レーザースペックルコントラストイメージングを用いたヒト皮膚微小循環における全身微小血管機能の標準化評価プロトコル

Summary

本プロトコルは、レーザースペックルコントラストイメージングと薬理学的イオントフォレーションおよび生理刺激を組み合わせて、臨床研究現場における微小血管反応性を評価するための標準化された非侵襲的手法を記述しています。

Abstract

レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)は、高解像度で非侵襲的な光学技術であり、微小血管の血液灌流をリアルタイムかつ全視野で可視化することを可能にします。本プロトコルは、LSCIを用いてヒト皮膚微小循環における全身微小血管機能を評価するための標準化された方法論を提示します。この技術で得られる測定値は環境的および生理学的な交絡因子に非常に敏感であるため、再現性と実験的信頼性を高めるために厳格な標準化手順を重視しています。プロトコルは、23°C±1°Cでの室温安定化、参加者の位置調整、順応手順、画像取得時の外部干渉の最小化など、重要な環境管理を詳述しています。この方法論は、LSCIを2つの補完的な誘発的手法と統合し、皮膚微小血管反応性を評価する。閉塞後反応性充血は統合的な微小血管反応性を評価するために用いられ、イオントフォレシス駆動の薬理学的課題は内皮機能の評価に用いられます。具体的には、内皮依存性血管拡張を評価するためにアセチルコリンを投与し、内皮依存性血管拡張を評価するためにニトロプルシドナトリウムを投与します。この段階的な可視化プロトコルは、臨床およびトランスレーショナル研究の場で標準化されたLSCI手法の採用を促進することを目的としています。このアプローチは、抵抗性高血圧、糖尿病、冠動脈疾患など、いくつかの臨床疾患における微小血管障害の特定に成功裏に適用されています。微小血管反応性の再現可能かつ非侵襲的な評価を可能にすることで、この手法は全身血管の健康を調査し、疾患の進行を監視し、微小血管を標的とした介入の有効性を評価するための貴重なツールを提供します。

Introduction

このプロトコルの主な目的は、レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)と生理学的および薬理学的誘発手法を組み合わせて、全身の微小血管機能と反応性を評価する標準化かつ再現可能な方法論を提供することです。微小循環は、直径約100μm未満の末端血管(動脈、毛細血管、静脈)から構成^{され、代謝}交換の主要な部位であり、末梢血管抵抗の重要な決定因子です^。これらの小さな血管における内皮機能障害は、しばしば大血管変異に先行し、高血圧、糖尿病、冠動脈疾患などの心血管疾患の初期バイオマーカーとして機能します³。重要なのは、微小血管障害が末端臓器損傷に大きく寄与する一方で、多因子性疾患過程において大血管動脈硬化や全身性慢性炎症と連動して作用する点です。したがって、微小血管反応性の非侵襲的評価は、早期診断および治療効果のモニタリングにおいて、トランスレーショ^{ナルリサー}チにおいて不可欠です。

全身血管の健康の代替として皮膚微小循環を利用する理由は、そのアクセスの容易さと、全体的な内^皮機能の代表的な窓口としての役割^{にあります。}従来、レーザードップラーフローメトリー(LDF)は非侵襲的皮膚評価のゴールドスタンダードとされ^{てきました7。}しかし、LDFは皮膚灌流の本質的な異質性に非常に敏感な点ごとの測定を提供するため、空間分解能が低いため制限^{があります。}これに対し、LSCIは組織灌流の全視野リアルタイム可視化を高時間・^{空間分解能}で提供し、大きな利点を提供します。レーザー光散乱によって生成される干渉パターンを解析することで、LSCIは物理的接触や外因性染料を必要とせずに複数の血管領域を同時に評価することを可能にします^10,11。

