マッピングミクグリアパラメータソフトウェア(MMPS):定量的なミクログリア形態分析のためのオープンソースで使いやすいツール

サマリー

マッピングミログリアパラメータソフトウェア(MMPS)は、コーディングの専門知識を必要とせず、免疫蛍光画像から単細胞微粒細胞形態学解析を半自動化するユーザーフレンドリーな解析パイプラインです。齧歯類リポ多糖誘発神経炎症モデルで検証され、MMPSは活性化に関連する形態変化を再現性可能に検出し、標準化され拡張可能なミクログリア表現型化を可能にします。

要約

ミクログリアは中枢神経系の骨髄由来免疫細胞であり、神経損傷後の組織劣化や再形成を媒介し、いくつかの神経変性疾患における有望な治療標的として注目されています。微粒膠細胞の形態の定量解析により、重要な 現地 情報を維持しつつ、微粒膠細胞亜集団間の微妙な違いを明らかにできます。しかし、現在利用可能な多くのマイクログリア形態解析プラットフォームは一般公開されていないか、専門的な計算専門知識を必要としているため、その普及は制限されています。これらの制約に対処するため、Python 3.11を用いたオープンソースの微粒膠細胞形態解析プラットフォーム「Mapping Microglial Parameters Software(MMPS)」が開発されました。MMPSは免疫蛍光ベースのワークフローに対応しており、設置や運用にコーディングの専門知識は必要ありません。このソフトウェアは、単細胞のマイクログリア形態解析を半自動化し、アクセスしやすいグラフィカルユーザーインターフェースを通じて、画像処理およびマスク生成ワークフローをカスタマイズ可能です。この研究は、齧歯類リポ多糖(LPS)誘発神経炎症モデルを用いてMMPSの検証を行うものです。定量的な動物レベル解析により、LPS処理動物のミクログリアは、ビークル処理対照群と比較してソーマ面積(p < 0.01)と細胞周囲周長が減少する(p < 0.05)を示し、微グリア活性化および神経炎症に関連する形態的特徴と一致することが示されました。総じて、MMPSは実験室間でマイクログリア形態の定量解析のための標準化され再現性の高いプラットフォームを提供します。

概要

ミクログリアは中枢神経系(CNS)の先天免疫細胞で、周囲の病原体や組織損傷を継続的に監視します^。活性化後、ミクログリアはプロセスを引き戻し、恒常的で分岐した形態からアメーバ型表現型^へと移行します^。虚血性脳卒中などの神経変性疾患では^4,5、アルツハイマー病では^6,7。ミクログリアは、持続的なサイトカイン産生、広範な組織分解、食細胞作用を通じて神経炎症を持続させることが多い^です。これらの過程は神経血管ユニットの破壊に寄与し、微膠細胞の活性化や中枢神経系損傷をさらに悪化^{させ、これにより}ミクログリアは治療的標的として有望な^9,10。

神経変性疾患における微粒膠細胞サブ集団間の微妙な違いを特定する一つの方法は形態学的解析です。これは一般的に、Cx3CR1-GFP動物を用いてin vivoの2光子顕微鏡¹¹、またはイオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)やP2Yプリノ受容体¹²などの確立されたミクログリアマーカーの免疫蛍光(IF)標識によって行われます。損傷後、ミクログリアはしばしば恒常性形態とアメーバ形態の間を移行しますが、過去の研究では、超分枝型ミ^{ログリア3,13}、ハニカム型ミ^{ログリア3,14}、反応性ミログリア¹⁵、桿体ミ^{ログリア3,16}など、追加の表現型も採用できることが示されています.しかし、ミクログリウム形態学の研究はしばしば恒常性およびアメーバイド表現型の手動分類に依存しています。これらの手法は専門的な分析パイプラインを必要とし、検査室間で標準化が欠如していることが多く、恒常性表現型と超分岐表現型などの類似形態の区別を訓練を受けた職員でも困難にしています¹⁷。さらに、微微な形態変化のIFベースの解析には高分解能イメージングが必要であり、さらなる技術的課題を伴います。

これらの制約に対処するため、半自動的に¹¹ または^{自動的に18} のマイクログリアを検出し、ユーザー定義のターゲット領域(例:200–800μm^²)にわたって複数の二値表現(「マスク」と呼ばれる)を生成する分析プラットフォームが開発されています。これらのアプローチはユーザーバイアスを減らし、再現性を高め、分析効率を向上させます。これらの進歩にもかかわらず、現在利用可能な多くのソフトウェアプラットフォームには、オープンソースのアクセシビリティ不足(¹⁷)、コーディング専門知識の要件(^11、19、20)、 生体内 の二光子顕微鏡システムへの依存(^11、19)、直感的なグラフィカルユーザーインターフェースの欠如(^11、21、22)、動作が遅いなど、広範な普及を制限する制約があります処理速度¹¹、または商用ソフトウェアプラットフォームへの依存^12、19、21。近年の研究でこれらの課題のいくつかが取り上げられ始めていますが、多くの既存プラットフォームは依然としてIFベースのワークフローには適していません。IFはミクログリア形態の研究に広く使われています。

