マウス骨格筋由来の機能的ミトコンドリアの分離、精製、および特徴解析

Summary

トリプシン消化と差別遠心分離を組み合わせた標準化されたプロトコルが、マウス骨格筋からのミトコンドリアの分離、精製、機能的特徴付けおよびミトコンドリア移植への応用評価のために確立されました。

Abstract

ミトコンドリアは、真核細胞におけるエネルギー代謝、シグナル伝達、細胞恒常性を調節する重要な小器官です。ミトコンドリア機能障害は多くの疾患の病因に寄与し、再生治療戦略としてのミトコンドリア移植の開発を促進しています。ミトコンドリア移植の成功は、高度に精製され機能的に完全なミトコンドリアの利用可能性に依存しています。骨格筋は、その高いミトコンドリア含有量、代謝活動、アクセスのしやすさから、適切なドナー供給源です。この研究では、マウス骨格筋から機能的ミトコンドリアの分離、精製、特徴付けのための標準化かつ再現性のあるプロトコルを確立し、ミトコンドリア移植における利用を評価しました。手術は主に2つの段階で構成されていました。まず、トリプシン消化と差分遠心分離を用いてC57BL/6マウスの骨格筋からミトコンドリアを単離しました。次に、単離ミトコンドリアを特性評価し、純度、超微細構造、機能活性を評価しました。ミトコンドリア純度はビシンコニン酸(BCA)タンパク質定量およびウェスタンブロット解析で評価されました。超微構造の完全性は透過電子顕微鏡で検証されました。機能活性はJC-1およびミトコンドリア蛍光標識を用いて評価し、高分解能呼吸計システムを用いて酸素消費量、ATP産生能力、呼吸制御比の測定を行いました。分離されたミトコンドリアは膜電位の保存、完全な超微細構造、安定した呼吸活動を示し、下流の機能研究やミトコンドリア移植の応用に適していることを示しました。

Introduction

ミトコンドリアはアデノシン三リン酸(ATP)産生の主要な部位であり、アポトーシス、カルシウム恒常性、活性酸素種(ROS)の代謝において中心的な役割を果たします。したがって、ミトコンドリアの機能的完全性は細胞の恒常性を維持し、細胞の運命を決定する上で極めて重要です^1,2。ミトコンドリア機能障害、特にミトコンドリアDNA(mtDNA)変異や電子伝達連鎖(ETC)異常は、エネルギー代謝障害、酸化ストレス、アポトーシスの調節障害を引き起こします^3,4。これらの異常は、遺伝性ミトコンドリア障害、神経変性疾患、心血管疾患など幅広い疾患に関連しています^5,6。抗酸化物質や代謝補因子などの従来のミトコンドリア機能障害治療法は、ミトコンド^{リア機能を直接}回復させることなく症状を緩和するため、一般的に限定的な効果しかありません ^7,8。その結果、ミトコンドリア移植は再生医療における有望な治療アプローチとして浮上しています。この戦略は、損傷または機能不全の細胞に完全な外因性ミトコンドリアを送達し、ミトコンドリアの活動と細胞エネルギー代謝を回復させることを含みます^9,10。過去の研究では、外因性ミトコンドリアが受容細胞に内部化され、内因性ミトコンドリアネットワークに組み込まれることで、生体エネルギー機能の向上と細胞生存率の向上が図られていることが示されています11,12,13。

骨格筋は、その高いミトコンドリア含有量、代謝活性、アクセス性の高さから、ミトコンドリア分離に適したドナーと考えられています14,15,16。ミトコンドリア移植には、ミトコンドリアの分離、精製、機能的特徴付け、そして受容者細胞への効率的な投与など、いくつかの重要なステップが必要です。しかし、特に組織均質化、酵素消化、温度制御、精製に関わる手法において、これまで報告されているプロトコルには依然として大きな方法論的ばらつきが残っています。このような変動はミトコンドリアの収率、純度、機能的完全性に影響を与え、実験的再現性を制限します。

方法論的一貫性と再現性を向上させるため、本研究はトリプシン消化と差異遠心分離を用いてマウス骨格筋から機能的ミトコンドリアを分離・特徴づける標準化されたプロトコルを提示します。分離されたミトコンドリアは、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質定量、ウェスタンブロッティング、透過電子顕微鏡、蛍光膜電位測定法、高分解能呼吸法を用いて純度、超微細構造の完全性、機能活性を評価しました。さらに、単離されたミトコンドリアの受容細胞による取り込みの量を評価し、ミトコンドリア移植への適合性を評価しました。このプロトコルは、下流の実験研究のために機能的な骨格筋由来ミトコンドリアを得るための再現可能なワークフローを提供します。

Protocol

すべての動物実験は特定の病原体フリー(SPF)施設で実施され、空軍医科大学第三付属病院の動物倫理・利用委員会(承認番号:IACUC-2024kq-065)によって承認されました。