より広範な文献では、LSCIをイオントフォレシスによる薬理学的刺激(アセチルコリン(ACh)やナトリウムニトロプルシド(SNP)などの薬物刺激と統合することが、内皮依存性および内皮非依存性血管拡張経路を評価するための堅牢なアプローチとして検証されています(^12,13)。さらに、閉塞後反応性充血症(PORH)は、内皮媒介物質、神経原性感覚神経、血管平滑筋機能を含む微小血管反応性の統合評価を提供します¹²。利点があるにもかかわらず、LSCIは環境および生理学的変動に対して高い感度があるため、厳格な標準化手続きが必要です。このプロトコルは、室温23°C±1°Cでの安定化や標準化された参加者の位置調整など、重要な環境制御を詳細に示し、被験者内および被験者間での再現性を向上させることを目指し^ます。この手法は、多様な患者集団にわたる微小血管病態生理を探求するための方法論的根拠のある非侵襲的アプローチを求める臨床およびトランスレーショナル研究者に適しています。

Protocol

人間参加者を含むすべての手技は、ブラジル保健省国立心臓病学研究所の倫理基準に従い、国家規則(国立研究倫理委員会(INAEP – 2024年5月法第14,874号より)およびヘルシンキ宣言(2024年改正)に準拠して行われました。

1. 参加者の準備と環境管理

1. 検査環境を安定させる
   1. 専用サーモスタットを使って検査室温(RT;23°C±1°C)に安定させ、安定した熱環境を維持します。
   2. 10分ごとに校正済みのデジタル温度計(精度±0.1°C)でRTを監視します。
      注:皮膚微小血管機能は温度変動に非常に敏感です。
2. 評価前に参加者を準備させてください
   1. 評価前24時間は喫煙、カフェインやアルコールの摂取を控え、激しい運動を行うよう指示してください。
   2. 評価前に少なくとも2時間断食し、水分摂取を許可するよう指示してください。
      注意:カフェインや激しい運動の禁断は、皮膚血管張りへの外部からの干渉を最小限に抑えます。カフェインはアデノシン受容体受容体受容拮抗薬として作用し、運動は交感神経の駆動や体温調節に作用することで、曝露後数時間持続する微小血管反応性の変化を引き起こす可能性があります^4,14。
3. 画像取得のために参加者の位置を決める
   1. 参加者の利き腕でない腕を心臓の高さに位置させ、ボディクッションを使って前腕を水平かつ安定した位置に保ちます。
   2. 前腕の腹面を評価部位として使いましょう。
      注:非利き前腕は日常生活に伴う側方血管再構築の影響を最小限に抑えます。腹側前腕は、毛髪密度の低下や皮膚厚の減少など、光学イメージングに適した解剖学的特徴を提供し、信号アーティファクトを最小限に抑え、イオントフォレティック薬物送達の再現性を向上させます。
4. 心血管の安定化を促す
   1. 微小血管記録を開始する前に、参加者を少なくとも20分間安静に保ちます。
   2. 休息期間中は、参加者が話すこと、評価された手足の動かすこと、電子機器の使用を制限します。
      注:安定化期間は、ベースライン獲得前の自律神経および心血管の変動を最小限に抑えます。
5. モーションアーティファクトの最小化
   1. 参加者の利き手でない前腕を真空クッションシステムに置きます。
   2. 画像取得中、腹側前腕面を安定した水平位置に保つようにクッションを調整してください。
6. 皮膚の表面を準備してください
   1. すべての測定では、毛髪が見えない皮膚部位を選びます。
   2. 必要に応じて、検査の24時間前に手術用バリカンを使って髪を抜きましょう。
      注意:皮膚の刺激が微小血管測定に影響する可能性があるため、カミソリの使用は避けてください。
7. 動脈血圧を測定してください
   1. 参加者の腕周に合わせてカフのサイズを選びます。
   2. 測定間隔1分を設け、校正済みの自動オシロメトリック装置を用いて3回連続で血圧測定を行います。
   3. 最初の測定値は廃止し、最後の2つの測定値の平均を計算して、ESC/ESHおよびAHA心血管ガイドラインに従い平均動脈圧(MAP)を算出します。

