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方法論記事

化学遺伝学的およびスペクトル的アプローチを用いた日中の概日リズム位相シフトの誘発

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DOI:

10.3791/71594

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2026年6月12日

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1Section on Light and Circadian Rhythms, National Institute of Mental Health (NIMH), National Institutes of Health (NIH)

この記事について

サマリー

本研究は、信頼性の高い昼間の概日リズム位相シフトを可能にする化学遺伝学および紫光を用いた戦略を導入します。

要約

哺乳類では、昼間の概日リズム位相シフトは視交叉上核(SCN)の光反応性の低下により制限されており、この段階で概日リズム時計を実験的に操作する能力が制限されます。したがって、昼間の位相シフトを誘導する信頼性の高い方法は、概日リズムの可塑性と光の同調機構のメカニズムを調査するために不可欠です。日中の概日リズム時計を強力かつ時間的に正確に操作できるように、遺伝的およびスペクトル的な補完戦略が記述されています。最初のアプローチは現在マウスに限定されており、設計薬剤によって独占的に活性化されたデザイナー受容体(DREADDs)を硝体内で送達し、内因性感光性網膜神経節細胞(ipRGCs)を選択的に活性化する化学遺伝学的戦略を用います。このアプローチにより、視床下部経路の制御された活性化が可能となり、周囲の照明条件に依存しない再現可能な日中の位相シフトを誘発します。2つ目のアプローチは、非侵襲的な代替手段として波長特異的光刺激を用います。紫光への曝露はipRGCのスペクトル感度を利用し、脱分極ブロックを抑え持続的な活性化を促進し、主観的な日中の信頼性の高い位相リセットを可能にします。この方法は哺乳類全般に広く適用可能であり、遺伝子操作や薬理学的介入を必要としません。実験準備、刺激タイミング、ロコモーター活動を用いた位相シフトの検証、c-Fos免疫組織化学によるニューロン活性化の評価に関する詳細なプロトコルが提供されています。概日リズムのタイミング、刺激パラメータ、実験対照などの主要な考慮事項が示されており、再現性を図ります。これらの手法は、日中の概日リズムの位相シフトを誘導するための多用途で実験的に扱いやすいツールを提供し、日中の概日応答性のメカニズムを直接調査することを可能にします。

概要

視交叉上核(SCN)は哺乳類の脳の主要な概日リズムであり、生理学や行動における重要な日々のリズム、睡眠・覚醒サイクルや摂食パターンを調整しています。外部環境との整合性を維持するために、SCNは内在的に光感受性を持つ網膜神経節細胞(ipRGC)から直接光入力を受け取り、網膜の光情報を伝達して内部の概日リズムを太陽日1,2と同期させます。

生物全体における概日リズムシステムの特徴の一つは位相依存応答性であり、異なる概日リズムの時間に同じ刺激が与えられても、著しく異なる効果を生み出すことがあります。哺乳類では、夜間光がSCN時計の位相シフトを確実に誘発しますが、主観的な日中の曝露はリセットをほとんど、あるいは全く生じさせません。この日中の見かけ上の無感度は、in vivoおよびin vitroの両方で一貫して観察されており、光入力を模倣しようとする試みでは有意な位相シフトが引き出されず、5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .

日中の無感度は、少なくとも一部は、位相リセット機構を作用させる網膜の駆動力不足や、SCN内の概日リズムのゲーティング機構に起因するとされています。この考えと一致して、ipRGCは光光条件下で均一に応答するわけではありません。サブセットは脱分極ブロックに入り、持続動作電位17、18、19の発火を制限します。この生理的制約は、日中の従来の光刺激の効果を低下させる可能性があります。この制限を克服すれば、伝統的に発光リセットに耐えると考えられていた昼間の時計可塑性を直接検証できるようになります。

主観的な日中の概日時計の強固な位相シフトを可能にする2つの補完的な手法が説明されています。最初のアプローチは、環境光条件に依存しない化学遺伝学的戦略を用いてipRGCsを選択的に活性化します。具体的には、Opn4Cre/+ マウスは、興奮性デザイナー受容体(DREADD)をコードするアデノ関連ウイルス(AAV)をCre依存的に注射します。概日リズム4(CT4)にクロザピンN-オキシド(CNO)を投与すると、ipRGCsのバースト状発火を誘発し、視床下部網膜経路の持続的な活性化をもたらします19。位相シフトは運動活動記録を用いて定量化され、SCN内の分子活性化はc-Fos免疫組織化学によって評価されます。

2つ目のアプローチは、波長特異的光刺激を非侵襲的な戦略として用い、より広範な応用を目指します。野生型マウスは、概日リズム6(CT6)に紫光(385nm)にさらされ、主観的な日の真ん中に照射されます。紫光は脱分光ブロックを低減させ、青色や白光と比較してipRGC活性化を持続的に支持します19。位相シフトは上記のように定量化されます。

