トンネル型ナノチューブおよびアストロサイトとニューロン間のミトコンドリア移動の標準化免疫蛍光イメージング

サマリー

このプロトコルは、インビトロでアストロサイトとニューロン間のトンネルナノチューブおよびミトコンドリア移動を可視化するための固定、染色、共焦点イメージング法を標準化しています。

要約

ミトコンドリアは、神経細胞におけるエネルギー産生、細胞シグナル伝達、代謝恒常性を調節する重要な小器官です。トンネルナノチューブ(TNT)は、長距離細胞間通信を媒介し、ミトコンドリアを含む細胞成分の連結細胞間の移動を促進する薄い膜構造です。TNTやミトコンドリア移動の信頼できる可視化には、これらの構造が非常に脆弱で固定、洗浄、イメージング条件に敏感であるため、慎重なサンプル取り扱いが必要です。このプロトコルは、星体サイトおよび星形細胞–ニューロン共培養系におけるTNTの固定、染色、共焦点イメージングの標準化手順を記述しています。ワークフローには、TNT可視化のための膜および細胞骨格染色、ミトコンドリア局在を追跡するためのミトコンドリア標識、Miro1共局在解析のための免疫蛍光染色が含まれます。TNTの形態を保存するための重要なステップ、特に穏やかな洗浄や光保護の取り扱いが手順全体で強調されます。また、固定細胞製剤中のTNTおよびミトコンドリアの特性評価のためのイメージング手法も概説しています。これらの手法は、TNT生成および神経細胞間のミトコンドリア移動をvitroで研究するための再現可能な実験的枠組みを提供します。

概要

ミトコンドリアは細胞のエネルギー工場として機能し、アデノシン三リン酸の産生を通じて細胞活動に必要なエネルギーを提供するとともに、細胞の信号伝達や酸化^{還元バランス}にも重要な役割を果たします。神経系において、ミトコンドリア代謝物は神経プロセスの複雑さと興奮性を高め、神経細胞の成長^と発達を支える2.ミトコンドリアは静的な細胞小器官ではありません。彼らはさまざまな細胞内および細胞外のストレスや代謝要求に適応するために、形態、位置、分布を絶えず変化させます^。3.細胞間ミトコンドリア移植は組織恒常性の維持に寄与し、生理学的条件下で発生を促進しますが、病理的条件下では損傷修復、免疫調節、疾患進行に関与します^4,5。

物質やエネルギーの細胞間コミュニケーションは、細胞の恒常性、組織修復、神経ネットワークの調節など、さまざまな生物学的プロセスに不可欠です。現在の研究では、複数の細胞間通信モードが明らかになり、その中でもトンネルナノチューブ(TNT)は細胞^間ミトコンドリア輸送に関連する最も広く研究されているメカニズムの一つです。TNTはFアクチンを基にした橋状の膜構造で、管状の形態を持ち、直径は50〜200 nmで^、長さ7で細胞径数個に及びます。研究によれば、TNTは神経細胞間の物理的な接続として機能し、神経変性疾患、脳腫瘍、その他の疾患の発症と進行と密接に関連しています。例えば、ミトコンドリアからニューロンへのTNTによるミトコンドリア移動は、^{神経細胞を}救助することが報告^{されています。}

現在のTNTに関する研究は、構造的な脆弱性があり、破損しやすく実験結果に影響を与える可能性があることなど、いくつかの課題に直面しています。TNTと糸足や他の膜突起の区別の困難;そして細胞間TNTの正確な定量に関する課題があります。TNT関連研究の再現性と一貫性を向上させるためには、TNTの洗浄、固定、染色、イメージングの標準化された方法が必要であり、実験的変動を最小限に抑えつつ構造と分布を正確に評価できるようにしています。固定前の細胞密度、光からの保護、洗浄強度、固定時間、固定後の染色条件などがTNTの構造や安定性に影響を与えます。本研究では、アストロサイトおよびアストロサイト-ニューロン培養系におけるTNTおよびミトコンドリア関連TNT構造の前処理、染色、共焦点イメージングの手順を記述します。

