方法論記事

乳癌担がん免疫能保持マウスにおけるアントラサイクリン誘発性心毒性の心腫瘍学マウスモデル

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DOI:

10.3791/71633

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2026年10月1日

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1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

アントラサイクリン誘発心毒性の臨床的に関連性の高いマウスモデルは不足しています。本研究では、抗がん剤治療を受ける腫瘍担持免疫能保持マウスを用いたモデルを提案し、がん患者の臨床プロトコルを模倣します。

要約

がん治療関連心機能不全の前臨床モデルに関する欧州心臓病学会による最近のアップデートでは、より代表的でトランスレーショナルなモデルの重要性が強調されています。 in vivo モデル。臨床集団に見られる不均一性をより正確に再現するためには、免疫能を保持し、腫瘍を担持した動物を用い、複数の系統および雌雄両方を取り入れたモデルを開発する必要性が指摘されています。したがって、乳がん担持動物におけるアントラサイクリン誘発性心毒性（AIC）の臨床的に関連のあるモデルを構築しました。マウスの遺伝的背景に基づき、Balb/cマウスまたはC57Bl/6Jマウスの雌雄の乳腺下部に、それぞれ4T1Luc細胞（20万個）またはPY8119細胞（20万個）を皮下注射しました。腫瘍の増殖はバイオルミネッセンスおよび触診によって管理しました。腫瘍細胞の注射から2週間後、触診で腫瘍塊が検出可能になった時点で、動物に抗がん剤ドキソルビシン投与を行いました。ドキソルビシンに対するマウスの耐性は系統依存的でした。心機能は、プロトコルの開始前（ベースライン）およびその後毎週、ケタミン麻酔下で心エコー検査により評価しました。心毒性は、左室短縮率がベースラインから絶対値で10%以上低下したことと定義しました。 <50％、および心拍数 >300 BPM。このプロトコルは再現性があり、99%の確率で腫瘍形成に成功し、そして >マウスの生存率は80%であった。心毒性は～において認められた。 >腫瘍を担持しドキソルビシンで処置したマウスの90%。

概要

心臓腫瘍学（Cardio-oncology）は、化学療法の前後および期間中におけるがん患者の心血管系の転帰を改善することを目的としています。前臨床モデルは、これら2つの疾患間の相互作用をより深く理解する上で大きな役割を果たしてきました。最近、パラダイムシフトとなる研究により、自発的な腸ポリープが発生しやすいマウスにおいて、心筋梗塞および心不全（HF）の期間を経て、これらの腫瘍が増加することが観察され、心血管イベントが腫瘍の増殖に直接的な影響を与えることが実証されました1。それ以来、多様な腫瘍型およびマウス系統において一貫した知見が多くの研究で報告されており、特定の分子経路やタンパク質の関与が頻繁に示唆されており、これにより、心血管疾患（CVDs）ががんの進行を促進するという概念が強化されています2,3,4,5.

逆に、がんがCVDsの発症リスクに及ぼす影響については、数十年間にわたり研究されてきました。疫学的データにより、がん生存者はより多くのCVDsに罹患していることが示されており、これはこれら2つの疾患に共通するリスク要因と、抗がん 治療による既知のさまざまな毒性の両方に起因しています6,7,8,9,10。前臨床研究では、長期的な心血管系の転帰を改善するためにヒトで調節可能な特異的標的を同定すべく、がん誘発性悪液質モデルが一般的に用いられてきました11,12,13,14。しかし、患者は多くの場合、このような進行がん症候群に至る前に治療を受けるため、これらのモデルは一般的な臨床状況をほとんど反映していないという議論もあり得ますが、それでも全身性の悪液質ががんによる全死亡に大きく寄与していると考えられています15。

欧州心臓病学会（ESC）の最初の心腫瘍学ガイドラインでは、がん（cancer）と心血管疾患（CVDs）の関係をより深く理解するために、さらなる研究が必要であると結論付けられています16。より具体的には、ESC心腫瘍学ワーキンググループによる最近のアップデートにおいて、この知識のギャップを埋めるためには前臨床研究が極めて重要であり、特に腫瘍担がん動物を用いたモデルが重要であると述べられています17。さらに、現在の臨床研究の多くは前臨床段階での研究が不十分な抗がん剤治療を対象に行われているため、前臨床研究と臨床研究のより良い相関関係を構築することが求められています18。

ドキソルビシン（Dox）などのアントラサイクリン（ACs）は、多くの固形腫瘍および血液腫瘍の化学療法に一般的に用いられています。今日ではより現代的な治療法が利用可能であるものの、安価であること、副作用が十分に文書化されていること、そして明白な有効性により、これらの薬剤は今後も長年にわたって使用され続けると考えられます19,20。膨大な証拠により、ACsは用量依存的な心毒性を引き起こし、主に左室機能不全として現れることが示唆されています。これは現在の臨床使用における主要な制限因子の1つであり、心腫瘍学医にとってしばしば懸念される要因となります21,22。これらの知見は主にヒトでの発生率が高い乳がんの研究から得られたものですが、リンパ腫、肺がん、および白血病に関する臨床研究でも同様の観察結果が得られています23。したがって、アントラサイクリン誘発性心毒性（AIC）の根本的な病態生理学的メカニズムを解明するために、数十年にわたり前臨床研究が行われてきました。その結果、酸化ストレス、直接的および間接的なDNA損傷、フェロトーシス、およびミトコンドリア損傷が一般的に関与していることが示されています23,24。

それにもかかわらず、AICの予防法や治療法に関するエビデンスは実際には限られています。一般的な心不全（HF）治療薬が臨床試験で検証されていますが、結果は一貫しておらず、数少ない候補薬の使用タイミングの決定も困難となっています21,23,25,26,27,28。鉄調節薬であるデキサラゾキサンは、AICの予防において有望な結果を示していますが、現在、体系的に使用されているわけではありません21。また、ACsを血液中に遊離させるのではなく、例えばリポソームに封入するなどの形態で投与することも有望な結果を示していますが、コストなどの理由もあり、依然として従来のACsに取って代わることは困難です21

この状況を説明する一つの要因として、AICの研究において臨床的に意義のある動物モデルが不足していることが挙げられます。17ヒトでは、Doxは時間をかけて投与される。 〜経由で 繰り返しの注入が行われ、AICの大部分は治療後1年以内に観察されます。しかしながら、最近発表されたレビューで示されているように、文献によって動物プロトコルに大きなばらつきが見られます。29急性心毒性モデルの典型的な例は、腫瘍のないマウスにドキソルビシン（Dox）20 mg/kgを単回投与するモデルである。30慢性心毒性の典型的なモデルにおいて、多くの研究では、腫瘍のないマウスにドキソルビシン5 mg/kgを週1回投与し、総累積投与量を20 mg/kgとする手法が記述されている。29,31この慢性心毒性モデルは、同用量のDoxを投与した腫瘍担持動物においても観察されますが、文献における報告は極めて稀です。29,32.

