非動脈化ラット肝移植モデルにおける長期生存の経験共有

サマリー

本プロトコルの目的は、非動脈化ラット肝移植モデルの確立に向けた最適化された手術体験を共有することであり、特に100日を超える長期的な動物生存を保証する技術的改良に焦点を当てることです。

要約

実験的な肝移植において、ラットモデルは移植免疫学および代謝過程の研究におけるゴールドスタンダードです。しかし、非常に細い肝動脈(~0.5 mm)を再建することは、非常に高度な技術的課題を伴います。これを回避するために、簡略化された非動脈化ラット肝移植(NArLT)モデルが広く利用されています。残念ながら、動脈断絶による胆汁漏れや虚血性胆管炎などの重度の胆管合併症は、受血者の長期生存をしばしば制限します。この障害は、長期的な宿主-移植片免疫適合性や慢性拒絶反応などの主要テーマの研究を大きく制限しています。ここでは、これらの虚血性胆道損傷を克服するために重要な技術的改良を取り入れたNArLTモデルの最適化プロトコルを提示します。主な改善点には、大幅に短縮された無肝期、「ノータッチ」胆道剥離技術、徹底した胆道洗浄、最適化された内部胆管ステント注入法が含まれます。この改良された手順を実施した後、100日間の観察期間中に受容者の生存率は94%を超えました。最終的に、この最適化されたプロトコルは、長期的な移植寛容のメカニズムを探るための非常に再現性が高く堅牢なプラットフォームを提供し、移植医学における新しい治療戦略の開発を支援します。

概要

ラット肝移植モデルは、基礎移植研究において最も広く利用されている実験的プラットフォームとなっています。しかし、その広範な応用はしばしば急な学習曲線によって妨げられ、これが下流の^{実験研究の}進行を大きく妨げることがあります^1,2。さらに、従来のラット肝移植モデルは、手術成功率が最適でなく、長期生存率も低いことが多いです。手術手順を徹底的に効率化し、手術の詳細を綿密に洗練し、血管および胆道再建を直接可視化しながら行うことで、この複雑な顕微外科モデルの学習曲線を大幅に短縮^{できます。}肝移植は末期肝疾患の唯一の治癒療法であり、ラット肝移植モデルの確立は^{科学研究にとって}極めて重要です^5,6。

非動脈化ラット肝移植(NArLT)モデルは、実験的手術において大きな利点を提供します。すなわち、微小血管動脈吻合という困難な課題を回避し、全体の手術時間を短縮し、ラットの麻酔時間を短縮します。動脈血流が断絶されているにもかかわらず、このモデルにおける胆道応答は虚血性胆道損傷の研究に独自の視点を提供します。しかし、従来のNArLTモデルは術後胆道合併症率が最大30^{%に達する}と関連しており、長期生存率を著しく損なう。従来のラット肝移植モデルでは、受容者の長期生存率は70%から85%未満です^8。これに対処するため、本研究ではヘパリン処理された軟胆管ステントを用いた最適化プロトコルを導入します。「ノータッチ」胆道解離技術を用いて周囲の小血管ネットワークの保存を最大化し、冷灌流による徹底的な胆道洗浄を行うことで、このアプローチは物理的支援と虚^血保護9を通じて胆道合併症を根本的に軽減し、最終的には長期的な免疫モニタリングのための堅牢で安定したプラットフォームを提供することを目指しています。

したがって、ラット肝移植におけるあらゆる技術的革新において、手技的成功率の最大化と受容者の生存延長が主要な目的とされています。これらの目標を達成することは、下流の^{実験研究が}タイムリーかつ途切れなく進行するために必要な重要な前提条件です。

プロトコル

本研究のすべての動物実験および手術は青島大学実験動物倫理委員会(No. 20260301SD5020260401065)によって承認されました。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力をしてください。

