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研究記事

miR-93-5pを標的とした脳内出血後の脳損傷に対するlncRNA FGD5-AS1の保護効果

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DOI:

10.3791/71556

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2026年8月4日

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1Department of Emergency Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, 2Department of Neurology, Jianli People's Hospital, 3Department of Rehabilitation Medicine, Ganzhou People's Hospital, 4Department of Nephrology and Endocrinology, Ganzhou Fifth People's Hospital, 5Department of Neurosurgery, Langfang People's Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、実験的な脳内出血モデルにおけるFGD5-AS1とmiR-93-5pの相互作用を調査し、FGD5-AS1のノックダウンが神経損傷、炎症、酸化ストレスの減少と関連していることが明らかになりました。

要約

脳内出血(ICH)は、高い死亡率と障害率に関連する神経疾患であり、重篤な神経障害を引き起こす可能性があります。本研究では、ICHにおけるFGD5-AS1の役割とその基礎メカニズムを調査しました。ICHの in vitro および in vivo モデルが確立されました。逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を用いてFGD5-AS1およびmiR-93-5pの発現を測定しました。神経学的欠損は修正神経重症度スコア(mNSS)を用いて評価され、脳浮腫は乾式・湿式重り法で評価されました。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて炎症性サイトカインおよび酸化ストレスマーカーを測定しました。細胞生存率は細胞生存率および増殖アッセイキットを用いて評価されました。FGD5-AS1とmiR-93-5pの相互作用は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイおよびピアソン相関解析を用いて調査されました。実験的なICHは、動物モデルおよび細胞モデルの両方でFGD5-AS1発現の上昇を伴いました。FGD5-AS1の抑制は脳の腫れを緩和し、神経機能を向上させ、炎症性および酸化損傷を減少させ、内皮細胞の生存率を向上させました。miR-93-5pの阻害はこれらの保護効果を弱め、両分子間の調節相互作用を支持しました。FGD5-AS1はmiR-93-5p発現を負の的に調節し、miR-93-5pの阻害はFGD5-AS1ノックダウン後の効果を弱めました。これらの結果は、FGD5-AS1がmiR-93-5pの調節を通じてICH関連脳損傷に寄与する可能性があり、FGD5-AS1/miR-93-5p軸が実験的なICHにおけるさらなる研究対象となる可能性を示しています。

概要

脳内出血(ICH)は、死亡率と障害率が高い神経疾患であり、全脳卒中症例の10%から20%を占めています1,2。効果的な治療標的が不足しているため、ICHの治療は現在手術および支持療法に限定されています。PinhoらはICH死亡率、機能的アウトカム、血腫成長率の予測を検証し、医療従事者に新たな視点を提供しました。ICH治療の進展にもかかわらず、患者の転帰は依然として芳しくありません。したがって、ICHの新規治療標的を特定することは、長期予後を改善するために重要です。

長く非コードRNA(lncRNA)は、200ヌクレオチドを超える非タンパク質コード転写産物のクラスであり、転写過程、転写後、エピジェネティック過程など多様なメカニズムを通じて遺伝子発現を調節します5。蓄積される証拠により、異常なlncRNA発現が脳卒中、外傷性脳損傷、脳内出血(ICH)、くも膜下出血など、さまざまな神経疾患の病因に関与していることが示されています。これらの調節分子の中で、FGD5-AS1は増殖、アポトーシス、炎症性シグナル伝達、酸化ストレス応答など、いくつかの細胞プロセスと関連しています。競合する内因性RNA活性、転写調節、エピジェネティック修飾などのメカニズムを通じて、FGD5-AS1は複数の下流標的の発現に影響を与えます。FGD5-AS1発現の異常は、悪性腫瘍、心血管疾患、代謝疾患など様々な病理学的状態で報告されています。それでもなお、神経疾患における生物学的意義は完全には解明されていません。過去の研究では、FGD5-AS1が膠質腫および膠芽腫の進行に関与し、酸素・グルコース欠乏/再灌流条件下で神経障害に寄与することが示されています14。これらの観察は、FGD5-AS1が神経損傷において調節的な役割を果たす可能性を示唆しています。しかし、ICH後の脳損傷への関与は完全には解明されていません。