この知識的ギャップの解消に寄与するため、AICを研究するための実用的かつ臨床的に妥当な乳癌担がん免疫能保有マウスモデルとして、4T1担がんBalb/cマウスを構築し、さらにPY8119担がんC57Bl/6Jマウスにおいてその堅牢性を確認した。著者らの知る限り、後者はC57Bl/6J系統のトリプルネガティブ乳癌を用いた心腫瘍学モデルの構築として初となる。腫瘍増殖を良好に捉えており、 〜経由で 心毒性を示すDoxを動物に投与する前に生物発光定量を行い、心臓腫瘍学実験と同時に腫瘍微小環境を研究するための臓器採取プロトコルを実施した。さらに、系統および性の感受性に関して、文献に記載されているものと同様の結果が観察された。C57Bl/6JマウスはAIC実験における生存率が高く非常に有用であるため、本研究は今後の心臓腫瘍学研究における動物プロトコルの標準化および改善に寄与することが期待される。29.

提案された手法の利点は、遺伝子操作が容易で、ゲノムが十分に解析されており、入手コストが低く、さらにACsの高累積投与量に対して耐性を持つC57Bl/6J系統を使用することである29,33,34。ACsを用いた特定の研究で遺伝子ノックアウトが必要な場合、このモデルはその目的に非常に適している。さらに、この系統由来のトリプルネガティブ乳がんを使用することは、トランスレーショナルリサーチの観点からも重要である。なぜなら、トリプルネガティブ乳がんの女性患者は、ACsによる治療を受ける可能性が非常に高く、かつ予後が最も不良な患者層であるからである35。このモデルを用いることで、特にこれらの患者におけるAICに関する知見が向上することが期待される。

このモデルの強みは、マウスにあらかじめ腫瘍を処置させている点にあり、これにより心血管のリモデリングに真の影響を与えることができる36,37点にあります。また、本モデルはAICの急性モデルと完全な慢性モデルの中間に位置しており、生存率が高いため動物のモニタリング期間を延長できる可能性があります。これは、他のACサイクルを検討する場合に非常に有用です。

しかしながら、本モデルは腫瘍接種への実用的アプローチを採用しているため、プロトコルの最終段階における特定の腫瘍特性評価には最適ではない可能性があります。これが科学的仮説の中核である場合は、腫瘍注入法を適宜調整して実施すべきです。また、Balb/cマウスへの4T1細胞注入は、より腫瘍学的なアプローチ、例えば本稿では述べていない転移の研究に適した確立されたモデルであり、転移が科学的問いにとって不可欠である場合は検討する必要があります38。本モデルは成マウスを用いて実施されていますが、小児期の設定でAICを研究することが目的である場合は、より若いマウスを検討すべきです。ただし、若齢マウスに対する本プロトコルの反応については、ここでは検討されていません。

プロトコル

すべての動物実験は、地域の動物倫理委員会（Lariboisière-Villemin）の指針に従い、フランス高等教育研究省（MESRI）によりプロトコル番号APAFIS 46086の下で承認された。プロトコルの設計においては3R原則が考慮された。Balb/cおよびC57Bl/6Jマウスは、Janvier LabsまたはEnvigoなどの動物メーカーから購入した。本プロトコルでは、トリプルネガティブ乳がんを患う女性に近い若年成人に相当させるため、組み入れ時のマウスの週齢を10週から18週とした。動物は、12時間明暗サイクル、室温をの間で、2〜5個体ずつの群で飼育した。 20 °C および 24 °C、湿度は30%から70%の間とした。水と餌は自由に摂取させた。 自由摂取プロトコルの実施にあたっては、記述されている通り、プロトコル開始前にあらかじめ定義された人道的なエンドポイントに従うよう注意を払った。 補足表1イソフルラン使用者の安全のため、必ずイソフルランフィルターを使用して廃ガスを回収してください。本プロトコルのすべてのステップにおいて、手袋と眼鏡を着用し、動物を慎重に扱ってください。すべての有害物質は、所属機関の地域の規定に従って処理する必要があります。本手順では、すべての汚染サンプル（血液、針、ドキソルービシン含有バイアルなど）をバイオハザード廃棄物容器に廃棄しました。プロトコルの概要を以下に示します。 図1A使用した試薬および器具は、以下に記載されています。 材料一覧表.

1. 0週目：細胞の調製および動物への注入

注：以下の手順は4T1Luc細胞について記載していますが、PY8119細胞を使用する場合も同様でした。ただし、製造元の推奨事項に従い、各細胞株に合わせて調整する必要があります。プロトコルを最適化するため、1人が細胞の調製を行い、もう1人が動物の調製を行うようにします。