2. LSCIシステムセットアップおよびソフトウェア構成

1. LSCIシステムの準備
   1. 画像取得の少なくとも10分前にLSCIシステムを起動し、レーザー光源の安定化を図ります。
   2. 録画開始前にソフトウェアステータスインジケーターでレーザーの安定化を確認してください。
2. レーザーヘッドの位置
   1. レーザーヘッドを参加者の前腕の真上に位置させます。
   2. メーカー提供の距離測定ツールを使って、レーザーヘッドを皮膚表面から正確に15cmの距離まで調整します(図1A)
      注意:固定の取得距離を維持することで、最適な画像のピントと参加者間の一定の視野角を確保します。
3. 取得ソフトウェアの設定
   1. 画像取得ソフトウェアを起動し、新しいスタディファイルを作成します。
   2. 参加者の人口統計情報と、以前に計算されたMAPを入力します。
      注意:該当する場合は、詳細なソフトウェア操作手順や代表的なスクリーンショットを補助資料として同封してください。
4. 取得パラメータの設定
   1. 取得サンプリングレートを1画像/秒(1Hz)に設定します。
   2. ターゲット取得領域の空間分解能を約0.1 mm/ピクセルに調整します。
      注:1 Hzのサンプリングレートは、時間的解像度と信号対雑音比の適切なバランスを提供しつつ、高吸血および薬理学的応答動態を十分に捉えます。
5. 周囲光の干渉を最小限に抑える
   1. 画像取得前にシステムの要件に応じて背景雑音チェックまたは暗黒フレームの減算を行います。
   2. 暗フレームの引き算が使えない場合は、すべての録音時に部屋の照明を暗くし、遮光カーテンで外部の日光を遮ります。
      注:標準化された環境照明は光学的干渉を最小限に抑え、信号の再現性を向上させます。
6. 関心領域(ROI)を定義する
   1. 取得ソフトウェア内のライブプレビュー画面で、約80 mm² の円形ROIを少なくとも3回作成してください。
   2. イオントフォレスシス電極部位に2つのROI、PORH評価部位に1つのROIを配置します。
   3. すべてのROIは肘窩から約5cm先の腹側前腕に置き、目に見える浅い静脈は避けます。
      注:ROI領域を標準化することで、皮膚灌流における空間的異質性の影響を最小限に抑え、薬物投与チャンバーに関連するエッジアーティファクトを減らします。
7. ベースライン灌流記録を取得してください
   1. 血管刺激の前に5分間連続して安静時の皮膚血灌流を記録してください。
   2. リアルタイムの灌流信号を監視し、ベースライン取得時に動作による急増がないことを確認します。
   3. 基準安定性を、連続した2分間の間隔で<10%の灌流信号変動と定義します。
8. 皮膚血管伝導(CVC)解析を可能にする
   1. 参加者のMAPを取得ソフトウェアに入力します。
   2. ソフトウェア設定でCVCの自動計算を有効にしてください。
9. 灌流および伝導率データの記録
   1. ソフトウェアを設定して、リアルタイム灌流値(APU)をMAPで割ってCVCを自動的に計算するように設定してください。
   2. プロトコル全体を通じて、生の灌流単位(PU)と計算されたCVC値を同時に記録してください。
      
      注:微小血管灌流をCVCとして表現することで、全身性血圧変動の交絡影響を最小限に抑え、異なる血行動態プロファイルを持つ参加者間の比較がより信頼性の高いものとなります。

図1。レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)とイオントフォレシスを組み合わせて、皮膚微小血管灌流を評価するための実験装置。(A) 血管拡張剤のレーザースペックルコントラストイメージングおよびイオントフォレーションを用いた皮膚微小血管評価に用いられる代表的な実験装置。(b)アセチルコリン(ACh)の累積用量による経皮イオントフォレーション送達中の代表的な微小血管灌流反応。(C) ACイオントフォレスシスの代表画像。(D) 車両搭載制御電極の代表画像。ラベルは以下の部品を示します:(1) イメージャーヘッド;(2) イオントフォレシス薬剤送達電極;および(3)分散電極。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. イオントフォレーシスと薬理学的誘発

