本プロトコルは、経膀胱性Ho:YAGレーザーアブレーションを実証し、熱損傷による線維化再構築および治療介入の研究のための膀胱頸部線維症の再現可能なラットモデルを作成しました。
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方法論記事
ホルミウム:ラットモデルにおける膀胱頸部拘縮のYAGレーザー支援誘導
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
膀胱頸拘縮症(BNC)は、膀胱出口の線維化性狭窄であり、前立腺の経尿道切除術(TURP)後の困難な合併症です。既存の動物モデルはしばしば膀胱外結紮や化学的焼灼に依存しており、これらは内視鏡手術後に発生する熱損傷による線維化を十分に再現できず、再現性も限定的である可能性があります。ここでは、膀胱頸の経膀胱性ホルミウム:YAGレーザー(Ho:YAGレーザー)アブレーションによって誘発される膀胱頸線維症のラットモデルを説明します。下部正中線の開腹術および膀胱切開術の後、200μmのHo:YAGレーザーファイバーを膀胱腔内に直接可視化して挿入します。レーザーエネルギーは接触モードで1.0 Jと10 Hzで、膀胱首の3時と9時の位置にあたり5秒ずつ、ポイントあたり50 J、動物あたり100 Jに相当します。4週間後、治療対象の動物は膀胱の大きな拡大、膀胱首の狭窄、膀胱壁の厚み、そしてコラーゲン沈着の増加やコラーゲンタイプIおよびIII型発現の増加を含む線維化性再構築の組織学的証拠を発症します。このプロトコルは、膀胱出口に局所的な熱損傷による瘢痕を模倣する実用的なモデルを提供します。女性ラットが使用され、本研究では機能的尿路動態検査が行われていなかったため、このモデルは男性の前立腺術後BNCを完全に再現するよりも、膀胱頸部線維症や構造的再構築の研究に最適です。このモデルは、BNCの線維化メカニズムの研究や抗線維化または再建介入の前臨床評価に有用である可能性があります。
概要
膀胱頸拘縮(BNC)は、特にTURP 1,2,3を経尿道手術後によく見られる膀胱頸の線維化性狭窄です。その病理的基盤は、組織損傷後の過剰な瘢痕形成とコラーゲン沈着、創傷治癒異常に挙げられます。BNCは持続的な排尿機能障害、再発的介入、そして高い罹患率を引き起こす可能性があるため、その病因と治療を調査するために再現可能な実験モデルが必要です7。
膀胱出口閉塞や尿道周囲線維症の研究には、近位尿道8の膀胱外結紮やその他の開放 手術法など、いくつかの動物モデルが用いられています。これらのモデルは尿閉塞や筋筋肥大を誘発できますが、内視鏡手術後に術後BNCを開始すると考えられる局所的な熱損傷を特異的に再現するものではありません。さらに、解剖学的標的や損傷の程度は標準化が困難であり、動物間のばらつきが増すことがあります。
理想的なBNC関連モデルは、解剖学的膀胱頸部を標的とすること、内視鏡的エネルギー装置による制御された熱損傷を再現すること、そして許容可能な手術的複雑さで線維化性狭窄を確実に発生させること。これらのニーズに対応するため、私たちは雌ラットにおける経腔内性Ho:YAGレーザーベースのプロトコルを開発しました。女性動物は、前立腺組織から干渉されることなく、手術的曝露を促進し、膀胱頸部特異的な熱損傷および線維化性再形成を隔離するために選定されました。膀胱内直接可視化を用いることで、膀胱頸部の粘膜および粘膜下にレーザーエネルギーを正確に届け、膀胱出口の線維化による再現性狭窄を生じさせます。
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プロトコル
すべての動物実験は、北京中医研究院実験動物福祉倫理委員会の施設動物ケア・利用委員会(承認番号)が承認したプロトコルに従って実施されました。BJTCM-R-2025-03-02)。動物は標準的な環境で飼育され、自由に食料や水を得られました。現在のプロトコルでは合計16頭のラットが使用され、そのうち8頭は手術なしの対照群、8頭はHo:YAGレーザー処理群に属していました。Ho:YAGレーザー処理群の2匹は術後に死亡しました。穿孔、重度の出血、モデル誘導失敗を理由に除外された動物は一切ありませんでした。
1. 術前準備
- 周術期鎮痛用の医薬品グレードメロキシカム(図1A)、小動物吸入麻酔システム(図1B)、200μmレーザーファイバーを用いたHo:YAGレーザーシステム(図1C)、無菌顕微外科器具(図1D)、8-0吸収性編組縫合糸(コーティングポリグリコール酸、PGA)は膀胱切開術の閉鎖用であり、4-0の吸収性編組ポリグラクチン910縫合糸は皮膚閉鎖、無菌生理食塩水、無菌ドレープ、無菌綿棒、無菌潤滑剤に使用されます(図1E)。
- 誘導室内で酸素に3%〜4%のイソフルランを投与して麻酔を誘導し、手術中は鼻のコーンを通して1.5%〜2.5%のイソフルランで麻酔を維持します。
- 呼吸数と承認された動物プロトコルに従って濃度を調整してください。切開前に足のつまみ反射がないことで十分な麻酔深度を確認し、手術中は麻酔深度を再評価してください。
- 下腹部の毛を広くクリップし、カーテンが残った毛を覆い、器具と未剪髪の毛の接触を防ぎます。
