miR-486-3pを強制的に過剰発現させると、A549およびH358肺腺がん細胞において、増殖関連活性、コロニー形成能、創傷治癒、およびMatrigel浸潤が抑制されます。これらの効果に伴い、WNT5B、DVL1、β-catenin、およびBCL-2の発現が低下しており、直接的な標的関係やパスウェイの因果関係は立証されていないものの、in vitroにおいてWnt関連の変化との関連があることが示されています。
研究記事
miR-486-3pは肺腺癌細胞において悪性表現型を抑制し、WNT5B、DVL1、およびβ-cateninの発現低下と関連している
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
肺腺がん（LUAD）は非小細胞肺がんの主要な組織学的サブタイプであり、依然として高い罹患率と死亡率に関連しています。先行研究では、LUADにおけるmiR-486-3pの腫瘍抑制機能が明らかにされていますが、WNT5B、DVL1、およびβ-cateninに関連する発現変化との関係は明確に定義されていません。本研究では、それぞれの日常的な培養条件下で維持されたA549およびH358 LUAD細胞におけるmiR-486-3pの基底発現量を検討し、Beas-2b気管支上皮細胞と比較しました。レンチウイルス導入により、miR-486-3pを安定的に過剰発現させるモデルを作製しました。細胞増殖に関連する活性、コロニー形成能、創傷閉鎖、およびMatrigelコーティング膜の透過性を、Cell Counting Kit-8、コロニー形成アッセイ、創傷治癒アッセイ、およびTranswellアッセイを用いて評価しました。WNT5B、DVL1、β-catenin、およびBCL-2のタンパク質量はウェスタンブロッティングにより評価し、さらにWNT5B、DVL1、CTNNB1、およびBCL2のmRNAレベルをRT-qPCRにより検討しました。使用した培養条件下において、miR-486-3pの発現量はBeas-2b細胞よりもA549細胞およびH358細胞で低く、レンチウイルス導入により両方のLUAD細胞株で安定的な過剰発現が誘導されました。miR-486-3pの強制的な過剰発現は、CCK-8シグナル、コロニー形成、創傷閉鎖、およびMatrigelコーティング膜の透過性を減少させ、それに伴いWNT5B、DVL1、総β-catenin、およびBCL-2のタンパク質量が低下しました。さらにRT-qPCRにより、miR-486-3pの過剰発現後、両方のLUAD細胞株においてWNT5B、DVL1、CTNNB1、およびBCL2の転写産物量が低下することが示されました。これらの知見は、miR-486-3pの強制発現、いくつかの悪性細胞指標の減弱、およびWnt関連発現の変化との間にin vitroでの関連があることを支持していますが、miRNAとターゲットの直接的な結合、パスウェイの活性、または因果的な線形シグナル伝達メカニズムを確立するものではありません。
概要
肺腺がん（LUAD）は非小細胞肺がん（NSCLC）の最も一般的な組織学的亜型であり、世界的に肺がんに関連する罹患率および死亡率の大きな要因となっています1,2,3,4,5。分子分類と標的療法により、特定の患者群における転帰は改善されましたが、進行したLUADは依然として治療が困難であり、生物学的な不均一性を有しています1,2,3,4,5。したがって、悪性細胞の挙動に寄与する調節プロセスを定義することは、検証可能な治療仮説の開発において引き続き重要です。
Wntシグナリングは、増殖、生存、極性、および運動性を制御するβ-catenin依存性およびβ-catenin非依存性の経路で構成されています6,7,8,9。WNT5Bは、受容体や細胞のコンテキストによって生物学的効果が異なりますが、多くの場合、非標準的シグナリングに関連しています10,11。DVL1は、複数のWnt経路で共通して利用される細胞質内の信号伝達タンパク質であり、肺がんにおけるβ-catenin関連の挙動との関連が報告されています12。したがって、WNT5B、DVL1、およびβ-cateninの同時に起こる変化のみをもって、単一の線形経路の証拠であると解釈すべきではありません。
マイクロRNA（miRNA）は、標的となる転写物と配列依存的な相互作用を通じて遺伝子発現を調節する短鎖の非コードRNAである13,14,15。1つのmiRNAが複数のRNAに影響を及ぼし得るため、miRNAの存在量の変化は多様な腫瘍関連表現型に影響を与える可能性がある13,14,15,16,17,18。いくつかのmiRNAは肺がんの増殖、運動性、およびシグナル伝達に関連しており、miRNAとWnt関連ネットワークとのクロストークが複数の癌のコンテキストで報告されている16,17,18,19,20。
MIR486遺伝子座からは、成熟ストランドであるmiR-486-3pおよびmiR-486-5pが生成されます。miR-486-3pは、口腔癌および膠芽腫において腫瘍抑制活性を示す一方で、皮膚扁平上皮癌においては腫瘍促進効果が報告されています21,22,23,24,25。本研究では、公開されているLUADデータにおける発現量の低下、LUADにおける既報の腫瘍抑制活性、およびWNT関連の候補転写産物との関連を示すバイオインフォマティクス的予測に基づいた仮説駆動型戦略により、miR-486-3pを選択しました。Tomiokaらは、LUADにおいてmiR-486の両ストランドが腫瘍抑制効果を持つことを実証し、ゲノムワイドなターゲットスクリーニングを通じてGINS4を同定しました26。したがって、本研究は抗腫瘍表現型を初めて実証することを目的とするものではありません。むしろ、miR-486-3pの強制発現に伴い、WNT5B、DVL1、およびβ-cateninの量に変化が生じるか、また2つのLUAD細胞株において再現可能な表現型の変化が起こるかを評価します。これらの解析は相関関係を評価するものであり、直接的なターゲティング、パスウェイの活性、または線形なWNT5B/DVL1/β-cateninメカニズムを立証するものではありません。
プロトコル
使用した試薬および器具は、材料表に記載されています。
細胞培養
ヒト肺腺がん（LUAD）細胞株のA549およびH358と、不死化気管支上皮細胞株のBeas-2bを使用した。A549（KRAS G12S）およびH358（KRAS G12C; STK11欠損）は、異なるKRAS変異背景を持つ一般的に用いられるLUADモデルとして選択し、Beas-2bは非悪性気管支上皮の比較対象として含めた。A549およびH358細胞はRPMI-1640培地で、Beas-2b細胞はDMEMで維持し、各培地には10%胎児牛血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。細胞は、5% CO₂を含む加湿条件下、37 °Cで培養した。腫瘍細胞株と上皮比較細胞株はそれぞれ異なる常用培地で維持されていたため、細胞株間での基底発現の比較結果の解釈には注意を払った。
レンチウイルス導入および安定発現細胞の選別