ここに紹介するのは、利用者向けのミクグリア形態解析プラットフォームであるMapping Microglial Parameters Software(MMPS)です。MMPSはコーディングの専門知識を必要とせず、確立されたImageJベースのワークフローと統合され、IF画像の利用を目的に設計されています。このソフトウェアはPython 3.11で開発され、以前に公開されたオープンソースの形態学プラットフォームの概念を取り入れています^。MMPSは直感的なグラフィカルユーザーインターフェースを備えており、複数のカスタマイズ可能な画像処理オプションを用いて大量のIF画像をインポート・処理できます。また、IFイメージング中に発生する過剰サンプリングアーティファクトを最小限に抑えるための手動セル選択や、ソーマ測定における細胞プロセスの含め込みを防ぐための手動ソーマアウトラインも取り入れています。さらに、MMPSにはカスタマイズ可能なマスク生成パラメータや複数の品質保証機能が含まれており、マスク精度の向上に努めています。このソフトウェアは、周囲、平均重心距離、マスク面積、離心率、円度、ソーマ面積など、一般的に使われるいくつかの形態パラメータを計算します。より高度な研究では、MMPS生成の出力は複数のImageJプラグインと互換性があり、フラクタル、骨格、ハル解析用のプラグインを用いてさらに解析できます。

MMPSは、皮質層IV内の小膠細胞変異を調べた齧歯類リポ多糖(LPS)誘発神経炎症モデルを用いて検証されました。定量解析により、LPS投与は車両処理対照群と比較して微粒細胞体面積を有意に増加させ、細胞周囲を縮小することが示されており、MMPSは微粒膠細胞活性化に関連する微妙な形態変化を正確に検出できることを示しました。

プロトコル

すべての動物処置は、ウェストバージニア大学の施設動物ケア・使用委員会(プロトコル#2109047180)および国立衛生研究所(NIH)が支援する実験動物のケアと使用ガイドに従って実施されました。この方法で使用される装置、試薬、ソフトウェアは 材料表に記載されています。

1. 実験動物

1. 2〜3ヶ月のオスのスプラグ・ドーリーラットを10匹入手しましょう。ラットが動物施設に到着したら、12時間の明暗サイクルでグループ収容され、自由に餌や水を利用できます。到着後、使用前に3日間の環境環境を整えます。
2. ラットをランダムに車両群またはLPS処理群に割り当てます(n=5匹/群)。
   注:使用するラットの数が少ないため、単純なランダム化戦略を用い、コンピュータ生成の乱数でラットを処理群に割り当てることができます。
3. 治療後のラットの「病気行動」:体重減少(>15%)、ポルフィリン分泌、呼吸器異常、活動減少など。
   注:嘔吐行動の症状は投与後最初の12時間以内に現れることが多く、早朝(6〜8時)に注射し、一日中行動を監視し、ラットは午後5〜7時に施設に戻してください。

2. 神経炎症モデル

1. 50mgのLPSを5mLのリン酸塩緩衝生理食塩水に溶かして、LPS(O111:B4)ストック溶液(10 mg/mL)を調製します。
   注: LPSはエンドトキシンです。研究者は所属機関の取り扱いおよび廃棄に関する標準作業手順(SOP)に従うべきです。
2. ラットの体重を量り、その後腹膜内にLPS(10 mg/kg)またはPBS(ビークル)を注射します。
3. ラットの体重に基づくと、注入量は150〜300μLと予想されます。
4. 注射後24時間後に心臓灌流でラットを安楽死させ、その後首を切断します。
5. ラットには吸入したイソフルラン_(酸素に5%)を5〜10分間麻酔します。足の引き込み反射がないことで麻酔を確認しましょう。
6. 麻酔中に胸椎の正中切開をして横隔膜と胸骨を露出させます。歯骨突起を止血鉗で挟み、胸腔を露出させます。
7. 横隔膜と肋骨を前肢に向かって切り、心臓を露出させます。
8. 降行大動脈と下大静脈を止血鉗で挟みます。左心室に25ゲージのウィングドニードルを挿入します。
9. 蠕動ポンプを使って氷冷PBS(25 mL、30 mL/分)をラットに灌流します。灌流開始後数秒以内に左心房を切開し、灌流液の排出を可能にしてください。
10. 4%パラホルマルデヒド(25 mL、30 mL/分)を灌流。
    注意: 適切な個人用防護具を用いて、換気の良い環境でパラホルムアルデヒドを扱いましょう。パラホルムアルデヒド廃棄物は、機関および地域の規制に従って処分してください。
11. 灌流後にギロチンでラットの首を切断します。
    注意:斬首の記録や刃物の研ぎに関して、所属機関のガイドラインに従ってください。
12. 頭皮を耳垂に引き戻して頭蓋骨を露出させます。
13. 眼窩に挿入した止血鉗やロンジュールで前頭骨を骨折します。
14. ピンセットを大孔に挿入し、頭頂骨を剥がします。
15. 細かい鉗子で脳を摘出し、4%パラホルマルデヒドで一晩培養します。
16. 脳を順次、20%ショ糖と30%ショ糖に一晩かけて移し、冷凍保護を行います。