1. 術前準備

1. 実験動物
   1. 成体のオスのスプラグ–ドーリー(SD)ラット(生後8〜10週、体重220〜250g)をドナーとして使用してください。受贈者の体重がドナーよりわずかに大きく、差は50g以内に抑えてください。
   2. ラットは病原体のない特定の条件下で、22°C±2°Cの管理温度、相対湿度50%±10%で飼育します。
   3. 12時間の明暗サイクルを維持し、ケージごとに2〜3匹の密度を保ちます。
   4. 標準的な実験室用齧歯類の食事を提供しましょう。手術介入の少なくとも1週間前、ラットが実験室環境に慣れるまで待ってください。
   5. 手術の12時間前から動物を断食します。水へのアクセスを自由に許可しましょう。
      注意:手術前の断食は麻酔中の誤嚥リスクを最小限に抑え、呼吸機能を損なう胃拡張や手術の妨げとなる胃拡張を防ぐのに役立ちます。
2. 手術器具と材料
   1. 図1に示されているように、移植手術に必要な器具を使用してください。手術で使用された消耗品の詳細を材料表に記載してください。
   2. 5Fおよび6F硬膜外カテーテル鞘は、220〜250gのオスSDラットの標的血管の生理的内径に合わせて選択します。
   3. 門脈(PV)には5Fのシース(約1.67mm)を使いましょう。下肝大静脈(IHIVC)には6Fのシース(約2.00mm)を使用します。
      注意:カテーテルのサイズは解剖学的基準と手術中の顕微鏡下での目視推定の組み合わせに基づいて選択してください。カテーテルの外径とターゲット血管の内腔をリアルタイムで比較します。適切なマッチングは、カテーテルが血管腔の約70%〜80%を占め、血管壁を過度に伸ばしたり過度なたばれを残さず滑らかに挿入できるようにします。指定された体重範囲内のSDラットでは、あらかじめ定義された解剖学的血管径を初期サイズ選択に用いることができ、個体差に応じて術中調整する必要があります。操作者は、事前の顕微外科訓練を通じてこの血管とカテーテルの一致を確立すべきです。
   4. 8〜10週齢のSDラットでは、PVおよびIHIVCのカフとしてそれぞれ5Fおよび6F硬膜外カテーテル鞘を選択します(図2A)。
   5. 全長(管状)が2.0〜2.5mmのカフを準備します。鉗子で扱う際は3.0〜4.0mmの延長長を保ちましょう。
   6. 蚊用の鉗子の顎でカフ壁を挟み、カフの近位端から約0.5〜1.0 mmの位置に円周溝を作ってください(詳細は 図2A 参照)。結び目を確実に結び、その後の固定を容易にするために、溝の深さを約0.1〜0.2mmに保ちます。
   7. 溝が7-0の固定リガチャーが硬いカテーテル表面から滑り落ちないようにしてください。
   8. 22Gの静脈内カテーテルをトリミングして、傾斜または斜めの端を持つ胆道ステントを作ります。長さは5〜7mmにしてください。
   9. ステント長は7mmを好みます。解剖学的差異に基づいて長さを調整し、右胃静脈の水平位置を指標とします。このランドマークから肝門までの距離を推定し、ステント長の選択を導きます。
   10. 推定距離が限られている場合や挿入時に抵抗がある場合は、ステントを約5〜6mmに短くします。ステントの約2〜3mmを曲げたり、曲がったり、突出したりせずに胆管に挿入できるようにしてください。
   11. ステントを室温(23°C±2°C)でヘパリン化生理食塩水(100 IU/mL)に浸します。使用前にステントを最低30分間浸漬させ、ドナーの胆管腔に挿入した際の腔内胆汁凝固を防ぐこと(図2A)。
       注意:手術前にカフを準備し、カフ壁にモスキートピンセットを使って溝を開けて、カニュレーション後に結び目や固定を容易にしてください。切除された胆道ステントの端が過度に鋭くならないよう、胆管穿孔を防ぐようにしてください。外科用顕微鏡(10×〜16×倍率)で、切断面がきれいでギザギザのプラスチックバリがないことを確認します。先端が針のように見えたら、マイクロハサミで少し鈍らせます。操作時には、細かく歯のないマイクロピンセットのみを使用してステントを扱ってください。ステント腔の平坦化、楕円化、曲がりが見えるような過度な外部力を加えないように注意してください。変形したステントは廃棄・交換してください。管腔狭窄は術後の胆道合併症のリスクを高めるためです。