hsa-miR-486-3p前駆体を搭載したレンチウイルスベクター（LV-miR-486-3p）またはスクランブル陰性コントロール配列（LV-NC）を用い、安定的な機能獲得デザインとした。A549細胞およびH358細胞を6ウェルプレートに5 × 104 cells/wellの密度で播種し、一晩培養した。翌日、8 µg/mLのポリブレン共存下で、感染多重度（MOI）10でレンチウイルスに曝露させた。24時間後、ウイルス接種液を新鮮な完全培地に交換した。導入細胞を2 µg/mLのピューロマイシンで7日間選択した。選択後、生存細胞を回復させ、その後の分子生物学的および機能的アッセイに向けて増幅させた。本研究は安定的な強制過剰発現の効果を評価することを特化した設計であるため、miR-486-3p阻害剤群は含めていない。
注意：細胞生存率における処置に関連した差異を最小限に抑えるため、MOI、ポリブレン（polybrene）の曝露時間、およびピューロマイシン（puromycin）による選択条件は、LV-NC群とLV-miR-486-3p群の間で同一に保つ必要があります。
RT-qPCR
miR-486-3pの発現レベルを決定し、A549およびH358細胞におけるレンチウイルスによる過剰発現の効率を確認するために、RT-qPCRを実施した。全RNAは、製造元の指示に従いTRIzol試薬を用いて単離した。RNAの濃度と純度は分光光度計で評価し、A260/A280比が1.8–2.1の範囲内であれば許容範囲とした。mRNA解析では、製造元のプロトコルに従い、市販のcDNA合成キットを用いて1 µgの全RNAをcDNAに逆転写した。microRNA解析では、miRNA特異的ステムループ逆転写プライマーを用いてcDNA合成を行った。定量PCRは、10 µLの2× SYBR Green Master Mix、各0.4 µMのプライマー、および2 µLのcDNAテンプレートを含む計20 µLの反応系で実施した。増幅プロトコルは、95 °Cで5分間の初期変性後、95 °Cで10秒間の変性と60 °Cで30秒間のアニーリング/伸長を40サイクル繰り返した。その後、増幅の特異性を検証するために融解曲線分析を行った。miRNAの定量には内部コントロールとしてU6 small nuclear RNAを用い、mRNAの標準化にはリファレンス遺伝子としてGAPDHを用いた。相対的な発現レベルは2−ΔΔCq法を用いて算出した。
miRNAプライマー配列は以下の通りである：ステムループ逆転写プライマー 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′、miR-486-3pフォワードプライマー 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′、共通リバースプライマー 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′、U6フォワードプライマー 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、およびU6リバースプライマー 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。WNT5B、DVL1、CTNNB1、BCL2、およびGAPDHのプライマー配列、ならびにアンプリコン長および増幅効率を表1に示す。mRNAの発現量はGAPDHで標準化し、miR-486-3pの発現量はU6で標準化した。各実験には3つの独立した生物学的反復を含め、各生物学的反復につき3つのテクニカルレプリケートを設けた。
ウェスタンブロッティング
7日間のピューロマイシン選択と回復期間の終了後、プロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファーを用いて細胞を溶解させた。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイを用いて決定した。等量のタンパク質（1レーンあたり20 µg）を10% SDS-PAGEゲルで分離し、300 mAで120分間のウェット転写によりPVDF膜に転写した。膜を、0.1% Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水（TBST）で調製した5%脱脂粉乳で、室温で1時間ブロッキングした。その後、膜をWNT5B (1:1,000)、DVL1 (1:1,000)、β-catenin (1:1,000)、BCL-2 (0.5 µg/mL)、またはβ-actin (1:5,000)に対する一次抗体とともに、4 °Cで一晩インキュベートした。すべての抗体の製造元およびカタログ番号は、材料表に記載されている。TBSTで10分間3回洗浄した後、1:5,000に希釈したHRP標識山羊抗ウサギIgG二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。その後、膜をTBSTで3回洗浄し、化学発光基質を用いてタンパク質バンドを可視化し、ゲルドキュメンテーションおよびイメージングシステムで撮像した。バンド強度はImageJを用いて定量化した。各標的タンパク質の量は、同一の生物学的サンプルから得られた対応するβ-actinのシグナルで標準化した。デンシトメトリ分析には、線形であり飽和していない検出範囲内の露光のみを使用した。3回の独立した生物学的実験を実施した。
Cell Counting Kit-8 アッセイ
LV-NCまたはLV-miR-486-3pを安定的に導入したA549細胞およびH358細胞を、完全培地100 µLを用いて96ウェルプレートに1.5 × 104 cells/wellの密度で播種した。一晩静置して細胞を接着させた後、培地を交換し、Cell Counting Kit-8試薬を添加して直ちに0時間の吸光度を測定した。0 h、24 h、48 h、72 h、および96 hにおいて、1ウェルあたり10 µLの試薬を添加し、37 °Cで1時間インキュベートした後、450 nmで吸光度を測定した。修正タイムコース解析では、各群をそれぞれの0時間の値で正規化してからプロットした。3回の独立した生物学的実験を行い、統計解析の前に各実験内のテクニカルウェルの平均値を算出した。
コロニー形成アッセイ
安定選択されたA549細胞およびH358細胞を、5 × 102 cells/mLの単一細胞懸濁液として調製した。6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を1 mLずつ播種し、続いて完全培地を3 mL加えた。5日ごとに培地を交換しながら、細胞を14日間培養した。コロニーをPBSで洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで20分間固定した後、クリスタルバイオレットで20分間染色し、洗浄して風乾させた。50個以上の細胞を含むコロニーをImageJでカウントした。3回の独立した生物学的実験を行った。