3. 免疫蛍光

1. Tissue Tek O.C.T.化合物でクライオプロテクト脳をドライアイスに凍結します。
2. クライオスタットで脳を30μmで切開します。
3. PBSで断面を採取し、12ウェルプレートに挿入されたネットウェルに移します。
4. ラット1匹につき少なくとも2つの前背側海馬のセクションを選択します。
5. PBSで5分間、2回、ブロックしながら切面を洗います。
6. 0.3%のTriton X-100/PBSで断片を45分間浸透させながら揺れます。
   注: 特に指定がない限り、洗浄または培養ごとに3mLの溶液を使用してください。
7. PBSで5分間、2回洗う部分を洗います。
8. 抗原回収液をPBSの1倍に希釈し、1ウェルあたり2 mLを加えます。
9. 切片を80°Cで20分間水浴で培養します。
10. 作業を進める前に、区画を室温まで冷やしてください。
11. PBSで5分間、2回洗う部分を洗います。
12. ブロックセクションは10%ロバ血清/0.05%トリトンX-100/PBSで37°Cで2時間、75rpmで振る。
13. 1%のドンキーセラム/0.05%のTriton X-100/PBSで5分間、3回洗浄します。
14. ネットウェルなしの新しい12ウェルプレートにセクションを移し、1%ロバ血清/0.05%トリトンX-100/PBSで調製した500μLの一次抗Iba1抗体溶液を含みます。
15. インキュベーション溶液から一次抗体を省略して陰性対照を準備します。
16. すべてのセクションを軌道ロッカーで4°Cの温度で一晩孵化させます
17. セクションをネットウェルに戻す。
18. 1%のドンキーセラム/0.05%のトリトンX-100/PBSで10分間3回洗浄します。
19. 抗ウサギ二次抗体(希釈1:1000)を室温で1%のロバ血清/0.05%トリトンX-100/PBSで1.5時間培養します。
    注: その後のすべての処置では光の照射を最小限に抑え、蛍光色素の劣化を防ぐためにアルミホイルでプレートを包みます。
20. PBSで5分間、2回洗う部分を洗います。
21. 顕微鏡スライドに断片を取り付けます。
22. 暗闇の中で>2時間自然乾燥させてください。
23. 水溶性化合物を用いたカバースリップ切断。
24. マウンティングメディウムを使ってネガティブコントロールスライドを準備します。
25. スライドは室温の暗い環境でスライドボックスに保管してください。

4. イメージング

1. イメージングシステムのピクセルサイズを40倍倍で特定します。スケールが見つからない場合は、各画像にスケールバーを追加します。
2. DAPI染色を用いて、皮質層IVに対応する低倍率の濃い皮質核の帯を特定します。
3. 画像を特定された皮質領域に焦点を合わせてください。
4. 40倍倍に切り替えてください。
5. DAPIおよびIba1信号を背景蛍光から最大限に分離するためにチャンネル露光設定を調整します。
6. ミクログリアの全深さにわたるZスタック画像(>30ステップ)を取得します。
7. 両方の染色のZスタックから合成最大強度投影画像を生成し保存します。
   注: 各画像の露出とZスタック設定を最適化し、DAPI/Iba1と背景蛍光の信号分離を最大化します。信号分離が悪いとマスク生成の精度が低下します。

5. 微粒膠細胞パラメータのマッピングソフトウェア(MMPS)

