水酸化ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムを用いた脱細胞化ヒト末梢神経グラフトの作製

サマリー

本プロトコルでは、水酸化ナトリウム処理とペリスタルティックポンプ駆動の溶液交換システムを組み合わせた、標準化されたアルカリ助長脱細胞化法について解説します。これにより、細胞を効果的に除去しつつ、天然の細胞外マトリックス構造を維持した脱細胞化ヒト末梢神経グラフトを作製することが可能です。

要約

末梢神経損傷では、軸索再生のための構造的なガイダンスを提供する移植材料が必要となることが多い。自家神経移植は依然として臨床的なゴールドスタンダードであるが、ドナー部位の罹患や組織の可用性の制限によってその使用は限定されている。これらの制限により、神経再生のための代替バイオマテリアルとして、脱細胞化ヒト末梢神経グラフトへの関心が高まっている。しかし、一般的に使用される界面活性剤ベースの脱細胞化プロトコルは、細胞外マトリックス（ECM）の構造を破壊し、グラフトの品質を損なう可能性のある細胞毒性残留物を残すことがある。本記事では、アルカリ補助脱細胞化アプローチを用いて脱細胞化ヒト末梢神経グラフトを調製するための標準化されたプロトコルを記述する。この手順は、効率的な細胞破壊を促進するための水酸化ナトリウム（NaOH）処理から始まり、続いて軽度のデオキシコール酸ナトリウム（SDC）ステップにより、天然のECM組織を維持しながら、残存する細胞成分および免疫原性成分を除去する。この戦略により、界面活性剤への曝露を制限しつつ、天然のECM構造の維持を支援する。ワークフローには、ドナー神経の調製、制御されたNaOH処理、それに続く軽度のSDC処理、およびペリスタポンプ駆動システムを用いた連続的な溶液交換による広範な洗浄が含まれ、残留処理剤の除去を促進する。さらに、構造的完全性を維持し、最終的な包装および滅菌に向けてグラフトを調製するための後処理ステップが実施される。脱細胞化効率は組織学的解析および残留DNAの定量によって評価し、ECM構造の保存状態は走査電子顕微鏡を用いて調べる。残留SDCの不在および処理済みグラフトの生物学的適合性は、細胞毒性試験を通じて確認された。本プロトコルは、末梢神経再生研究およびトランスレーショナルアプリケーションのための脱細胞化ヒト末梢神経グラフトを製造するための実用的なアプローチを提供する。

概要

末梢神経損傷は深刻な機能障害を引き起こす可能性があり、再生医療および再建外科において依然として重要な臨床的課題となっています。分節的な神経欠損の再生には、損傷部位のギャップを橋渡しするだけでなく、軸索の再生と再神経支配をサポートするための構造的ガイダンスおよび生化学的シグナルを提供する移植材料が必要です。自家神経移植は、天然の細胞外マトリックス（ECM）構造を維持し、神経再生のための支持的な微小環境を提供するため、臨床的なゴールドスタンダードであると広く認識されています^1,2。しかし、その臨床利用は、ドナー組織の可用性の制限、追加の手術手順の必要性、およびドナー部位の合併症によって制限されています^3,4。これらの制限により、代替移植材料の開発、特に免疫原性のある細胞成分を最小限に抑えつつ天然のECM構造を保持した脱細胞化末梢神経移植片の開発が進められてきました^5,6,7,8。