  1. 細胞培養フラスコで細胞がコンフルエント（コンフルエンス 80%–90%）になったら、37 °C、5% CO2の条件下でトリプシン 3 mL を 5 分間作用させる。
  2. フラスコを軽く叩いてすべての細胞を剥離させ、細胞の凝集を避けながら細胞培養培地で再懸濁する。
  3. マラッセズ血球計数器（または利用可能な他の手法）を用いて細胞数を計測する。
  4. 細胞を 300 × g で 5 分間遠心分離し、等量の PBS で再懸濁して、100 µL あたり 200,000 個の細胞を注入できるようにする。
    注：細胞数は文献レビューに基づいて決定した（付録表 2 を参照）。
  5. 26 G 注射器を用いて、細胞懸濁液 500 µL をゆっくりと吸引する。細胞懸濁液が注射器内にある時間を長くしすぎないよう、マウス 5 匹分に必要な量よりも少なめに注射器に充填することを推奨する。
  6. （可能であれば同時に）マウスをイソフルランチャンバーに入れ、外気に 3% イソフルランを 1 L/min で流して速やかに麻酔を導入する。動物が眠った直後に、動物を仰臥位にし、鼻先を 1% イソフルランを含むコーンに入れる。
  7. 綿棒を用いて、動物の胸部および左下腹壁に除毛クリームを 1 分間塗布する。水で毛とクリームを取り除き、ティッシュで皮膚を拭いて乾燥させる。
  8. 足指をつねり、十分な麻酔深度であることを確認する。
  9. 左上腹部の乳頭を特定する。ピンセットで優しく掴み、上方に持ち上げる（図 1B を参照）。
  10. 注射針を皮下に刺入し、針先が乳腺の下に到達するまで挿入する。
  11. 細胞懸濁液 100 µL を注入する。乳頭の下に皮下気泡（盛り上がり）が形成されるはずである（図 1C を参照）。対照動物には PBS を投与する。ランダム化は、ランダム化ソフトウェア（無料のオンラインツールである RandoMice など）を使用するか、あらかじめ定義した 1:1 または 2:2（あるいはそれ以上）の比率でマウスに処置を割り当てることで行う。
  12. ゆっくりと針を抜き、ピンセットで掴んでいた乳頭を放す。
  13. 動物の体重を測定し、プロトコルのベースライン体重を記録する。
  14. 動物を外気中で覚醒させてから、ケージに戻す。

2. 第1週：生物発光による腫瘍増殖の制御

注：これは、増殖を制御するために、注入後のどの日に行っても構いません。さらに、腫瘍の増殖率に関心がある場合は、複数の時点で実施することも可能です。ただし、10–14日後は、がんの増殖過程における自然な腫瘍細胞選択により、信号が減衰することがあります。また、プロトコルに従って最初に正しく実施していれば、毛の再生が適切な光子捕捉の妨げになることはないはずです。腫瘍注入後2、5、8、および11日目に定量化したバイオルミネッセンスの代表的な結果については、図2A,Bを参照してください。

  1. 動物をイソフルランチャンバーに入れ、3%のイソフルランで速やかに麻酔を誘導します。
  2. 動物が睡眠状態になったら、26-Gシリンジを用いて、体重1gあたり10 µLのルシフェリンを腹腔内（IP）に注射します。腫瘍が存在し、数日後にはすでに触知できる場合があるため、左側へのルシフェリン注射は避けてください。
  3. 腫瘍は腹側に位置するため、光子キャプチャを最適化するために、マウスを仰向け（背臥位）にして光子イメージャーに配置します。吻部をノーズコーンに固定し、イソフルラン濃度を1%に下げます。
    注：5匹の動物を光子キャプチャ装置に正しく配置するには時間がかかります。撮影開始の少なくとも2分前から配置を開始してください。
  4. ルシフェリン注射の10分後に発光活性の取得を開始し、5分間実行します（図2A参照）。本装置の取得モードはBLI、1フレームあたり89 msで、画像サイズは220 mm x 165 mm、BVRピクセルサイズは153 µmに設定しました。
  5. 取得が完了したら、動物を外気中で覚醒させてからケージに戻します。
  6. メーカーの推奨に従い、光子イメージャーに適応した定量化ソフトウェアを使用してください。

3. 2週目：ドキソルビシン投与

注意：心エコー検査による評価は、Dox投与を開始する前に行う必要があります。したがって、初回Dox投与によるストレスを最小限に抑えるため、心エコー検査後に導入した麻酔を利用し、動物が眠っている間に投与を行ってください。また、累積投与量は各マウス系統に合わせて調整する必要があります。本手順では、過去の自施設データおよび文献29に基づき、Balb/cマウスには16 mg/kg、C57Bl/6Jマウスには24 mg/kgを用いました（図3A–Cを参照）。

  1. ドキソルビシン粉末を生理食塩水で再懸濁し、希釈します。4 mg/kgのDoxが240–360 µLの量に相当するように希釈液を調製してください。推奨される方法は、2 mg/mLの溶液を調製し、その後生理食塩水で6倍に希釈することです（最終濃度 0.33 mg/mL）。
  2. 腫瘍注入から2週間後、腹部左下で腫瘍が触知でき、かつ大きさが1 cm未満であることを確認します。
  3. Dox投与後の体重減少を管理するため、動物の体重を測定します。
  4. 26 Gの注射器を用い、腹部右下に4 mg/kgとなる相当量を腹腔内（IP）に投与します。対照群の動物には生理食塩水を投与してください。ランダム化はステップ1.11と同様に行うことができます。
  5. この手順を4日間毎日繰り返し、累積投与量16 mg/kgとします（C57Bl/6Jマウスで24 mg/kgとする場合は、さらに2日間追加してください）。

4. 2〜5週目：心毒性モニタリング

注意：この操作は週単位で実施可能です。より頻繁に評価を行う場合は、プロトコルの3週目から4週目に動物が最も脆弱になりやすいこと、また一部のマウス系統は全身麻酔に敏感で死亡率が高まる可能性があるため、注意が必要です。イソフルランは心筋抑制を誘発するため、心機能不全を記録できる可能性を最適化するために、心エコー図検査はケタミン麻酔下で行います。投与量は、Balb/cマウスで40 mg/kg、C57Bl/6Jマウスで80 mg/kgとします39。化学療法を開始する前に、腫瘍の成長が心機能に及ぼす潜在的な影響を定量化するため、腫瘍注入前に一度超音波検査を行うことが推奨されます。