1. 皮膚をイオントフォレーションのために準備してください
   1. 選んだ腹側前腕の皮膚部位は、アルコールを含まない生理食塩水または穏やかな洗剤で洗浄してください。
   2. 電極を挿入する前に、皮膚を優しく叩いて乾かします。
      注意:皮膚準備時の過剰な機械的刺激は避けてください。機械的誘導による血管拡張は基準値測定に干渉する恐れがあります。
2. 薬物投与電極の位置を取れ
   1. 両面接着ディスクを用いて、準備された皮膚部位に2つの薬剤送達電極を取り付けます(図1A)。
   2. 電流の干渉を防ぐために、電極間距離を約5cmに保ちましょう。
3. AC溶液を準備します
   1. 最初の電極室に200μLの2%ACh溶液を0.9%生理^食塩水で調製^します。
   2. ACh電極を使って内皮依存性血管拡張を評価します。
      注:選択された薬剤濃度は、非特異的刺激やガルバニックアーチファクトを最小限に抑えつつ、強健な線量依存的な微小血管応答を誘導するよう最適化されました。
4. SNP解を準備する
   1. 200μLの2%SNP溶液を0.9%の生理食塩水で調製し、第2電極室を満たします。
   2. SNP電極を使って内皮非依存性血管拡張を評価してください。
      注意:SNPは光に敏感です。アルミホイルで溶液を光から保護し、調製から4時間以内に薬理学的安定性を維持するために溶液を使用しましょう。
      注:選択されたSNP濃度は安定したプラトー血管拡張を促進し、非特異的な電気的影響を最小限に抑えます。
5. 閉じ込められた気泡を取り除きましょう
   1. 皮膚を取り付ける前に、電極室に閉じ込められた気泡がないか点検してください。
   2. 目に見える気泡は、電極室を優しく叩くか、滅菌プラスチック製のシリンジ先端を使って除去してください。
      注意:気泡は電流の流れを妨げ、不均一な薬物送達を引き起こす可能性があります。
6. 基準電極の位置を取る
   1. 参照(中性)電極を薬剤送達電極の約15cm近位に導電性ゲルまたは接着剤で取り付けます(図1A)。
   2. イオントフォレーションを開始する前に、電極接触が安定しているか確認してください。
      注:薬理学的評価領域とPORH評価領域の空間的分離により、交絡相互作用を最小限に抑え、ACh誘発性軸索反射フレアとPORH測定領域の重複を防げます。
7. イオントフォレーシスシステムを接続します
   1. 電流を適用する前に、すべての電極をイオントフォレーシス供給装置に接続してください。
   2. プロトコル開始前に電極極性を確認してください(AChは陽極、SNPは陰極)。
      注意:電極極性が誤ると薬物送達効率が低下し、血管反応が変化することがあります。
8. イオントフォレシスの現在プロトコルを実施してください
   1. 両方の薬理学的薬剤に対して、30、60、90、120、150、180μAの6回の増分電流投与を行います。
   2. 現在の各用量を10秒間塗布します。
      注:インクリメンタルカレント・カレントプロトコルは線量反応曲線の構築を可能にし、微小血管感受性およびプラトー応答の評価を容易にします¹¹。低電流振幅と短い刺激間隔の組み合わせにより、非特異的なガルバニック血管拡張が最小限に抑えられます。
9. 刺激の間隔を保ちましょう
   1. 連続した電流の適用間隔を60秒保ちましょう。
   2. 投与間隔の安定化期間中に灌流信号を監視してください。
      注:選択された間隔は、局所薬物送達を維持しつつ、微小血管反応の安定化を可能にします。
10. 微小血管反応を記録してください
    1. すべてのイオントフォレシス刺激を通じて、微小血管灌流信号を継続的に記録します。
    2. 最終的な電流適用後、最大プラトー応答を捉えるために少なくとも10分間記録を続けてください。代表的な線量依存応答は 図2Aに示されています。

図2。イオントフォレーションおよび閉塞後反応性充血(PORH)における皮膚微小血管灌流の代表的な記録。(A) イオントフォレーション中にLSCIを用いて得られた2% AChの皮膚微血管血流の代表記録。陽極電流は30、60、90、120、150、180 μAの増大する陽極電流を10秒間隔で1分間供給。(B) PORH評価中に得られた代表的な記録。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 閉塞性反応性充血(PORH)