マイクロRNA(miRNA)は、標的メッセンジャーRNA内の補完配列と相互作用することで遺伝子発現を調節する短い非コードRNAです15。研究により、miRNAもICHにおいて重要な役割を果たしていることが示されています。具体的には、miR-143-3pは急性脳損傷後の好中球の経内皮移動を促進し、ATP6V1A16を標的とします。miR-195-5pはMMP-9およびMMP-2の発現を阻害することでICH誘発性脳損傷に対する保護効果を発揮します17。MiR-93-5pはICH18後の転帰改善のための治療標的としても特定されています。研究ではICHにおけるFGD5-AS1およびmiR-93-5pの異常発現と、ICH後の神経機能障害の進行への関与が確認されていますが、これまでの研究は主にそれぞれの生物学的効果に焦点を当ててきました。FGD5-AS1とmiR-93-5pが内因性RNAとして競合的に関与する規制関係はまだ明確に確立されていません。

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プロトコル

1. 実験動物

この研究は赣州人民病院動物倫理委員会(承認番号20230789)により承認され、NIHの実験動物ケア・利用ガイドに厳格に従って実施されました。本研究ではSPFグレードの雌のSDラット(生後6〜8週、体重180〜230g)を使用しました。ラットは22°C±3°Cの管理された環境で、12時間の明暗サイクルで餌と水を自由に利用できる環境で飼育されました。動物たちは実験の7日前に慣れさせられました。プロトコルで使用される化学物質、試薬、装置は材料 表に記載されています。

2. 生体内 ICHモデルの確立

実験的な脳内出血(ICH)モデルを作成するために、0.23 UのタイプVIIコラーゲンを1 μLの無菌生理用生理用食塩水に溶解しました。ラットには腹腔内ペントバルビタールナトリウム(50 mg/kg)で麻酔され、その後コラーゲンゼ溶液を0.5 μL/min(前頭点後0.2 mm、正中外側3.0 mm、頭蓋骨表面6 mm深さ)で線条体に立体的に注入しました。対照群の動物も同じ処置を受けましたが、コラーゲン酵素ではなく生理食塩水を同じ量で投与しました。実験設計の概観は 補足図1に示されています。

補足図1:動物実験設計図。ラットは無作為に2つのグループに分けられました。1グループは0.23U型VIIコラーゲナーゼを用いてICHモデルを構築し、あるグループは生理食塩水を対照群として使用しました。モデル群ラットは無作為に2つのバッチに分けられ、ICHにおけるFGD5-AS1の役割とFGD5-AS1/miR-93-5p軸の相乗効果を分析しました。ICH誘導から1時間後、トランスフェクション試薬をラット脳に注入しました。0日目、1日目、3日目、7日目にmNSSを用いてラットの神経機能を評価すること;ICH誘導後7日間脳組織を採取してください。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ラットはランダムに2つのグループに分けられました。1グループはICHにおけるFGD5-AS1の役割を分析し、さらに4つのサブグループに分けられました:対照群、ICH、ICH + レンチウイルス(LV)-shNC、およびICH + LV-shFGD5-AS1です。もう1つのグループはFGD5-AS1/miR-93-5p軸の相乗効果を解析し、5つのサブグループに分けられました:ICH、ICH + LV-shNC、ICH + LV-shFGD5-AS1、ICH + LV-shFGD5-AS1 + アンタゴミールNC、およびICH + LV-shFGD5-AS1 + miR-93-5p アンタゴミール。各グループには12匹のラットが含まれていました。ICH誘導から1時間後、トランスフェクション試薬をラット脳に2 mg/kgの用量で注入しました。

3. 細胞培養と処理

脳微小血管内皮細胞(BMECs)は、血液脳関門、神経疾患のメカニズム、薬物送達の研究における重要なモデルとして機能します20。BMECsにおいて、酸素・グルコース剥奪(OGD)/ヘミン治療を用いたin vitro ICHモデルが確立されました。BMECは、5%CO2および95%N2のガス混合物下で、グルコースおよび血清を含まないDMEMで10分間培養しました。その後、細胞はヘミン(10μM)で処理され、5%CO2と95%N2を含む嫌気性チャンバーに2時間移されました。OGDは細胞を通常の培養条件に戻すことで終了しました。対照群も同じ条件下でPBSで治療されました。