注：細胞の不自然な凝集を防ぐため、均一な単一細胞懸濁液を調製し、コロニー形成時のプレートへの刺激を最小限に抑える必要があります。
細胞遊走アッセイ
安定的に導入されたA549およびH358細胞を6ウェルプレートに播種し、コンフルエントな単層が形成されるまで培養した。滅菌済みの10 µLピペットチップを用いて直線的なスクラッチを作成し、剥離した細胞を除去した後、同じマークした視野を0 h、24 h、48 h、72 hで画像化した。ImageJで傷の面積を測定し、傷の閉鎖率を（0 hの面積 − 指定した時点の面積）/ 0 hの面積 × 100%として算出した。3回の独立した生物学的実験を行った。薬理学的な増殖抑制剤は使用していないため、このアッセイは遊走特異的な読み出しではなく、傷の閉鎖の測定として解釈した。
注意：スクラッチは一定の幅と圧力で作成し、タイムコースを通じて同一の視野を追跡してください。
細胞浸潤アッセイ
Transwell浸潤アッセイは、孔径8 µmの24ウェルポリカーボネート膜インサートを用いて実施した。各インサートの上面に、無血清DMEMで1:8に希釈したMatrigel基底膜マトリックス100 µL（最終タンパク質濃度は約1 mg/mL）をコーティングし、37 °Cで4時間インキュベートした。A549細胞およびH358細胞を、それぞれ8 × 105 cells/mLおよび4 × 105 cells/mLの密度で無血清RPMI-1640培地で再懸濁した。細胞懸濁液200 µLを上部チャンバーに加え、インサート1個あたり1.6 × 105個のA549細胞または8 × 104個のH358細胞とした。下部チャンバーには、化学誘引物質として20%胎児牛血清を含むRPMI-1640培地500 µLを満たした。5% CO₂を含む加湿雰囲気下、37 °Cで48時間インキュベートした後、膜の上面に残った非浸潤細胞を綿棒で優しく除去した。膜を浸潤した細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、室温で0.1%クリスタルバイオレットを用いて20分間染色した。各インサートにつきランダムに選択した5つの顕微鏡視野を撮影し、浸潤細胞数をImageJを用いて定量化した。5つの視野の平均細胞数を各インサートの1つの値とし、個々の顕微鏡視野ではなくインサートを実験単位として扱った。独立した生物学的実験を3回実施した。
注：メンブレンを損傷させたり、下層に遊走した細胞を剥がしたりしないよう、非浸潤細胞を慎重かつ均一に取り除いてください。
統計解析
特に指定がない限り、データは平均値 ± SD で示し、n は独立した生物学的実験回数を表します。テクニカルレプリケートまたは同一実験単位からの複数の顕微鏡視野は、推論統計検定の前に平均化しました。3つの細胞株の比較には、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、続いて Tukey の補正によるペア比較を行いました。CCK-8 および創傷閉鎖のタイムコースでは、二元配置反復測定分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）を用いて、処理、時間、および処理×時間の相互作用による影響を評価し、続いて個々の時点において Šídák の補正による比較を行いました。2群間の比較は、両側非ペア Student の t-tests を用いて分析しました。統計解析およびデータの視覚化は、統計解析およびグラフ作成ソフトを用いて行いました。正確な p 値は、図パネルまたはソースデータテーブルに記載しています。統計的有意性は p < 0.05 と定義しました。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。
結果
TCGA/starBase解析によりLUADにおけるmiR-486-3pの発現量減少が示され、TargetScanにより候補結合部位が同定された
starBase v3.0を通じてアクセスしたTCGA由来の発現データにより、miR-486-3pの存在量は、20例の非腫瘍肺サンプルよりも512例の肺腺癌（LUAD）サンプルにおいて有意に低いことが示された（Wilcoxon順位和検定、p = 3.2 × 10⁻5; Figure 1）。TargetScanHumanにより、DVL1の3′非翻訳領域（3′ UTR）の468–474番目の位置に、保存性の低いmiR-486-3pの候補7mer-m8サイトが同定され、context++スコアは−0.23、context++スコアパーセンタイルは80であった。また、WNT5Bの3′ UTRの913–920番目の位置に、保存性の低い候補8merサイトが同定され、context++スコアは−0.46、context++スコアパーセンタイルは97であった（Figure 2）。これらの計算により予測されたサイトは、実験的仮説を立てるために使用されたものであり、miRNAとターゲットの直接的な結合の根拠と見なされたわけではない。ソースURLはTable 2に記載されている。
LUAD細胞株においてmiR-486-3pの発現量は減少しており、レンチウイルスによる導入後に著しく増加した
それぞれの通常の培養条件下において、RT-qPCR分析の結果、miR-486-3pの発現量は、Beas-2b気管支上皮細胞よりもA549細胞およびH358細胞で低いことが示された。一元配置分散分析後のTukey調整済み比較により、A549細胞とBeas-2b細胞の間（p < 0.01）、およびH358細胞とBeas-2b細胞の間（p < 0.01; 図 3A）に有意な差が認められた。
LV-miR-486-3pによる安定的な導入により、対応するLV-NC群と比較してmiR-486-3pの存在量が著しく増加した。発現量は、A549細胞で約1,470倍、H358細胞で約20倍に増加し、いずれの比較においても統計的有意差が認められた（p < 0.01; Figure 3B,C）。これらの結果から、miR-486-3pを安定的に過剰発現させた細胞モデルの構築に成功したことが確認された。
miR-486-3pの強制発現は、WNT5B、DVL1、β-catenin、およびBCL-2の発現低下と関連している
ウェスタンブロッティングの結果、LV-miR-486-3pを導入した細胞では、それぞれのLV-NCコントロールと比較して、WNT5B、DVL1、total β-catenin、およびBCL-2のタンパク質発現量が低下していることが示された（Figure 4A–E）。A549細胞において、miR-486-3pの強制発現は、β-catenin (p = 0.02)、WNT5B (p = 0.008)、DVL1 (p = 0.019)、およびBCL-2 (p = 0.017) のタンパク質発現量の減少と相関していた。同様の減少がH358細胞においても、β-catenin (p = 0.01)、WNT5B (p = 0.002)、DVL1 (p = 0.03)、およびBCL-2 (p = 0.018) で観察された。