- 手術部位を交互にポビドンヨウ素と70%イソプロピルアルコールスクラブで消毒する。ドレープの前に各溶液を3回塗布します。
- 動物を仰向けにして、37°Cに設定された温熱パッドの上に置き、処置中は無菌状態を保ちます。
- 膀胱充填や術中の膀胱頸の特定が必要な場合は、小さな無菌尿道カテーテルまたはカニューレに無菌潤滑剤を塗り、尿道口から膀胱内に優しく挿入し、ゆっくりと無菌生理食塩水を注入します。無理やり挿入したり、詰めすぎたりは避けてください。計画される手術の露出に応じてカテーテルを除去または固定してください。
2. 膀胱の露出
- 無菌条件下で3〜4cm下の正中線皮膚切開を行います(図2A)。
- 細かい鉗子と顕微なハサミを使い、皮下組織を分割し、白線を開いて腹膜腔に入ります。
- 無外傷性鉗子で膀胱の外側を優しく外側に開けます(図2B)。
- 膀胱の首を膀胱基部と近位尿道の接合部と特定してください。
- 鈍いプローブを膀胱の首の下に置き、優しいサポートと目標部位の安定化を図2Cにします。
3. 経息性Ho:YAGレーザーアブレーション
- 無菌生理食塩水で膀胱を広げ、膀胱壁が中程度に緊張するまで続けます。過剰膨張は解剖学的ランドマークを隠したり、膀胱切開部位の緊張を増やしたりする恐れがあるため避けてください。
- 細かいマイクロハサミを使って前膀胱ドームに0.5cmの縦方向膀胱切開術を作成します(図2D)。
- 準備済みの200μmのHo:YAGレーザーファイバーを膀胱切開術から膀胱腔内に挿入します。
- 線維を膀胱首まで直接視認します。
- 繊維の先端を膀胱の頸粘膜に直接優しく置きます。組織の目に見える凹みがない状態で接触モードを維持;エネルギー供給の全過程で、先端から組織までの距離をほぼ0mmに保ちます。
- 9時位置で1.0 Jと10 Hzのレーザーエネルギーを5秒間照射し(図3A)、3時位置で繰り返します(図3B)。この設定では、1点あたり50J、動物1匹あたり100Jを供給し、動物全体で電力は10Wに固定されています。
注:成功したアブレーションは、粘膜の均一な白化と炭化なしに浅い粘膜から粘膜下のクレーター形成によって示されます。 - 5秒の散布中は繊維を安定させ、繊維を壁に押し込まないようにしましょう。深いクレーター形成や全層穿孔は避けてください。線維を尿管口や遠位尿道に向けないでください。
- 繊維を取り除き、無菌生理食塩水で膀胱内腔を洗浄してゴミを取り除き、止血を確認します。
- 2–3で8-0中断のまま膀胱切開術を締めくくる防水性の吸収性編組縫合(コーティングPGA)です。
- 閉鎖線からの漏れがないことを確認するために、0.5〜1.0 mLの無菌生理食塩水で膀胱を補充します(図3C)。
- 腹壁と皮膚を層ごとに閉じます(図3D)。
4. 術後ケア
- ラットは完全に麻酔から回復するまで温熱パッドで保たせてください。
- 術後の鎮痛のためにメロキシカムを皮下投与し、1日1回、1〜3日間継続します。または承認された動物プロトコルに従います。
- 少なくとも7日間、痛み、苦痛、血尿、尿の貯留、傷口の裂傷、感染の兆候がないか毎日観察してください。
- 回復初期には水分補給や柔らかい食事を提供しましょう。
5. 膀胱頸部拘縮の評価
- 手術後4週間、動物の回復を待ち、膀胱首の線維化性再形成を許可してください。
- 実験的エンドポイントでは、ナトリウムペントバルビタール過剰投与(腹腔内投与150 mg/kg)または施設動物プロトコルで承認された他の方法で安楽死させ、組織収穫前に死亡を確認します。膀胱、膀胱首、近位尿道を一括で摘出します。
- 標本を縦方向に開け、膀胱の首を撮影して、目に見える狭窄を記録します。
- 組織を4%パラホルマルデヒドに4°Cで24時間固定し、エタノールを段階的に脱水、キシレンで透明化、パラフィンに埋め込み、膀胱頸部を通る連続4μm断面を取得します。
- ヘマトキシリンとエオシン、マソン氏トリクロム、ピクロシリウスレッドを標準組織学的プロトコルまたは製造元の指示に従って染色し、腔の狭窄、膀胱の首壁の厚み、コラーゲン沈着の評価を行います。
- 免疫組織化学では、脱パラフィン切片、抗原回収、内因性ペルオキシダーゼおよび非特異的結合の遮断、コラーゲンI型およびIII型に対する抗体で切片を培養し、適切な二次抗体を適用し、クロモゲンで現像し、ヘマトキシリンで補染します。
注意:抗体は製造元の推奨に従って希釈されています。 - ImageJ/Fijiまたは同等の画像解析ソフトウェアを用いて、腔面積とコラーゲン陽性面積を定量化します。
- 顕微鏡スケールバーを使ってピクセルからマイクロメートルスケールを校正し、膀胱頸のルーメンと関心のある組織領域を手動で区分し、ルーメン面積を測定します。
- マッソンのトリクロム染色では、関心領域内の青色コラーゲン陽性ピクセルを特定するために一貫した色閾値を適用します。
- コラーゲン陽性面積の割合を、コラーゲン陽性面積を総組織面積で割ったものとして計算します。
- 各動物の比較可能な断面や場で測定を行い、画像をブラインド方式で解析します。
