カエノラブディティス・エレガンスにおける胚致死率の定量化

サマリー

このプロトコルは、 カエノラブディティス・エレガンスの胚致死率を定量化する簡便かつ低コストな手法を提供します。専門的な機器や虫拾いの専門知識なしに、集団全体の胚異常を簡単に検出できます。このプロトコルは、遺伝子変異、RNA干渉介在の遺伝子ノックダウン、食事の影響を定量化するために用いられます。

要約

胚致死率は、カ エノラブディティス・エレガン スの研究で用いられる基盤的な表現型であり、毒性曝露や遺伝子変異などの要因による発生異常を特徴づけるために用いられます。したがって、胚致死率の浸透度を正確に定量化することは、これらの摂動が動物の発生に与えるメカニズムと影響を理解する上で極めて重要です。自動スコアリングプラットフォームは存在しますが、これらの方法は多額の資金投資や専門的なハードウェアやソフトウェアを必要とすることが多いです。この記事では、孵化に失敗した胚の割合を測定することで、低技術かつ低コストのアッセイで胚の致死率を定量化する方法について説明しています。特に、このバージョンのアッセイはミミズピックを不要にし、初心者に非常に適しています。この手法のもう一つの利点は、各技術的アッセイが複数の動物から子孫を再現し、単一線生虫アッセイのバイアスを回避できることです。このプロトコルには、表現型の浸透率を正確に捉えるために必要な最小子孫数や方法論の根拠など、重要なパラメータの議論が含まれています。最後に、RNA干渉、薬理学的治療、栄養補給 による 遺伝子ノックダウンの効果を評価するためのアッセイの適応に関する指針を提供し、 C. elegans 研究者のツールキットに多用途でアクセスしやすいツールを追加します。

概要

胚致死率は、遺伝子や環境要因が早期発生に果たす役割を評価する上で重要な表現型です。C. elegansは、その不変性細胞系統、透明な体、そして急速な^{ライフサイクル1}により、発生過程の研究に強力なモデルです。C. elegansの胚致死性は、化学的、薬理学的、栄養的、遺伝的変動に対する発生的完全性の評価に用いられます 2,3,4,5。したがって、胚致死率を正確に定量化するための手軽で多用途な方法が研究コミュニティに利益をもたらすでしょう。

胚発生を研究する高度なハイスループットかつ高コンテンツの手法は、専門的な画像診断システムやソフトウェアに依存し、しばしば多額の資金投資を必要とします ^4,6,7 に対し、より単純なハイスループット手法は主に定性的な読み取りを提供します ^8,9。対照的に、古典的な方法は手作業で低コストで、通常は個々の雌雄同体をミミズピックで繰り返し移送し、全体の胚致死性を評価する手法^です。しかし、この方法は初心者には技術的に難しく、スケーラビリティも限られています。さらに、古典的な親族サイズベースのアッセイは、シングルマザーの子孫における胚の生存可能性を定量化するため、意図しないバイアスが生じる可能性があります。

この手法の全体的な目的は、中流量での胚の生存可能性を定量化するための代替的でシンプル、費用対効果が高く、多用途なアプローチを提供することです。この方法は、複製ごとに複数の動物の子孫の胚致死率を測定し、ミミズピックの使用を不要、特殊または高価な機器を避けます。また、この手法がRNA干渉や薬物・栄養素検査など一般的な摂動にも応用できることも示しています。

プロトコル

1. C. elegans メンテナンス

注: C. elegans の飼育に関する詳細なガイダンスはWormBook¹¹に記載されています。

1. メンテナンス線虫成長培地(NGM)プレートを準備してください。
   1. NGMを1リットル作るには、2リットルのボトルに3gのNaCl、2.5gの細菌ペプトーン、17gの寒天を組み合わせます。蒸留水975mLとスターターバーを加え、121°Cで20分間オートクレーブします。
   2. 培地を水浴で55°Cまで冷やします。ボトルを攪拌板に置き、無菌技術を用いて1Mリン酸カリウムバッファー25mLと、以下の1mL(1 M MgSO₄、1 M CaCl₂、5 mg/mL)を加えます。各100mmプレートに約25mLを注ぎます。
2. 一晩でE . coli OP50培養を準備します。
   1. 無菌技術を用いて、1リットルのエルレンマイヤーフラスコにLB培地を1分の1(200 mL)まで満たします。滅菌接種ループを用いて、単一コロニーの大 腸 菌OP50で培地に接種します。軌道シェーカーで200rpmの37°Cで一晩培養します。
3. 大 腸菌 OP50を用いたNGMメンテナンスプレート(図1A)。
   1. 大 腸菌 OP50培養液を高圧滅菌処理済みの遠心分離機ボトルに移し、室温で3,500 ×g の遠心分離機で30分間移管します。細菌ペレットを元の体積の20分の1に再懸浮させます。100mmのNGMプレートごとに1〜1.5mLの濃縮培養液を用いてシードします。
   2. 培地は常温で一晩培養して細菌の増殖を待ちます。
      注:これらのメンテナンスプレートは高密度の細菌を持ち、1プレートあたり最大4,000匹のミミズを支えるため、多数のアッセイを行う場合や成長の遅い C. elegans株の扱いにおいて望ましいです。種をまいたメンテナンスプレートは、4°Cの冷蔵庫で最大1か月間保存できます。
4. 一次栽培を確立します(図1A)。
   1. 滅菌ピペットの先端を使って、飢えたメンテナンスプレートから約1,000匹のミミズを含む寒天の小さな塊を切り取ります。寒天の塊を種付けしたNGMプレートに置きます。
   2. 新しい皿をプラスチック容器に入れ、20°Cで3日間孵化させ、ミミズが妊娠して卵を産むまで待つ。細菌の芝生が十分であること、そしてミミズの個体数が飢えないようにしましょう。この時点で、ミミズの個体数は実験の準備が整っています。