両アプローチとも、ipRGC駆動によるSCNへのシグナル伝達を強化し、主観的な日特有の発光応答性の低下を克服することを目指しています。これらの手法は、伝統的に光のリセットに抵抗が強い段階で概日リズムを操作するための堅牢で実験的に扱いやすい戦略を提供します。

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プロトコル

すべての動物処置は、国立精神衛生研究所(NIMH)動物ケア・利用委員会(ASP-SLCR-01)のガイドラインに従って承認され、実施されました。痛みを最小限に抑え、使用する動物の数を減らすためにあらゆる努力がなされました。使用される研究ツールは 材料表に記載されています。

1. 化学遺伝学戦略

  1. Opn4Cre/+ マウスにおける腺関連ウイルスの硝子体内注射
    1. 立体誘導ステージおよびすべての手術器具を適切な滅菌手順で清掃・滅菌してください。注射装置をセットアップし、ガラス毛細管注射針を取り付けます。
    2. イソフルランでマウスを麻酔します。酸素流量を約1.5 L/minに設定します。誘導時はイソフルランを3%〜5%に調整し、手技中は維持のために1〜3%に減らします。
    3. 足の指をつまんで十分な麻酔を確認してください。離脱や痙攣反射が見られず、完全に麻酔状態にあると考えます。
    4. マウスを温熱パッドの上に置き、施術中は体温を保ちます。
    5. ガラス毛細血管針を抜いてください。針は先端から約1.5mmの位置で、立体顕微鏡下の細かいマーカーで一貫した貫通深度を保証しました。
    6. 鈍い鉗子で下まぶたに優しく圧力をかけ、眼球を少し突き出して背側辺縁を露出させます。背側アプローチを用いて、針を眼の表面に接線方向に挿入し、血管化した辺縁部を避けつつ、強膜を0.5〜1 mm後方に貫通します。
    7. あらかじめ決められた深さまで硝子体チャンバーに針を挿入します。眼圧を緩め、組織による針先の詰まりを防ぐために少し引きます。
    8. 合計1.5μL AAV溶液(2.4 x 1013 GC/ml)を5回連続注射(それぞれ300 nL、50nl/s)で注入します。注射間隔を5秒間置き、広がりを促し逆流を最小限に抑えましょう。最終注射後は30秒待ってからゆっくりと針を抜きます。同じパラメータで対側眼でも同じ手順を繰り返し、外傷や逆流を最小限に抑えるよう注意してください。
    9. 手術直後にケトプロフェン(10 mg/kg、皮下投与)を投与してください。
    10. マウスは少なくとも2週間は回復させ、十分なウイルス発現を確実にしてから行動施設に移送してください。
  2. 車輪走行活動とCNOの管理(図1A)
    1. 走る輪付きのケージに個別に飼い込んだマウス。自動データ取得システムを用いてホイールランニング活動を記録します。
    2. マウスを4〜7日間、12時間12分の明暗サイクルに同調させました。安定した同列を確認し、動物を恒常暗闇(DD)に移行させます。
    3. 分析ソフトウェアを使って活動開始を特定します。夜間齧歯類における活動開始をCT12と定義します。CT4を計算してください。
    4. DDの8日目には、マウスにCT4でCT4のCNO(1 mg/kg)腹腔内注射を受け、薄暗い赤色光の下で投与されます。
    5. 動物を元のケージに戻し、常に暗闇の中で飼育してください。8日間連続して運動活動を記録してください。
    6. 活動開始を特定し、注射前後の期間について回帰分析を行う。位相シフトを予測活動開始と観測開始の差として計算します。
  3. 化学遺伝活性化後のSCN c-Fos免疫組織化学
    1. 12時間12分の明暗サイクルに同束させ、常に暗闇に放たれます。DDの2日目にCT6でCNOを投与します。注射後30分で動物に灌流してください。
      注:CT4は行動実験で使用され、CNOの影響が主観的な夜間に及ぶ可能性を最小限に抑えました。CNOは数時間活動を続けることができるためです。対照的に、CT6はCNOが概日リズム時計に及ぼす急性効果を評価する免疫染色実験に用いられ、注射後30分後に灌流された。
    2. 脳を解剖し、4%パラホルマルデヒドに4°Cで一晩浸して固定します。 組織が沈むまで30%ショ糖でクライオプロテクトを包みます。40μmで冠状切断。
    3. ブロッキング溶液で切片を培養し、その後4°Cで一晩一次抗体培養を行います。 洗浄後、二次抗体とともに1時間培養します。DAPIとマウントセクションでカウンターステインを施します。
    4. 一定の顕微鏡設定で画像を取得しましょう。解析ソフトウェアを用いて画像を現像します。mCherry陽性細胞でAAV感染領域を特定する。