注:モデル誘導の成功は、膀胱出口の狭窄と病変部位における同心線維症およびコラーゲン沈着の増加の組織学的証拠によって支持されています。Ho:YAGレーザー処理群では、予想される粗大表現型および組織表現型の発達に基づき、運用成功率は8人中6%でした。
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結果
手術から4週間後、Ho:YAGレーザーを施したラットは、膀胱頸部線維化性狭窄に一致する重複可能な粗大な変化および組織学的変化を示しました。本研究では、手術なしの対照群に8匹、Ho:YAGレーザー処理群に8匹のラットが含まれていました。処理された動物のうち6匹は期待される表現型を発現しました。喪失はHo:YAGレーザー治療群で術後死亡2例にとどまり、追加の除外例はありませんでした。大まかに、コントロール膀胱は正常な大きさと滑らかな外観を示しました(図4A)、縦方向に開いたコントロール膀胱は薄い膀胱壁と広く開通した膀胱の首を示しました(図4B)。Ho:YAGレーザー処理膀胱は拡大し球状に見え(図4C)、縦方向に開いた処理済み膀胱では膀胱壁の肥厚、小梁化、粘膜充血、膀胱頸部の同心円状狭窄が見られました(図4D)。これらの肉眼的な所見は、膀胱...
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ディスカッション
本研究では、経膀胱性Ho:YAGレーザーアブレーションを用いて膀胱頸部線維化性狭窄のラットモデルを構築しました。この方法の主な強みは、解剖学的膀胱頸部で制御された熱損傷を引き起こし、その後進行性線維化性再構築を進める点にあります。これは、主に外部圧迫による閉塞を引き起こす従来の膀胱外結紮モデルとは異なり、内在的な瘢痕形成10とは異なります。臨床における術後BNCは内視鏡手術後の組織損傷およびその後の線維化と密接に関連しているため、熱損傷モデルは疾患の重要な起因メカニズムの一つをよりよく反映できる可能性があります。
このプロトコルの重要なステップは、レーザー照射前に膀胱頸部の正確な同定と安定化です。優しい膀胱の膨張は視覚化を助け、鈍いプローブはアブレーション中にターゲット位置を維持するのに役立ちます。望ましい終点は、3時と9時の位置に浅いクレーターを伴う粘膜の白化です。過剰なレーザー照射は深部組織の破壊や穿孔を引き起こす可...
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開示事項
著者たちは何も明かすことはありません。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金(H.R.82474255号)および河北省中医庁研究プログラム(H.R.B2025018)からの助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 吸収性編組縫合糸（被覆PGA）、8-0 | 上海浦東金環医療製品有限公司、上海、中国 | R831 | |
| 抗コラーゲンI抗体、マウスモノクローナル | Proteintech Group, Inc.、武漢、中国 | 66761-1-Ig | |
| 抗コラーゲンIII抗体、マウスモノクローナル | Proteintech Group, Inc.、武漢、中国 | 68320-1-Ig | |
| 被覆Vicryl Plus縫合糸（ポリグリコピン910）、4-0 | Ethicon, Inc.（Johnson & Johnson） | VCP773D | SH 26 mm ½-circle taper針; 紫色編組; 吸収性; Lot: RLMCJX |
| ヘマトキシリンおよびエオジン（HE）染色キット | Servicebio、武漢、中国 | 2310005 | |
| ホルミウム-YAGレーザーシステム（LITHO） | Quanta System S.p.A、イタリア | https://www.quantasystem.com/laser/litho/ | 1 J、10 Hz、10 W、200 μmファイバー |
| HRP結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体 | Boster、武漢、中国 | BA1050 | |
| イソフルラン | RWD | 2025010601 | |
| マッソンのトリクローム染色キット | 珠海Basoバイオテクノロジー有限公司、珠海、広東、中国 | BA4079B | |
| メロキシカム注射 | 齊魯動物健康、山東、中国 | E135H003 | |
| パラホルムアルデヒド（4%） | Servicebio、武漢、中国 | 2510H0070148 | |
| ピクロシリウスレッド染色キット | 南京センベイジアバイオテクノロジー有限公司、南京、江蘇、中国 | 20250228 | |
| 小型動物吸入麻酔システム | RWD生命科学、深圳、中国 | https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/ | 3％–4％のイソフルランと酸素で誘導 |
参考文献
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