2. 実験培地および細菌培養の調製

注意:この段階では、RNAi介在遺伝子ノックダウンの効果を検証するための方法1、または栄養補助食品を調査するための方法2のいずれかを選択してください。

1. 方法1:RNAi用の実験用NGMプレートを給餌で準備する。
   1. ステップ1.1で説明された1LのNGMを準備し、無菌技術を用いて1 mLの1 M IPTGと1 mLの50 mg/mLアンピシリンを加えます。各35mmプレートに約5mLを注ぎます。
   2. 目的のC. elegans遺伝子を標的としたL4440プラスミドを持つ大腸菌HT115 RNAi摂食クローンを、空のベクター制御菌とともに接種します。接種ループ付きの単一のコロニーを選び、50 μg/mLのアンピシリンを含む1.5 mLのLBに移します。軌道シェーカーで37°C、200rpmで18時間キュベートします。
   3. アンピシリンとIPTGを含む35mm NGMプレートを100μLの一晩E . coli HT115培養でシードし、各条件に2回の技術的複製を準備しました。プレートを室温で一晩培養し、細菌の増殖と二本鎖RNA産生を誘導します。種子なしのプレートを同数4°Cで保存し、後の卵移植用に使用します。
2. 方法2:実験用NGMプレートを栄養または薬物サプリメントで準備します。
   1. ステップ1.1の指示に従って1.5倍濃縮NGMを準備しますが、蒸留水は975mLではなく642mL加えます。準備済み培地は55°Cの水浴で保温します。
   2. 目標濃度の3倍の水性補剤を準備します(例えば、40 mMのナトリウム・フアルマートを含むプレートを準備する場合は120 mMのストックを作ってください)。必要な在庫容量は、実験プレートの数に1.666 mL(プレート容量の3分の1)を掛けて計算します。シリンジフィルターでストックをろ過して滅菌し、その後水浴で55°Cまで温めます。
   3. 50mLの円錐形チューブに、1.5xNGMを2份、サプリメントストック1を混ぜます。サプリメントコントロールなしの場合、1.5倍NGM2と熱い滅菌水1を混ぜてみてください。チューブを10回逆さまに混ぜ、無菌技術を用いて約5mLの培地を素早く各35mmプレートに注ぎます。
      注:大量のサプリメントを加えた際の中程度の希釈を補うために1.5倍のNGMが使用されます。しかし、薬剤や代謝物のストックが最終濃度の100×以上に濃縮されている場合は、1.5× NGMの代わりに通常のNGMを使用できます。有機酸を補う際は、そのナトリウム塩の形態を使うことで、中pHの低下を防ぐことができます。
   4. 無菌技術を用いて、50 mLのエルレンマイヤーフラスコにLB培地を5分の1(10 mL)まで満たします。大 腸菌 OP50のコロニーで接種し、軌道シェーカーで200 rpmの37°Cで一晩培養します。
   5. 35mm NGMプレートに100μLの夜間大 腸菌 OP50培養を施し、各条件ごとに2回の技術的複製を準備しました。プレートは室温で一晩孵化します。種子なしのプレートを同数4°Cで保存し、後の卵移植用に使用します。