1. 閉鎖カフの位置を取る
   1. LSCI記録に使う同じ肢の上腕に、幅約12cmの標準的な空気圧カフを装着します。
   2. カフを選定された微小血管評価部位の近位部に置きます。
2. PORH評価領域を定義する
   1. イオントフォレシス電極の隣接する腹側前腕に3つ目のROIを作成します。
   2. 薬理学的干渉を避けるために、治療を不要な皮膚領域にROIを配置してください。
      注意:独立した血管反応を維持するために、薬理刺激部位とPORH評価領域の間に空間的な分離を維持してください。
3. PORHのベースライン記録を取得する
   1. 動脈閉塞前に5分間連続して安静時皮膚灌流を記録してください。
   2. カフ膨張前に基準的な灌流信号をモニタリングし、信号の安定性を確認してください。
4. 動脈閉塞を誘発する
   1. 自動インフレーターまたは手動膨張バルブを使って、<5秒以内に空気圧カフを素早く膨らませてください。
   2. カフ圧を参加者の以前に測定した収縮期血圧(SBP)より50 mmHgまで上げます。
      注意:閉塞期間を開始する前に動脈閉塞が完全にあることを確認すること。不完全な閉塞は充血反応を損なう可能性があるため。
5. 閉塞期間を維持する
   1. 動脈閉塞を正確に3分間連続で維持してください。
   2. LSCI信号が生物学的なゼロプラトー(< 10 APU)に低下することを確認して完全な閉塞を確認しましょう。
      注:生物学的ゼロ信号は、ブラウン運動を含む、指向性血流とは独立した血球の残留運動を反映しています。
6. 閉塞カフを外せ
   1. 急排気バルブを使ってカフ圧力を瞬時に解放します。
   2. 血流の即時回復を許し、反応性充血反応を開始する。
7. 充血反応を記録してください
   1. カフを外した後、少なくとも5分間はLSCIの録音を続けてください。
   2. ピークの灌流反応とその後の基準灌流レベルへの回復を捉えます。代表的なPORH応答は 図2Bに示されています。
8. PORH応答を定量化してください
   1. 画像取得ソフトウェア内でピークCVCを計算します。
   2. 解析ソフトウェアを使って、超吸動応答信号の曲線下面積(AUC)を計算します。

5. データ抽出と統計解析

1. 記録されたデータを開いて検証します
   1. 画像解析ソフトを使って記録された取得ファイルを開いてください。
   2. すべての事前定義されたROIが対応する測定地点に正しく配置されていることを確認してください。
      注意:再配置ROIは、モーションアーティファクトや獲得ドリフトによって元の配置が損なわれた場合のみ行います。
2. 解析区間を定義する
   1. 灌流およびCVCトレンドグラフ上の具体的な分析区間を特定します。
   2. 最初の血管刺激直前の連続した60秒の基準間隔を選択します。
   3. イオントフォレーション刺激後の各60秒間隔の最後の30秒を選択して、プラトーの微小血管反応を捉えます。
      注:ベースライン安定性を、データ解析前に血管運動振動や運動アーティファクトの影響を最小限に抑えるため、灌流信号の5%<変動係数(CV)と定義してください。
3. PORH応答変数の特定
   1. PORHプロトコルの動脈閉塞期における生物学的ゼロ信号を特定します。
   2. カフリリース直後にCVCのピーク値を特定してください。
4. 区間平均値を計算します
   1. 画像解析ソフトウェアを使って、各あらかじめ定義された分析区間の平均CVC値を計算します。
   2. 最終的な計算値を確定する前に、動きのアーティファクトがないか確認してください。
5. 抽出したデータを整理する
   1. 平均生のPU値と平均CVC値をエクスポートするか手動で文字起こしし、構造化されたスプレッドシートにしてください。
   2. データセットは、アセチルコリン、ニトロプルシドナトリウム、PORH反応などの血管刺激や研究グループごとに整理します。
      注意:データ処理時にはファイル名と参加者識別コードの一貫性を維持し、文字起こしの誤りを最小限に抑えてください。
6. 二次的な血管転帰の計算
   1. 基準灌流またはCVC値からの増加率を計算し、血管反応性を判断します。
   2. 二次評価項目分析のために必要な場合にAUCを計算します。
7. 統計解析を行う
   1. 統計分析ソフトウェアを使ってデータを分析します。
      注意:該当する場合は、ソフトウェアベースの解析に関する代表的なスクリーンショットやワークフロー指示を補助資料として含めてください。
   2. データ分布の評価
      1. シャピロ・ウィルク検定を用いてデータの正規性を評価します。
      2. 正規分布データを平均±標準偏差(SD)として表現します。
      3. 非正規分布のデータを中央値および四分位数範囲(IQR)として表現します。
   3. 微小血管反応の比較
      1. 正規性仮定が満たされた場合、独立したt検定を用いて2グループデータセットを比較します。
      2. 複数のグループを一方向ANOVAで比較し、その後Tukeyの事後検定を行います。
   4. 統計的有意基準の定義
      1. 統計的有意性をp < 0.05と定義します。
      2. 影響を受けた分析からペアワイズ削除または除外を用いて、運動アーティファクトによる欠損データを処理します。
         注意:分析の完全性を維持するために、すべての研究グループで同じ欠損データ戦略を一貫して適用してください。