オスのC57BL/6マウス(生後6〜8週、18〜20g)は空軍医科大学実験動物センターから購入されました(製造許可:SCXK(陝西)2024-002)。マウスは個別換気ケージ(IVC)に収容され、陽圧かつ清潔な環境で、温度は20〜26°C、相対湿度は40%〜70%、12時間の明暗サイクル、1時間に少なくとも15回の換気が行われました。滅菌された食事、飲料水、環境改善が提供されました。

プロトコルで使用される試薬、化学物質、実験機器は 材料表に記載されています。

1. 動物の生贄と組織採取

1. マウスを密閉された安楽死チャンバーに入れ、2酸化炭素(CO₂)を徐々に吸入し、チャンバーの容積を毎分30%から70%で吸入します。
2. 自発呼吸と心拍の停止、瞳孔反射の喪失、機械的刺激に対する反応なしによる死亡を確認しましょう。
3. 安楽死したC57BL/6マウスを75%エタノールに5分間浸して消毒します。
   注意:アルコールによる組織固定や細胞損傷を防ぐために、浸漬時間を10分に制限してください。プロトコル全体を通して新しい組織を使用し、凍結はミトコンドリアの生存率や機能的完全性を損なうからです。
4. マウスを無菌のペトリ皿に入れ、腹部を上向きにして腹部と後肢の部分を完全に露出させます。
5. 鉗子を使って下腹部の皮膚を性器近くの部分を持ち上げ、小さな切開を入れます。鈍的解剖を行い、皮膚を下の組織から分離してください。切開部を正中線に沿って足首まで上方へ、両後肢に向かって外側に伸ばして後肢の筋肉群を完全に露出させます。
6. 太ももの前側にある大腿四頭筋を特定し、鈍い解剖で筋繊維の方向に沿って慎重に筋肉を分離します。遠位膝蓋靭帯と近位腱を切断し、筋肉組織を完全に隔離します。
   注意:組織を事前に冷却したリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗い、2%ペニシリン-ストレプトマイシンを補足し、洗うたびに新鮮なペトリ皿を使い、汚染を最小限に抑えてください。
7. 分離した筋肉組織をすぐに冷蔵したPBSに入れ、組織表面の毛や血液をよく洗い流します。
8. 滅菌ガーゼで組織の余分な水分を優しく拭き取ってください。組織を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに分け、サンプルの重さを量ります。各サンプルごとに約100mgの組織を使い、調製間の一貫性を保ちます。

2. 組織のミンシングと均質化

1. ステップ1.8の組織を入れたマイクロ遠心分離機チューブを氷の上に置きます。組織を約1〜2 mm³インチの小さな破片に無菌ハサミで刻みます。
2. 事前に冷蔵した0.25%トリプシンを8巻加え、組織断片を氷で15分間消化します。
   注意:必要なトリプシン容積は組織質量(1 mg ≈ 1 μL)に基づいて計算してください。例えば、組織80mgに0.25%トリプシン640 μLを加えます。
3. 混合物を1,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清液を捨て、組織ペレットを残します。ペレットを、D-マンニトール(215 mM)、ショ糖(75 mM)、HEPES(20 mM)、EGTA(1 mM)、および脂肪酸を含まない牛血清アルブミン(0.5% w/v)を含む1 mLの予備冷却ミトコンドリア分離バッファーに再懸浮させます。
4. 懸濁液を氷上に保管されたガラスホモジナイザーに移します。組織を10〜12回の優しい上下ストロークで均質化し、懸濁液が濁るまで続けます。
   注意:均質器の底部でガラス棒を横方向に回転させるのは避けてください。過度の機械的力はミトコンドリア膜を損傷し、ミトコンドリア機能を損なう恐れがあります。

3. 差動遠心分離

1. ホモジネートを1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移し、1,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
2. 上清液を新鮮な1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに移し、 12,000 × g で4°Cで5分間遠心分離機で粗ミトコンドリアペレットを得ます。
   注意:1 mLのシリンジで上清液を慎重に採取し、ペレットや残留組織の破片を乱さないようにしてください。

4. ミトコンドリアの精製と貯蔵

1. 粗ミトコンドリアペレットを、スクロース(250 mM)、HEPES(10 mM、pH 7.4)、EGTA(1 mM)、牛血清アルブミン(0.15% w/v)を含む予備冷却済みの洗浄バッファーに優しく再懸浮させます。懸濁液を1,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
2. 上清液を新しい遠心分離機チューブに移し、 12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離機で精製ミトコンドリアペレットを得ます。
   注意:可能な限り、新たに分離したミトコンドリアをすぐに使用してください。4°Cでの短期保存または−80°Cでの長期保存は、ショ糖(0.25 M)、Tris-MOPS(10 mM、pH 7.4)、EGTA(0.1 mM)を含むミトコンドリア貯蔵バッファ内で可能です。しかし、凍結はミトコンドリア酵素活性や呼吸機能を損なう可能性があります。冷凍サンプルは主にタンパク質分析に使用してください。