図1。移植手術で使用される手術器具。 (A)ステンレス製の腎臓盆。(B)マイクロニードルホルダー。(C)マイクロハサミ。(D) マイクロ鉗子(直線かつ湾曲)。(E)微小血管クリップと小型の蚊型ブルドッグクランプ。(F)標準針ホルダー。(G) 直線止血鉗子(蚊用鉗子)。(H)血管クランプ。(I) 標準的な外科用ハサミ。(J) ゴムバンド(滅菌手術用手袋のカフから作られました)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2。特注の外科用カフ、胆道ステント、計画的な腹部切開。 (A) 血管カフと胆道ステントの準備、そしてミリ定規の準備。左から右へ:下肝下大静脈(IHIVC)カフに使われる6F硬膜外カテーテル鞘、門脈(PV)カフに使われる5F鞘、22G静脈カテーテルからトリミングされた5–7mm胆道ステント。(B) ドナーラット腹部に手術的曝露を最大化するための十字切開。(C) 受け入れラット腹部に標準的な正中開腹切開。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. ドナー運営

1. 初期のステップ
   1. 誘導室内で5%イソフルランを1L/minの空気流量で麻酔します。自発的な四肢の動きや離脱反射の欠如を確認し、麻酔の深さを評価します。
      注:麻酔の深さは、自発的な四肢の動きの有無、離脱反射の欠如、呼吸数の有無を観察することで評価されます。手術が円滑かつ安全に進むため、これらのパラメータは手術中20分間隔で厳格に再評価されます。
   2. 右下腹部に腹腔内注射で1%ペントバルビタール(40–45 mg/kg)を投与し、正中線の外側約1–2cm(白線)および右鼠径靭帯の頭蓋内1–2 cmに投与します。後ろ足をつまんで、離脱反射がないか確認して十分な麻酔を確認しましょう。
   3. ドナーラットを37°Cの温熱パッドの上で仰向けにして、術中体温を保ちます。
   4. 腹部の手術部位を剃りましょう。ポビドンヨウ素で3回消毒してください。
2. 肝灌流前の手技
   1. 十字切開を剣突端まで伸ばし、恥骨結合まで、そして腋窩正中線まで外側にかけて手術視野の露出を最大化します(図2B)。
      注意:開腹手術は2層に分けて行ってください。まず皮膚と皮下組織を切開します。その後、鉗子で白線をテント状にし、空気の侵入を可能にするために小さな切開を開け、内臓を剥がします。臓器損傷を防ぐために、下刃を腹壁と平行に保ちながら、ハサミで切開を広げてください。
   2. 腸を生理食塩水に浸したガーゼで包みます。腹部左側の無菌手術フィールドに置き、手術部位を露出させます。
      注意:内臓切除された腸の湿潤を全過程で保湿し、虚血性乾燥や低体温症を防ぐことが不可欠です。覆うガーゼを定期的に、約10〜15分ごとに温かい(37°C)の生理食塩水を滴し、または外科的な照明下でガーゼが乾き始めたらすぐに塗布します。
   3. 鰕骨状靭帯を分けてください。頭蓋骨突起をクランプして引っ込め、上肝下静脈(SHIVC)と左下横隔静脈を露出させます。
   4. 左三角靭帯を分割してください。左横隔静脈をSHIVCに近い位置で7-0または8-0で結紮します縫合(図3A)。
      注意:左下横隔静脈の結紮時は、結紮をSHIVCの近くに位置させてください。縫合針が横隔膜を刺して気胸を引き起こす可能性があることに注意してください。血管の近くに縫合線を。
   5. 電気焼灼は血管分割に推奨されており、迅速な止血と手術時間を短縮することで、処置の一貫性と再現性を向上させます。
      注:電気焼灼は止血を標準化し、手術時間を短縮し、操作者間の再現性を向上させます。
   6. 尾状核と乳頭葉を動員します(図3B)。
   7. 顕微鏡下の鉗子を使ってIHIVCの表面から脂肪や結合組織を除去します。
      注意:血管壁が滑らかで透けるまで結合組織を除去してください。血管クランプを干渉なく装着でき、カフや縫合に支障をきたす残留組織がない場合、十分な曝露が得られます。
   8. 右副腎静脈をIHIVCにぴったりと結紮してください。右腎静脈を分離し、IHIVCとぴったり合うように結紮してください。
   9. 左腎静脈のすぐ上までIHIVCを尾側で解離し続けます(図3C)。