  1. 動物の体重を測定する。著しい体重減少が認められた場合は、以下の手順に従う。 付録表1.
  2. 26 Gシリンジを用いて、ケタミンを40 mg/kg（Balb/cマウス）または80 mg/kg（C57Bl/6Jマウス）の用量で腹腔内（IP）投与し、軽度麻酔状態となるまで動物を麻酔させる。
  3. 低体温症を避けるため、動物をヒートパッドの上に置いてください。
  4. 動物が睡眠状態になったら、1.7で説明した通りに除毛を行い、胸部領域の被毛を除去します。
  5. ケタミン投与の10分後に、最大5分間心エコー図検査を行う。超音波ゼリーはあらかじめ温めて使用すること。使用する装置に応じて、Mモードでの観察および／またはストレイン定量解析を行う。
  6. Mモードを使用する場合は、パラステライナル長軸像で心室中部の断面を、拍動が少なくとも4秒間含まれる状態で3回以上記録し、マウスの心機能の代表的な平均値を得る（参照 図4A,B）。ここでは、フレームレートを100 frames/s、送信周波数を38.4 MHz（出力100%）、受信周波数を96 MHz、音速を1538 m/s、スイープ速度を1200 Hzに設定した。
  7. 約5分後になると、動物の覚醒が進み、心エコー検査が困難になります。超音波検査に使用したジェルを拭き取り、動物をケージに戻してください。
  8. 心機能を盲検法を用いて定量化する39,40本モデルにおける関連する機能不全は、ベースライン値より10%低下し、かつ絶対値が[数値]であることと定義される。 <心拍数は維持したまま、左室短縮率（FS）が50%に低下し >300 BPM。前処理後のFS値が低すぎる場合は、その個体を解析から除外することを検討してください。
    注：4秒間の切り出し動画から定量化を行うには、各測定につき少なくとも3回の心周期が必要ですが、可能な場合はより多くの周期を使用してください。解析の盲検化を図るため、可能であれば、すべての超音波検査を同一の実験者が行い、定量化は別の人物が担当するようにしてください。超音波検査の品質管理に関する推奨事項は、別の文献に掲載されています。40.
  9. 統計解析を行う（ステップ6を参照）。プロトコル全体を通じて2つの群を解析するために推奨される検定は二元配置分散分析（two-way ANOVA）である。これは、「時間」と「処理」という2つの要因を比較するためである。
  10. これを毎週実施してください。機能不全は、ドキソルビシン投与からわずか1週間後に現れます。
    注：例えば心機能バイオマーカーの測定など、Dox投与後の特定の時点で採血が必要な場合は、麻酔剤の追加投与を避け、動物のストレスを最小限に抑え、時間を最適化するため、心エコー検査の直後に採血を行ってください。

5. 第5週：犠牲処置

注：理想的には、この臓器採取プロトコルは2人体制で実施してください。

  1. 5週目の最後の心エコー検査後、ケタミンを100 mg/kgで腹腔内投与（IP）します。採血に使用する眼に、1%テトラカインを1滴滴下して局所麻酔を施します。
  2. ヘパリン処理キャピラリーを用い、後眼窩静脈叢採血を行い、可能な限り多くの血液をヘパリンチューブ（またはEDTAキャピラリーを用いてEDTAチューブ）に回収します。
  3. それ以上の採血が不可能になった時点で、施設で承認されたプロトコルに従って頸椎脱臼を行います。回収した血液は、ステップ5.5に示す安楽死プロトコルを進めながら、次工程まで直ちに氷上に保持します。
  4. 血液を4 °Cで2000 x g、10分間遠心分離し、血球と血漿を分離します。血漿チューブを液体窒素で急速凍結し、分析まで-80 °Cで保存します。
  5. 動物を吸収紙を敷いたポリスチレンフォームの蓋の上に置き、4本の脚をピンで固定します。
  6. 腫瘍が十分な大きさ（少なくとも2 cm）であることを確認します。腫瘍を切り出すために、腫瘍周囲に十分な余裕を持って切除します。さらなる解剖は、ステップ5.15に記載される残りの臓器採取後に行います。
  7. 別の領域で、ピンセットで腫瘍を保持しながら、小さく鋭利なハサミを用いて慎重に腫瘍を切り出します。腫瘍を損傷させずに緊張を高めるため、余分な皮膚を蓋にピンで固定します。これにより、切り出しが容易になります。
  8. 腫瘍を十分に切り出した後、PBSで優しく洗浄して、血液、毛、その他の付着したゴミを取り除きます。腫瘍の重量を量ります。
  9. 5 mL遠心チューブに22 µmナイロンメッシュを配置し、その上に腫瘍を静かに置き、遠心分離まで氷上に保持します。
  10. チューブを4 °Cで100 x g、10分間遠心分離し、組織間液を回収します（図 5A参照）。得られる液量は1から20 µLの範囲で、多くの場合、赤色を呈しています（図 5B）。これを200 µLマイクロ遠心チューブに移し、分析まで-80 °Cで保存します。
    注：腫瘍の残りは小さく切断して保存チューブに入れ、液体窒素で急速凍結し、分析まで-80 °Cで保存できます。
  11. 骨髄を回収するため、ハサミで右脚を切断し、メスとピンセットを用いて、すべての筋肉、結合組織、脂肪を取り除きながら大腿骨と脛骨を切り出します。メスを用いて両骨の両端の骨端を切断します。ステップ5.15に記載されるマウスの臓器採取を完了させる間、洗浄した骨をPBSを入れた12ウェル培養プレートに入れます。
    注：骨髄分離の詳細については、別の文献41に掲載されています。
  12. 18 Gの針で500 µLマイクロ遠心チューブの底に穴を開け、そこに2本の骨を入れ、さらにそのチューブを400 µLのPBSを満たした1.5 mL遠心チューブに入れます。
  13. チューブを4 °Cで10,000 x g、1分間遠心分離します。1.5 mLチューブの底に細胞のペレットが形成されます。これらはすべて骨髄細胞であり、骨髄ストローマはPBSに混在しています。上清（骨髄ストローマ）をすべて別の保存チューブに吸引し、液体窒素で急速凍結して-80 °Cで保存します。
  14. ハサミを用いて、横隔膜レベルの胸部下方に横切開を入れ、胸骨を縦軸に沿って切断して、肺と心臓を露出させます。
    注：今後の分析に必要な場合は、ここで生理食塩水による全血除去を行うことができます。
  15. 生体分子分析および組織学的分析に必要なすべての臓器を回収します。重量を量り、今後の生体分子分析を容易にするために小さく切断します。臓器を小さく切断し終えた直後に、すべてのチューブを液体窒素で急速凍結し、-80 °Cで保存します。
  16. 心臓については、心尖部を心臓の上部から分離し、OCTを満たしたプラスチック型に配置します。OCTに入れた後、冷イソペンタンに浸し、液体窒素で急速凍結して-80 °Cで保存します。