その後、タンパク質レベルでの所見に伴い転写産物レベルの変化が生じているかを確認するため、RT-qPCRを実施した（図 4F–I）。A549細胞において、miR-486-3pを強制発現させたところ、LV-NC群と比較して、CTNNB1 mRNAは0.226倍（p = 0.004）、WNT5B mRNAは0.180倍（p = 0.04）、DVL1 mRNAは0.278倍（p = 0.06）、およびBCL2 mRNAは0.259倍（p = 0.03）に減少した。
H358細胞においても、同様の転写レベルの変化が検出されました。LV-NC群と比較して、CTNNB1 mRNAは0.28倍に（p = 0.028）、WNT5B mRNAは0.250倍に（p = 0.019）、DVL1 mRNAは0.271倍に（p = 0.020）、そしてBCL2 mRNAは0.534倍に（p = 0.03）減少しました。したがって、転写レベルの変化の方向性は、両方の細胞株における対応するタンパク質レベルの知見と一致していました。これらの結果は、協調的な発現変化を示していますが、直接的な標的設定や、線形なWNT5B/DVL1/β-cateninシグナル伝達メカニズムの活性を立証するものではありません。
miR-486-3pの強制発現により、増殖に関連するCCK-8シグナルが低下する
CCK-8測定値は、各実験群の0時間値で正規化されました。正規化されたCCK-8シグナルは、LV-NC導入細胞およびLV-miR-486-3p導入細胞の両方で時間とともに増加しましたが、miR-486-3pを強制発現させた後では、概して低い値が観察されました（図 5）。
A549細胞において、二元配置反復測定分散分析後のŠídák補正による比較では、LV-miR-486-3p群のCCK-8シグナルは、LV-NC群と比較して24、48、および96 hで有意に低く（p < 0.05）、一方で72 hにおける差は統計的に有意ではありませんでした（Figure 5A）。H358細胞では、LV-miR-486-3p群のCCK-8シグナルは、24、48、72、および96 hで有意に低くなっていました（p < 0.05; Figure 5B）。これらの結果は、miR-486-3pの強制発現が成長に関連する代謝活性を低下させたことを示しており、その効果はH358のタイムコースにおいてより一貫していました。
miR-486-3pの強制発現によりコロニー形成能が低下する
長期的なクローン形成能を評価するために、コロニー形成アッセイを実施した。LV-miR-486-3pを導入したA549細胞は、対応するLV-NC細胞に比べてコロニー形成数が有意に少なかった（p = 0.013; Figure 6A）。また、H358細胞においてもコロニー数の有意な減少が観察された（p = 0.06; Figure 6B）。この減少はA549細胞よりもH358細胞においてより顕著であり、2つのLUADモデル間でクローン形成能への影響の大きさが異なることが示された。
miR-486-3pの強制発現により創傷閉鎖が抑制される
傷の閉鎖率は、スクラッチ後24時間、48時間、および72時間で定量化した（図 7）。A549培養において、LV-miR-486-3p群は、24時間、48時間、および72時間のいずれにおいても、LV-NC群より有意に低い傷の閉鎖率を示した（各比較においてp < 0.05；図 7A,C）。
同様に、LV-miR-486-3pを導入したH358培養細胞において、24時間および48時間（p < 0.05）、ならびに72時間（p < 0.01；Figure 7B,D）で創傷閉鎖が抑制されました。このアッセイは薬理学的な増殖抑制剤を用いずに実施したため、これらの結果は、排他的に遊走特異的な効果による証拠としてではなく、創傷閉鎖の抑制として解釈されました。
miR-486-3pの強制発現により、Matrigelコート膜の透過能が低下する
48時間後、細胞がMatrigelコートTranswell膜を通過する能力を評価した。A549 LV-miR-486-3p群では、A549 LV-NC群と比較して、下層膜表面で検出されたクリスタルバイオレット染色細胞数が有意に少なかった（p = 0.01; Figure 8A）。H358細胞においても同様の減少が観察された（p = 0.07; Figure 8B）。
各インサートについて5つの顕微鏡視野を平均し、インサートを実験単位として扱いました。これらの結果は、本アッセイで用いた条件下において、miR-486-3pを強制発現させることで、Matrigelでコーティングされたメンブレンを通過する細胞が減少したことを示しています。
データの可用性：
図の根拠となるすべてのソースデータは、以下に含まれています。 補足ファイル 1データベースのソースファイル、RT-qPCRデータ、トリミング前のウェスタンブロット、デンシトメトリー値、顕微鏡画像、計数記録、CCK-8測定値、および統計解析ファイルを含む。
図1TCGA/starBaseにおけるLUADおよび正常肺サンプルのmiR-486-3p発現量。 TCGA由来の発現データは、2026年5月にstarBase v3.0を通じて取得され、512例の肺腺癌（LUAD）サンプルと20例の正常肺サンプルが含まれていた。群間比較にはウィルコクソン順位和検定を用いた（p = 3.2 × 10⁻5). LUAD、肺腺癌。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2TargetScanにより予測された、〜におけるmiR-486-3p結合候補部位 DVL1 および WNT5B 3′非翻訳領域（3′ UTR）。 TargetScanHumanにより、468–474番目の位置に7mer-m8候補部位が同定された。 DVL1 3′非翻訳領域（3′ UTR）および、その913–920番目の位置にある候補8mer部位 WNT5B 3′ UTR。ソースURLは以下に提供されています。 表 2これらの計算による予測は、仮説生成に用いられたものであり、直接結合の実験的根拠を構成するものではない。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3miR-486-3pの基底レベルの存在量およびレンチウイルスによる過剰発現の検証。 (A) 〜のRT-qPCR解析 miR-486-3p それぞれのルーチン培養培地で維持されたA549、H358、およびBeas-2b細胞における含有量。B,C) ～のRT-qPCRによる検証 miR-486-3p A549における過剰発現（B) および H358 (CLV-NCまたはLV-miR-486-3pを導入した細胞。発現量はU6で標準化した。データは3回の独立した生物学的実験の平均値±標準偏差（SD）として示す。A)は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、続いてTukey法による多重比較検定を用いて解析した。(B,C）は、両側非対応Studentのt検定を用いて解析した。 t-試験。*p < 0.01; **p < 0.01。