Results

このプロトコルを成功裏に適用すると、安定したベースラインが得られ、その後各血管刺激に対して明確かつ識別可能な微小血管反応が得られます。技術的に成功した実験では、ベースライン記録が最小限の変動で安定した灌流信号を示し、平均信号の< 10%の標準差(SD)と定義されます。ACおよびSNPのイオントフォレーション中は、APUが段階的に増加することが予想され、これは線量依存的な血管拡張を反映しています。成功したPORH反応は、動脈閉塞時に灌流が急速に低下して安定した生物学的ゼロにし、その後カフ解除直後に急激な充血ピークが現れ、健康な被験者では基準値を数倍も上回る傾向があります。 図1A は、LSCIおよびイオントフォレーシスを用いた皮膚微小血管評価に用いられる実験装置を示しています。 図1B–1D は、代表的なイオントフォレシス応答と電極位置を示しています。 図2A はACイオントフォレーション中の線量依存的な微小血管反応を示し、図 2B は代表的なPORH応答を示しています。

最適でない、または技術的に成功しない録音は、信号の不安定さや動きに関連するアーティファクトが特徴的です。高周波の急激な急増や急激なベースライン変動は、参加者の動きや真空クッション支持システムの不十分な安定化を示すことが多いです。健康な参加者でイオントフォレーション時に血管拡張反応が減少または全く現れない場合、電極と皮膚の接触不良や電極チャンバー内に気泡が閉じ込められていることを示すことが一般的であり、電流の伝達が障害されます。 図3 は、動作に関連する信号の不安定性を特徴とする許容できない記録の代表例を示しています。

図3。イオントフォレーション時の許容できない微小血管灌流記録の代表例。 ACイオントフォレーション中にLSCIを用いて取得した皮膚微小血管血流の代表的な記録は、信号の不安定性と定量解析に適さない運動関連アーティファクトを示しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

PORH閉塞期に安定した生物学的ゼロを達成できなければ、動脈閉塞不完全を示しており、これは一般的にカフの位置の誤りやカフの膨張圧力不足によって引き起こされます。このような条件下では、その後の充血反応は弱まり、信頼できる解釈に適さなくなります。

成功裏に実行されたプロトコルは、再現可能な灌流曲線およびCVC曲線を生成します。SNPイオントフォレーション時に観察される最大CVCプラトーは、全血管拡張能力と血管構造の完全性を反映しているのに対し、ACh介在応答は主に内皮依存的な微小血管機能を反映しています。これらの血管応答の標準化された比較により、保存された微小血管機能と障害された機能に一致するパターンの区別が可能になります。健康な若年被験者および抵抗性動脈高血圧患者から得られる代表的な定量的微小血管パラメータを 表1に示しています。