脱細胞化神経グラフトの性能は、脱細胞化プロセスに強く依存します。従来の方法では、一般的にTriton X-100やデオキシコール酸ナトリウム（SDC）などの界面活性剤ベースの試薬が用いられ、脂質膜を可溶化させることで細胞成分を除去します^9,10,11。しかし、これらの界面活性剤に長時間曝露させると、ECMの微細構造が破壊されたり、細胞生存率や再生結果に悪影響を及ぼす細胞毒性物質が残留したりする可能性があります^12,13。その結果、ECMの完全性を維持しながら効率的な細胞除去を可能にする代替的な脱細胞化戦略が活発に研究されています¹⁴。水酸化ナトリウム（NaOH）を用いたアルカリ脱細胞化は、極端なpH条件下で細胞成分、核酸、および脂質を効率的に分解できるため、潜在的な代替アプローチとして登場しました^15,16,17。それにもかかわらず、強力なアルカリ条件下での制御されていない曝露はECMの完全性を損なう可能性があり、処理条件を精密に制御することの重要性が浮き彫りになっています^16,18。

本記事では、ペリスタポンプ駆動の連続溶液交換システムを組み込んだ、ヒト末梢神経移植片のための標準化されたアルカリ補助脱細胞化プロトコルを提示します。従来の静的な浸漬法と比較して、この動的なプロセスは連続的な溶液交換を可能にし、細胞残渣や残留処理剤の除去を促進します。本記事では、ドナー神経の準備、制御されたアルカリ補助脱細胞化、およびペリスタポンプ駆動システムを用いた連続溶液交換を含む、完全なワークフローをステップバイステップの視覚的なデモンストレーションで提供します。得られた移植片は、効率的な脱細胞化とECM超微細構造の保存を確認するため、組織学的解析、残留DNAの定量、および走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて評価されました。重要な技術的ステップを明確に可視化することで、本記事は脱細胞化神経移植片を調製するための明確に定義された枠組みと、将来的なプロセスのスケールアップのための指針を提供します。

プロトコル

寄贈されたヒト末梢神経は、L&C BIOとの独占契約に基づき、米国組織銀行から、米国組織銀行協会（AATB）および米国食品医薬品局（FDA）の規制に従って入手されました。年齢、性別、既往歴、血清学的検査結果を含むドナー情報は組織と共に提供され、認定医療責任者によって審査および承認されました。受領後、すべての組織に対して、ドナースクリーニング、血清学的検査、および関連病原体の検査の確認を含む受入検査が実施されました。事前定義された受理基準を満たした組織のみを本研究に使用しました。ヒト検体を用いたすべての手順は、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施されました。本研究ではヒト被験者を直接募集または関与させていないため、個別の機関審査委員会（IRB）承認番号は発行されていません。

1. 溶液の調製（1日目）

1. 1 Lの蒸留水に10 gのNaOHを加え、マグネチックスターラーで撹拌して0.25 N水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を調製する。
2. 1 Lの蒸留水に40 gのSDCを加え、マグネチックスターラーで撹拌して4%デオキシコール酸ナトリウム（SDC）溶液を調製する。
3. 調製した各溶液を滅菌済みのガラス瓶に移す。
   注意：デオキシコール酸ナトリウム（SDC）は化学薬品用ドラフトチャンバー内で取り扱うこと。吸入および皮膚への接触を防ぐため、手袋、白衣、保護メガネなどの適切な個人用保護具を着用すること。

2. 脱細胞化のための末梢神経節片の調製

1. 包装された末梢神経生材の外表面を消毒し、無菌的に開封します。
2. 末梢神経を滅菌蒸留水で数回洗浄します。
3. 滅菌済みのハサミとピンセットを用いて、残存する脂肪組織、結合組織、不要な分枝、および損傷した神経組織を除去します。その後、末梢神経を再び滅菌蒸留水で洗浄します。
4. 末梢神経を長さ2–5 cmのセグメントに切断します。準備したセグメントを、2–3 cm、>3–4 cm、>4–5 cmの3つの長さグループに分類します。
   注：表1にまとめられている通り、神経セグメントの長さに応じてIPA、NaOH、SDCの処理時間が異なるため、長さグループごとに個別に処理してください。