LV-NC：陰性対照レンチウイルス；RT-qPCR：逆転写定量PCR；SD：標準偏差。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4miR-486-3pの強制発現は、候補遺伝子の発現低下に関連している。 (A) LV-NCまたはLV-miR-486-3pを導入したA549細胞およびH358細胞における、β-catenin、WNT5B、DVL1、BCL-2、およびβ-actinの発現量を示す代表的なウェスタンブロット図。分子量はキロダルトンで示している。(B–E) β-カテニンのデンシトメトリー定量化（B）、WNT5B（C)、DVL1（D）、およびBCL-2（E)、β-アクチンで標準化した。 (F–I) のRT-qPCR解析 CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H）、および BCL2 (I転写産物量（～で正規化済み） GAPDHデータは3回の独立した生物学的実験の平均値 ± 標準偏差（SD）として示されており、各点は独立した生物学的反復試行を表している。群間の比較には、両側t検定（unpaired Student’s t-test）を用いた。 t-試験。正確な pp値およびフォールドチェンジは対応するパネルに示されている。kDa：キロダルトン、LV-NC：ネガティブコントロールレンチウイルス、RT-qPCR：逆転写定量PCR、SD：標準偏差。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5miR-486-3pの強制発現により、増殖に関連するCCK-8シグナルが経時的に減少する。 A549（A) および H358 (BLV-NCまたはLV-miR-486-3pを導入した細胞を、0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間で解析した。OD450値は、各群の対応する0時間の値で正規化した。データは、3回の独立した生物学的実験の平均値±標準偏差（SD）として示した。処置、時間、および処置と時間の相互作用による影響を二元配置反復測定分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）を用いて解析し、その後、各時点における群間比較をŠídák法で補正して行った。*p < 0.05. CCK-8, セルカウンティングキット-8; LV-NC, ネガティブコントロールレンチウイルス; OD450, 450 nmにおける吸光度; SD, 標準偏差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6miR-486-3pの強制発現により、コロニー形成能が低下する。 A549（A)およびH358(BLV-NCまたはLV-miR-486-3pを導入した細胞。コロニー数は、全グループで同一の解析設定を用いてImageJで定量した。データは3回の独立した生物学的実験の平均値±標準偏差（SD）として示し、両側t検定（unpaired Student’s t-test）を用いて解析した。 t-試験。正確な pp値は対応するパネルに記載されている。LV-NC：陰性対照レンチウイルス、SD：標準偏差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7miR-486-3pの強制発現は創傷閉鎖を抑制する。 A549（A,C) および H358 (B,D）スクラッチ後0時間、24時間、48時間、および72時間の細胞。創傷閉鎖率は次のように算出した：(0時間の創傷面積 － 指定した時点の創傷面積) / 0時間の創傷面積 × 10%。データは、3回の独立した生物学的実験から得られた平均値 ± 標準偏差（SD）として示した。処置、時間、および処置と時間の相互作用による影響を二元配置反復測定分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）を用いて解析し、次いで各時点における群間比較にŠídák補正を用いた。スケールバーは、 200 µm. *p < 0.05; **p < 0.01. LV-NC：陰性対照レンチウイルス；SD：標準偏差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 8miR-486-3pの強制発現により、MatrigelコーティングTranswellメンブレンの通過能が低下する。 A549（において、代表的なクリスタルバイオレット染色顕微鏡視野および定量的なインサートレベルの細胞数が示されている。A)およびH358（BLV-NCまたはLV-miR-486-3pを導入した細胞。8-μmの孔径を持つトランスウェルインサートを用いてµm 孔径を使用した。各インサートについて5つの顕微鏡視野を平均し、各インサートを1つの実験単位として扱った。データは3回の独立した生物学的実験から得られた平均値±標準偏差（SD）として示し、両側非対応Studentのt検定を用いて解析した。 t-試験。スケールバー、 200 µm正確な p-値は対応するパネルに記載されている。LV-NC：ネガティブコントロールレンチウイルス、SD：標準偏差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | プライマー配列 | アンプリコン長 | 増幅効率 | |
| WNT5B | Forward: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 18 bp | 101% | |
| Reverse: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Forward: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95.60% | |
| Reverse: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Forward: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 bp | 96.30% | |
| Reverse: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Forward: 5'- GTCATGTGTGGAGCGT-3', | 139 bp | 97.20% | |
| Reverse: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Forward: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98.30% | |
| Reverse: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
表1：～に使用したプライマー配列 RT-qPCR（逆転写定量PCR）.