1. すべての合成画像を単一の画像ディレクトリに保存します。
2. MMPSで生成された結果用の別の出力ディレクトリを作成します。
3. GitHubリポジトリからMMPSスタンドアロンパッケージまたは MMPS.py スクリプトをダウンロードしてください。
4. MMPS.py 経由でMMPSを起動する場合は、requirements.txtファイルに記載されているすべての依存関係をインストールしてください。
5. MMPSパッケージを開くか、スクリプトを実行する MMPS.py。
6. 「画像フォルダを選択する」を選び、画像ディレクトリを選択します。
7. 「出力フォルダを選択する」を選び、出力ディレクトリを選択します。
8. オペレーティングシステムから求められた場合、フォルダアクセス権限を付与します。
   注: 追加のインストール手順、トラブルシューティングのガイダンス、使用例は補助ドキュメントおよびGitHubリポジトリに掲載されています。
9. 「画像ラベリング」を選択し、各画像に動物識別子と処理グループを割り当ててください。
   注: 画像ラベリングが省略されている場合、MMPSはデータエクスポート前に処理群および動物識別子を入力するプロンプトを出します。
10. 「パラメータ」タブからピクセルサイズを入力します。
11. ピクセルサイズが不明な場合は「スケールバーからキャリブレート」を選択してください。表示されたらスケールバーの開始点と終了点を選択します。ここで既知のスケールバー距離(マイクロメートル)が登場します。
12. マイクログリア信号を含む蛍光チャネルを選択します。
13. 各画像名の横にあるチェックボックスにチェックを入れて処理対象画像を選択してください。背景蛍光が画像ごとに大きく異なる場合は、個別に画像を処理します。
14. 「オリジナル」「プレビュー」「処理済み」「マスク」タブを確認し、画像処理の段階を比較してください。
15. 画像処理設定を評価するには「現在の画像プレビュー」を選択してください。
16. 必要に応じて、ローリングボールの背景減算、ノイズ除去、シャープ化の設定を調整してください。
17. 背景の減算には5〜150ピクセルのローリングボール値を使いましょう。
18. 3〜7ピクセルのノイズ除去値を用いて、不均一な照明アーティファクトを減らします。
19. エッジの定義を改善するために、シャープニング値は1〜2の間で使われます。
20. 画像処理設定の最適化後に「選択画像の処理」を選択してください。
    注: 画像処理時間は画像数や選択されたパラメータによって異なります。
21. 「ソーマ(すべての画像)を選んでください」を選びます。
22. RGB合成画像を表示するには「色を表示(C)」を選択してください。「チャンネル...」を選択してください。画像の色が歪んでいるように見える場合は未使用チャンネルの選択を解除します。
23. DAPIとIba1の共局在を示す選択的なミクログリアソーマ。画像の境界に接触するセルを選択しないようにしてください。誤って選ばれたソーママーカーは「バックスペース」または「削除」キーで削除してください。
24. 「Enter」または「Return」を押して次の画像に進みます。
25. ソーマ選択が完了したら「ソーマ(全)のアウトライン」を選択してください。
26. 選択された各ミクログリア細胞のソーマ周囲を概説します。ソーマのアウトラインから細胞プロセスは除外し、ソーマごとに少なくとも8つのアウトラインポイントを使用します。誤って配置されたアウトラインポイントは「元の位置取り消し」「削除」または「バックスペース」で削除してください。
27. 報道 「Enter」「Return」、ダブルクリック、右クリックで各ソーマのアウトラインを確定できます。
28. 必要なら「最後のアウトラインをやり直す」を選択して、前のSomaアウトラインを繰り返してください。
29. Somaのアウトライン作成を終えた後、「すべてのマスクを生成する」を選択してください。
30. マスクに低強度の背景ピクセルを取り込むのを制限するために最小閾値を適用します。
    注: 高い値は分岐を犠牲にして分岐精度を保ち、低い値は分岐精度を保つ代わりにソマを犠牲にします。10〜30%の閾値は通常、バランスの取れた背景抑制と枝の保存を提供します。
    注: マスク生成時間は選択セルの数によって異なります。
31. 「QA All Masks」を選択して、マスクの品質保証を開始してください。
32. 最大(800μm^²)から最小(200μm^²)までのマスクをレビューします。
33. 各マスクを対応するミクログリアと「処理済み」と「マスク」タブを使って比較してください。
34. 「A」キーのショートカットでマスクを受け入れます。「R」キーのショートカットでマスクを拒否してください。「B」ボタンを押すと、合格または拒否を取り消します。キーボードの矢印キーを使ってマスクのサイズを操作できます。
35. 隣接する細胞や過剰な背景、画像の境界線、スケールバーを含まず、マイクログリア分岐を正確に捉える最大で許容できるマスクを選択してください。
    注: 正確さに不確かさがある場合はマスクを拒否してください。
    注: 「すべてのマスクをクリア」を選択し、ほとんどが誤った場合は異なる閾値でマスクを再生成します。
36. マスク品質保証が完了した後、「Calculate Simple Characteristics」を選択してください。
    許容されたマスクとソーマの輪郭線を用いて、平均重心距離、マスク面積、周囲、離心率、丸み、ソーマサイズを計算します。
37. 神経炎症におけるパラメータ定義と微粒膠質の傾向については 表1 を参照してください。
38. ダウンロード 「Sholl.py」「FractalAnalysis_ImageJ.py」「SkeletonAnalysisImageJ.py」で追加の分析を行うことができます。
39. フラクタルやハル解析用のFijiプラグインとして「FractalAnalysis_ImageJ.py」を開いてください。
40. 出力ディレクトリの場所とピクセルサイズを入力すると、促されました。最大許容マスクのみを分析したい場合は「最大のマスクのみ」オプションを選択してください。
41. Sholl解析用のFijiプラグインとして「Sholl.py」を開いてください。
42. 出力ディレクトリの場所とピクセルサイズを入力すると、促されました。
43. 希望するショル解析ステップサイズを入力します。「開始半径としてソーマ半径を使う」を選択して、MMPS由来のソーマ半径をSholl解析の開始半径として使用してください。MMPS由来のソーマ半径が使われない場合は、固定されたソーマ半径値を入力します。
44. 骨格解析用のフィジープラグインとして「SkeletonAnalysisImageJ.py」を開いてください。
45. 出力ディレクトリの場所、ピクセルサイズ、マスクフォルダの場所を入力すると、促されました。
46. 完成したら、プラグインで生成されたすべての結果をCSVファイルとして出力ディレクトリにエクスポートしてください。

6. ミクログリア形態計算に用いられるMMPSの式

注: すべての計算は「Calculate Simple Characteristics」を押すとMMPSによって自動的に行われます。パラメータの計算は以下に示されています。