3. ペリスタルティックポンプシステムのセットアップ

1. 十分な長さの耐化学性シリコンチューブを、クロマトグラフィーカラムの両端に取り付けます。
2. チューブの一端をペリスタルティックポンプに接続します。
3. チューブのもう一端を、ポンプ用チューブを用いてイソプロピルアルコール（IPA）が入った1 Lのガラス瓶に接続し、クローズドループ循環システムを構築します。
   注：ペリスタルティックポンプからの圧力や振動によってチューブがカラムやボトルから外れる可能性があるため、すべてのチューブ接続部をしっかりと固定してください。

4. 末梢神経の脱脂処理

注：特に指示がない限り、すべての溶液交換ステップは、チューブの構成に応じて90–186 mL/minに設定したペリスタルティックポンプを用い、室温（20–25 °C）で実施してください。各処理工程の間、選択した流速を一定に維持してください。

1. クロマトグラフィーカラムの一端を開き、挿入直後に神経組織が浸漬した状態を維持できるよう、IPA溶液をカラムに部分的に満たします。
2. 滅菌鉗子を用い、準備した末梢神経セグメント1本の端にある外側の組織を優しく掴みます。神経の本体を直接圧縮したり掴んだりしないように注意してください。神経セグメントをカラム内の溶液の中へ慎重に下げます。
3. 鉗子を用いて神経セグメントを優しく伸ばし、流体の流れの方向と平行になるよう縦方向に配置します。セグメントが折りたたまれたり、巻いたり、あるいはカラムの内壁や出口フィルターに押し付けられたりしていないことを確認してください。
4. カラムを閉じ、出口側が入口側よりもわずかに高くなるよう、出口に向かって緩やかに上向きに傾けて配置します。この向きにすることで、神経セグメントが両端のフィルター、特に出口フィルターに沈着するのを防ぐことができます。
   注：1回の操作につき、1本のリカラムに対して1本の末梢神経セグメントを処理してください。追加の物理的な固定装置は不要です。神経組織の自然な浮力と比較的緩やかな流体の流れにより、セグメントは懸濁し伸展した状態に維持されます。処理中に組織の位置を確認し、カラム壁やフィルター、あるいは組織同士に付着している場合は、滅菌鉗子で優しく位置を調整してください。
5. IPA溶液をペリスタルティックポンプシステムに接続します。神経セグメントの長さが2–3 cmの場合は1.5 h、>3–4 cmの場合は2 h、>4–5 cmの場合は2.5 h、カラムを通して連続的に溶液交換を行います。
6. カラムから溶液を排出します。
7. 滅菌蒸留水 40 mLをカラムに加えます。カラムを5回優しく反転または振とうし、末梢神経を洗浄します。
8. ステップ4.6および4.7を繰り返し、計5回の洗浄を行います。
9. 5 Lの滅菌蒸留水を入れたリザーバーをペリスタルティックポンプシステムに接続します。一晩、カラムを通して連続的に溶液交換を行います。
   一時停止点：一晩の洗浄が完了した後、手順を一時停止できます。ペリスタルティックポンプを停止し、ステップ5.1に進むまで、末梢神経を滅菌蒸留水に完全に浸漬させた状態で 4 °Cで最大24 h保存してください。
   注：効率的な溶液交換を促進するため、カラム内の気泡を最小限に抑えてください。必要に応じて末梢神経セグメントを調整し、溶液中に懸濁させ、カラム内壁やフィルターへの付着を防いでください。

5. 1回目の脱細胞化を行う（2日目）

1. 0.25 N NaOH溶液をペリスタルティックポンプシステムに接続する。神経セグメントの長さが2–3 cmの場合は6時間、>3–4 cmの場合は8時間、または>4–5 cmの場合は10時間、カラムを通じて溶液の連続交換を行う。
2. カラムから溶液を排出する。
3. 手順4.6–4.8に記載の方法で、末梢神経を洗浄する。
4. 5 Lの滅菌蒸留水を入れたリザーバーをペリスタルティックポンプシステムに接続する。カラムを通じて一晩、溶液の連続交換を行う。
   一時停止ポイント：一晩の洗浄が完了した後、手順を一時停止することができる。ペリスタルティックポンプを停止させ、末梢神経を滅菌蒸留水に完全に浸した状態で4 °Cで最大24時間保存し、その後に手順6.1に進む。