5. ミトコンドリアおよび細胞質タンパク質抽出およびBCA定量

1. ミトコンドリアタンパク質抽出
   1. 精製済みミトコンドリアペレットを、開始組織100mgあたり50μLのRIPA溶解バッファーに再懸濁し、懸濁液を氷上で15分間培養します。
   2. 約14,000 × g で4°Cで15分間溶除します。 上清液を新鮮な1.5mLのマイクロ遠心分離管に移し、ミトコンドリアタンパク質の分画を得ます。
2. 細胞質タンパク質抽出
   1. ステップ4.2で得られた細胞質上清液を12,000 × gで4°Cで15分間遠心分離します。 上清液は廃棄し、ペレットは濃縮された細胞質分画として保持します。
   2. 細胞質ペレットを50μLのRIPA溶解バッファーに再懸浮させ、 ステップ5.1.1-5.1.2に従ってサンプルを処理します。
      注意:分解バッファーはプロテアーゼ阻害剤で新鮮に準備し、すべての処置は氷上で行い、タンパク質分解を最小限に抑えてください。この工程で使われるミトコンドリアは、生または冷凍のいずれかです。
3. BCAタンパク質定量
   1. 試薬Aと試薬Bを50:1(v/v)の比率で混合してBCA作動溶液を準備します。96ウェルプレートの各ウェルに200μLの作業溶液を加えます。
      注意:使用直前にBCA作動液を準備し、室温で1時間以内に使用してください。
   2. 牛血清アルブミン(BSA)のストック溶液(2 mg/mL)を0.5 mg/mLに希釈し、使用まで氷で保管してください。
   3. 標準曲線を準備するには、20、19、18、16、12、8、4、または0μLのBSA溶液を別々の井戸に加えます。最終的な容量をNaCl溶液で20μLに調整します。
   4. 1つのウェルセットにミトコンドリアタンパク質4 μLとNaCl溶液16 μLを加えます。別のウェルセットに4 μLの細胞質タンパク質と16 μLのNaCl溶液を加えます。
   5. 各ウェルに200μLのBCA作動溶液を加え、37°Cで暗闇で30分間培養します。マイクロプレートリーダーを使って562 nmの吸収を測定します。
   6. 相関係数(R²)が0.999≥のタンパク質標準曲線を構築します。標準曲線から吸収度値を補間してタンパク質濃度(μg/μL)を計算します。

6. 骨格筋由来ミトコンドリアの純度評価

1. ミトコンドリアおよび細胞質タンパク質サンプルを最終濃度1.5 μg/μLに希釈します。30 μgのタンパク質と4つの×負荷バッファーを含む20 μLの反応混合物を準備します。残った量はNaCl溶液で調整します。サンプルを10分間煮沸し、−80°Cで保存して使用します。
2. タンパク質サンプルは4%〜20%勾配のプレキャストゲルで分離します。140〜150Vで50分間電気泳動を行います。
3. メタノール中のPVDF膜(0.22μm)を1分間活性化します。400 mAの急速転送バッファーを用いて30分間タンパク質を移動させます。
4. 移送サンドイッチからPVDF膜を取り出し、TBSTで5分間洗います。5%脱脂乳を室温で1時間、優しく振って膜を塞ぎます。
5. 一次抗体(COX IV、シトクロムc、βアクチン)を抗体希釈バッファーに1:1,000希釈します。膜を一次抗体とともに4°Cで一晩培養します。
6. 膜はTBSTで3回、1回10分洗ってください。
7. 膜を室温で1:10,000希釈した二次抗体で1時間培養します。
8. 膜をTBSTで3回、それぞれ10分ずつ洗います。ブロットを現像し、画像を撮影します。

7. 骨格筋由来ミトコンドリアのミトラッカー染色

1. 使用直前に、染色作業液を予温培地で最終濃度200 nMまで希釈します。
2. ミトコンドリアペレットを作動溶液100μLに再懸浮させ、暗い環境で37°Cで20分間培養します。
3. 培養後、5ボリュームの予備冷却済み貯蔵バッファーを追加します。懸濁液を12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、結合していない染料を含む上澄液を廃棄します。
4. 染色されたミトコンドリア懸濁液のアリコートをガラススライドに移し、サンプルをカバースリップで覆います。
5. 適切な励起および発光設定を用いて、赤色蛍光ミトコンドリア染料検出のためにレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蛍光画像をキャプチャします。