3. L1幼虫の同期個体群の取得

1. アルカリ性漂白剤溶液を、滅菌水7mL、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液2 mL、5 N NaOH1 mLを混ぜて調製します。
2. M9バッファーは、蒸留水1LにKH₂PO₄ 3g、Na₂HPO₄ 6g、NaCl 5 gを溶かし、pHを6.5に調整します。121°Cで20分間オートクレーブし、溶液を冷やした後、無菌的に1 mLの1 M MgSO4を加えます。
3. 妊娠した成虫(ステップ1.4.2)をM9バッファーでプレートから洗い流し、15 mLの円錐形チューブに移します。350 x g で2分間遠心分離し、上清液を吸引し、チューブ内に新しいM9バッファーを入れます。洗濯を2回繰り返します。
4. ミミズペレットに2mLのM9緩衝液と2mLのアルカリ性漂白剤溶液を加えます。渦巻きを激しく振らせ、ほぼすべてのミミズが溶けるまで定期的に顕微鏡で調べます。
5. チューブにM9バッファーを入れ、350 x g で遠心分離機で2分間加熱します。チューブを逆さにして上清液を取り出し、その後M9バッファーで4回洗います。ワームが溶けた後すぐに最初の洗浄を行い、過剰漂白を防ぐようにしてください。最後の洗浄後、チューブに8mLのM9バッファーを入れ、ロッカーの上で18〜20時間孵卵させて卵が孵化するまで待つ。

4. 母性人口の育成

1. 3μLのミミズ懸濁液を5滴ガラススライドに置き、顕微鏡で孵化したL1幼虫の数を数えます。総数を15で割ると、1マイクロリットルあたりの濃度が得られます。
2. 30匹のL1幼虫をそれぞれのシードした35mmプレートにプレートし、20°Cで72時間孵化します。実験条件が発育遅延を引き起こす場合は、抱卵時間を延ばしてミミズが妊娠し卵を産み始めるまで続けます(図1B)。

5. 胚を孵化プレートに移植する

1. 種のついていない35mmのプレートを冷蔵庫から取り出し、室温にします。
2. 顕微鏡でミミズプレートを調べ、100個以上の胚が含まれており、孵化したL1幼虫は存在しないことを確認します。
3. プレートにM9バッファーを慎重に詰めます。真空管を使って液体を吸引し、母体集団を除去します。成虫のミミズが皿に残らないように注意してください。
4. マイクロピペットの先端に200μLのM9バッファーを入れ、ピペットを上下に強く動かして胚を細菌の芝生から剥がします。顕微鏡で観察しながら、ピペットの先端を胚の密集領域に向けて誘導します。
5. 未シードプレートを取り、胚の懸濁液を中央にピペットで滴り込みます。顕微鏡で水滴を調べてください。100〜300個の胚が含まれていなければ、この範囲に達するまでさらに胚の懸浮量を追加してください。親生集団からの寄生虫が胚と一緒に移植されないように注意してください。
6. 液体を乾燥させた後、移送プレートを20°Cで少なくとも24時間培養します。
   注意:実験プレートにすでにL1幼虫が存在する場合は、M9洗浄の代わりに真空ラインを使って母体全体を一つずつ除去してください。これにより、胚のように細菌の芝生にくっつかないL1の孵化した幼体が洗い流されるのを防ぎます。子孫移植を進めてください。これでは胚とL1幼虫の両方が含まれます。すべての条件に同じアプローチを適用するようにしましょう。

図1:胚致死性アッセイの主要ステップの実験タイムラインおよび概説。 (A) 実験プロトコルの全期間を示すフローチャートのタイムライン。メンテナンス培地準備からハッチングプレートのスコアリングまで。実験の該当日に対応する主要な手順が示されています。(B) 胚致死性アッセイの概説(ステップ4–6)。4日目には、同期したL1幼虫を実験的なRNAiまたは補助プレートに追加し、母体集団を確立します。72時間後、7日目にミミズが卵を産み終えると、母体集団は洗い流され、胚は細菌の芝生に付着したまま残ります。胚はピペットで芝生から洗い流され、孵化プレートに移されます。1枚の胚は少なくとも100個の胚が入っています。24時間の孵化後、孵化した幼虫と未孵化した胚が数えられます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. スコアリングプレート

1. 35mmのペトリ皿の蓋に、油性マーカーでおおよそ4mm×4mmのグリッドを描き、蓋をプレートの下に置きます。グリッドをガイドとして使い、顕微鏡の下でL1幼虫と孵化していない胚の数を手持ちのクリックカウンターで数えます。
2. 技術的なレプリケートのカウントを組み合わせて、各レプリケートの子孫数に基づいて適切な重み付けを確実にします。具体的には、技術的複製をまたがる未孵化胚と孵化した幼虫の数を合計してください。
3. 未孵化の虫(胚)の数を寄生虫と胚の総数で割り、100を掛けてパーセンテージで表すことで、生物複製あたり1回の胚致死率を計算します。
   注:孵化した幼虫のみまたは胚のみを含むプレートは、胚致死率がそれぞれ0(0%)または1(100%)であるため、このカウントステップを省略できます。