この研究プロトコルは、ほとんどの実験室環境に一般的に適用可能です。一次星形サイトおよびマウスの海馬神経細胞株での検証により、このプロトコルは一次神経細胞および不死化細胞株の両方に適していることが確認されました。しかし、このプロトコルにはいくつかの制限があります。共焦点顕微鏡はTNT可視化において超分解能イメージングよりも空間分解能が低く、MitoTrackerを用いたミトコンドリア移動の評価は、染料漏れや非ミトコンドリア信号干渉の影響を受ける可能性があります¹⁰。

プロトコル

この研究はヒト被験者や生きた脊椎動物を対象としていません。使用されたのは商業的に入手または確立された細胞株のみであり、倫理的承認は必要ありませんでした。

1. 星形膠球におけるTNTの染色

1. 細胞シーディング
   1. 種子で一次ラットのアストロサイトを3番(P3)で分離し、35mmのガラス底培養皿に1皿あたり5個×10個⁴ 細胞の密度で分離しました。Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)完全培地2 mLを加え、胎児用牛血清(FBS)10%と3重抗生物質混合物(ペニシリンG、ストレプトマイシン、アンフォテリシンB)を補足します。細胞は37°Cで、5%のCO₂を含む加湿インキュベーターで培養します。
   2. 細胞を約24時間潜伏させ、付着が起こるまで続けます。
2. 前処理と固定
   1. 細胞付着後は、培養皿を光の遮られた環境で清潔な作業台に移します。
      注意:TNTの完全性を保つために、取り扱い中の不必要な動きや振動を最小限に抑えてください。
   2. 薄暗い環境で培地を優しく取り除きます。
      注意:培地除去時には細胞表面を完全に乾燥させないように注意してください。TNTは崩壊して培養基質に付着する恐れがあります。
   3. カルシウムとマグネシウムイオンを含まない500μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を優しく洗浄します(pH 7.3–7.5)。洗浄中に細胞間TNTを乱さないように、培養皿の壁に沿ってPBSをゆっくり加えたり取り除いたりします。
   4. PBSは慎重に取り外してください。
   5. 細胞を、パラホルムアルデヒド(pH 7.2–7.4)を含む市販の4%組織細胞固定液で、室温(RT;20°C–25°C)で薄暗い環境で30分間固定します。
      注意:固定液は適切な個人用保護具を使用して取り扱い、すべての手順を機関の化学物質安全ガイドラインに従って行ってください。
   6. 固定液を取り除きます。
   7. 細胞をPBSで一度洗浄してください。
3. 細胞透過性と蛍光染色
   1. 500μLのすぐに使えるTriton X-100透過液を20分間RTで細胞を透過化します。
      注意:トリトンX-100は脆弱なTNT構造を破壊する可能性があります。透過化時の過度な攪拌を最小限に抑えましょう。
   2. 透過化溶液を除去します。
   3. 細胞をPBSで一度洗浄してください。
   4. 使用直前に着色剤を準備してください。PBS中のF-アクチン染色染料を最終濃度1μMまで希釈し、4′,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)をすぐに使える核染色剤として使用します。使用前に2つの染色液をよく混ぜてください。
      注:ファロイジン系染色試薬はFアクチンの可視化の代替として使用されることがあります。
   5. Fアクチンと核染色液を1:1の比率(等体積)で光の遮蔽条件下で混ぜます。
   6. 調理済みの染色液を培養皿に加えます。
   7. 細胞を暗闇で37°Cで30分間培養します。
   8. 染色液を除去してください。
   9. 細胞をPBSで3回洗い、1回の洗いにつき500μLを1分ずつ洗います。
   10. 画像作成中に細胞の乾燥を防ぐためにPBSを1mL添加します。
4. 共焦点イメージング
   1. ニコン製の逆立共焦点顕微鏡(×20対物レンズ搭載)で画像を取得します。DAPIには405nm励起、Fアクチン染色には488nm励起を使用します。光保護条件下で1024×1024ピクセルの解像度で画像を撮影します。
   2. サンプルごとに少なくとも5つのランダムに選ばれた視野を用いて、質的評価と手動定量化を行います。各視野にTNTの数と、1つ以上のTNTを含むTNT陽性細胞の数を定量化します(図1Aおよび1B)。
      注意:蛍光損失とTNTの構造破壊を最小限に抑えるため、染色直後に画像を取得してください。