6. 統計解析

注：すべての統計解析およびグラフ作成は、統計・グラフ作成ソフトウェアを用いて行い、統計ガイドの推奨事項42に従った。

  1. 提示するデータは平均値 ± SEMとする。
  2. 短縮率のすべてのグラフで同一のスケールを使用する。
  3. すべてのグラフに個々の実験単位（マウス）を表示する。
  4. 有意水準alphaを p = 0.05に設定し、Shapiro-Wilk検定を行って各実験群の分布の正規性を評価する。
  5. 2群間の比較には、分布の正規性に応じてWelchの検定またはMann-Whitney検定を使用する（両群とも正規分布の場合はWelchの検定を、1群または両群が非正規分布の場合はMann-Whitney検定を使用する）。信頼水準を95%に設定し、両側検定を選択する。
  6. 特定の時点における3群以上の比較について、ステップ6.4と同様に群の分布が正規であるかどうかを判定する。分布が正規である場合は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、それに続いて多重比較のためのHolm-Sidak補正を行う。
    注：分布が非正規である場合は、代わりにKruskal-Wallis検定を行い、多重比較のためのDunn補正を行う。有意性の判定には、ファミリーワイズのalpha閾値を0.05に設定する。
  7. 縦断的データについては、反復測定二元配置分散分析（repeated-measure two-way ANOVA）に続いて多重比較のためのSidak補正を用い、特定の時点における群間差を検討した。有意性の判定には、ファミリーワイズのalpha閾値を0.05に設定する。

結果

このプロトコルは、〜に示されている通り 図1A、は5週間のプロトコルであり、その結果、以下の実験群が設定される：非腫瘍担持・Dox非投与マウス、非腫瘍担持・Dox投与マウス、腫瘍担持・Dox非投与マウス、および腫瘍担持・Dox投与マウス。両性を使用するかどうかによって、これらの群数は2倍になる。Dox投与を開始する前の腫瘍増殖の最初の2週間で、200,000個の細胞を4に注入した後の腫瘍増殖には十分である。th 動物の左乳腺（図1B）。腫瘍細胞懸濁液をゆっくりと注入した際、乳頭の下に気泡が現れることで、皮下注射が正しく行われたことを確認してください（図1C). 表1 各マウス系統におけるプロトコルの主要なパラメータと、以下で詳述する主な結果について簡潔にまとめる。

図2A 腫瘍のないマウス（左）と腫瘍のあるマウス（右）にルシフェリンを注射し、5分間光子を収集した際に得られた生物発光シグナルの代表的な画像である。この解析には、ルシフェリンの注射によって光子を発生させる、ルシフェラーゼ遺伝子を発現した腫瘍が必要である。計33匹の4T1Luc細胞を注射したBalb/cマウスを11日間にわたり生物発光でモニターし、同時に9匹のコントロールを用いた。 図 2B 腫瘍は急速に増殖するが、信号強度は8日目以降にプラトーに達し始めることが確認され、また、図に示されるように、雄のBalb/cマウスと比較して雌において初期の腫瘍増殖がより速い傾向にあることが示唆される。 図2C. 5週間後、Balb/cマウスは45匹中1匹のみ腫瘍が認められなかったのに対し、C57Bl/6Jマウスは全個体で腫瘍が認められた（図2D).

図3A  および 図3B Doxの累積投与量の減少が、Dox投与開始から3週間後の生存率の向上につながることを実証する。腫瘍担持Balb/cマウスでは、24 mg/kg投与時の生存率は0%であったが、16 mg/kg投与時は50%が生存した。しかし、腫瘍担持C57Bl/6Jマウスはより耐性が高く、Doxを24 mg/kg投与した場合であっても、 >化学療法の開始から3週間後に、その80%が生存している（図3D）。性別が結果に重要な影響を及ぼした。Balb/cマウスにおいて、雌は雄よりも生存率が大幅に高く、雌29匹中16匹が生存したのに対し、雄は16匹中3匹のみが生存した。 図3C 16 mg/kgのDoxを投与したBalb/cマウスにおける雌雄差を示しています（雄の個体数が少なかったため、統計検定は実施していません）。C57Bl/6Jマウスでは、生存率に統計的な有意差は認められませんでした（参照 図3E).

Dox投与前の心エコー検査により評価した、健康なマウスの心機能の代表的な画像をFigure 4Aに、Dox投与後に心機能不全を呈したマウスの画像をFigure 4Bに示します。24 mg/kgのDoxを投与した腫瘍担持C57Bl/6Jマウス17匹において、Mモードで定量化したFS（短軸C-fraction）は、2週間後に有意な低下を示しました（Dox投与前 59.3% vs Dox投与後 44.3%、p < 0.0001、Figure 4C）。生存した12匹のマウスのうち、心毒性の事前定義基準を満たさなかったのはわずか1匹（8%）でした。心拍数は、Dox投与前の623 BPMから投与後の569 BPMへと、わずかですが有意に低下しました（p < 0.05、Figure 4D）。Mモードで定量化したすべてのパラメータは、Supplementary Table 3に記載されています。

ドキソルビシンの心毒性効果の確認は、肉眼的および顕微鏡的な解析によって行われます。図 6A,Bは、ドキソルビシン投与後に生存した少数の腫瘍担持雌性Balb/cマウスにおいて、絶対心重量が有意に減少したことを示していますが、心重量を総体重で正規化した場合は傾向が見られるのみでした。非腫瘍担持C57Bl/6マウスを用いた実験では、24 mg/kgのドキソルビシン投与から1週間後、心臓の以下の遺伝子のmRNAに予想される変化が誘発されました。萎縮を促進するAtroginおよびMurf1が増加し、酸化ストレスを促進するNQO1が増加し、さらにプロアポトーシス状態を促進するBaxが増加しました（図 6C–F）。