細胞は製造元の指示に従ってトランスフェクトされました。細胞には20 nMのFGD5-AS1 siRNA(si-FGD5-AS1)、陰性対照siRNA(si-NC)、miR-93-5p阻害剤、またはブランクコントロール阻害剤(NC阻害剤)をトランスフェクトしました。

4. 修正神経重症度スコア検査

生 体内 ICHモデル確立後、0日目、1日目、3日目、7日目に修正神経重症度スコア(mNSS)を用いて神経機能を評価しました。スコアは運動機能、感覚機能、バランス、反射機能の4つの領域に基づいて定量化されました。スコア1から4は軽度障害、5から9は中等度障害、10から14は重度障害を示しました。

5. サンプル採取

ICH誘導から7日後、ラットは50 mg/kgのペントバルビタールナトリウム腹腔内注射で麻酔され、その後頸椎脱臼による安楽死と脳組織の採取が行われた。

6. 脳浮腫の評価

脳浮腫は乾湿重量法を用いて評価されました。摘出直後に脳を重さ測り、湿った重さを得ました。その後、組織は100°Cのオーブンで24時間乾燥させ、再度重さを量って乾燥重度を得ました。組織の水分含有量は以下の通り計算されました。

[(湿った重さ - 乾重さ)/ 濡れた重さ] × 100%

7. リアルタイム定量PCR

製造元のプロトコルに従い、組織および細胞サンプルからRNA抽出試薬を用いて総RNAを単離しました。その後、逆転写キットを用いて補完的なDNAを合成しました。その後、GAPDHおよびU6を内因性参照遺伝子としてリアルタイムPCRプラットフォームを用いて定量PCR解析を実施しました。増幅プロトコルは、95°Cで10分間の初期変性ステップ、その後95°Cで15秒間の変性40サイクル、60°Cでのアニーリング/延長、60秒間のアニーリング・エクステンションで構成されていました。相対的な遺伝子発現レベルは2−ΔΔCt 法を用いて算出されました。本研究で使用されたプライマー配列は 補足表1に示されています。

補足表1:本研究で使用されたプライマー配列および関連試薬配列。 リアルタイムqPCR実験に関わる配列と、試験体外実験 で使用される 試薬の関連配列。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

8. 細胞増殖アッセイ

トランスフェクトされた細胞は96ウェルプレートにシードされました。0、24、48、72時間培養後、各ウェルに10μLのCCK-8試薬を加えました。細胞は37°Cで2時間インキュベートされ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの光学密度が測定されました。

9. デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ

miR-93-5p結合部位を含むFGD5-AS1の野生型(WT)および変異体(MUT)3′-UTRをpGL3ベクターにクローニングしました。このベクターは、トランスフェクション試薬を用いてmiR-93-5p模倣株と共トランスフェクトされました。相対ルシフェラーゼ活性はデュアルルシフェラーゼレポーターシステムを用いて測定されました。

10. 酵素結合免疫吸着アッセイ

脳組織サンプル(20–50 mg)は、氷冷RIPA溶解バッファーで1:9の組織対バッファー比で均質化されました。均質化後、サンプルは12,000 × g で4°Cで20分間遠心分離し、得られた上澄液を分析のために収集しました。各実験群のBMECは収穫され、12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離され、その後上清液を保持しました。MDA、IL-1β、IL-6、TNF-αの濃度は、製造元の指示に従い対応するアッセイキットを用いて測定されました。

11. 統計解析

すべてのデータは平均標準差±表示されています。データは統計ソフトウェアを用いて可視化されました。各実験は少なくとも3回繰り返し行われました。At検定を用いて2つのグループを比較し、分散の一方的分析とTukeyの事後検定を用いて2群以上のグループを比較しました。P < 0.05の値は統計的に有意とされました。