      注意:解剖時にはIHIVCが徹底的に骨格化されていること(脂肪結合組織から血管をできるだけ完全に分離)していることを必ず確認してください。これにより、その後の肝臓移植やカフ装着手術が容易になります。
   10. 綿棒で肝臓を優しく持ち上げます。右下肝葉と後腹膜の間の靭帯結合部を解離する。
       注意:SHIVCは肝極上部にある短く幅広く壁が薄い青みがかった血管と特定してください。前面がきれいになり、隣接する横隔膜線維が見えるようになったら、解剖を止めてください。
   11. SHIVCに到達したら解剖を停止せよ。
       注意:実質損傷を防ぐために肝臓の扱いには細心の注意が必要です。頭蓋後腹膜解離時には下腔内腔を保護するよう注意してください。
   12. PVと適切なHAの間の結合組織を解剖してください。PVを隔離してください。
   13. 右胃静脈(幽門静脈)をPVとぴったり合わせて結紮してください。脾静脈の根まで解剖を続けてください。
   14. ポルタヘパティスを露出させてください。PVの左側にある臍帯状の脂肪結合組織を特定し、総胆管(CBD)とHAを包み込んでいます。
   15. CBDの前壁、肝管分岐部から3〜5mm遠位に「V」字型の切開を開けます。
   16. マイクロ鉗子を使って胆道ステントを保持してください。ステントを胆道内に約3mm挿入し、管と平行に合わせます。
       注意:抵抗なくスムーズにステントを前進させてください。側面の膨らみ、角度、またはダクト壁の膨らみがないことを確認してください。抵抗や変形が発生した場合は、再挿入前に引き抜いて再調整してください。
   17. ステントは7-0シルクタイで固定してください。切開部のレベルでHAを結紮し、近位部を横断します(図3D)。
       注意:ドナーCBDを解剖する際は、過度な「骨格化」を厳格に避けてください。周囲の二環結合組織、神経叢、微小血管ネットワークを保存し、早期側支循環と術後胆道治癒を促進します。ドナー管の遠位端が最も虚血が多い領域であるため、吻合部位は肝門の近くに保ち、虚血負荷を最小限に抑えてください。
3. 肝灌流
   1. 腹部大動脈を露出させてください。23ゲージ(23 G)の頭皮静脈針(約1 cm)を、20 mLのシリンジに接続し、冷たい(4°C)ウィスコンシン大学(UW)溶液を充填します。
      注意:針を浅い角度(15°〜20°)で腹部大動脈に挿入してください。動脈血のフラッシュバックを観察して挿入を確認し、少し前進して針を血管と平行に整えて後壁穿孔を防ぎます。
   2. 注入前に注射器から空気を抜いてください。血管クランプで腹大動脈と針をクランプして固定します。
      注意:針先端に連続した滴が見えるまで、バブルを叩いて液体を排出し、注射器から空気をすべて抜きましょう。カニュレーション前に針のハブに空気がないことを確認してください。
   3. 注射器を手動で3〜3.5 mL/分の一定速度で押さえてゆっくり灌流を開始します(図3E)。
      注意:チューブ内の血液戻りを観察して正しい血管内位置を確認してください。
   4. 横隔膜を切開しろ。胸腔下伏と大動脈を完全に露出させてください。
   5. 胸椎下腔内腔を右心房との接合部で、胸大動脈と血管クランプでクランプします。
   6. クランプのすぐ下の胸腔下IVCを切断し、灌流液の排出を許可します。
      注意:クランプはできるだけ頭蓋にかけ、血管の長さを保つためにその下を横断してください。凝固を防ぎ、移植片の質を維持するために直ちに灌流を開始してください。
   7. 一定のペース(3–3.5 mL/分)で灌流を続け、総体積は約40 mLにします。
   8. 肝実質が完全に淡色(黄褐色)になったら灌流を停止します(図3F)。
      注:肝臓が均一に淡色(黄褐色)になり、切断したIHIVCからの排出物が残留血液なしで透明になると、十分な灌流が確認されます。
   9. IHIVCを左腎静脈とフラッシュで横断します。脾静脈のレベルでPVを横断します。
      注意:内皮および実質損傷を防ぐために、速や力の強い灌流剤注射は避けてください。
   10. 横隔膜切開部を拡大してください。肝移植片を一括で、付属の横隔膜と一緒に採取します。
   11. 移植片を冷たいUW保存液を入れた無菌ペトリ皿に入れます。
   12. グラフトは4°Cの冷たいUW溶液で維持してください。 移植は入手から2時間以内に完了します。