8. JC-1染色を用いたミトコンドリア膜電位の評価

1. CCCP(カルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン)処理基
   1. ミトコンドリア懸濁液を最終濃度10μMのCCCPで処理し、20分間インキュベートしてミトコンドリア膜電位を消散させます。
   2. CCCP処理済みミトコンドリア懸濁液を、37°Cで250μLのJC-1染色液で20分間、穏やかに攪拌しながら培養します。
2. JC-1処理群
   1. ミトコンドリアペレットをJC-1作動液100μLに再懸浮させ、37°Cで光を遮って20分間培養します。
   2. 1× JC-1染色バッファーを5×:6のストック溶液を蒸留水で2:8(v/v)の比率で希釈し、バッファーを氷の上に置いて準備します。
   3. 染色液を取り除き、ミトコンドリアペレットを事前に冷却した1×JC-1染色バッファーで2回洗います。
   4. 染色されたミトコンドリアをPBSで再懸浮させ、レーザー走査型共焦点顕微鏡で画像化します。緑色蛍光JC-1モノマーおよび赤色蛍光JC-1集合体の検出には適切な励起および発光設定を用いてください。

9. 透過電子顕微鏡による孤立骨格筋ミトコンドリアの超微細解析

1. 新たに分離したミトコンドリアを2.5%グルターアルデヒドに0.2 Mリン酸バッファー(pH 7.4)で調製し、4°Cで一晩培養します。
2. 試料を0.1 Mリン酸塩緩衝生塩水(PBS、pH 7.4)で洗浄し、1%四酸化オスミウムに室温で1時間固定します。
3. 試料を段階的なエタノール系列で脱水し、その後浸透、埋め込み、エポキシ樹脂に重合します。
4. ウルトラミクトームを用いて、50〜70nmの厚さで埋め込まれたサンプルを切片します。
5. 区画は酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色します。透過電子顕微鏡で試料を観察し、画像化してください。

10. 骨格筋由来ミトコンドリアの細胞取り込み

1. カルチャーNCTCクローン929(L929;RRID: CVCL_0462)市販業者から取得した、MEMアルファを含む完全培地に胎児用牛血清10%とペニシリン・ストレプトマイシン1%を補足した細胞。
2. 細胞が80%〜90%の合流に達したら、培地を吸引し、事前に温めたPBSで細胞を2回洗浄します。トリプシン-EDTAを加え、細胞が剥離するまでインキュベートします。
3. 完全な培地を加えて消化を終え、優しいピペッティングで単細胞懸濁液を生成します。懸濁液を1,000 gで遠心分離×5分間行い、上澄液を捨てます。
4. 細胞ペレットを新鮮な完全な培地に再懸浮させ、適切な密度で新しい培養皿に種子をまきます。細胞は37°Cで、5%のCO₂を含む加湿大気で培養します。
5. 5番(P5)細胞を35mmのガラス底皿に種子通し、一晩培養します。
6. 分離されたミトコンドリアを、ミトコンドリア特異的な赤色蛍光染料で暗闇で37°Cで20分間標識し、PBSでミトコンドリアを洗浄して未結合染料を除去します。
7. 赤色蛍光色素標識ミトコンドリア(1皿あたり20μgのミトコンドリアタンパク質)を細胞に加え、5%のCO₂を含む加湿大気で37°Cで24時間培養します。
8. 蛍光アクチンプローブで細胞を30分間染色し、アクチン細胞骨格を可視化し、蛍光核染料で核をカウンター染色します。
   注意:共潜伏中は血清濃度を慎重に管理してください。過剰な血清はミトコンドリアの取り込み効率を低下させる恐れがあります。この工程で使われるミトコンドリアは新鮮です。

11. 高分解能呼吸計を用いたミトコンドリア呼吸機能の測定

1. 楽器の準備
   1. 呼吸室、電極区画、栓を清掃してください。
   2. 各チャンバーに磁気攪拌棒を設置し、酸素電極膜の完全性を検証します。
2. 計測器の校正
   1. 各呼吸チャンバーにミトコンドリア呼吸バッファー(MiR05、pH 7.10)を2.1mL追加し、気泡が存在しないことを確認します。
   2. 高分解能呼吸計システムを37°Cで30分間平衡させ、酸素ベースラインの安定化後に毎日の空気校正を行います。
      注意:酸素電極信号に干渉し、データ品質を損なうため、空気の気泡を呼吸室に持ち込むのは避けてください。 この工程で使われるミトコンドリアは新鮮です。
3. 試料負荷と平衡化
   1. 約30μgのタンパク質を含む新たに分離したミトコンドリアを呼吸室に加え、その空間を密封します。
   2. チャンバーを5〜8分間平衡させ、基礎酸素消費量を記録します。
      注意:ミトコンドリアは氷上に置き、分離直後に呼吸測定を行い活動を維持してください。
4. SUITプロトコル
   1. ピルビン酸5μL(2 M)、グルタミン酸10 μL(2 M)、マラー酸10 μL(400 mM)を順次に加えます。反応を5分間安定させ、CI漏れ呼吸を記録します。
   2. 10μLのADP(500 mM)を加えて酸化リン酸化を誘導し、CI OXPHOS呼吸を記録します。塩化マグネシウム10μL(0.3 M)を加えます。
   3. 20μLのスクシネート(1 M)を加え、安定化後にCI+CII OXPHOS呼吸を記録します。
   4. 2μLのATP合成酵素阻害剤(0.01 mM)を加え、プロトン漏れ呼吸を記録します。
   5. CCCP(1 mM)を2分間隔で3回、2 μLずつ段階的に添加し、酸素消費量が一定の停滞に達するまで加えます。最大電子移動系容量を記録してください。
   6. 複合体I活性を抑制するためにロテノン1μL(1 mM)を追加します。
   7. 1 μLの抗マイシンA(5 mM)を追加して複合体III活性を抑制し、残留酸素消費量を記録します。
   8. 5μLアスコルビン酸(800 mM)と5 μL N,n,n',n'-テトラメチル-p-フェニレンジアミン(200 mM)を加えます。安定化後の最大複合IV呼吸活動を記録します。
      注意:冷凍の前にすべての試薬を分割して、繰り返しの凍結解凍サイクルを避けてください。過度のアンカップリングはミトコンドリア呼吸を抑制するため、CCCPを徐々に添加してください。
5. データ分析
   1. データ解析ソフトウェアを用いて、CIリーク、CIオックスフォス、CI+CIIオックスフォス、CI+CIIリーク、CI+CII ET、CII ET、CIVなどのミトコンドリア呼吸パラメータを取得します。
   2. 呼吸制御比(RCR;呼吸状態3/呼吸4)およびATP生成能力。統計分析のために、すべての値は3桁までの有意数値を保持してください。データ解析に使用されたソフトウェアはOroboros Datlab 8(Oroboros Instruments)でした。

