけるmiR-486-3pの安定的な強制発現の影響を評価しました。両方のモデルにおいて、miR-486-3pの過剰発現は、増殖に関連するCCK-8シグナルの減少、コロニー形成能の低下、創傷治癒能の低下、およびMatrigelコーティングしたTranswell膜を通過する細胞数の減少と相関していました。これらの表現型の変化は、WNT5B、DVL1、総β-catenin、およびBCL-2タンパク質量の減少とともに、WNT5B、DVL1、CTNNB1、およびBCL2の転写レベルの低下を伴っていました。総合すると、これらの知見は、miR-486-3pの強制発現、複数の悪性細胞表現型の減弱、および選択されたWnt関連分子の協調的な変化との間の関連性を支持しています。しかし、これらはmiRNAと標的の直接的な結合、パスウェイの活性、または因果関係のあるシグナル伝達配列を立証するものではありません。
本研究で観察された全般的な腫瘍抑制表現型は、先行報告と一致し...
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著者らに申告すべき利益相反はありません。
本研究は、浙江省医療衛生科学技術計画（2025KY349）および嘉興市重点支援学部（2023-zc-014）による資金提供を受けて実施されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | SDS-PAGEスタッキングゲルの調製 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | SDS-PAGE分離ゲルの調製 |
| 20× TBS緩衝液 | Solarbio | 71080 | ウェスタンブロットの洗浄および抗体希釈用ストックバッファー |
| 30% アクリルアミド/ビス-アクリルアミド溶液 (29:1) | Solarbio | A1010 | SDS-PAGEゲルの作製 |
| 4%パラホルムアルデヒド固定液 | Servicebio | G1101 | コロニー形成能およびトランスウェルアッセイのための固定 |
| 5× タンパク質ローディングバッファー | Beyotime | P0015 | SDS-PAGEのためのタンパク質試料調製 |
| 過硫酸アンモニウム | Solarbio | 427A038 | SDS-PAGEゲルの重合開始剤 |
| BCAタンパク質定量キット | Beyotime | P0009-1 | タンパク質濃度の測定 |
| BCL-2抗体 | Boster Biological Technology | A00040-2 | ウサギポリクローナル抗体；ウェスタンブロッティングにて1:5,000で希釈 |
| セルカウンティングキット-8 (CCK-8) | 標的分子 | C0005 | 細胞増殖に関連する代謝活性測定法; 10 μ100あたりのL μL培養基 |
| 化学発光イメージングシステム | Bio-Rad | ChemiDoc MP | ウェスタンブロットイメージング |
| クロロホルム | Servicebio | G3005 | TRIzolを用いたRNA抽出における相分離 |
| クリスタルバイオレット染色液 | Servicebio | G1014 | コロニーおよびトランスウェルメンブレンの染色 |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Beas-2b細胞用の日常的な培地 |
| DVL1抗体 | Signalway抗体 | 53180 | ウサギ一次抗体。ウェスタンブロッティングでの希釈倍率は1:5,000。 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Biosharp | BL203B | 通常細胞培養用に10% (v/v) 添加；Transwell下層チャンバーには20% (v/v) 添加 |
| GraphPad Prism 8 | GraphPadソフトウェア | バージョン 8 | グラフの作成および統計解析 |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | SYBR Greenを用いた定量PCR |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | mRNA RT-qPCRのための逆転写 |
| IBM SPSS Statistics | IBM | バージョン 22.0 | 統計解析 |
| ImageJ | アメリカ国立衛生研究所 | バージョン 1.53 | ウェスタンブロットのデンシトメトリー、創傷領域の測定、コロニー数のカウント、およびトランスウェルを用いた細胞カウント |
| 倒立顕微鏡 | Olympus | CKX53 | 創傷治癒能イメージングおよびTranswellアッセイ |
| イソプロパノール | Servicebio | G3006 | TRIzolを用いた抽出におけるRNA沈殿 |
| LV-miR-486-3pおよびLV-NCレンチウイルス調製物 | GenePharma | カスタム合成 | 安定的なmiR-486-3p過剰発現ベクターおよびスクランブル陰性コントロールベクター |
| Matrigel基底膜マトリックス | Corning | 354234 | 無血清DMEMで1:8に希釈し、最終タンパク質濃度を約1 mg/mLとする |
| メタノール | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | PVDFメンブレンの活性化 |
| マイクロプレートリーダー | BioTek | ELx800 | 450 nmにおける吸光度の測定 |