図3。ドナー肝動員および原所灌流における主要な外科的ステップ。(A) 左下横隔静脈の露出および結紮。(B) 肝・食道伝達枝の分離と分裂。(C) IHIVCの解離、右副腎および右腎静脈の結紮を示す。(D) 「ノータッチ」技術を用いて、カスタム胆道ステントを総胆管(CBD)に挿入し、周囲胆道結合組織を保存すること。(E) 腹部大動脈のカニュレーションによる冷静原位灌流の開始。(F)完全灌流されたドナー肝臓で均一に淡い外観を示し、血液洗浄に成功したことを示す。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. 体外移植片準備

注意:すべての生外移植片準備は氷上で行ってください(図4A)。接ぎ木はUW溶液中の温度を4°C±2°Cで維持し、適切な冷却保存を確保するために定期的に温度を監視してください。

図4。ドナー肝移植片の体外準備。(A) 摘出した肝移植片を、冷たいUW保存液を含む滅菌ペトリ皿に置き、低体温を維持するために砕氷の上に置かれます。(B) ドナーPVをカスタムカフで内転させ、周囲の結紮で固定する。(C) PVおよびIHIVCのためのカフ準備完了、胆道ステントを所定。(D) 両側の四角にステイ縫合を施し、その後の吻合を促進するために肝上IVC(SHIVC)の準備。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. PVカフの準備
   1. PVカフの尾部を蚊用鉗子で掴み、ペトリ皿の底に対して垂直に下向きに固定します。
   2. カフの腔にマイクロ鉗子を通します。PVをカフから引き出します。
   3. PVの前壁を調整してください。カフテールの広がった端から、血管壁の約3mmを越えて隠します。
   4. 外側の血管をカフの外壁に、円周形の7-0シルクタイで固定します(図4B)。
      注意:血管とカフがねじれや角度なしに整列していることを確認してください。固定後、PVカフを約1mLのUW溶液で洗浄し、SHIVCからの排出を観察して開通を確認します。
2. IHIVCカフの準備
   1. IHIVCの準備とカフは、Step 3.1でPVで説明されたのと全く同じ手順で行われます。簡単に言えば、血管の動員、トリミング、カフ固定を同じ標準化されたプロトコルに従え、実験的な一貫性と再現性を確保することが含まれる。(図4C)
      注意:洗浄後にSHIVCからの閉塞のない排出を観察することでIHIVCカフの通位を確認してください。
3. 胆道の洗浄
   1. 胆管を1mLの注射器(0.5mLのUW溶液を含む)で優しく洗浄します。
   2. 洗浄中に液体漏れが発生しないように注意してください。
      注:液体漏れがないことは胆管の完全性を確認させます。
4. SHIVC準備
   1. 残存横隔膜を切除して肝移植片のSHIVCをトリムします。
   2. ステップ2.2.7で定義された通り、SHIVCが完全にスケルトン化されていることを確認してください。
5. ステイ縫合の位置
   1. 7-0か8-0を使いましょう縫合はオペレーターの好みに基づいています。
      注:手術的転帰(吻合的通位および受容者生存率を含む)に関しては、このモデルでは両縫合線のサイズは機能的に同等です。どちらを選ぶかは、操作者の個人的な好みや検査室での利用可能性に基づいて行うことができ、手順の再現性には影響しません。
   2. SHIVCの切り株を優しく平らにします。縫合糸は左右の外側の角に針を内側から外側へ、端から約1mmの位置に通して配置します(図4D)。