図5Aは、腫瘍間質液採取プロトコルの概略図である。採取された液体の代表的な画像を図5Bに示す。得られた液量は少量である。

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図1: 実験プロトコルの代表的なイラスト。 (A) 実験プロトコルの概略図。BioRender（ライセンス番号：JE29USE7LU）を用いて作成。 (B) 皮下腫瘍接種の概略図。BioRender（ライセンス番号：SO29JHW7R6）を用いて作成。 (C) 皮下腫瘍移植成功の概略図。BioRender（ライセンス番号：SO29JHW7R6）を用いて作成。 こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 2: 生物発光イメージングおよび腫瘍定着率. (A) コントロールマウス（左）および腫瘍担がんマウス（右）の代表的な生物発光画像。(B) 時間経過に伴う生物発光シグナルの変化（平均 ± SEM；反復測定二元配置分散分析 [ANOVA]；*P < 0.05）。(C) オスおよびメスのBalb/cマウス間における生物発光シグナルの比較（平均 ± SEM）。(D) 両マウス系統における腫瘍定着成功率。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 3: 腫瘍担持マウスの生存解析. (A) 24 mg/kg のドキソルビシン (Dox) を投与した Balb/c マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。 (B) 16 mg/kg の Dox を投与した Balb/c マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。 (C) 16 mg/kg の Dox を投与した雄および雌の Balb/c マウスを比較したカプラン・マイヤー生存曲線。雄マウスの数が限られていたため、統計解析は行わなかった。 (D) 24 mg/kg の Dox を投与した C57BL/6J マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。 (E) 24 mg/kg の Dox を投与した雄および雌の C57BL/6J マウスを比較したカプラン・マイヤー生存曲線 (ログランク検定, P = 0.86)。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 4: ドキソルビシン誘発性心毒性の超音波心電図による評価. (A) 健康なマウスの代表的なMモード超音波心電図。 (B) ドキソルビシン誘発性心毒性を有するマウスの代表的なMモード超音波心電図。 (C) ドキソルビシン投与前および投与14日後におけるC57BL/6Jマウスの左室短縮率 (FS)。 (D) ドキソルビシン投与前および投与14日後におけるC57BL/6Jマウスの心拍数 (HR)。 データはn = 17匹のマウスについて示されている。統計学的比較にはWelchのt-testを用いた。 *P < 0.05; ****P ≤ 0.0001。 略語：FS, fractional shortening（左室短縮率）；HR, heart rate（心拍数）。 こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図5: 器官サンプリングプロトコル。 (A) 腫瘍間質液回収プロトコルの模式図。BioRender（ライセンス番号：HV29USD91R）を用いて作成。 (B) 器官サンプリング中の腫瘍間質液回収を示す代表的な画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 6: ドキソルビシン誘発心毒性. (A) 腫瘍担持Balb/cマウスにおいて、16 mg/kgのドキソルビシン投与開始から3週間後に測定した心重量。 (B) 腫瘍担持Balb/cマウスにおいて、16 mg/kgのドキソルビシン投与開始から3週間後に測定し、総体重で標準化した心重量。 (C) 24 mg/kgのドキソルビシン投与開始から1週間後のC57BL/6Jマウス心筋におけるAtrogin mRNA発現量。 (D) 24 mg/kgのドキソルビシン投与開始から1週間後のC57BL/6Jマウス心筋におけるMurf1 mRNA発現量。 (E) 24 mg/kgのドキソルビシン投与開始から1週間後のC57BL/6Jマウス心筋におけるNQO1 mRNA発現量。 (F) 24 mg/kgのドキソルビシン投与開始から1週間後のC57BL/6Jマウス心筋におけるBAX mRNA発現量。 統計解析は、データの分布に基づき、Welchのt-testまたはMann–Whitney U検定を用いて適切に実施した。 ns, P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マウス系統Balb/cC57Bl/6J
使用細胞株4T1LucPY8119
注入細胞数200 000200 000
使用した性別雄および雌雄および雌
投与日数46
1日投与量4 mg/kg4 mg/kg
ドキソルビシン累積投与量16 mg/kg24 mg/kg
ケタミン投与量40 mg/kg80 mg/kg
心毒性発現率>90%>90%
生存率19/4516/19

表1：各マウス系統における主要なプロトコルパラメータ。Balb/cおよびC57BL/6Jマウスのプロトコルで使用した主要な実験変数および試薬濃度の比較。

補足表1：動物福祉エンドポイント. こちらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表2：4T1実験プロトコルの文献概要. こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表3：24 mg/kgのドクソルビシンを投与した腫瘍担持C57BL/6Jマウス17匹においてMモードで測定した心エコーパラメータ. こちらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、乳癌担がんマウスにおけるドキソルビシン誘発性心毒性モデルを構築しました。このモデルは、今後の心血管腫瘍学研究において高い臨床的関連性を持つと考えられます。本モデルの目的は、癌の診断を受けて来院してから、心毒性の可能性がある化学療法による治療に至るまでの患者の臨床経過を再現することでした。本プロトコルは実用的な設計に従っており、世界中で入手可能な免疫正常マウスを使用しているため、他の研究室での再現が可能です。また、腫瘍植え付けの成功率が高いため、今後の心血管腫瘍毒性研究における強力な候補モデルとなります。

本プロトコルの一般的な注意点として、心拍数の低いマウスで心エコー図検査を行うと、短縮率（FS）が人為的に低くなる可能性があることが挙げられます。心エコー図による評価の前に、麻酔薬による初期の負の変時性作用からマウスを回復させることで、正確なFS測定が可能になります。Balb/cマウスにおいて死亡率が高いままである場合は、麻酔量をさらに減らす必要があるかもしれません。観察者間のばらつきが顕著になる可能性があるため43、研究期間中のすべての心エコー図評価は同一の実験者が行う必要があります。腫瘍移植において、注入時にシリンジを急いで引き抜くと、線状の腫瘍が形成され、適切な注入で生成された腫瘍よりも大きく成長することがあります。また、正しい乳頭への注入が極めて重要であり、上腹部の乳頭に配置すると、腫瘍成長の後期段階において心エコー図評価の妨げになる可能性があります。各マウスに同数の細胞を投与し、プロトコル終了時の腫瘍サイズのばらつきを最小限に抑えるため、懸濁液中の細胞を手動で計数し、注入前に十分に混合することが推奨されます。週に一度の採血が必要な場合は、ドキソルビシン投与後のマウスは脆弱になるため、採取量を厳密に制御する必要があります。採取量が多いとプロトコル中の死亡率が高まる可能性があるため、各採血時点での総血容量は最大50 µLとすることが推奨されます。また、採血の頻度と量は、地域の動物倫理要件および施設内の動物施設ガイドラインに準拠させる必要があります。採血後の水分損失を補うため、採取した血液量と同量の生理食塩水を皮下投与することが有効です。