| ターゲット | 予測情報 | ソース | ||
| DVL1 | 7mer-m8、468–474番目のポジション | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST0397196.2&taxid=9606&構成要素=miR-486-3p&CNC表示=1& 表示されたc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&サブセット=1) | ||
| WNT5B | 8量体、ポジション913–920 | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST0037891.5&taxid=9606&構成要素=miR-486-3p&CNC表示=1& 表示済みnc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
表2：TargetScanデータベースおよび対応するURL.
補足ファイル 1：本研究の結果を裏付けるデータ。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
ディスカッション
本機能獲得研究では、A549およびH358肺腺癌（LUAD）細胞におけるmiR-486-3pの安定的な強制発現の影響を評価しました。両方のモデルにおいて、miR-486-3pの過剰発現は、増殖に関連するCCK-8シグナルの減少、コロニー形成能の低下、創傷治癒能の低下、およびMatrigelコーティングしたTranswell膜を通過する細胞数の減少と相関していました。これらの表現型の変化は、WNT5B、DVL1、総β-catenin、およびBCL-2タンパク質量の減少とともに、WNT5B、DVL1、CTNNB1、およびBCL2の転写レベルの低下を伴っていました。総合すると、これらの知見は、miR-486-3pの強制発現、複数の悪性細胞表現型の減弱、および選択されたWnt関連分子の協調的な変化との間の関連性を支持しています。しかし、これらはmiRNAと標的の直接的な結合、パスウェイの活性、または因果関係のあるシグナル伝達配列を立証するものではありません。
本研究で観察された全般的な腫瘍抑制表現型は、先行報告と一致しており、これを主要な新規発見として解釈すべきではありません。Tomiokaらは、miR-486-3pとmiR-486-5pの両方がLUAD細胞における悪性表現型を抑制することを previouslyに実証し、非偏向的なターゲットスクリーニング戦略を通じてGINS4を同定しています26。本研究の貢献はより具体的であり、2つのLUAD細胞モデルにおいて、miR-486-3pの強制発現に伴いWNT5B、DVL1、およびβ-cateninの発現量が減少することを明らかにしました。さらに、本研究では、安定的なレンチウイルス導入、RT-qPCR、ウェスタンブロッティング、CCK-8解析、コロニー形成能試験、創傷治癒アッセイ（wound closure）、およびMatrigelコートTranswellアッセイを組み合わせた統合的な実験ワークフローを提示しています。この区別は重要です。なぜなら、本研究はLUADにおけるmiR-486-3pの抗腫瘍活性を初めて実証したと主張するのではなく、その過剰発現に関連する分子レベルの観察結果を拡張したものであるためです。
Wntに関連する知見については、慎重な解釈が必要です。WNT5Bは一般に非正規Wntリガンドとして記述されており、受容体やコンテキストに依存した方法で、平面細胞極性（planar-cell-polarity）またはWnt/Ca2⁺シグナリングを活性化させる可能性があります。一部の細胞環境において、非正規Wntシグナリングはβ-catenin依存性シグナリングを拮抗させる場合もあります10,11。DVL1は、正規および非正規の両方のWntシグナリングに関与し得る共通の細胞内メディエーターであり、非小細胞肺癌におけるβ-catenin関連の表現型との関連が報告されています12。したがって、WNT5B、DVL1、および総β-cateninが同時に減少していることは、線形なWNT5B→DVL1→β-catenin経路を証明するものではありません。むしろ本データは、miR-486-3pの強制発現後、WNT5Bの発現およびDVL1とβ-cateninの量的な減少が同時に起こったことを示しています。
転写産物レベルの結果は、ウェスタンブロットの所見と方向性において一致していました。miR-486-3pの強制発現により、A549細胞およびH358細胞の両方において、WNT5B、DVL1、およびCTNNB1の転写産物量（abundance）が減少しました。この一致は、観察されたタンパク質の変化が、単にタンパク質の安定性の変化によるものではなく、転写産物量の変化を伴っている可能性を示唆しています。しかしながら、転写産物およびタンパク質レベルの減少だけでは、miR-486-3pが予測される3′非翻訳領域（untranslated regions）に直接結合していることを証明したことにはなりません。WNT5BまたはDVL1がmiR-486-3pによって直接制御されているかを判断するには、野生型および変異型結合部位を用いたデュアルルシフェラーゼ・レポーターアッセイおよびレスキュー実験が必要となります。同様に、BCL-2量の減少は生存関連タンパク質の変化を示していますが、検証済みの細胞死アッセイがない限り、これをアポトーシスの増加の証拠として解釈することはできません。
機能的アッセイには、それぞれに特有の制限もあります。CCK-8は細胞数を直接的に決定するのではなく、細胞の代謝活性を測定するため、吸光度の変化は増殖、代謝、または生存率の変動を反映している可能性があります。コロニー形成法は、クローノゲン能の長期的な指標となりますが、その効果の大きさは2つの細胞株間で異なり、A549細胞では緩やかな減少が見られたのに対し、H358細胞ではより大きな減少が認められました。この差は、miR-486-3pの強制発現に対する応答が、分子および細胞のコンテキストに依存している可能性を示唆しています。
両方の細胞株において創傷閉鎖の遅延が観察されましたが、アッセイ中に増殖抑制剤は使用していませんでした。miR-486-3pの強制発現が増殖に関連する測定値にも影響を与えたため、増殖の低下が創傷閉鎖の表現型に寄与していた可能性があります。したがって、これらの結果は遊走特異的な効果ではなく、創傷閉鎖の低下として解釈されるべきです。同様に、48時間のMatrigelコーティングTranswellアッセイは、膜の通過、増殖、生存、または接着の差に影響されている可能性があります。その結果、下層膜表面の細胞数の減少が観察されたことは、試験条件下での通過能の低下を裏付けるものですが、特定の浸潤メカニズムを単独で特定するものではありません。
さらなる検討事項として、miR-486-3pの過剰発現量がある。レンチウイルスによる導入により、miR-486-3pの発現量は、対応する対照群と比較してA549細胞で約1,470倍、H358細胞で220倍に増加した。このような超生理的な発現は、シード配列依存的なオフターゲット抑制を増大させたり、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）の構成成分の利用可能性に影響を及ぼしたり、あるいは非特異的な細胞ストレスを誘導したりする可能性がある。用量反応系列の検討が行われていないため、miR-486-3pの発現量と観察された表現型との関係を定義することはできなかった。さらに、インヒビターを用いた機能喪失（loss-of-function）実験が行われていないため、LUAD細胞におけるmiR-486-3pの内因的な生理的役割に関する結論を出すことはできない。したがって、本結果は、安定的な強制過剰発現による結果として具体的に解釈されるべきである。