4. 受領者操作

1. 初期のステップ
   1. ドナーに記載されたプロトコル(ステップ2.1.1)で受容ラットを麻酔します。
   2. 受け取り側のラットを37°Cに保温した温熱パッドの上に置きます。
   3. 注意:麻酔前に投与ラットの体重を測定してください。体重がドナーの体重より約50g上回ることを確認しましょう。
2. 受容者肝臓の動員
   1. 正中開腹手術を行います。
   2. 4本の弾性リトラクターを使って腹壁を横方向に引き戻します。上2つの牽引器は両側肋縁の外側に、2つの下リトラクターは両側鼠径部の外側に配置し、最適な露出を実現します。
      注意:組織が白くなったり呼吸を妨げたりする過度な緊張を避けるため、手術視野を露出させる十分なリトラクションをかけてください。
   3. ドナー手術で説明されたのと同じ方法で左下横隔静脈(LIPV)を結紮します(ステップ2.2.1を参照)。
   4. 左肝葉と後腹膜の間の靭帯を解離します。尾状と乳頭葉を動員してください。
   5. 電気焼灼を使って、食道と左肝葉の間の靭帯と連絡枝を分けます。
      注意:電気焼灼は迅速な止血、手術時間の短縮、手技の再現性向上のために推奨されます。
   6. IHIVCを右腎静脈のレベルまで鈍く切り離してください。
   7. 左副腎静脈をIHIVCとの合流点から約2mm離れた位置で慎重に隔離し結紮します。
   8. 肝臓の右下葉は、ドナー手術で説明されたのと同じ方法で管理してください(ステップ2.2.4を参照)。
   9. SHIVCの後ろに、無菌手術用手袋のカフから作った約10cmのゴムバンドを横方向に通します。
      注意:呼吸を制限せずにSHIVCを露出させるために、優しい牽引を行ってください。
   10. その後のSHIVCの横断作業中はゴムバンドをそのままにしておきましょう。
   11. 肝門から幽門枝までのPVを解剖し、分離します。
       注意:PVの解剖は吻合領域に限定してください。周辺の支流を保存し、手術外傷を軽減すること。
   12. 肝門でHAを隔離してください。
   13. HAをヒルムと密接に結紮し、近位部を横断します。
   14. 肝門の下でCBDを形成する左と右の肝管の合流点を特定します。この部位のCBDは7-0プロリーン縫合糸で結紮し、横断します(図5A)。
       注意:この部位の外科的外傷は最小限に抑えてください。HAの最大限の長さと、周囲胆管結合組織、神経叢、微小血管ネットワークを保存し、側副循環の早期確立を促進します。
3. 受容者肝摘出術
   1. 右腎静脈の頭側にあるIHIVCをすぐに閉塞するために微小血管クランプを適用します。
   2. 微小血管クランプを装着して、幽門静脈との接合部のすぐ上をPVを閉塞します。
   3. 肝実質の目に見える暗色を観察して血管閉塞の成功を確認しましょう。
      注:肝臓の均一な暗化(シアノーシス)、実質膨張の喪失、PVの崩壊による血管閉塞を確認します。
   4. 23Gの頭皮静脈針を5mLのシリンジに接続してPVに挿入します。
   5. 約30秒かけて5%グルコース溶液2mLを注入し、肝内血液を全身循環に流します。
      注意:肝門近くのPVからゆっくりと注射し、肝内血液を全身循環に流してください。
   6. 輪ゴムバンドに下向きの牽引力をかけてSHIVCを露出させます。
   7. 血管クランプを用いてSHIVCをクロスクランプします(図5B)。
   8. 肝実質と密接するIHIVC、PV、SHIVCを横断します。
   9. 腹腔から本来の肝臓を完全に取り除きます。
      注意:無肝期は26分以内に維持してください(30分を超えない)。トランセクト血管は肝臓とぴったり合い、十分な長さを保ち、血管断端の滑らかさを確保します。
4. 肝移植片の移植
   1. SHIVC再建
      1. 肝移植片をその直位解剖学的配位に配置してください。
      2. 左角にあらかじめ設置された7-0縫合糸を使って、右角に向かって後壁の連続縫合を開始します。
      3. 縫合糸を右隅のステイ縫合に固定してください。
      4. 縫合糸を前壁に沿って走らせて吻合を完了させます(図6A–6C)。
      5. 針の入り距離は器の端から0.5〜1.0mmに保ちます。
      6. 縫合のピッチは1.0〜1.5mmに保ちます。
         注意:針の間隔と縫合の角度を一定に保ち、安定し緊張のない吻合を確保してください。
      7. 各縫合後に縫合糸を締めて、死角をなくし、適切な張力を保ちます。
         注意:前壁縫合を完了する前に、浸留針でUW溶液でSHIVCを洗浄し、残留空気を排出し空気塞栓を防ぎます。
   2. PV再構築
      1. 受領側PVスタンプの左右の角に7-0のステイ縫合糸を設置します。
      2. 三点トラクションをかけて三角形の開口部を作ります。
      3. カフ付きのドナーPVをルーメンに挿入します。
      4. 周囲の溝に7-0のリガチャーを結んで固定します(図6D–6F)。
   3. IHIVC再建
      1. PV再構成と同じ手法でIHIVCを再構築します(ステップ4.4.2参照)(図6G–6I参照)。
   4. 再灌流
      1. SHIVC、PV、IHIVCの血管クランプを順次放出します。
      2. 血液の詰まり、出血、漏れなしに均一な色回復を観察することで再灌流の成功を確認します(図7A)。
         注:胆管からの活発な胆汁生成は、肝灌流および早期移植片機能の回復を示しています。
   5. 胆道再建
      1. 受贈側のCBD切り株の前壁に、管径の半分の小さな横切開を開けます。
      2. ドナー胆道ステントをCBD腔内に約3mm挿入します。
      3. 7-0環状縫合糸(図7B)でステントを固定します。
         注意:再建を完了する前に、ドナーステントの遠位端からの活発な胆汁流出を観察してください。これにより、開通性と早期移植片の機能が確認されます。
5. 受信者の再加熱
   1. 腹部閉鎖前に、37°Cの生理食塩水150mLで腹膜腔を洗浄します。
      注:この工程では残留血液を除去し、体温を回復し、SHIVC、IHIVC、PV吻合での止血検査が可能になります。
6. 腹部閉鎖と術後ケア
   1. 4-0吸収性糸で連続走行縫合糸で筋膜層を閉じ、1cm間隔で5mmずつ噛みます。
   2. 4-0シルク糸で連続縫合糸で皮膚を閉じます。
   3. ブプレノルフィン(0.1 mg/kg)を12時間ごとに皮下投与し、合計2回投与します。
   4. 受け取ったラットを清潔で温度管理されたケージに移します。
   5. 麻酔から完全に回復し、正常な自発運動が再開するまで継続的にモニタリングしてください。

