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方法論記事

mtDNA患者血小板からのトランスミトコンドリアシブリド生成:コロニー選択と機能検証を最適化する効率的なプロトコル

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DOI：

10.3791/71632

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2026年7月10日

 ,  ,  , 
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Genetic and Genomic Medicine, Department of Pediatrics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

この記事について

サマリー

mtDNA患者血小板から最適化されたトランスミトコンドリアサイブリド生成プロトコルを記述し、成長パラメータとコロニー分離を重視します。このアプローチにより、共通核背景下で異なるヘテロプラズミーレベルでミトコンドリアDNA変異を研究し、電子伝達連鎖酵素活性および統合呼吸能力における機能的意義を定量化することが可能になります。

要約

トランスミトコンドリアサイブリッド細胞株生成は、同一のmtDNAおよび核ゲノム背景の中で、関心のある特定のミトコンドリアDNA(mtDNA)変異を高・低パーセンテージ(ヘテロプラズミーレベル)で生化学的に解析することで病原性を決定するゴールドスタンダードの手法を示しています。歴史的に、サイブリッド生成プロセスは面倒で効率的ではありませんでした。ここでは、ヒト血小板と標準的な骨肉腫143B細胞株を融合させ、mtDNAを枯渇させた等原体核背景(Rho0 細胞)を提供することで、トランスミトコンドリアサイブリッド細胞株を生成する非常に効率的かつ効果的なプロトコルを説明します。細胞分離株は、異なる程度のヘテロプラズミーを持つ安定した細胞株を確立したり、異なるミトコンドリアハプログループ間の異なる効果を比較するために、特定のmtDNAゲノムを捕捉します。ミトコンドリア患者からのサイブリドは標準プロトコルでは確立が難しい可能性があるため、現在の手法は電子輸送連鎖活性に影響を与えるmtDNA変異の単離に焦点を当てています。ここでは、コロニー選択技術が高レベルヘテロプラズミーmtDNA変異サイブリッド系統の生成時間を短縮し、生産性を向上させることを示します。 MT-ND1 m.3985G>A(p.E227K)における重要性不明の変異体のサイブリッド生成の症例研究が示されています。このプロトコルを用いてサイブリッド生成プロセスの効率を分析し、高分解能呼吸計による機能研究を実施します。このプロトコルによって生成された高レベルヘテロプラズ ミーMT-ND1 m.3985G>Aサイブリド変異体は、野生型制御に比べて複雑なI依存性ミトコンドリア呼吸を障害していることが示されており、m.3985G>Aが病原性である可能性が高いことが示されています。

概要

ミトコンドリアDNA(mtDNA)変異の病原性の確立は、その希少性、異なる組織で変異および野生型mtDNAゲノムのレベルが異なるヘテロプラズミー、多様な病態生理機構、そして核ゲノム背景との複雑な相互作用のために困難です。.これらの理由から、ミトコンドリアサイブリッド細胞株はmtDNA変異体の病原性を確立するゴールドスタンダードの方法であり、「サイブリッド」とは、ある細胞の核と他細胞のミトコンドリア5,6,7,8,9,10の融合を表しています(図1).サイブリッド細胞株は、研究対象のmtDNA変異体に対して特定の異質質率を持つアイソジェニック核背景とミトコンドリアを含みます。このようにして、0%から100%の異質質レベルまでのサイブリッド系統で、特定のmtDNA変異体の病原性影響や、サイブリッド系統間で異なるミトコンドリアハプログループの相対的影響を判断するために、呼吸法測定(ポラグラグラフィー)や電子伝達酵素活性(分光光度測定)などの機能的アッセイを実施できます。.他の細胞タイプは病原性の研究に用いられ、サイブリッド生成や機能解析を補完するのが最も適しており、各細胞タイプにはそれぞれ利点と欠点があります。患者の線維芽細胞は患者から直接由来しますが、遺伝性の異形形成に限られ、核遺伝子影響を排除する等遺伝子核制御を欠いています。mtDNA編集は人気が高まっていますが、mtDNA13ではオフターゲット編集や編集可能な部位の制限に悩まされています。誘導多能性幹細胞(iPSCs)は、ニューロンや網膜神経節細胞など異なる細胞タイプに対する変異の影響を研究するために分化させることができますが、多能性の誘導は関心のあるmtDNA変異の喪失や新たな新発変異を引き起こす可能性があります14。サイブリッド研究は、がん細胞株(古典的には143B骨肉腫)の核背景に基づくより人工的なシステムを生成するもので、古典的に良好に成長するため、候補介入の高スループットスクリーニング研究に適しています。高ヘテロプラズミーレベルのサイブリド生成の制限には、血小板の質、初期ヘテロプラズミー、そして変異ミトコンドリアの選択的欠点があり、これらは本プロトコルで詳しく論じられています。