1. 周囲
   1. 次の式で周囲周長を計算します。
      
   2. 周長を辺数、ピクセルサイズ(μm)として定義します。
2. 平均重心距離
   注: 平均重心距離は細胞拡散¹¹とも呼ばれます。
   1. セル座標に基づいて4つの分岐エンドポイントを特定します。
      上分岐:最小y座標、
      下部枝:最大y座標、
      左枝:最小x座標、
      右枝:最大x座標。
   2. 重心座標は以下の式を用いて計算します。
      
      
   3. c_x と c_y を重心座標、x_i と y_i をピクセル座標、そしてピクセル数の合計と定義します。
   4. 次の式を用いて枝の距離を計算します:
      
   5. d を分岐距離、x_i と y_i を分岐端座標、c _x と _{c y} を重心座標と定義します。
   6. 平均重心距離は次の式で計算します:
      
   7. 平均重心距離を、分岐距離を d_i と定義し、ピクセルサイズ(μm)を定義します。
3. マスクエリア
   1. マスク面積は以下の式で計算します:
      
   2. マスク面積を^μm²単位で定義し、マスク内のピクセル数を、ピクセルサイズμmを定義します。
4. 風変わりさ
   1. 次の式を用いて二次中心モーメントを計算します。
      
      
      
   2. μ₂₀、μ₀₂、μ₁₁ を第二中心モーメント、x_i と y_i をピクセル座標、c_x と c_y を重心座標、 N をピクセル数として定義します。
   3. 次の式を用いて共分散行列固有値を計算します。
      
   4. λ₁ ≥ λ₂ を定義します。
   5. 以下の式を用いて長軸と短軸の長さを計算します。
      
   6. aを長軸の長さ、bを短軸の長さと定義します。
   7. 離心率は次の式を用いて計算します。
      
   8. 風変わりさとは何か。
5. 丸み
   1. 丸みを次の式で計算します:
      
   2. を円度、長軸の長さを、短軸の長さを定義します。
6. ソーマサイズ
   1. ソーマ面積は次の式で計算します:
      
   2. Saをソーマ面積(^μm²)と定義し、ソーママスク内のピクセル数として、Sをピクセルサイズ(μm)とします。

7. 統計解析

1. すべての統計解析はRバージョン4.3.2を使用して実施してください。
2. 各セルに対して最大許容マスクを用いてデータセットをフィルタリングします。
3. 統計解析前の動物レベルの平均細胞パラメータ。
4. シャピロ–ウィルク検定およびレヴェーン検定を用いて正規性と分散を評価する。
5. データセットがパラメトリック仮定を満たす場合、学生のt検定または反復平均ANOVAを事後ホルム補正のペアt検定で実施します。
6. データセットがパラメトリック仮定を満たさない場合は、ホルム補正済みウィルコクソン符号付き順格検定を用いてウィルコクソンのランク和またはフリードマン検定を行います。
7. 統計的有意性を p < 0.05 と定義します。

結果

オープンソースのスタンドアロンのミクログル形態解析プラットフォームであるMapping Microglial Parameters Software(MMPS)が開発され、IFベースのミクグリア形態解析のためのアクセスしやすく標準化されたワークフローを提供します。このプラットフォームは従来の形態学解析手法を基盤としており、コーディングの専門知識は不要で、アクセスしやすいグラフィカルユーザーインターフェースを組み込んでいます。MMPSは微小なマイクログリア分岐の検出を向上させるとともに、マイクログリアマスクの過大評価を最小限に抑えるための複数の安全対策を組み込むことを目的と設計されました。

MMPSはLPS誘導の齧歯類神経炎症モデルを用いて検証されました。組織処理および画像取得後(図1)、一次抗体染色を伴わない陰性対照切片を用いてIF特異性が確認されました(補足図1)。MMPS処理は、IFイメージをソフトウェアインターフェースにインポートすることから始まります(図2A)。このソフトウェアは、マイクログリア信号検出と背景分離を改善するための複数の画像処理オプションを提供します。必須の背景減算はScikit-imageパッケージに実装されたローリングボールアルゴリズムで行われ、SciPyベースのガウスフィルタリングによるオプションのノイズ除去やシャープネスフィルターも利用可能です。画像処理後、ミクログリアソーマは手動で選択され、赤色の選択マーカーで同定されます(図2B)。その後、ソーマ境界は下流の形態学的計算のために手作業で描かれます(図2C)。

図1:神経炎症モデルと処理の図解的概要。 ラットにはLPSまたはPBSを注射し、心臓灌流を経て24時間採取し、その後首を切断しました。脳を抽出し、30μmの断片に切り分けてミクログリアマーカーIba1のIFで使用し、MMPSで処理しました。Biorenderで作成。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:MMPSの使用概観。(A) MMPSで参照される皮質小膠細胞(赤、Iba1)の画像例(青、DAPI)。(スケールバー=75μm、40倍)。MMPSによる画像処理後、背景を縮小し、正確な形態を評価します(B) MMPSで画像処理後、ソマを赤い円で手動で選択し、その後の手順で使用します(スケールバー=75μm、40倍)。 (C) 代表的な2つのミクログリアを手動でアウトラインし、保存されたソーマのアウトライン画像を以下に示します。 (D) 選択された細胞のマスク生成は最大800μm^²までのミクログル枝を自動的に追跡しますが、手動の品質保証が必要です。ここでは、不正確な800μm2マスクを表示し、その後により正確な700μm2マスクを表示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ソーマアウトライン後、MMPSはユーザーが定義した最小強度閾値に制約された適応的閾値を用いて、200〜800μm^² サイズ範囲にわたって反復的にマスクを生成します。小型のマスクはユーザー定義の閾値により厳密に従い、大型マスクは枝の組み込みを最大化するために閾値制限を段階的に緩和します。生成されたマスクは、隣接セルの挿入、過剰な背景の組み込み、画像の境界線やスケールバーによる切断を防ぐために、手動の品質保証レビューを受けます。図2Dに示すように、代表的なミクログリア細胞の800μm^²マスクは隣接細胞に拡張されました。800μm2マスクのリジェクションと700μm2マスクの選択により、セグメント誤差を修正しつつ、ターゲットミクログリアの正確な区画を保持しました。