このdox手順を比較するため、AICの動物モデルに関する最近のレビューでは、ほとんどの前臨床モデル（88%）がDoxの反復投与を行い、数週間後に（多くは心エコー検査を用いて）アウトカム測定を行っていたことが観察された29。ほとんどの論文でC57Bl/6J系統（73.8%）の使用が報告されており、これはおそらくその堅牢さと低コストによるものである29。残念ながら、かなりの数の研究では、ACsを投与する前の動物の生物学に対する腫瘍の影響が無視されていた17,29。736件の研究のうち、腫瘍担持モデルを報告したのはわずか46件であり、そのうち12件ではBalb/cマウスに4T1細胞株（トリプルネガティブ様乳がん）を使用しており、C57Bl/6Jマウスにおける乳がんモデル（より具体的にはEGFR2陽性様乳がん）はわずか1件であった29。別の研究では、EGFR-2陽性様乳がんを伴うC57Bl/6Jが使用されていたが、化学療法の開始前に腫瘍の増殖を許容していなかったため、このモデルのトランスレーショナルな側面が制限されていた32。

免疫不全マウスを用いた異種移植モデルではヒト腫瘍細胞株の使用が可能ですが、機能的な免疫系を欠いているため、免疫介在性心毒性のメカニズムの研究が制限されます。これは、免疫チェックポイント阻害剤に関連する心毒性の重要性が高まっている現状において、大きな制約となります。心腫瘍学の分野では大型動物モデルが登場していますが、高コストであることや遺伝子工学的な操作能力が限定的であるという欠点は常に付きまといます44。In vitroおよび2D/3Dヒト細胞ベースのシステム（例：ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓オルガノイド）は、ハイスループットなメカニズム解析や毒性スクリーニングを可能にしますが、in vivoモデルで捉えられる統合的な個体生理（血行動態、神経内分泌調節、免疫クロストーク）を再現することはできません。これらのアプローチと比較して、本研究で用いる同系・免疫能を有する腫瘍担がんモデルは、生物学的ばらつきが大きく、一部の系統で死亡率が高く、また単純なin vitroモデルや非担がんin vivoモデルよりもスループットが低いという点はあるものの、腫瘍量と化学療法誘発性心毒性の相互作用を研究するための、より臨床的に適切なコンテキストを提供します。

これまで主に用いられてきた非腫瘍担持AC心毒性モデルは、再現性が高く、低コストであり、心エコー検査や生存率の評価が容易であるという利点がある。しかし、腫瘍負荷、癌関連炎症、および悪液質が心臓に及ぼす全身的な影響を捉えることができず、これらは患者における心毒性の重要な混同要因として認識されつつある17,45。さらに、D-2-ヒドロキシグルタリン酸やコハク酸などの分泌オンコメタボライトによって、心臓の代謝リプログラミング、ひいては収縮機能が変化する可能性がある14。したがって、さまざまなオミクス解析（例えばプロテオミクスやメタボロミクス）を用いた心臓の生化学的分析のために心臓腫瘍学モデルを構築する場合、化学療法前に腫瘍が存在していることが不可欠である。また、腫瘍自体が顕著な心機能不全を誘発し得るというエビデンスもあるが、文献によって一貫していない。腫瘍の接種がFS（短軸短縮率）や電気伝導パラメータに悪影響を及ぼしたモデルがある一方で、腫瘍の存在が横大動脈狭窄によって誘発されるリモデリングからマウスを保護したとする報告もある11,13,46。一方で、予備的な仮説によっては非腫瘍担持動物も必要となる。これらの動物は、化学療法剤の直接的な心毒性作用を、腫瘍自体の混同影響から分離して評価できる唯一の設定であり、因果関係を確立し、薬剤特異的な作用機序を解明するための不可欠な前提条件となる。これらの動物は、抗癌剤療法の効果およびそれが腫瘍と相互作用して心毒性に及ぼす影響を評価するための対照群として機能する。この比較対象がなければ、観察された心機能表現型のどの構成要素が薬剤、腫瘍、あるいはそれらの相互作用に起因するのかを判別することは不可能である。この区別は、機序の理解だけでなく、心保護戦略の合理的設計にとっても極めて重要である。したがって、これらの各モデルは、異なる相補的な科学的問いに対応しており、単一のモデルだけでは臨床的な心臓腫瘍学の複雑さを完全に再現するには不十分であることを認識することが重要である。堅牢な機序的およびトランスレーショナルな結論を導き出すには、多くの場合、両モデルを併用または逐次的に使用することが必要である。

本プロトコルでは、心毒性を2022年ESC心腫瘍学ガイドラインに基づいて定義した。同ガイドラインでは、中等度の無症候性がん治療関連心機能不全を、左室駆出率（LVEF）の減少として定義している。 >LVEFが40%から49%の間である10%16しかしながら、左室駆出率（LVEF）を正確に定量化するには、超音波診断装置に3Dモジュールが必要です。39心収縮機能の不正確な評価を避け、かつ旧式の超音波診断装置を使用している研究室でも実施可能な簡便なプロトコルを維持するため、心機能不全の指標としてFS（短縮率）を採用することが好ましいと判断した。マウスにおけるFSは、ESC（欧州心臓病学会）が規定した基準と同様の基準を用い、Mモード解析によって正確かつ容易に算出できる。本プロトコルを用いた場合、生存マウスの90%が心毒性の基準を満たしており、今後のトランスレーショナル研究における有力な候補となる。Balb/cマウスにおけるDoxの心毒性効果は、肉眼的な評価（心重量の減少）によって確認された。C57Bl/6マウスにおいては腫瘍のみの群を設けていないため、現時点では本系統における比較データはない。さらに、腫瘍を担有していないC57Bl/6マウスにおいて、Doxの投与は、アントラサイクリン系薬剤による心毒性のメカニズムに関する先行文献と一致する変化（萎縮の亢進、酸化ストレス、およびアポトーシス）を誘導した。19,20.