図5。受容者肝動員および肝摘出術における主要な外科的ステップ。 (A) 受領者のCBDの門門分岐付近の同定および結紮。(B) SHIVCの曝露および交差クランプ。SHIVCの後ろにはゴムバンドが置かれ、クランプ時のトラクションと視覚化の改善が図られています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6。肝移植片移植時の血管再建のための重要な外科的ステップ。 SHIVCの再構築:(A) コーナーステイ縫合によるアライメント、(B) 後壁連続縫合、(C) 前壁縫合の完了。カフ技術を用いたPV再建:(D)三点牽引、(E)カフ付きのドナーPV挿入、(F)カフ固定の結紮。IHIVC再建は同じカフ技術で行われます:(G)露出、(H)挿入、(I)結紮。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7。移植片機能の検証、胆道再建、術後回復の検証。 (A) 再灌流後の早期移植片機能の評価(ドナー胆管ステントからの胆汁流出が目に見えること)。PVおよびIHIVCの復元が確認できます。(B) ドナー胆道ステントを受給者CBDに挿入・固定するを含む胆道再建術を完了。(C) 代表的な受領ラットで、術後完全回復を示し、正常な姿勢と自発活動が認められている。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

NArLTモデル間で一貫した手術の質と再現性を確保するため、すべての手術は同じ経験豊富な顕微外科医によって実施されました。研究期間中に合計50件のラット肝移植が完了しました。手術の平均期間は以下の通りです:ドナー手術は平均25.3±2.6分、体外移植片準備は平均13.1±2.1分、レシピン手術は平均43.0±1.6分、無肝相は平均15.7±1.2分でした。

最適化されたNArLT手技を受けた受験者は、100日間の観察期間で94%(47/50)の生存率を示し、周術期死亡もこの計算に含まれていました。3匹の受付者ラットが死んだ。検死の結果、1例は流出路閉塞、1例はSHIVCでの出血、1例は術後回復中に原因不明で死亡したことが判明しました。生存したすべての受容者ラットは100日間の全期間観察され、研究終了時に解剖が行われました。長期生存者の間では、胆汁漏れ、胆道閉塞、虚血性胆管炎などの重度の胆管合併症は認められませんでした。再建されたすべての胆道は機械的通位性と機能的完全性を維持しており、解剖時に腔閉塞、胆汁蓄積、導管拡...