サイブリッド生成はmtDNA変異の病原性を機能的に決定するゴールドスタンダードですが、ミトコンドリア疾患の研究のためにサイブリッドを生成する研究室はごくわずかです。9、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25。26、27。むしろ、がんや老化を研究するためにより多くのサイブリッドが生成されます。ここでは、ミトコンドリア病の患者症例が疑われるケーススタディを用いて、mtDNA患者血小板からサイブリッド生成を促進するために開発された最適化戦略、選択過程や標的mtDNA変異体の高低異質を持つサイブリッド細胞株を確立するために必要な細胞調製法を示します。具体的には、複合I(CI)サブユニットMT-ND1変異体m.3985G>Aのサイブリッド細胞株を生成する方法論を示し、この変異株の病原性を示す生化学的研究を実施しています。図2はサイブリッド生成のタイムラインを示しており、主要な方法論的ステップとして融合、選択、分離法を用いて異なるコロニーを生み出します。

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プロトコル

血小板はフィラデルフィア小児病院(CHOP)のIRB試験08-6177に基づいて採取されました。

1. 血小板の製製

  1. 1日目:採血時に酸-クエン酸-デキストロースチューブに血液を採取します。
    注意:血液はすぐに回転筋に投与してください。理想的には採血後最大4時間以内に採取します。
  2. 血液量を記録してください。血液量は5〜6mLが推奨されます。
  3. 200 × g で12°Cで20分間遠心分離血液を投与します。
    注:12°Cでの遠心分離はサンプルの完全性を保ち、血小板の活性化を防ぎます。
  4. 上清液(血漿)を新しい遠心分離機管に移します。
  5. プラズマの量を記録しろ。
  6. 1500 × g で12°Cで20分間遠心分離します。
  7. 推定血小板ペレットの体積を記録してください。
    注意:このプロトコルでは血小板が多すぎると面倒になることがあります。融合後、Rho0 細胞と血小板をプレートする際に、過剰な血小板がフラスコの底に付着し、Rho0 細胞の付着を妨げることがあります。融合には血小板のペレット体積のうち50μL未満の使用が推奨されます。余剰血小板は以下の工程で血小板を分割して凍結できます。
  8. 上清液を取り除きます。
    注意:ペレットが大きい場合は、吸引によってペレットの除去が可能です。患者の血小板は時に大幅に減少し、あまり粘着性がありません。もしそうなら、ピペットを使ってゆっくりと血漿を除去してください。
  9. 新しい血小板を継続する場合は、ペレットを最小限のエッセンシャルイーグル培地(SMEM)のスピナー修飾1mLに再懸浮させ、マイクロ遠心分離機チューブに移します。
  10. 凍結する場合は、ペレット(血小板)を1.05 mLのSMEMと450 μLの血小板冷凍液(胎児用牛血清[FBS] 350 μL + ジメチルスルホキシド[DMSO]100 μL)に再懸浮させます。
    注意:凍結手術中に一部の患者血小板が安定せず、凍結後に高変異型サイブリッドを得ることはできません。新鮮な調理法を使うことが推奨されます。
  11. もしRho0 セルが間に合わない場合は、血小板を37°Cに置き、60rpmで軽く振る。
    注意:最終的には、血小板とRho0 細胞が同時に準備されるタイミングを合わせるのが最善です。2時間以上待つことは推奨されません。