しかし、スペックルトラッキング法による全周性縦方向歪み（GLS）など、患者に使用されるより現代的な変数は、技術的な理由によりここでは定量化されませんでした。もし局所的に実施可能であれば、GLSを定量化することは付加価値があると考えられます。なぜなら、GLSは一般的に、早期の心損傷を検出することにおいてより感度が高いと考えられているためです23。心毒性検出の確実性を高めるために、トロポニンなどの循環心 biomarkers を評価することも可能ですが、マウスにおけるこれらの解析に従来必要とされる血漿量は、これらの動物の総血液量が少ないため、制限要因となる場合があります。さらに、Dox投与後のこれらの動物の脆弱性は、採血中または採血後の死亡率を上昇させる可能性があります。最後の制限要因は、これらのバイオマーカーに対するアッセイの感度であり、これがしばしば解釈を妨げる原因となります。

超音波測定はすべて同一の熟練した実験者が行いましたが、処置なしの状態であっても、同一のBalb/cマウスにおいて週ごとの変動が大きく観察されました。これは、本系統のケタミン麻酔に対する感受性で説明できます47。実際に、麻酔下での処置中に高い死亡率が認められ、プロトコルの最後まで到達する動物数が少なくなったため、Balb/cマウスに使用するケタミンの投与量を80 mg/kgから40 mg/kgに減量しました。Dox投与したBalb/cマウスの生存曲線を確認すると、麻酔時（週1回の心エコー検査）に一部の死亡が発生していますが、死亡の大部分は能動的な処置が行われていない動物飼育施設内で発生しており、これらのマウスにおける死亡の主因がDoxであることを強調しています。それにもかかわらず、2つ以上の系統を比較してこのモデルの生存曲線を解釈する際には、麻酔に関連した死亡を念頭に置くことが重要です。麻酔による死亡リスクを軽減するために、覚醒したマウスで心エコー検査を行うことも可能ですが、これにはプロトコルにマウスを組み込む前のトレーニングと順化が必要です。Doxに関しては、減量後であってもBalb/cマウスのほぼ半数がプロトコルの最後まで到達しませんでした。さらに低用量のDoxで心毒性の誘導を試みることも考えられますが、その場合は心毒性の基準を満たす動物数が減少するリスクがあります。別の戦略としては、Doxの各注射後に動物の回復時間をより長く設けることが挙げられます。本研究では実施していませんが、文献では生存率が向上したという報告があります29。

このモデルを構築する過程で得られた、Balb/cマウスはC57Bl/6JマウスよりもDoxに対して感受性が高く、また雌は雄よりもDoxに対して耐性が高いという観察結果は、先行文献29と一致しています。さらに、両マウス系統で同様の再現性のある結果が得られたことは、提案した本モデルの堅牢性をさらに裏付けるものです。短期間に中〜高用量の連日投与を行うことで高い累積投与量に到達させ、高い生存率を維持しつつ高い心毒性率を得ることができました。C57Bl/6Jで乳がんモデル（PY8119はトリプルネガティブ様乳がんです）を構築することは、これらのマウスがトランスジェニックモデルの主要な遺伝的背景の一つであるため34、今後の研究に非常に有用 будетと考えられます。また、腫瘍接種の高い成功率は、選択した注入法の有効性を支持しており、本モデルにとって有望です。さらに、これらのマウスのDox耐性が高いことは、二次がんや転移という頻繁な臨床状況を模倣するための、Dox再投与を伴う長期的な研究への道を開きます。最後に、この臓器サンプリングプロトコルにより、すべての実質臓器、腫瘍およびその間質液、ならびに骨髄とそのストロマを採取でき、非常に徹底したモデル解析が可能となります。

このモデルにはいくつかの限界があります。実用的な設計を優先し、侵襲的な手術を避けているため、皮下注射では腫瘍の正確な位置（すなわち、皮下脂肪ではなく正しい乳腺への注入）を正確に制御することができず、研究対象となる科学的な問いによっては、これが極めて重要になる場合があります48。正確な部位への癌細胞注入が必要な場合は、より広範囲の手術による同所性注入の方が適している可能性があります。ただし、注入方法に関わらず、腫瘍の体積、潜伏期間、発生率は同様の結果となるため、この点は主に腫瘍の生化学的分析が計画されている場合にのみ真に重要であると考えられます48。また、アントラサイクリン（AC）のみの使用は、患者がシクロホスファミドやシスプラチンなどの併用療法を受けることが多いという臨床状況と完全に相関していないという議論もあるでしょう。これは、本プロトコルの次なる設計案となり得ますが、使用する各化学療法剤の用量調節を慎重に行う必要があります。さらに、Dox投与開始3週間後のBalb/cマウスにおける50%を超える死亡率は依然として非常に高く、用量を減らすことで生存率を向上させられる可能性がありますが、その場合、心毒性が弱まる可能性があります。また、本モデルで使用した用量は、現在人間で使用されている一般的な用量よりも高いことに留意すべきであり、これが本モデルのトランスレーショナルな可能性を制限する要因となるかもしれません。

開示事項

著者らは、本原稿に関して利益相反がないことを宣言します。

謝辞

動物の福祉に関する日々のモニタリングにご協力いただいた動物施設チームに感謝いたします。動物実験プロトコルの作成を支援してくださったLéanne Borges氏、Elias Ait Assa氏、およびClémence Chabaud氏に感謝いたします。PY8119細胞をご提供いただいたINSERM Unit 932のDr Julie Helftに感謝いたします。また、バイオルミネッセンスの解析にご協力いただいたDr Sylvain Provost氏と学生のMel Gavens氏に特段の感謝を申し上げます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4T1Luc細胞ATCCCRL-2539
ドキソルビシン粉末クリニサイエンス23214-92-8
超音波心拍計Visual SonicsVEVO LT-200
ルシフェリンPerkin Elmer E1605
ナイロンメッシュMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
PY8119細胞Julie Helft博士からの提供物

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