微小血管パラメータ	部隊	ヘルシー・ヤング・コントロールズ (n = 25)	抵抗性動脈高血圧症の患者 (n = 50)	p値
ベースラインCVC	APU/mmHg	0.37 ± 0.13	0.29 ± 0.12	0.01
ACh誘発のピークCVC	APU/mmHg	0.67 ± 0.23	0.51 ± 0.19	0.004
SNP誘発ピークCVC	APU/mmHg	0.60 ± 0.21	0.41 ± 0.17	0.0003
PORHピークCVC	APU/mmHg	0.87 ± 0.18	0.60 ± 0.16	< 0.0001

表1:健康な若年被験者および抵抗性動脈高血圧症患者における代表的な微小血管反応性パラメータ。 値は平均±標準偏差(SD)で表されます。p値は独立t検定を用いてグループ間の比較を行いました。略称:ACh、アセチルコリン;SNP、ニトロプルシドナトリウム;PORH(閉塞後反応性充血);CVC(皮膚血管伝導);APU、任意の灌流装置。データは著者の研究室からの未発表の結果を表しています。

Discussion

LSCIは、高い空間的・時間的分解能を持つ標準化かつ非侵襲的な全身微小血管機能評価を提供します。LDFは単点測定に限定され、皮膚灌流の空間的異質性に非常に敏感であるのに対し、LSCIは全視野画像化と複数のROIの同時評価を可能にします。この特性は測定の再現性を大幅に向上させ、臨床微小血管研究における変動係数を低減します。さらに、LSCIの非接触性により、プローブ技術に一般的に伴う局所的な圧力アーティファクトが最小限に抑えられ、トランスレーショナルおよび臨床研究の場での繰り返し評価に適しています。

このプロトコルの重要な要素は、灌流データをMAPに正規化してCVCを計算することです。皮膚血の灌流は全身灌流圧に強く影響されるため、生のAPU単独の解釈では、特に高血圧や脂質異常などの血行動態プロファイルが変化する集団では有意な交絡を引き起こす可能性があります。このため、プロトコルでは、異なる生理学的および病理的条件下での微小血管機能の解釈を改善するために、生のPU値と正規化されたCVC値の両方を報告することを推奨しています。プロトコルのもう一つの重要な側面は、室温管理、運動アーティファクトの最小化、参加者の位置の標準化など、厳格な環境および参加者の安定化であり、これらは再現可能な記録を達成するために不可欠です。

LSCIにはいくつかの制限も考慮する必要があります。この技術は主に約0.5〜1mmの深さにある浅層皮膚微小循環を評価するため、より深い血管床を完全には反映できない場合があります。さらに、皮膚の色素沈着や周囲光の干渉は信号対雑音比に影響を与えることがあり、このプロトコルで説明された環境制御の重要性を強調しています。もう一つの制約は、手順全体を通じてCVC計算に単一の基準MAP測定を用いることです。約40分間の記録期間中に全身血圧が変動することがありますが、繰り返しのカフ膨張は意図的に避けられました。なぜなら、繰り返し血圧測定が交感神経活性化や動きアーティファクトを引き起こし、レーザーのスペックル信号に干渉する可能性があるからです。今後の継続的な非侵襲血行動態モニタリングの統合研究は、微小血管伝導測定の生理学的解釈をさらに改善する可能性があります。

重要なプロトコルステップには、環境安定化、モーションコントロール、電極の位置調整、PORH中の完全な動脈閉塞が含まれます。不安定なベースライン記録は、参加者の動きや十分な休息時間の不足によって引き起こされることが多く、真空クッションシステムの再安定化と順応期間の延長によって最小限に抑えられます。鈍化されたイオン球反応は、電極と皮膚の接触不良や、供給チャンバー内に空気が閉じ込められていることを示唆することが多いです。慎重なチャンバー充填と電極の再配置はこれらの問題を一般的に解決します。PORH閉塞期に生物学的ゼロを達成できないのは、通常、カフの膨張不十分またはカフの位置の誤りによる動脈閉塞不完全を反映しています。このような条件下では、その結果生じる吸血応答は弱まり、信頼できる解釈に適さなくなります。