2. スペクトル戦略

  1. 野生型マウスは行動施設に移し、上記の通り走行車付きのケージに個別に収容してください。動物を常に暗闇(DD)下に置き、自由に動く概日リズム活動を監視します。
  2. DDの8日目、概日リズム6(CT6)にケージを遮光キャビネットから外し、ネズミに15分間の光パルスを当てます。
  3. マウスは青色光パルス(λmax = 470 nm;1.8 ×10 14–2.2 × 1014 光子/cm/2/s)または紫色の光パルス(λmax = 385 nm;1.45 × 1014–3.3 × 1014 cm/s)のいずれかにさらし、強度はケージの中心と四隅すべてを動物の目の高さで測定します。
  4. どちらの波長条件でも、ケージの蓋を外したままネズミを自宅のケージに入れて飼いましょう。固定された光源の真下にケージを配置し、光線の中心がケージの中心と揃うようにすることで均一な照明を確保します。
  5. 光に当たった後は、常に暗闇の中でケージを元の位置に戻してください。位相シフト解析のために中断なくホイールランニング活動の記録を継続してください。

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結果

OPN4Cre/+ マウスでCT4で生理食塩水を投与されたAAV-DREADDを発現させたマウスは、ホイールランニング活動に有意な位相シフトを示さなかった(n = 5;図1B)。対照的に、CT4でのCNO投与は活動開始に有意な相遅延をもたらしました(SEM±平均:5.03 ± 0.48時間;n = 5;図1C、D)は、この概日リズム時間におけるDREADDの活性化が運動活動リズムをシフトさせることを示しています。実験設計の回路図は図2Aに示されています。同じマウスでは、CNO投与により注射後30分後のSCN内のc-Fos発現が生理食塩水対照群(図2C、D)と比べて増加し、主観的日中にSC...

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ディスカッション

結果は、主観的な日中にipRGCsが活性化されると、マウスに概日リズムの位相ずれを誘発し、この時期は通常光刺激に対する感受性が低下することが特徴であることを示しています。化学遺伝学的アプローチにより、外部光に依存しないipRGCsの選択的活性化が可能となり、車輪走行挙動において堅牢な位相遅延が実現しました。この活性化はSCNにおける急性c-Fos発現も誘導し、中央概日ペースメーカーの活性化を確認しました。これらの結果は、ipRGC駆動の網膜視床下部経路への強い刺激が、概日リズム系の日中の応答性低下を克服するのに十分であることを示しています。

波長特異的光学刺激は、日中の位相リセットを達成するための補完的かつ非侵襲的な戦略を提供します。紫光の短いパルスは有意な位相遅延を引き起こしましたが、同等の強度・同等の持続時間の青色光パルスはそうではありませんでした。これらの発見は、光のスペクトル的性質が主観的な日中の概日リズムの調節能力に重要な影響を与えることを示唆しています。化学遺伝学的操作とは異なり、波長特異的刺激はウイル...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

著者らはNIMHのSLCRメンバーとジョンズ・ホプキンス生物学マウスTri-Labのメンバーの有益な議論に感謝します。資金提供元:国立精神衛生研究所助成金  ZIAMH002964(S.H.)

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361Cre依存性のウイルスベクターで、興奮性DREADD（hM3Dq）がmCherryと融合し、選択的なipRGC活性化を可能に
Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal)Cell Signaling Technology2250S神経活性化のマーカーとしてc-Fosを検出するために使用される一次抗体
Anti-tdTomato antibody (goat)LSBioLS-C340696mCherry/tdTomato報告遺伝子発現を検出するために使用される一次抗体
Blue LED driverThorlabsLEDD1B青色LEDの強度と出力を制御するための電源
Blue LED light sourceThorlabsM470L5光刺激用の青色光（λmax 約470 nm）を放射するLED光源
ClockLab softwareActimetricsVersion 6.0.53昼夜リズム運動活動データの取得と分析のためのソフトウェア
Clozapine-N-oxide (CNO)Sigma-AldrichC0832-5MGin vivoでhM3Dq DREADD受容体を活性化するために使用されるリガンド
DAPIInvitrogen62248細胞核のラベリングに使用される蛍光核染色
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555InvitrogenA21432ヤギの初級抗体を検出するための蛍光二次抗体
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA21206ウサギの初級抗体を検出するための蛍光二次抗体
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02組織切片の蛍光を保存するために使用されるマウンティング液
ImageJ (Fiji) softwareNIHVersion 2.16.0/1.54g画像処理と定量分析のためのオープンソースソフトウェア
Opn4cre MiceThe Jackson LaboratryRRID:IMSR_JAX:035925ケモジェネティック活性化に使用されるマウス
Violet LED driverMightexSLA-1000-2紫色LED出力を制御するための電源
Violet LED light sourceMightexBLS-LCS-0385-04-22波長特異的刺激のための紫色光（λmax 約385 nm）を放射するLED光源
Wild-type miceThe Jackson LaboratryJackson strain #101043紫色光実験に使用されるマウス

参考文献

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