いくつかの制限事項を考慮する必要があります。KRAS変異LUAD細胞株は2種類のみが検討されており、また、異なる常用培地を使用しているため、Beas-2b細胞との比較結果の解釈には制限があります。本研究では細胞株の認証およびマイコプラズマ検査が実施されておらず、miR-486-3pの定量においてU6のみを参照として使用しました。また、機能喪失試験、用量反応試験、レポーターアッセイ、レスキュー試験、およびWnt経路の機能解析アッセイが行われていません。さらに、創傷治癒アッセイおよびTranswellアッセイの結果は、増殖能、生存率、または接着性の違いによる影響を受けている可能性があります。最後に、動物モデル、患者検体、または臨床検証コホートは含まれていません。したがって、これらの知見は、この強制発現によるin vitroシステムに限定されており、直接的な標的化、経路の因果関係、または臨床的有用性を立証するものではありません。
結論として、miR-486-3pの安定的な強制発現は、A549およびH358 LUAD細胞における成長および運動性に関連するいくつかの測定値を減少させ、それに伴いWNT5B、DVL1、総β-catenin、およびBCL-2の発現低下が認められました。これらの知見は、さらなるメカニズム研究の基礎となるものですが、WNT5BやDVL1が直接的な標的であることや、線形のWNT5B/DVL1/β-catenin経路であること、あるいはmiR-486-3pの臨床的価値を確定させるものではありません。
開示事項
著者らに申告すべき利益相反はありません。
謝辞
本研究は、浙江省医療衛生科学技術計画（2025KY349）および嘉興市重点支援学部（2023-zc-014）による資金提供を受けて実施されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | SDS-PAGEスタッキングゲルの調製 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | SDS-PAGE分離ゲルの調製 |
| 20× TBS緩衝液 | Solarbio | 71080 | ウェスタンブロットの洗浄および抗体希釈用ストックバッファー |
| 30% アクリルアミド/ビス-アクリルアミド溶液 (29:1) | Solarbio | A1010 | SDS-PAGEゲルの作製 |
| 4%パラホルムアルデヒド固定液 | Servicebio | G1101 | コロニー形成能およびトランスウェルアッセイのための固定 |
| 5× タンパク質ローディングバッファー | Beyotime | P0015 | SDS-PAGEのためのタンパク質試料調製 |
| 過硫酸アンモニウム | Solarbio | 427A038 | SDS-PAGEゲルの重合開始剤 |
| BCAタンパク質定量キット | Beyotime | P0009-1 | タンパク質濃度の測定 |
| BCL-2抗体 | Boster Biological Technology | A00040-2 | ウサギポリクローナル抗体；ウェスタンブロッティングにて1:5,000で希釈 |
| セルカウンティングキット-8 (CCK-8) | 標的分子 | C0005 | 細胞増殖に関連する代謝活性測定法; 10 μ100あたりのL μL培養基 |
| 化学発光イメージングシステム | Bio-Rad | ChemiDoc MP | ウェスタンブロットイメージング |
| クロロホルム | Servicebio | G3005 | TRIzolを用いたRNA抽出における相分離 |
| クリスタルバイオレット染色液 | Servicebio | G1014 | コロニーおよびトランスウェルメンブレンの染色 |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Beas-2b細胞用の日常的な培地 |
| DVL1抗体 | Signalway抗体 | 53180 | ウサギ一次抗体。ウェスタンブロッティングでの希釈倍率は1:5,000。 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Biosharp | BL203B | 通常細胞培養用に10% (v/v) 添加；Transwell下層チャンバーには20% (v/v) 添加 |
| GraphPad Prism 8 | GraphPadソフトウェア | バージョン 8 | グラフの作成および統計解析 |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | SYBR Greenを用いた定量PCR |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | mRNA RT-qPCRのための逆転写 |
| IBM SPSS Statistics | IBM | バージョン 22.0 | 統計解析 |
| ImageJ | アメリカ国立衛生研究所 | バージョン 1.53 | ウェスタンブロットのデンシトメトリー、創傷領域の測定、コロニー数のカウント、およびトランスウェルを用いた細胞カウント |
| 倒立顕微鏡 | Olympus | CKX53 | 創傷治癒能イメージングおよびTranswellアッセイ |
| イソプロパノール | Servicebio | G3006 | TRIzolを用いた抽出におけるRNA沈殿 |
| LV-miR-486-3pおよびLV-NCレンチウイルス調製物 | GenePharma | カスタム合成 | 安定的なmiR-486-3p過剰発現ベクターおよびスクランブル陰性コントロールベクター |
| Matrigel基底膜マトリックス | Corning | 354234 | 無血清DMEMで1:8に希釈し、最終タンパク質濃度を約1 mg/mLとする |
| メタノール | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | PVDFメンブレンの活性化 |
| マイクロプレートリーダー | BioTek | ELx800 | 450 nmにおける吸光度の測定 |
| マイクロボリュームUV-Vis分光光度計 | Allsheng | Nano-600 | RNA濃度およびA260/A280純度の評価 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 日常的な細胞培養用の1% (v/v) 添加剤 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Servicebio | G0002 | 細胞および膜の洗浄 |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | APExBIO | K1007 | RIPA溶解バッファーに添加した |
| タンパク質ラダー | Biosharp | BL712A | ウェスタンブロッティング用分子量マーカー |
| PVDFメンブレン | Millipore | K2MA8350E | ウェスタンブロッティング用タンパク質転写膜 |
| QuantStudio 5 リアルタイムPCRシステム | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | RT-qPCRデータの取得 |