Results

ミトコンドリアの分離および精製ワークフローの概略図は 図1に示されています。すべての処置はミトコンドリアの完全性と機能活性を維持するために4°Cで実施されました。新たに分離された骨格筋組織は細切に刻み、トリプシンで消化して組織解離を促進し、その後ガラスホモジナイザーを用いた等張性分離バッファーで均質化しました。その後、ミトコンドリアを組織の残骸や細胞質汚染物質から分離するために差別遠心分離が行われました。1,000 × gでの初期遠心分離では核や大きな破片が除去され、その後の12,000 × gでの遠心分離では粗いミトコンドリアペレットが得られました。追加の洗浄および遠心分離工程により細胞質汚染がさらに減少し、下流の構造および機能解析に適した精製ミトコンドリアが得られました(図1)。

図1:ミトコンドリア分離と精製の概略図。 高純度のミトコンドリアは、制御されたトリプシン消化と差分遠心分離の複合アプローチで分離されました。すべての手技はミトコンドリアの構造的および機能的完全性を維持するために4°Cで実施されました。新たに分離された骨格筋組織は酵素分解、均質化、逐次遠心分離の工程を受け、下流の機能解析および構造解析に適した精製ミトコンドリアを得ました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

分離ミトコンドリアの機能活性はJC-1染色および蛍光ミトコンドリア標識を用いて評価されました(図2)。JC-1染色は、基底条件下で新たに分離されたミトコンドリアで強い赤色蛍光を示し、ミトコンドリア膜電位の保持を示しました。カルボニルシアン化合物m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)処理後、赤色蛍光は減少し、緑色蛍光は増加し、これはミトコンドリア膜脱分極と一致しました。これらの発見により、分離されたミトコンドリアは膜ポテンシャル応答性を保持し、分離後も機能的に活性を維持できることが確認されました。蛍光標識はさらに、ミトコンドリアが明確な集積や染料沈殿を伴わず、フィールド全体に均一に分布した点状構造として現れることを示しました。低い背景蛍光と均一な染色パターンは、分離後もミトコンドリアの完全性と膜電位の保持を示唆しました。

図2:単離ミトコンドリアの機能活性の特徴付け。(A) JC-1染色によるミトコンドリア膜の潜在能力の評価。精製されたミトコンドリアはJC-1で染色され、蛍光顕微鏡で観察されました。対照ミトコンドリア群では異なる赤色蛍光集合体が観察され、ミトコンドリア膜電位が保持されていることを示しています。アンカップラーCCCPによる処理後、蛍光は主に緑色のJC-1モノマーにシフトし、膜の脱分極と膜電位の崩壊を示しました(スケールバー=50μm)。 (B) 精製ミトコンドリアのミトコンドリア蛍光標識。蛍光標識されたミトコンドリアは、明確な凝集がなく、背景蛍光も最小限に、ミトコンドリアの完全性が保たれ、膜電位が安定していることを示しました(スケールバー=100μm)。 (C) JC-1染色後の異なるグループにおけるJC-1蛍光強度比の定量解析。データはSEM平均±(n=3)として示されます。統計的有意性は、ペアなしのt検定(****P < 0.0001)を用いて解析されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