生理学的および薬理学的刺激の統合は、このプロトコルの大きな強みであり、これらのアプローチは微小血管調節の補完的な側面を評価するためです。PORHは、一過性虚血およびせん断応力によって引き起こされる内皮、神経原性、血管平滑筋機構に関わる微小血管反応性の統合生理学的評価を提供します¹⁶。これに対し、イオントフォレシスは内皮依存性および内皮非依存性血管拡張経路の選択的評価を可能にします¹⁵。AChは内皮依存性一酸化窒素介在の血管拡張を評価するのに対し、SNPは直接一酸化窒素ドナーとして内皮シグナル伝達に依存しない血管平滑筋応答性を評価する¹⁵。これらの反応の比較解釈により、機能的内皮障害と構造的微小血管再構築の区別が可能になります。この区別は、加齢、抵抗性高血圧、糖尿病、慢性代謝疾患において特に重要であり、内皮シグナル伝達の障害と微小血管の稀薄化が共存する可能性がある^14,17。

まとめると、この標準化されたLSCIプロトコルは、人間の微小血管健康の非侵襲的評価において再現可能かつトランスレーショナルな方法を提供します。薬理学的イオントフォレーシスと生理学的虚血・再灌流検査の組み合わせにより、内皮および構造的な血管機能の詳細な特徴付けが可能であり、厳格な環境および血行動態の標準化を通じて実験的変動を最小限に抑えます。多様な心血管および代謝疾患における早期微小血管機能障害の検出に敏感であるため、このアプローチは臨床研究、縦断的モニタリング、トランスレーショナル血管医学における治療評価において貴重なツールとなります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ストロング>装備
自動シロメトリック血圧モニター	オムロン・ヘルスケア	HEM-7120	基準平均動脈圧(MAP)評価に使用(3回の測定)
デジタルキャリブレーテッド体温計	デルタOHM	HD2301.0	精度とプラス、0.1°Cは室温モニタリング
分散(参考)電極	ペリメドAB	PF 384	大表面積の中性電極
薬物送達電極	ペリメドAB	PF 383 / LI 611	非侵襲型イオントフォレーシスチャンバー(約80 mm²)
イオントフォレシスパワーコントローラー	ペリメドAB	周囲微小血管診断システム	デュアルチャネル電流コントローラ(最大200およびマイクロ;A)
レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)システム	ペリメドAB	PeriCam PSI NR	高分解能血液灌流イメージャー
医療グレードの真空クッション	ABジェルマ	該当なし	心臓の高さでの安定した前腕の位置取りに使用されます
片手操作の真空ポンプ	ABジェルマ	該当なし	真空クッションの排出に使用
ラピッドカフインフレーター	D.E.ホーカンソン社	E20 ラピッドカフインフレーター	標準化された3分間の動脈閉塞に使用されます
<ストロング>試薬と消耗品
アセチルコリン塩化物(ACh)	シグマ・オルドリッチ	A6625	内皮依存性血管拡張剤を2%で調製
アルコール準備パッド	ベクトン・ディキンソン	326895	肌の準備用70%イソプロピルアルコールパッド
脱イオン水	シグマ・オルドリッチ	38796	電極の最終洗浄に使用
塩化ナトリウム(0.9%生理食塩水)	地元サプライヤー	該当なし	薬剤調製および皮膚洗浄用の溶剤
ニトロプルシドナトリウム(SNP)	シグマ・オルドリッチ	S0501	内皮非依存血管拡張剤を2%で準備
滅菌ガーゼ	地元サプライヤー	該当なし	洗浄後の皮膚表面の乾燥に使用します
Software
灌流分析ソフトウェア	ペリメドAB	PIMSoft	LSCIのデータ取得およびROI分析用ソフトウェア
統計分析ソフトウェア	GraphPadソフトウェア	プリズム10	線量応答曲線のフィッティングおよび曲線下面積(AUC)計算に使用