2. Rho0セルの準備

  1. 新たに解凍した143Bの骨肉腫Rho0 細胞か、ほぼ合流に成長していたRho0 細胞のいずれかを使用してください。
    注意:インキュベーター内でほぼコンフルレンスまで成長していたRho0細胞の使用が推奨されます。新たに解凍したRho0細胞が使用可能であり、高細胞密度の冷凍バイアルを使用することが推奨されます。融合の2時間以上は細胞を付着させてください。
  2. T75フラスコはPBS5mLで洗います。
  3. Rho0 細胞を覆うために1mLのトリプシン-EDTA 0.25%を加えます。
  4. 37°Cで5分間孵化します。
  5. フラスコを揺らした後、底を5mLのSMEMで洗います。
  6. Rho0 細胞を15 mLの円錐形チューブに採取します。
  7. 細胞数測定のために200× g で遠心分離機で5分間濃縮します。
  8. 上澄液を取り除き、1 mLのSMEMに再懸濁します。
  9. 細胞の数を数えろ。
    注:理想的には、1回の融合に150万個の細胞が存在するべきです。しかし、3万細胞未満でも成功した融合も行われています。
  10. 150万個の細胞を1.5本のマイクロ遠心分離機管に分け、体積を1mLにします。
    注意:予備の「模擬融合」チューブを用意してください。このチューブはRho0 細胞のみを含み、選択過程の誘導に使用されます。
  11. 血小板を1700 × g で室温で15分間遠心分離します。
    注:Rho0 セルは低温に敏感です。
  12. 血小板から上澄液を取り除きます。
  13. 血小板ペレットの上に1mLのRho0 細胞を加えます。
  14. Rho0 細胞と血小板を室温で200× g で5分間遠心分離します。

3. 融合

  1. Rho0 細胞と血小板ペレットから上清液を除去します。
  2. 融合バッファー150μL(50%ポリエチレングリコール[PEG]/10%DMSO)を加え、90秒間三層処理して再懸濁させます。
    注意:一部のペレットはかなり粘着性が高く、ピペットの上下操作に加えて手動でかき混ぜたり砕いたりする必要があります。ペレットが粘着性があったかどうかを記録してください。
  3. T75フラスコに12mLのサイブリッド培地(DMEM)+10%FBS+50μg/mLのウリジンを加えます。
  4. 融合血小板1mLとRho0 細胞をフラスコに加えます。
  5. 細胞は37°Cで5%のCO2 を高湿度で培養します。
    注:すべての細胞成長ステップはこれらの条件下で行われます。

4. 成長

  1. 2日目:サイブリッド培地を除去し、新鮮なサイブリッド培地12mL+10%FBS+50μg/mLウリジンを追加します。
    注:Rho0 細胞はmtDNAを取り込むのに約1週間かかります。
  2. 5日目:サイブリッド培地を除去し、新鮮なサイブリッド培地12mL+10%FBS+50μg/mLのウリジンを加えます。
    注意:Rho0 セルが80%の合流度にある場合は、セルを2つのフラスコに分けてください。

5. 選考

  1. 8日目:培地を取り除き、細胞を5mLのPBSで洗浄します。
  2. PBSを除去し、トリプシンを1mL追加します。
  3. フラスコの底にトリプシンを塗り、37°Cで5分間孵育します。
  4. サイブリッド培地5mL+FBS10%+ウリジン50μg/mLを加えます。
  5. 細胞の数を数えろ。
    注意:選択は10%のコンフルエンスから開始すべきで、これはT75または組織培養処理されたペトリ皿内の125,000個の細胞です。コロニー採取方法を好む場合はペトリ皿の使用が推奨されます。希釈法を使う場合はT75を使いましょう。
  6. 適切な容器に125,000個の細胞を加え、残りの体積は選択培地(DMEM)で最大12mLまで加えます。
    注:選択培地は、ミトコンドリアを持つ融合した143B細胞をRho0 細胞から分離することを目的としています。Rho0 細胞は生きるためにピルビン酸とウリジンを必要とします。透析されたFBSにはピルビン酸やウリジンが含まれておらず、選択のためにのみ使用してください。可能であれば、2種類の異なる選択媒体を使いましょう。一方は10%透析FBSで、もう一方は増殖制限の少ないもので、例えば20%透析FBS+50μg/mLのウリジンなどです。重度変異体には、より制限の少ない選択培地が並行して提案されています。
  7. 残りの細胞を2つのクライオビアルにそれぞれ1mLの冷凍液で凍結します。
    注意:これらは予備選択セルであり、後から異なる選択を試すことができます。
  8. 約1週間は隔日でメディアを交換します。
    注意:Rho0 セルは死んだときに浮き上がり、培地を変えた後に洗い流されます。「モック」融合セルを使って選択が完了したかどうか(フラスコに細胞が残っていない状態)を判断します。このフラスコは完全に空になります。なぜなら、すべてのRho0 セルが洗い流されてしまっているからです。モックフラスコが空でももう一日待つのが賢明です。なぜなら、融合した細胞は培地中の栄養分を供給し、他のRho0 細胞がフラスコ内に残るのを助けるからです。細胞が20%以上の合流率に成長した場合は、分割して再プレートを施します。さらなる成長は選考を隠すことになります。