分離されたミトコンドリアの超微構造的な完全性は透過電子顕微鏡を用いて調査されました(図3)。低倍率画像では主に楕円形の精製ミトコンドリアが確認され、高倍率画像では完全な外膜と明確に定義されたクリスタ構造が確認されました。明らかな腫れ、破裂、構造的損傷は認められませんでした。定量的評価のために、各フィールドに約40〜60個のミトコンドリアを含む5つの無作為に選ばれたフィールドが解析されました。これらの観察により、分離手順がミトコンドリア超微細を効果的に保存し、下流の機能研究に適したミトコンドリアを生成することが示されました。

図3:透過電子顕微鏡で評価された孤立骨格筋ミトコンドリアの超微構造的な完全性。 (左)低倍率(4,000×スケールバー=2μm)での代表的なTEM画像で、主に卵形の精製ミトコンドリアが示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

(右)高倍率TEM画像(40,000×スケールバー=200 nm)では、滑らかで連続した外膜と明確に定義されたクリスタ構造が示されました。黄色の矢印は無傷の外側ミトコンドリア膜を示し、白い矢印はよく組織されたミトコンドリアクリスタエを示します。腫れ、破裂、構造的破損の証拠は観察されなかった。各フィールドに約40〜60個のミトコンドリアを含む5つの無作為に選ばれたフィールドが解析されました。これらの発見は、分離プロトコルがミトコンドリア超微構造の完全性を保持し、下流の機能的アッセイの信頼できる構造的基盤を提供したことを示しています。

その後、ミトコンドリアの収量と純度はタンパク質定量および免疫ブロット解析によって評価されました(図4)。トリプシン消化法(TD)と通常抽出法(NE)法の比較では、TD法は1 mg組織あたり約2.3〜2.4 μgのミトコンドリアタンパク質を得られるのに対し、NE法は約1.7〜1.8 μg/mgの組織が得られました。免疫ブロット解析では、ミトコンドリア分画においてシトクロムcオキシダーゼおよびCOX IVというミトコンドリアマーカーの強い濃縮が示され、細胞質分画ではほとんど検出されませんでした。対照的に、細胞質マーカー βアクチンはミトコンドリア画分において弱い信号のみを示し、細胞質汚染が限定的であることを示しました。TD群とNE群の比較により、トリプシン消化がミトコンドリアの収量と純度を改善することが示唆されました。これらの発見は、プロトコルが下流の分子解析および機能解析に適したミトコンドリアを生成することを示しました。

図4:精製ミトコンドリアの収量と純度の比較。(A) トリプシン消化法(TD)および正常抽出法(NE)を用いた単位組織質量あたりのミトコンドリアタンパク質収量の比較。TD群は約2.3〜2.4 μg/mgの組織を得て、NE群は約1.7〜1.8 μg/mgの組織を得ました。データはSEM平均±(n=3)として示されます。統計的有意性はペアなしのt検定(*P < 0.05)を用いて分析されました。 (B) TDおよびNE法を用いて単離したミトコンドリア画分中のミトコンドリアおよび細胞質マーカータンパク質の免疫ブロット解析。 (C-D) ミトコンドリアマーカータンパク質であるシトクロムcオキシダーゼおよびCOX IVの定量解析。ミトコンドリアマーカーはミトコンドリア画分で強く富集されていましたが、細胞質画分ではほとんど発現が見られませんでした。細胞質マーカー βアクチンはミトコンドリア画分において弱い発現のみを示し、細胞質汚染物質の効率的な除去を示しました。NE群と比較して、TD群はミトコンドリア純度の向上を示しました。データはSEM平均±(n=3)として示されます。統計的有意性は非ペアt検定(*P < 0.05; **P < 0.01)を用いて解析されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

さらにミトコンドリアの呼吸機能を評価するため、高分解能呼吸計(図5)を用いて酸素消費量を測定しました。TD法で分離したミトコンドリアは呼吸制御比(RCR)値が約9-10を示したのに対し、NE法で分離されたミトコンドリアは約8-9のRCR値を示しました。RCR値が4を超えると一般的にミトコンドリア呼吸活動の保存を示すと考えられているため、これらの結果は両方の方法で単離されたミトコンドリアが機能的完全性を保つことを示しました。TD群で観察された高いRCR値は、NE群よりもミトコンドリア呼吸機能の良好な保存を示唆しました。生化学的結合効率も式1−(リーク呼吸率/電子移動呼吸率)を用いて評価され、1に近づく値は呼吸結合の強化とATP産生の効率化を示しました。両群とも結合効率が1に近づき、分離後もミトコンドリアの生体エネルギー機能が保持されたことを示しています。

図5:精製ミトコンドリアにおける呼吸機能のアッセイ。(A) トリプシン消化群(TD)と正常抽出群(NE)群間のミトコンドリア呼吸制御比(RCR)の比較。両群のRCR値は4以上であり、分離後もミトコンドリア呼吸活動が維持していることを示しました。TD群はNE群よりもやや高いRCR値を示し、呼吸機能の良好な保存を示唆しました。データはSEM平均±(n=3)として示されます。統計的有意性は非ペアt検定(**P < 0.01)を用いて解析されました。 (B) TD基とNE基間のミトコンドリア生化学的結合効率およびATP合成能力の比較。両群とも結合効率値は1に近づき、高度に結合した呼吸と効率的なATP産生を示しました。データはSEM平均±(n=3)として示されます。統計的有意性はペアなしのt検定(*P < 0.05)を用いて分析されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