MMPS処理後、各細胞に対して最大限のマスクを用いてミクログリア活性化を評価しました。これらのマスクは遠位分岐を最も正確に捉えつつ、背景の取り込みを最小限に抑えました。計算された形態的パラメータは表1にまとめられ、図3に示されています。LPS投与は、車両処理対照群と比較して平均重心距離および細胞周囲を有意に減少させました(p < 0.05;図3A,B)は、活性化中の微小膠細胞突起の縮退と一致しています。マスク面積、丸み、離心率には治療群間で有意な差は認められませんでした(図3C–E)。これらのパラメータは活性化された微粒細胞^表現型と関連付けられている報告があった^3,23。本研究は、ソーマ形状やマスク面積の微妙な違いを統計的に検出する精度を持っておらず、ミクログアのサブポピュレーションはこれらの傾向に均一に従わない異質な炎症形態を採用することがある(³)。対照的に、LPS処理動物では身体圧群と比較してソーマ面積が有意に増加しました(p < 0.01;図3F)は、活性化に関連する形態的再^{構築をさらに}支持しています。

図3:微膠細胞形態パラメータの比較。 すべてのパネルで正常性検定(Shapiro-WilkおよびLevene)が行われ、すべてのケースで有意でない値(p>0.05)が見つかり、学生t検定が採用されました。 点は個体動物を表します(n=5件)(A)車両群の平均重心距離はLPS処理群と比べて有意に長かった。(B) ミクログリア細胞の周囲は、車両群でLPS治療群と比べて有意に大きい。(C) 治療群間でマスク面積に有意差は認められなかった。(D) グループ間でソーマの偏心率に有意な差は認められなかった。(E) 処理群間でソーマの丸みに有意な差はありません。(F) LPS群 のソーマ面積は * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 の有意な増加が見られました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

パラメータ	定義	小膠細胞活性化との関係
平均重心距離	最上、右、下、左の位置における最端の枝の平均距離	減少
周囲	セルの周囲の測定	減少
マスクエリア	セルの実際の面積であって、ターゲットマスクの面積ではありません	減少
風変わりさ	細胞体質のおおよその伸長(0:円形、1:非常に伸長)の測定値	減少
丸み	細胞ソーマの近似円形(0:細長、1:円形)の測定値	増加
ソーマサイズ	細胞ソーマの領域	増加

表1:MMPSから計算されたパラメータとミクログリア活性化反応の予測変化。 この表は、Mapping Microglial Parameters Software(MMPS)によって算出された形態パラメータをまとめたもので、周囲長、平均重心距離、マスク面積、離心率、丸み、ソーマ面積などが含まれます。

その後、同じ画像セットを盲検で未訓練のユーザーに提供し、独立した分析のためにユーザー間再現性を評価しました(補足図2参照)。ユーザー間で統計的に有意な差は認められず、すべてのユーザーはLPS処理動物においてミクログリア活性化と一致する形態的傾向を再現しました。

MMPSはさらに、下流の高度な形態学的解析もサポートします。 図3 から生成されたパラメータの相関解析により、異なる形態的特徴間の関係性が示されました。車両処理ラットでは、ミクログリアの丸みと周囲の相関は弱い(R² = 0.17)しか示されず、LPS処理ラットではより強い相関(R² = 0.64)が示され、ミクログリウム活性化の増加は円度と周囲の同時減少と関連していることが示唆されました(図4A)。さらに、マスク領域は、車両群およびLPS処理群の両方で平均重心距離と強い正の相関を示しました(それぞれR² = 0.71および0.88)、これは微粒細胞活性化状態に関連する分岐複雑性の変化と一致しています(図4B)。