6. コロニー選択増殖法

  1. Cybrid培地+20% FBS + 50 μg/mLのウリジンでコロニーを目視で観察できるまで培養します。
    注意:皿を傾けて光にかざしてください。コロニーは雲の円のように見えます。顕微鏡下では、コロニー間に多くの背景細胞は存在しないはずです。
  2. フラスコの底にマーカーを置き、光にかざして独立して重ならないコロニーを丸で囲みます。
  3. P20を使って、フラスコの底に機械的に取り付けられた細胞をスクワイプし、同時に20μLを吸引し、選択した菌株の細胞をP20の先端に配置します。
    注:手作業で削ると細胞が外れ、20μLを引き上げるとピペット先端に細胞が集まります。
  4. 各コロニーをそれぞれ独立した井戸で96井戸プレートでメッキします。
    注:この方法の利点は、143B細胞が一緒によく増殖しやすいため、増殖に問題がなく、より速い結果が得られることです。欠点は、人口が混在する可能性があることです。

7. 希釈成長法

  1. 細胞がサイブリッド培地で75%の合流率+20% FBS + 50 μg/mLのウリジンに達したら、5 mLのPBSで細胞を洗浄します。
  2. PBSを除去し、トリプシンを1mL追加します。
  3. フラスコの底にトリプシンを塗り、37°Cで5分間孵育します。
  4. サイブリッド培地5 mL + FBS 20% + ウリジン50 μg/mLを加えます。
  5. 細胞の数を数えろ。
  6. 10個×5 個の細胞を20mLのサイブリッド培地+20% FBS+50μg/mLのウリジンを50mLの円錐形チューブ1に加えます。
    注:これは5000細胞/mLであり、96ウェルプレートでプレートを施すと100μLで500細胞となります。
  7. 50 mLの円錐形チューブを100倍に希釈(チューブ1から200 μL、Cybrid mediaの20 mL + 20% FBS + 50 μg/mLのウリジン)を準備します。
    注:これは井戸あたり約5セルです。
  8. 50 mLの円錐形チューブ3を1:1の希釈(チューブ2から10 mL、サイブリッド培地10 mLに+20% FBS + 50 μg/mLのウリジン)で準備します。
    注:これは1井戸あたり約2.5セルに相当します。
  9. 50 mLの円錐形チューブ4を1:1の希釈で準備します(チューブ3 10 mL、サイブリッド培地10 mL + FBS 20% + ウリジン50 μg/mL)。
    注:これは井戸あたり約1セルです。
  10. プレートチューブ2、3、4はそれぞれ100μLの96ウェルプレートに設置されています。
    注意:メッティング前にセルを混ぜることを忘れないでください。セルが底に沈んで固定される必要があるため、当日に各井戸にセルがあるかどうかを確認するのは難しいです。この方法の利点は、単一の細胞がコロニーに成長し、混合背景が存在しないことです。欠点は、重度の変異体が単離されると生存できない可能性があることです。
  11. 翌日、明らかに複数のセルがある井戸を切り消します。
  12. 数日後、再び井戸を確認してください。
    注:コロニーは存在し、井戸の端近くに単一セルがある場合により明確です。もし複数のコロニーがある場合は、それらの井戸を撤去してください。セルがなければ、井戸を撤去してください。

8. 成長

  1. 96ウェルプレートから始め、必要に応じて大きなプレートに段階的に移送します。
    注意:これらの細胞は高密度の細胞で最もよく成長し、十分な細胞を移動させないと死に至る可能性があります。前のプレートにはセルが入っているものを必ず保管し、どの井戸がどこから来たかをマークしておきましょう。そうすれば必要なときにいつでも戻れるようにしましょう。重要なのは、143B細胞が過剰に結合すると死んで剥離するので、毎日これらの細胞をチェックしてください。