ディスカッション

NArLTモデルは、複雑な微小血管動脈吻合を回避できるため、実験的移植研究の基盤^{となっています。}しかし、従来のNArLT法は歴史的に胆道合併症の発生率が高く、最大30%に達し、長期生存を著しく制限し、慢性免疫学的試験を妨げています²。提案された方法の重要性は、これらの虚血性胆道損傷を回避できる能力にあります。本研究では、100日生存率が94%に達し、これは従来のラット肝^{移植研究で}報告された短期生存率を上回っています8。

このプロトコルの中で、グラフトの生存率と受容者の生存を確保するために重要なステップがいくつかあります。最も重要なのは、ドナー準備中の「ノータッチ」胆道解離技術です。CBDの過度な骨格化を厳格に避けることで、周囲結合組織、神経叢、微小血管ネットワークが保存されます。この保存は、側副循環の早期確立とその後の胆道治癒に不可欠です^...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-0吸収性縫合線	エティコン	W9109H	筋膜層(白線)の閉鎖に使用されます
4-0 シルク・シュトゥーレ	エティコン	VCP304H	皮膚の閉鎖に使用
7-0か8-0縫合/シルクタイ	エティコン	Z1711E	血管の結紮(例:左横隔静脈)に用いられます
22G静脈内カテーテル	B. ブラウン	4252098B	5&ndashにトリム;胆道ステントの準備のために傾斜した端を持つ7mm。
23G頭皮静脈針	山東欽開医療工業有限公司	MDLSSVS	肝灌流のために腹大動脈への挿入に使用されます
ブプレノルフィン	天津製薬研究所製薬株式会社	H12020275	術後の皮下鎮痛として投与
綿棒	Aoocn	216-236	解剖中に肝臓を優しく持ち上げるために使われました
砕氷	該当なし	該当なし	体外準備中の移植片温度維持に用いられます
弾性リトラクター	該当なし	該当なし	開腹手術中に腹壁を引っ込めるために使われていました
硬膜外カテーテル鞘	江蘇邁創医療機器有限公司	20173084015	サイズは5Fと6F;PVおよびIHIVCのカフスとして使用されます
ガーゼ	中央医療技術株式会社	CH-1001	生理食塩水に浸された;腸を覆い保護するために使われます
グルコース溶液(5%)	四川科倫製薬有限公司	H20044307	受血者肝摘出術中に肝内血液を洗い流すために使われました
ヘパリン生理食塩水	深圳生命バイオテクノロジー有限公司	H2012003	100 IU/mL;胆道ステントを浸すために使われました
インドリングニードル	B. ブラウン	4254074B	吻合を完了する前にSHIVCを洗浄して空気を抜くために使われました
イソフルラン	済南光生源バイオテクノロジー有限公司	153107015	5%の濃度;麻酔誘導に使用&注::
微小血管クランプ	上海医療機器有限公司	JCZ200	手術中の血管閉塞に使用
蚊鉗子	上海医療機器有限公司	J31010	細かい操作やカフの準備に使用
生理食塩水(0.9%)	四川科倫製薬有限公司	H20044304	灌漑およびガーゼ浸漬に使用されます(37°C)
ペントバルビタール(1%)	上海元思科技有限公司	P0500000	40–45 mg/kg;外科的麻酔に使用
末梢挿入静脈カテーテル(PIVC)	コロビディエン	8888145015	カフ付きのPVを洗浄し、破裂を確認するために使われました。
ポビドン-ヨウ素	山西トリンダーバイオテクノロジー株式会社	41836054	手術部位消毒に使用
ラバーバンド(サージカルグローブより)	アンセル	該当なし	施術者の手術中のSHIVC牽引に使用されます
スプラグ&アンドダッシュ;ドーリー・ラッツ	華福康(北京)バイオテクノロジー有限公司	22001A	成体のオスラット、8–10週間、220回からナッシュ;250 g
無菌ペトリ皿(10cm)	山東恩友バイオテクノロジー有限公司	H905001	体外準備中にUW溶液中にグラフトを保持するために使用されました
注射器(20mL)	山東威高グループ医療用ポリマー製品有限公司	20163141593	肝灌流(3–3.5 mL/min)とnbsp;
UW保存ソリューション	人生への橋	BTL-UW-1L	4度で維持;C;ドナー肝臓灌流および移植片保存に使用