図4:ミクログリアパラメータの高度な解析。 すべてのパネルは、通常の最小二乗法で計算された動物レベルの最適適合線で、決定係数(R²)と表示され、95%信頼区間でシェーディングされています。 (A) ミクログリアソーマの丸みと総周囲長は、ビクター群で弱い傾向を示します(R² = 0.17)が、LPS曝露後は相関が強い(R² = 0.64)。 (B) 平均重心距離は、ビークル群(R² = 0.71)およびLPS(R² = 0.88)群におけるミクログリアの面積と相関します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:否定対照によるIFプロトコルの検証。各ラットの同一領域の脳スライス1枚を一次抗体追加なしにIFプロトコルを受け、自己蛍光の欠如を確認しました(スケールバー=75μm)( A)DAPI の車両染色組織の代表画像(青)。 (B) Iba1の車両染色組織の代表画像(赤)。 (C) DAPI(青)およびIba1(赤)の車両染色組織の代表画像。 (D) DAPIのLPS染色組織の代表画像(青)。 (E) Iba1のLPS染色組織の代表画像(赤)。 (F) DAPI(青)およびIba1(赤)のLPS染色組織の代表画像。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:MMPSのユーザー間変動の評価。複数のブラインドユーザーが 図3 の同じサンプルに対してMMPSを使用し、動物レベルの結果を比較しました。すべての検定(Shapiro-WilkおよびLevene)は有意でなかった(p>0.05)ため、事後補正ホルム補正による対対t検定(p>0.05)を用いた反復平均ANOVAが利用された。 (A) 各グループ間で平均重心距離(p>0.05)で有意差は認められなかった。 (B) 周囲値(p>0.05)で各グループ間で有意差は認められなかった。 (C) マスク面積に関して各グループ間で有意差は認められませんでした(p>0.05)。 (D) 各グループ間で離心率の有意な差は認められなかった(p>0.05)。 (E) 各グループ間で丸み度(p>0.05)に有意差は認められなかった。 (F) 各グループ間でソーマ領域の有意な差は認められなかった(p>0.05)。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

この手法の主な目的は、共通の技術的障壁を減らしつつ、確立された形態学的評価手法の強みを維持しつつ、ミクログル形態分析へのアクセスを拡大することです。MMPSは、フラクタル解析、骨格解析、シェル解析、ショール解析などの高度な解析との互換性を維持しつつ、微細な微膠細胞形態的変化の検出を可能にします。既に発表された手法と比較して、MMPSはアクセスしやすいグラフィカルユーザーインターフェース、一般的に使われる形態パラメータの統合計算、コーディング要件の排除、さらに高度な下流解析との互換性を維持しつつ提供します。

いくつかの重要な方法論的ステップが、分析の正確性と再現性に大きな影響を与えます。高品質な免疫蛍光(IF)イメージングは、信頼性の高いマスク生成および形態学計算に不可欠です。抗体特異性は画像品質の主要な決定要因であり、非特異的標識は背景蛍光を増加させ、ミクログリアと周囲組織間の信号分離を低下させます。同様に、最適でない抗体濃度は蛍光強度を低下させ、画像解像度を低下させることがあります。Zスタック画像の取得も極めて重要です。なぜなら、Zスタック画像の省略は見かけの微グリウム分岐の複雑さやプロセスの拡散を人工的に変え、形態学的計算に偏りが生じる可能性があるからです。

MMPS処理時にはいくつかの追加の考慮点が重要です。MMPSはバッチ画像処理をサポートしていますが、背景特性や染色品質が画像ごとに大きく異なるため、個別の画像最適化が望ましいことが多いです。画像品質はマスク生成の精度に直接影響します。したがって、画像前処理時の最適化は、下流解析の再現性と堅牢性を大幅に向上させます。微粒細胞体細胞の慎重な選択も重要であり、特に細胞が画像境界に接触するのを避けることが重要です。部分細胞選択は体細胞の測定値を人工的に減らし、マスク生成を歪める可能性があります。マスク品質保証審査では、隣接セルを含むマスクや過剰な背景、画像の境界線を含むマスクは拒否すべきです。逆に、すべての遠位プロセスを捉えられないからといって、小さなマスクを却下すべきではありません。反復マスク生成アルゴリズムは、マスクのサイズや地域ピクセル強度に応じて局所的な閾値パラメータを意図的に調整するためです。

この手法は非常に適応性が高く、特定の実験要件に合わせて修正可能です。MMPSはオープンソースであるため、個々のZスタックフレームの解析や自動セル検出アルゴリズムの組み込みに拡張でき、完全自動化された形態学解析パイプラインを生成できます。さらに、生成されたマスクやソーマアウトラインは、フラクタル、ハル、スケルトン、Sholl解析のImageJベースのワークフローと互換性があります。MMPSはPython 3.11で開発されたため、外部のソフトウェアプラットフォームを必要とせず、一般的な科学的Pythonパッケージを使って追加の解析を直接ソフトウェアに組み込むことも可能です。

これらの利点にもかかわらず、いくつかの制限を考慮する必要があります。MMPSは、オスのスプラグ・ドーリーラットの特定の脳領域における神経炎症モデルを用いて検証され、異なる脳領域、疾患モデル、種、生物学的性別が形態学的結果に影響を与える可能性があります。したがって、MMPSの代替実験パラダイムへの適用性は、パイロット研究を通じて検証されるか、既存文献比較によって裏付けられるべきです。さらに、IFベースのイメージングは、焦点面の真上または真下に伸びるプロセスが最大投影画像では検出できないため、三次元の分岐構造を不完全に捉えることができます。解析される細胞数を増やすことで、この制限を緩和するのに役立つかもしれません。MMPSは画像取得品質に依存しているため、個々のイメージングシステム、染色プロトコル、抗体調製の最適化が必要です。低解像度画像は、ソマの周囲の境界がぼやけたり、枝が密集しているため、マスクのサイズを人工的に膨らませることがあります。このため、本プロトコルではフリーフローティングIF手法と複数の画像処理オプションを組み込み、画質を最大化しています。