9. 遺伝的確認

  1. 分離したセルを450×g で5分間遠心分離します。
  2. メディアを除去してください。
  3. 5μLのDNA抽出バッファー(50 mM NaOH)を追加します。
    注意:セル数が多い場合、この数値は変動することがあります。重要な細胞ペレットは10μLのバッファーに含まれます。
  4. 95°Cで30分間培養します。
  5. 抽出バッファーに同量のDNA安定化バッファー(0.1 M Tris-HCl; pH 8)を加えます。
  6. 酵素のガイドラインに従ってポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施してください。
    注:一部のポイントミュータントは制限酵素を使って対照細胞と患者細胞を区別できます。他の点変異は区別できず、シーケンスが必要です。この場合、高品質な結果を得るためには、色素を含まないPCRミックスを使用することが重要です。サンガーシーケンスや次世代シーケンスも利用できます。25μLの反応には2.5μLのDNAが十分です。
  7. サンガーシーケンスにはこの変異に特異的なPCR増幅コンを使用します。
    注:PCRアンプリコンはサンガーのシーケンスのために送られました。変異異質レベルは、クローンの拡張および機能解析の両方で確認されました。

10. 高分解能呼吸法を用いた呼吸法

  1. 呼吸計(例:Oroboros Instruments)のガイドラインに従って空気校正を行いましょう。
  2. T75フラスコでPBSを使ったサイブリッドを洗います。
    注意:セルは過剰に混在してはいけません。70%〜80%の合流率が理想的です。
  3. トリプシン1mLを加え、4分間培養します。
  4. サイブリッド培地5mLを加え、細胞数をカウントします。
  5. 50万個の細胞をチューブに入れて、450× g で5分間遠心分離機で下ろします。
    注:呼吸計の細胞数と体積は0.5 mLチャンバーで示しています。
  6. PBSで再懸濁液と遠心分離機でセルを洗浄します。
  7. 細胞を510μLのMiR05バッファーに再懸濁し、空のチャンバーに追加します。
  8. 安定化後、ディジトニン0.65 μL(50 mg/mL)、マラート 0.8 μL(2.5 M)、ピルビン酸 2 μL(2.5 M)を加えます。
    注:ディジトニン添加前は、ここで基礎呼吸の測定が行われています。その後のすべてのステップは安定化後に行うべきです。
  9. アデノシン二リン酸(ADP)(0.25 m)を12 μL加えます。
  10. グルタミン酸4μL(2.5 m)を加えます。
  11. 12μLのスクシネート(1.25 M)を加えます。
  12. オリゴマイシン1μL(1 mg/mL)を加えます。
  13. カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン[FCCP](0.2 mM)を1 μL加えます。
    注意:複数回の追加を繰り返して増量し、これ以上の増加が見られないまで(通常は3〜5回)。
  14. ロテノン1μL(2 mM)を加えます。
  15. 抗マイシンAを1 μL(1 mg/mL)追加します。
  16. アスコルビン酸0.5 μL(0.8 M)とテトラメチルフェニルネジアミン[TMPD]0.5 μL(0.2 M)を加えます。
  17. スペーサーでチャンバーを20分間開けます。
  18. チャンバーを閉じて5分間安定させます。
  19. アジドを22.5μL(4 M)加えます。
  20. ビシンコニン酸(BCA)アッセイキットを用いて細胞を採取し、タンパク質定量を行います。
  21. 酸素消費率の安定化後に計算を行い、タンパク質で正規化します。基礎呼吸とは、細胞がチャンバーに追加された後の安定化された酸素消費率のことです。
    注意:その他の測定は記載された基質または阻害剤の後に行われます。
  22. OXPHOSCI(グルタミン酸アンチマイシンA)/(FCCP-アンチマイシンA)を計算します。
  23. OXPHOSCI+CII:(スシネート-アンチマイシンA)/(FCCP-アンチマイシンA)を計算します。
  24. ETSCI+CII(FCCP-アンチマイシンA)を計算してください。
  25. ETSCIIを計算します:(ロテノン-アンチマイシンA)/(FCCP-アンチマイシンA)。
  26. LEAKCI+CII(オリゴマイシン-アンチマイシンA)/(FCCPアンチマイシンA)を計算します。
  27. OXPHOSCIV(TMPD/ASC-アジド)/(FCCP-アンチマイシンA)を計算します。
  28. 呼吸計測には最低4〜6個の生物学的レプリケートを使用してください。