7. 統計解析

1. 独立した生物学的複製を得るために、実験全体を少なくとも3回繰り返します。各生物学的複製には、各条件につき技術的複製プレートを2枚使用し、1回の技術的複製ごとに最低100個の胚を使用します。
2. 一方移動ANOVAを用いて胚致死率が条件間で有意に異なるかどうかを判断し、その後ベンジャミニ・ホッホバーグ法のような複数検定補正を伴う事後ペアワイズ・スチューデントの t検定 を用います。
   注:2つの技術的複製を組み合わせると、1回の生物学的複製につき最低200個の胚が得られます。これは、Rの基本関数パワープロップ検定で推定されるサンプルサイズ要件(~184胚/状態)を満たし、致死率の差(例:20% 対35%)を検出し、90%の検出力とα=0.05の有意水準を検出します。

結果

胚致死率アッセイは野生型N2株とRNAi高感受株rrf-3(pk1426)の2株で実施されました。RNAiを用いて摂食を用い、高スループットスクリーニング^9,12で胚致死率が報告された遺伝子をノックダウンしました。図2はアッセイ性能の代表的なデモンストレーションを示しています。T04G9.4ノックダウンはrrf-3(pk1426)およびN2動物の両方でほぼ完全な浸透型胚致死性を示し(図2A,B)、したがって強い胚致死性表現型の信頼できる正の対照群として機能する可能性があります。胚致死率は割合で測定されるため、二項結果のカテゴリーに属し、分散は範囲の中部付近で最大、境界付近で低くなると予想されます¹³。したがって、致死率0%に近い表現型(ベクター)や100%致死率(T04G9.4やK08E...

ディスカッション

アッセイの再現性と正確さにはいくつかのステップが不可欠です。まず、漂白の段階は成虫を胚を損傷せずに溶かすタイミングを慎重に調整しなければなりません。もう一つ重要な点は、カウントのために十分な数の胚を移植することです。少なすぎると精度が低下し、数えすぎるとカウントが不必要に面倒になります。次に、胚が孵化し始める前に胚移植を行うべきです。そうしないと、孵化したヒナは成体と一緒に流されてしまい、孵化率がより高い胚の致死率に偏る可能性があります。最後に、胚とL1のカウントの一貫性を維持するために、初心者実験者は胚を正確に識別し、すべての孵化した幼体を検出する訓練を受けなければなりません。一見単純な作業ですが、特定のサプリメントで発生する細菌の芝生の質感の変化やゴミによって複雑になることがあります。

また、真の胚致死性と発達遅延を区別することも重要です。標準条件下では、野生型胚の子宮外胚発生は9時間^14分15

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンピシリンナトリウム塩	Sigma-Aldrich	A9518
細菌用ペプトン	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	野生型
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi 過敏
無水塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	746495
コレステロール	Sigma-Aldrich	C3045
コーニカルチューブ、15 mL	VWR	60818-725
培養管、14 mL	VWR	470150-966
ダイアフラム真空ポンプ	Amazon	TC-100
解剖用顕微鏡	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III 欠損型、RNAi フィード実験に使用
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
粒状寒天	Fischer Scientific	BP97445
手動タリーカウンター	LabDepot	HTCP01
IPTG、ジオキサンフリー（イソプロピル-b-D-チオガラクトシド）	US Biological	I8500
LBブロス（ミラー）	US Biological	L1520	LB培地を作るには、1Lの蒸留水にLB粉末25gを溶解します。121.1 °C で20分間オートクレーブします。
ルールロック使い捨て注射器	BH Supplies	BH20LL
硫酸マグネシウム	Sigma-Aldrich	M2643
顕微鏡スライド	Sail Brand	7101
ペトリ皿、100 mm	Tritech Research	T3371
ペトリ皿、35 mm	Tritech Research	T3501
リン酸カリウムバッファー（PPB）			リン酸カリウムバッファー（1 M）を作るには、リン酸カリウム一水和物98gとリン酸カリウム二水和物48gを1Lの蒸留水に溶解します。pHを6に調整します。121 °C で20分間オートクレーブします。
リン酸カリウム二水和物	Sigma-Aldrich	795496
リン酸カリウム一水和物	Sigma-Aldrich	529568
ロッカー（振動ミキサー）	Corning LSE	6720
セロロジカルピペット、25 mL	Corning	4489
セロロジカルピペット、5 mL	Celltreat	229235
揺れインキュベーター Infors Multitron	INFORS HT	NA
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S9888
水酸化ナトリウム溶液、5 N	Fisher Scientific	SS256-500
次塩素酸ナトリウム、5%	LabDepot	LC246302
リン酸二ナトリウム	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus 遠心分離機	Thermo Scientific	75016030
スチーププレート	ONilab	ONi28-S
注射器フィルター	Semmerfeld	JQP033022QE1
水浴	FOUR E's Scientific	WB401