MMPSはユーザーが手動でセルを選択し、ソーマをアウトライン化するため、ユーザー依存的な変動の可能性も保持しています。しかし、DAPIとIba1の共局在を用いることで、細胞選択時の曖昧さが大幅に軽減されます。さらに、ブラインドユーザー間分析では、未学習ユーザー間での変動が最小限であることが示され、分析ワークフローの再現性を支持しました。

これまでに発表されたいくつかのミクログル形態学プラットフォームとは異なり、MMPSは完全に自動化されているわけではありません。しかし、この設計はセグメンテーションの精度とマスク品質保証を優先するために選ばれました。Pythonのソースコードを修正することで、DAPI/Iba1の共定位検出、輪郭ベースのソーマアウトライン作成、機械学習によるマスクの受理または拒否を可能にするために、自動化されたワークフローを組み込むことができます。さらに、MMPSは生成されたマスクやソーマのアウトラインが自動的に.tiffファイルとして保存され、下の分析や品質保証のために大幅なディスクストレージ容量を必要とします。ストレージ要件は、ソフトウェアを修正してセルごとにマスクを逐次生成し、その後即時の品質評価とパラメータ抽出を行うことで削減できます。

結論として、MMPSはコーディングの専門知識や 生体内 イメージング能力を必要としない標準化されたオープンソースプラットフォームを提供することで、ミクログル形態の定量的解析へのアクセスを拡大します。このプラットフォームは、IFベースのミクグリア形態の再現性を可能にしつつ、先進的な下流解析手法との互換性を維持します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12ウェルプレート	Fisher Scientific	07-200-82	組織切片のインキュベーションと洗浄に使用するプレート。
アルミニウム箔	Fisher Scientific	01-213-101	蛍光サンプルを光線から保護するために使用。
抗原回収バッファー（10×）	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	免疫蛍光染色中の抗原アクセシビリティを向上させるために使用。
抗Iba1一次抗体	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	ミクログリアの免疫蛍光ラベリングに使用する一次抗体。
凍結切片機	Fisher Scientific	95-710-0L	凍結脳組織を定義された厚さで切片するために使用する機器。
ウサギ抗体に対するヤギIgG、Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	ウサギ一次抗体の可視化に使用する蛍光二次抗体。
ヤギ血清	Fisher Scientific	50-413-115	非特異的な抗体結合を減少させるために使用するブロッキング試薬。
EVOS FL Auto 2イメージングシステム	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	画像取得に使用する蛍光顕微鏡。
Fiji（ImageJ）2.16.0	NIH	fiji.sc	下流の形態学分析とプラグインに使用する画像処理プラットフォーム。
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	蛍光を保存し、カバースライドを固定するために使用するマウンティング媒体。
イソフルラン	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	動物実験中に使用する吸入麻酔薬。
リポポリサッカライド	Millipore Sigma	L2630	げっ歯類の全身性神経炎症とミクログリア活性化を誘導するために使用。
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		データ可視化と図の生成に使用するPythonプロットライブラリ。
MMPS（Mapping Microglial Parameters Software）v1.00	この作品	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	ミクログリア形態学分析用に開発されたオープンソースソフトウェアプラットフォーム。
ネットウェル	Millipore Sigma	CLS3477	染色手順中にフリーフローティング組織切片を保持するために使用するインサート。
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		MMPS内での数値計算に使用するPythonライブラリ。
対物レンズ（4×）	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	解剖学的方向と領域の識別に使用する低倍率対物レンズ。
対物レンズ（40×）	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	ミクログリア形態学イメージングに使用する高倍率対物レンズ。
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		MMPS内での画像処理機能に使用するコンピュータービジョンライブラリ。
パラホルムアルデヒド	ThermoFisher Scientific	169650025	切片化前の組織灌流と保存に使用する固定剤。
パーマウント	Fisher Scientific	SP15-100	スライド保存に使用する永久マウンティング媒体。
リン酸緩衝生理食塩水	Fisher Scientific	BP3991	組織洗浄と試薬調製に使用する緩衝溶液。
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		画像処理操作に使用するPythonイメージングライブラリ。
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		MMPSのグラフィカルユーザーインターフェースを生成するために使用するPython GUIフレームワーク。
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	MMPSを開発および実行するために使用するプログラミング言語環境。
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	データ分析とグラフ生成に使用する統計ソフトウェア。
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		画像処理とセグメンテーションに使用するPythonイメージ分析ライブラリ。
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		フィルタリングと画像処理操作に使用するPython科学計算パッケージ。
スプラーグ・ドーリーラット	Evingo	002	神経炎症モデルの検証に使用する実験動物。
スクロース	Fisher Scientific	S5-3	脳組織凍結前に使用する凍結保護剤。
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		TIFF画像ファイルを読み書きするために使用するPythonパッケージ。
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	凍結組織サンプルの凍結切片に使用する埋め込み媒体。
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	免疫蛍光中の膜透過性化に使用する界面活性剤。