| RIPA溶解バッファー | Beyotime | P0013B | 全細胞タンパク質の抽出 |
| RNA抽出試薬（TRIzolタイプ） | Servicebio | G3013 | 全RNA抽出 |
| RPMI 1640培地 | Servicebio | G4510 | A549細胞およびH358細胞の常用培地および無血清Transwell細胞懸濁液 |
| SDS | Solarbio | S8010 | SDS-PAGE試薬 |
| 脱脂粉乳 | BD | 2271470 | ウェスタンブロッティング用5%ブロッキング溶液 |
| StarBase v3.0 | 中山大学 | ENCORE (Enhanced NMR Constraints for Protein-RNA complexes) ENCOREは、タンパク質-RNA複合体の構造決定を目的としたNMR制約の算出および最適化のためのウェブベースのツールです。 ENCOREの概要 ENCOREは、NMRデータの解析を効率化し、タンパク質-RNA複合体の高精度な3次元構造モデルを構築するために設計されました。本ツールは、実験的に得られたNMR制約を処理し、構造計算における制約の重み付けを最適化することで、より信頼性の高い構造解析を可能にします。 主な機能 ・NMR制約の統合：NOE（核オーバーハウザー効果）やJ結合定数などの多様なNMRデータを統合して処理します。 ・制約の最適化：構造計算の過程で、実験データとモデル構造間の不一致を最小限に抑えるための重み付け最適化を行います。 ・構造精査：得られた構造モデルが、提供されたNMR制約をどの程度充足しているかを定量的に評価します。 ・ユーザーフレンドリーなインターフェース：専門的な計算リソースへのアクセスを簡略化し、ウェブブラウザ経由で解析を実行できます。 利用方法 1. データのアップロード：実験的に得られたNMR制約ファイルおよび初期構造モデルをアップロードします。 2. パラメータ設定：解析に必要な計算パラメータ（反復回数、カットオフ値など）を設定します。 3. 計算の実行：ENCOREサーバー上で制約の最適化および構造計算を実行します。 4. 結果のダウンロード：最適化された制約セットおよび最終的な構造アンサンブルをダウンロードし、解析します。 ENCOREを利用することで、複雑なタンパク質-RNA相互作用の構造的基盤をより迅速かつ正確に明らかにすることができ、分子生物学および生物物理学的な知見の深化に寄与します。 | TCGA由来のmiR-486-3p発現解析 |
| TargetScanHuman | ホワイトヘッド生物医学研究所 | https://www.targetscan.org/vert_80/ | 候補となるmiR-486-3p結合部位の予測 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | SDS-PAGEゲルの重合触媒 |
| Transwellインサート、24ウェル、8μm μm ポアサイズ | Corning | 3428 | Matrigelコーティング膜透過アッセイ |
| トリプシン | Servicebio | G4000 | 細胞の剥離 |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | ウェスタンブロット洗浄バッファーの調製 |
| 垂直電気泳動システム | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | SDS-PAGEによるタンパク質分離 |
| ウェスタンブロット用HRP基質ルミノール試薬 | Affinity Biosciences | KF001 | 化学発光ウェスタンブロット検出 |
| ウェット転写システム | Bio-Rad | 1703930 | PVDF膜へのタンパク質転写 |
| WNT5B抗体 | Signalway抗体 | 56808 | ウサギ一次抗体；ウェスタンブロッティング、1:5,000で希釈 |
| β$\alpha$-アクチン抗体 | Abcam | ab8227 | ローディングコントロール；ウェスタンブロッティングにおいて1:5,000で希釈 |
| β$\beta$-カテニン抗体 | Signalway 抗体 | 21725 | ウサギ一次抗体；ウェスタンブロッティング（希釈倍率1:5,000） |
参考文献
- Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
- Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
- Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
- Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
- She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
- Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
- Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
- Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
- Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
- Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
- Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
- Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
- Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
- Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
- Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
- Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
- Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
- Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
- Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
- Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
- Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
- Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
- Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
- Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
- Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
- Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.