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結果

方法論の違いとプロトコル最適化への道筋を示すために、電子伝達連鎖の複合体I(CI)のMT-ND1に不明の重要性(VUS)変異を持つミトコンドリア病疑いのある患者からサイブリッド生成の結果を提示します。複数の組織で臨床的なmtDNAゲノム次世代シーケンシングが行われた2つの異なるCLIA承認臨床診断ラボで、病原性が疑われた唯一の変異株はMT-ND1 m.3985G>Aでした。患者の血液中のMT-ND1 m.3985G>A(p.E227K)変異の異質性は50%でした。この個人のためにサイブリッドを生成することで、複数のプロトコル最適化に関する洞察が示されました(表1)。凍結血小板からサイブリドを生成しようとした以前の試みは失敗するか、野生型(0%ヘテロプラズミー)サイブリッドしか得られませんでした(表1)。対照的に、新たに分離した血小板を使う方がより良い結果が得られました。SMEM追加後、患者の血小板が安定していなかったことが明らかになり、これが凍結血小...

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ディスカッション

ここでは、mtDNA患者血小板からトランスミトコンドリア・サイブリッド細胞株を生成するための非常に効率的なプロトコルを提示します。重要性が不確かな MT-ND1 変異の症例研究を通じて、成長および選択パラメータを慎重に考慮することの重要性を示します。これらの主要な課題が最適化されれば、呼吸連鎖機能を損なう可能性のあるmtDNA変異を持つサイブリッドの選定が成功します。このプロトコルはmtDNA変異を持つサイブリドの生成にも用いられます。

ケーススタディのタイムラインは、サイブリッド生成が血小板分離から約2.5か月かかることを示しています(図2)。活動時間に関しては、1日目と20日目が最も時間がかかります。96ウェルプレートから大きなウェルへの移動時間は変動が大きく、143Bセルの作業では過剰な結合や細胞数不足が細胞剥離や死死を引き起こす可能性があるため、毎日チェックする必要があります。コロニーピッキング法は多くの細胞を1つの井戸に移し、そ...

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開示事項

著者側には本研究に関して金銭的利益相反はありません。

謝辞

患者さんとそのご家族、そして実験的なトラブルシューティングの指導をしてくれたレベッカ・ガネツキー、シーラ・クレバー、ダグ・ウォレス、ライアン・モローに感謝します。この研究は、CHOPミトコンドリア医学マッツッロ家複合体I研究基金および国立衛生研究所(R35-GM134863 to MJF)から一部資金提供を受けました。内容は著者の責任であり、NIHを含む資金提供者の公式見解を必ずしも反映するものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ADPシグマ・アルドリッチA5285-1G
アンチマイシンAシグマ・アルドリッチA8674-25MG
アスコルビン酸シグマ・アルドリッチ11140-250G
アジドシグマ・アルドリッチS2002-100G
透析済みFBSフィッシャーサイエンティフィック35071CV
ジギトニンシグマ・アルドリッチD141-100MG
DMEMコーニング10-013-CVサイブリッド培地
DMEMコーニング10-017-CM選択培地
FBSサイティバSH30910.03
FCCPエイペックスバイオB5004
グルタミン酸シグマ・アルドリッチG5889-100G
グラフパッド・プリズムグラフパッド
Hybri-Max シグマ・アルドリッチP7306融合バッファー
マレートシグマ・アルドリッチM1000-100G
MiR05バッファーオロボロス・インストゥルメンツ60101-01
O2Kレスピロメーターオロボロス・インストゥルメンツC-0050
オリゴマイシンシグマ・アルドリッチO4876-5MG
ピルビン酸シグマ・アルドリッチP2256-100G
ロテノンシグマ・アルドリッチR8875-1G
SMEMシグマM8167
サクシネートシグマ・アルドリッチS2378-100G
TMPDシグマ・アルドリッチT3134-5G
トリプシン-EDTA 0.25%サーモ・サイエンティフィック25200056
ウリジンシグマ・アルドリッチU3750-25G

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