6. 2回目の脱細胞化を行う（3日目）

1. 4% (w/v) SDC溶液をペリスタルティックポンプシステムに接続する。神経セグメントの長さが2～3 cmの場合は6時間、長さが >3～4 cm、またはそれ以下の長さのセグメントの場合は10時間 >4–5 cm
2. カラムから溶液を排出します。
3. ステップ4.6～4.8に記載されている手順に従い、末梢神経を洗浄する。
4. 5 Lの滅菌蒸留水を入れたリザーバーをペリスタルティックポンプシステムに接続する。カラムを用いて、一晩連続的に溶液交換を行う。
   一時停止ポイント：一晩の洗浄が完了した後、手順を一時停止できます。ペリスタルティックポンプを停止し、末梢神経を滅菌蒸留水に完全に浸した状態で、以下の温度で保存してください。 4 °C ステップ7.1に進む前に、最大24時間まで保持する。

7. 脱細胞化した末梢神経の滅菌（4日目）

1. カラムから少量の蒸留水を取り除きます。残った液体の中に浮遊させたまま、脱細胞化末梢神経を慎重に回収します。
2. 末梢神経を滅菌蒸留水とともにパッケージします。
3. パッケージした末梢神経を25 kGyの線量でガンマ線照射し、滅菌します。
   注：カラムから蒸留水を完全に抜き取らないでください。神経セグメントがカラムの内壁に付着するのを防ぎ、液体を溢れさせずに穏やかに取り扱えるよう、十分な量の液体に浮遊させたまま保持してください。

結果

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

ディスカッション

本研究では、末梢神経再生のための脱細胞化ヒト末梢神経グラフトを作製するための、標準化されたアルカリ助長脱細胞化プロトコルを提示します。本プロトコルは、ドナー神経の前処理、制御された化学的脱細胞化、およびペリスタルティックポンプ駆動の溶液交換システムを明確に定義されたワークフローに統合しており、天然のECM構造を維持しつつ、細胞成分や免疫原性成分を効率的に除去することを可能にします。

本手法の重要な特徴は、アルカリ処理と界面活性剤への曝露時間の短縮を統合した点にあります。Sondell法（3% Triton X-100および4% SDC）やHudson法（sulfobetaine-10、sulfobetaine-16、Triton X-200）などの従来の界面活性剤ベースのプロトコルでは、効果的な脱細胞化を行うために、長期にわたる多段階の界面活性剤処理に依存しています^9,10。これらのアプローチは細胞成分を効果的に除去しますが、界面活性剤への長期間の曝露はECMの完全...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BT100-1L マルチチャンネルペリスタルティックポンプ	Longer Pump	BT100-1L	脱脂、脱細胞化、および洗浄中の連続的な循環および溶液交換に使用。
Econo-Column クロマトグラフィーカラム, 2.5 × 10 cm	Bio-Rad	737-2512	連続的な溶液交換中に末梢神経セグメントを保持するために使用。
イソプロピルアルコール (IPA)	Daejeong Chemicals	5035-4410	末梢神経組織の脱脂に使用。
Masterflex Tygon E-LFL ポンプチューブ	Thermo Scientific	06440-16	溶液の連続循環のため、ペリスタルティックポンプ、クロマトグラフィーカラム、および溶液リザーバーを接続するために使用。
デオキシコール酸ナトリウム (SDC)	Sigma-Aldrich	30970-100G	残留細胞成分を除去するための第2段階の脱細胞化用界面活性剤として使用。
水酸化ナトリウム, NaOH	Duksan	1636	細胞破砕用。