L929細胞を用いて、受容細胞による分離ミトコンドリアの取り込みが評価されました(図6)。細胞は赤色蛍光色素標識された骨格筋由来ミトコンドリアと共インキュベートされ、蛍光アクチンプローブを用いてアクチン細胞骨格を可視化しました。共焦点顕微鏡では、細胞質全体に分布する点状の赤色蛍光構造が確認され、L929細胞が外因性ミトコンドリアを取り込んだことが示されました。定量解析では、12時間、24時間、48時間でミトコンドリアの取り込みが時間依存的に増加することが示されました。しかし、24時間から48時間の間にわずかな増加しか見られず、24時間以降は取り込み効率が飽和状態に近づいたことを示唆しています。さらに、受容者のL929細胞はミトコンドリア取り込み後にミトコンドリア膜電位が増加し、ミトコンドリア機能の改善を示しました。これらの発見は、このプロトコルで単離された骨格筋由来のミトコンドリアが、機能的な活動を維持しつつ、受容細胞によって効果的に内化できることを示しました。

図6:L929細胞による骨格筋由来ミトコンドリアの細胞取り込み。(A) L929細胞による精製ミトコンドリアの吸収は、異なるインキュベーション時間(12時間、24時間、48時間)で行われます。ミトコンドリア蛍光色素標識ミトコンドリア(赤)が受容細胞の細胞質内で検出され、ファロイジン染色(緑色)を用いてアクチン細胞骨格の可視化が行われました。核染色はDAPI(青)を用いて行われました。共焦点顕微鏡により、L929細胞による外因性ミトコンドリアの内部化が確認されました(スケールバー=50μm)。 (B) L929細胞による異なる時間点におけるミトコンドリア取り込み効率の定量的解析。 (C) 骨格筋由来ミトコンドリアの取り込み後のL929細胞におけるミトコンドリア膜電位のJC-1染色解析。 (D) ミトコンドリア取り込み後の受容者L929細胞におけるJC-1集合体とモノマー蛍光比の定量解析。活動的な骨格筋由来ミトコンドリアの内部化後、ミトコンドリア膜電位は有意に増加しました。データはSEM平均±(n=3)として示されます。統計的有意性は一元ANOVA(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)を用いて分析されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Discussion

ミトコンドリア移植は、機能的に完全なミトコンドリアを送達することで、エネルギー代謝が障害のある細胞の生理機能を回復させる細胞療法および再生医療における新たな戦略です。細胞のエネルギー代謝を調節するだけでなく、この技術はアポトーシスや酸化ストレスなどの重要な生物学的プロセスを調節し、さまざまな疾患に対して新たな治療機会^{を提供します。}しかし、ミトコンドリア移植の臨床移植には依然としていくつかの課題があり、その中には標準化され効率的かつ再現性の高いミトコンドリア分離プロトコルの欠如が依然として大きなボトルネックとなっています。

この問題に対処するため、本研究では、C57BL/6マウス骨格筋から機能的遊離ミトコンドリアを効率的に分離するための、差分遠心分離に基づく標準化かつ可視化された実験プロトコルを確立しました。精製手順の最適化とトリプシンの前消化、洗浄、精製工程を取り入れることで、組織解離を効果的に改善し、ミトコンドリアの構造的完全性を維持し、非標的細胞成分からの汚染を減少させます。

提案されたプロトコルは、ミトコンドリア純度と収量のバランスを良好に達成しています。従来の粉砕抽出法と比べて、現在の方法はより速く、実用的かつコスト効率が高く、日常的な実験室での応用やドナーミトコンドリアの調製に適しています。既存のミトコンドリア分離アプローチにはそれぞれ一定の限界があります。例えば、密度勾配遠心分離や免疫親和性精製はより高い純度を達成できますが、時間とコストがかかります。一方、ナノスケールのプローブベースのアプローチは日常的な使用には十分に開発されていません^20,21。骨格筋のような高密度組織では、最適化されたトリプシンの事前処理ステップ(37°Cで0.25%トリプシンを10〜15分間)と穏やかな均質化を組み合わせることで、従来の差分遠心分離よりもミトコンドリアの完全性を保ちます。

本研究では、市販の差動遠心分離キットを低温条件下で標準化されたワークフローで使用し、構造的に完全なミトコンドリアを迅速に取得しました。抽出過程で直面する潜在的な問題、例えば低収量、タンパク質汚染、異常な膜の可能性に対処するため、いくつかのトラブルシューティング戦略が提案されています。