| マイクロボリュームUV-Vis分光光度計 | Allsheng | Nano-600 | RNA濃度およびA260/A280純度の評価 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 日常的な細胞培養用の1% (v/v) 添加剤 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Servicebio | G0002 | 細胞および膜の洗浄 |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | APExBIO | K1007 | RIPA溶解バッファーに添加した |
| タンパク質ラダー | Biosharp | BL712A | ウェスタンブロッティング用分子量マーカー |
| PVDFメンブレン | Millipore | K2MA8350E | ウェスタンブロッティング用タンパク質転写膜 |
| QuantStudio 5 リアルタイムPCRシステム | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | RT-qPCRデータの取得 |
| RIPA溶解バッファー | Beyotime | P0013B | 全細胞タンパク質の抽出 |
| RNA抽出試薬（TRIzolタイプ） | Servicebio | G3013 | 全RNA抽出 |
| RPMI 1640培地 | Servicebio | G4510 | A549細胞およびH358細胞の常用培地および無血清Transwell細胞懸濁液 |
| SDS | Solarbio | S8010 | SDS-PAGE試薬 |
| 脱脂粉乳 | BD | 2271470 | ウェスタンブロッティング用5%ブロッキング溶液 |
| StarBase v3.0 | 中山大学 | ENCORE (Enhanced NMR Constraints for Protein-RNA complexes) ENCOREは、タンパク質-RNA複合体の構造決定を目的としたNMR制約の算出および最適化のためのウェブベースのツールです。 ENCOREの概要 ENCOREは、NMRデータの解析を効率化し、タンパク質-RNA複合体の高精度な3次元構造モデルを構築するために設計されました。本ツールは、実験的に得られたNMR制約を処理し、構造計算における制約の重み付けを最適化することで、より信頼性の高い構造解析を可能にします。 主な機能 ・NMR制約の統合：NOE（核オーバーハウザー効果）やJ結合定数などの多様なNMRデータを統合して処理します。 ・制約の最適化：構造計算の過程で、実験データとモデル構造間の不一致を最小限に抑えるための重み付け最適化を行います。 ・構造精査：得られた構造モデルが、提供されたNMR制約をどの程度充足しているかを定量的に評価します。 ・ユーザーフレンドリーなインターフェース：専門的な計算リソースへのアクセスを簡略化し、ウェブブラウザ経由で解析を実行できます。 利用方法 1. データのアップロード：実験的に得られたNMR制約ファイルおよび初期構造モデルをアップロードします。 2. パラメータ設定：解析に必要な計算パラメータ（反復回数、カットオフ値など）を設定します。 3. 計算の実行：ENCOREサーバー上で制約の最適化および構造計算を実行します。 4. 結果のダウンロード：最適化された制約セットおよび最終的な構造アンサンブルをダウンロードし、解析します。 ENCOREを利用することで、複雑なタンパク質-RNA相互作用の構造的基盤をより迅速かつ正確に明らかにすることができ、分子生物学および生物物理学的な知見の深化に寄与します。 | TCGA由来のmiR-486-3p発現解析 |
| TargetScanHuman | ホワイトヘッド生物医学研究所 | https://www.targetscan.org/vert_80/ | 候補となるmiR-486-3p結合部位の予測 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | SDS-PAGEゲルの重合触媒 |
| Transwellインサート、24ウェル、8μm μm ポアサイズ | Corning | 3428 | Matrigelコーティング膜透過アッセイ |
| トリプシン | Servicebio | G4000 | 細胞の剥離 |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | ウェスタンブロット洗浄バッファーの調製 |
| 垂直電気泳動システム | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | SDS-PAGEによるタンパク質分離 |
| ウェスタンブロット用HRP基質ルミノール試薬 | Affinity Biosciences | KF001 | 化学発光ウェスタンブロット検出 |
| ウェット転写システム | Bio-Rad | 1703930 | PVDF膜へのタンパク質転写 |
| WNT5B抗体 | Signalway抗体 | 56808 | ウサギ一次抗体；ウェスタンブロッティング、1:5,000で希釈 |
| β$\alpha$-アクチン抗体 | Abcam | ab8227 | ローディングコントロール；ウェスタンブロッティングにおいて1:5,000で希釈 |
| β$\beta$-カテニン抗体 | Signalway 抗体 | 21725 | ウサギ一次抗体；ウェスタンブロッティング（希釈倍率1:5,000） |
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