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結果

FGD5-AS1がICHラットに与える影響

FGD5-AS1の発現はICH群で対照群より有意に高かった(P < 0.0001; 図1A)。LV-shFGD5-AS1のトランスフェクション後、FGD5-AS1の発現はLV-shNC群と比較して有意に低下しました(図1B)。脳浮腫の評価では、ICHラットで対照ラットよりも重度の脳浮腫が見られ、一方でFGD5-AS1のサイレンシングは脳水分含有量を有意に減少させました(図1C)。同様に、ICH誘導後はMDAレベルが著しく上昇し、FGD5-AS1ノックダウン後には減弱されました(図1D)。mNSSを用いた神経機能の評価では、ICH群の方が対照群よりも有意に大きな障害が見られ、一方でFGD5-AS1のサイレ...

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ディスカッション

脳内出血後の脳損傷は、初期出血だけでなく、時間とともに進行する一連の二次的な病理反応からも生じます21。原発血腫は周囲組織の直接的な機械的破壊を引き起こしますが、その後の損傷は炎症の活性化、酸化的損傷、プログラム細胞死などの過程によって媒介されます。これらの二次的メカニズムは神経学的悪化と不利な臨床転帰に大きく寄与しています22.したがって、二次損傷を制限できる分子経路の特定はICH研究において重要な目標であり続けています。

増え続ける証拠は、LNCNAがさまざまな神経疾患の発症と進行に関与する遺伝子発現の主要な調節因子であることを強調しています(23)。LncRNA Snhg3は下流の神経炎症性TWEAK/Fn14/STAT3経路を活性化し、ICH24を持つラットの脳微小血管機能障害を引き起こします。LncRNA MIR17...

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開示事項

著者には開示すべき関連する財務的または非財務的利害関係はありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Antagomir NCGenePharma, 中国B04007ネガティブコントロールantagomir
BMECsATCC, アメリカCRL-8270ヒト脳微小血管内皮細胞
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)Beyotime, 中国C0038細胞生存率アッセイキット
DMEM培地Gibco, アメリカ12430054グルコースフリー、血清フリー培地
Dual-GloルチフェラーゼアッセイシステムPromega, アメリカE2920ルチフェラーゼ活性の検出
電子天びんSartoriusSecura224-1CN組織の重量測定用精密天びん
GAPDHおよびU6プライマーSangon Biotechカスタムプライマー合成サービス内部基準プライマー
Graphpad Prism 8.0GraphPad Software, アメリカ——統計解析ソフトウェア
ヘミンMCE, 中国HY-19424細胞傷害誘導用ヘミン試薬
IL-1ベータELISAキットAbcam, 英国ab197742炎症性サイトカイン定量
IL-6 ELISAキットAbcam, 英国ab222503炎症性サイトカイン定量
LightCycler 96 PCRシステムRoche, スイス5815916001リアルタイムPCR機器
Lipofectamine 3000Invitrogen, アメリカL3000001トランスフェクション試薬
MDAアッセイキットBeyotime, 中国S0131脂質過酸化アッセイ
マイクロプレートリーダーBioTekSynergy H1OD450吸光度測定
miR-93-5p antagomirGenePharma, 中国B05001in vivo実験用miR-93-5pインヒビター
PBSSolarbio, 中国P1020リン酸緩衝生理食塩水
ペントバルビタールナトリウムSigma, Merck KGaA11715麻酔薬
pGL3-プロモーターNovoPro, 中国V011541ルチフェラーゼレポーターベクター
PrimeScript RT MixキットTakara, 日本RR037A逆転写キット
RIPABeyotime, 中国P0013Bタンパク質/組織溶解バッファー
ShFGD5-AS1レンチウイルスGenePharma, 中国D02001FGD5-AS1ノックダウンベクター
SPFグレードの雌SDラットVital River——6〜8週齢、SPFグレード
SYBR Green Realtime PCR Master MixTakara, 日本RR420A定量PCR試薬
TNF-α ELISAキットAbcam, 英国ab208348炎症性サイトカイン定量
TRIzol試薬Invitrogen, アメリカ15596026総RNA抽出試薬
タイプVIIコラーゲナーゼSigma, Merck KGaAC0773クロストリジウム・ヒストリチクム由来; ICH誘導

参考文献

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