ミトコンドリア収量の低下は、一般的に均質化不足、組織量不足、または遠心損失によって引き起こされます。これらの問題は、十分な前消化の確保、穏やかな均質化(密着ホモジナイザーによる10〜15回のパス)、少なくとも100〜150mgの新鮮骨格筋組織の使用、遠心分離条件の厳格な制御(破片除去用1,000 × g、ミトコンドリアペレット用10,000〜12,000 g× )、および広口径ピペットチップを用いたサンプルの再懸濁によって最小化できます。タンパク質汚染は主に、不完全な破片除去や脂質干渉によって引き起こされます。したがって、1,000 ×g 遠心分離の工程を繰り返し、さらに2回の12,000 ×g の洗浄工程を加え、脂肪組織を慎重に除去することが推奨されます。ミトコンドリア膜電位の異常は、機械的損傷や温度変動と関連していることが多いです。したがって過度の均質化は避け、全ての手順は氷上で行い、60〜90分以内に完了し、隔離バッファーにはEGTAと0.5%BSAを補給する必要があります。不完全均質化は、適切な酵素的消化を確保し、適切な均質剤を選択し、均質化後のろ過を行うことで改善できます。

現在のプロトコルはミトコンドリア分離の効率と純度を大幅に向上させていますが、いくつかの制限が残っています。まず、この処置は組織の新鮮度に大きく依存します。理想的には、組織サンプルは死後1時間以内に処理されるべきです。次に、残留トリプシンは洗浄時に十分に除去されない場合、トランスロカーゼ関連タンパク質を含むミトコンドリア表面タンパク質を分解し、その後の細胞の取り込み効率に影響を与える可能性があります。第三に、ミトコンドリアの貯蔵時間は限られており、4°Cでの長時間の保存や低温保存はミトコンドリア活性を大幅に低下させます。

翻訳レベルでは、生 体内 送達効率の向上、ミトコンドリア統合の長期メカニズムの理解、移植ミトコンドリアと宿主ゲノム間の潜在的な相互作用の解明など、さらなる課題が残っています。ミトコンドリア分離および精製技術の継続的な進歩により、さらなる方法論的革新がミトコンドリア移植療法の臨床翻訳を加速させることが期待されています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	ミトコンドリアの特徴づけ
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	蛍光色素の光減衰を減少させる
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	タンパク質濃度測定
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	ベータアクチン抗体は、分離されたミトコンドリアの純度を検出するために使用されました
BSA	Sigma	A6003	分離中は、遊離脂肪酸と結合してミトコンドリアの活性を保護します。
Centrifuge	Eppendorf	5418R	4 °C 遠心
CCCP	Solarbio	C6700	ミトコンドリアの酸化リン酸化を解離し、最大のプロトン漏れを誘導する
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	免疫蛍光染色観察
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	ミトコンドリアの特徴づけ
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	核反染
D-mannitol	Solarbio	IM00402	分離中の浸透圧バランスを維持し、ミトコンドリアの膨潤を防ぐ
EGTA	Sigma	E4378	ミトコンドリア分離バッファーで一般的に使用され、Ca2+を特異的に結合することでミトコンドリア機能を保護します
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	L929細胞の培養
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	組織をつかむ、保持し、持ち上げるために使用
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	組織のホモジネート化とミトコンドリアの分離に使用
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	タンパク質を架橋することで細胞の超微細構造を迅速に固定し安定化させ、オートライシスを防ぎ、細胞器の自然な形態を保存します。
HEPES	Thermo Fisher	J67485	安定したpH環境を提供します。
Incubator	Thermo Fisher	51032874	L929細胞の培養
JC-1	Solarbio	M8650	精製ミトコンドリアの膜電位の変化を検出します。
L929 cell line	Procell	CL-0137	ミトコンドリアの内在化アッセイ用
Lead citrate	Sigma	15326	精細な細胞下構造観察用に超薄切片を染色します。
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	L929細胞の培養
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	転移バッファーの構成要素として、SDSを除去し、ゲルから固相膜へのタンパク質の転移を促進するために使用されます。
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	JC-1染色ミトコンドリアの吸光度を測定
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	骨格筋におけるミトコンドリア膜電位の検出
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	差動遠心に基づく抽出キット
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	ミトコンドリアの保存用
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	ミトコンドリアの特徴づけ
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	溶液調製におけるバッファーとして
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001は、ウェスタンブロットでマウスIgG (H+L)を標的とします
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001はELISAとウェスタンブロットでウサギIgG (H+L)を標的とします
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	主にブロッキング剤として使用され、膜上の非特異的結合部位を占有することでバックグラウンドシグナルを減少させます。
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	ミトコンドリアの呼吸機能と酸素代謝を決定します。
Osmium tetroxide	Sigma	75633	またはTEMサンプルの脂質を保存し、膜のコントラストを向上させるための後処理。
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	筋肉組織の清掃
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	L929細胞の培養
Phalloidin-488	Beyo