図1:アストロサイトにおけるトンネル型ナノチューブ(TNT)の蛍光染色。 (A) ガラス底培養皿で培養したアストロサイトにおける核およびFアクチン染色を示す代表的な共焦点顕微鏡画像。(B) パネルAのボックス領域の拡大図。白い矢印は隣接するセル間のTNT様構造を示しています。(C) 不適切なサンプル取り扱いによりTNT様構造が破壊された代表画像。(D) パネルCのボックス領域の拡大図。黄色の矢印は破壊されたTNT状構造を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. TNTを介したアストロサイトからニューロンへのミトコンドリア移動のための染色

1. アストロサイトシーディングとミトコンドリア標識
   1. 種子で一次ラットのアストロサイトを35mmのガラス底培養皿に単離し、1皿あたり3個×10個^4細胞の 密度で35mmのガラス底培養皿に移しました。DMEM/F-12全培地2mLに、10%のFBSと1%のトリプル抗生物質混合物(ペニシリンG、ストレプトマイシン、アンフォテリシンB)を補足します。細胞は37°Cで、5%のCO₂を含む加湿インキュベーターで培養します。
   2. 細胞を約24時間潜伏させ、付着が起こるまで続けます。
   3. 細胞付着後は、培養皿を薄暗い環境の清潔な作業台に移します。
      注意:TNTの完全性を保つために、取り扱い中の不必要な動きや振動を最小限に抑えてください。
   4. 光の遮蔽条件下で培地を優しく取り除きます。培地除去時にTNTを破壊しないように注意してください。
      注意:培地除去時には細胞表面を完全に乾燥させないように注意してください。TNTは崩壊して培養基質に付着する恐れがあります。
   5. ジメチルスルホキシド(DMSO)中に50μgの凍乾ミトトラッカー染料を再構成し、1 mMのストック溶液を準備し、そのストック溶液を−20°Cで保存します。 使用前に、ストック溶液を完全なDMEM/F-12培地400μLに10%のFBSおよび1%のトリプル抗生物質混合物を加えて希釈し、最終的なMitoTracker濃度50μMを得ます。
      注意:蛍光染料は調製および培養過程で直射光から保護してください。
   6. ミトコンドリア染色液を培養皿に加えましょう。
   7. 細胞は37°Cの加湿インキュベーターで、5%のCO₂を含む環境で30分間、光の遮られた環境で培養します。
   8. ミトコンドリア染色液は光遮蔽条件下で除去してください。
   9. カルシウムとマグネシウムイオンを含まないPBS500μL(pH 7.3–7.5)で細胞を優しく洗浄します。洗浄中に細胞間TNTを乱さないように、培養皿の壁に沿ってPBSをゆっくり加えたり取り除いたりします。
   10. PBSは慎重に取り外してください。
2. アストロサイト-ニューロン共培養
   1. 種子を不死化したマウス海馬神経細胞を3回(P3)でアストロサイトを含む培養皿に3〜10個の密度で植え付け×1皿あたり。DMEMとDMEM/F-12の1:1混合培地に10%のFBSおよび1%のトリプル抗生物質混合物を補足した合計2mLの細胞を追加します。トランスウェル挿入なしで直接接触法で共培養を確立します。細胞は37°Cで、5%のCO₂を含む加湿インキュベーターで培養します。
      注意:既存のTNT構造の破壊を最小限に抑えるために、神経細胞を優しく添加してください。
   2. 標準的なインキュベーター条件下で24時間共培養を維持しつつ、取り扱い手順中のサンプルを不必要な光曝露から保護します。
3. 固定と透過化
   1. 培地は光の遮られた環境で除去してください。
   2. 細胞をPBSで一度洗浄してください。
   3. 薄暗い環境でRTで30分間、パラホルムアルデヒドを含む4%の組織細胞固定液で細胞を固定します。
      注意:固定液は適切な個人用保護具を使用して取り扱い、すべての手順を機関の化学物質安全ガイドラインに従って行ってください。
   4. 固定液を取り除きます。
   5. 細胞をPBSで一度洗浄してください。
   6. 500μLの即使用済みTriton X-100透過液で、薄暗い環境でRTで20分間細胞を透過化します。
      注意:トリトンX-100は脆弱なTNT構造を破壊する可能性があります。透過化時の過度な攪拌を最小限に抑えましょう。
   7. 透過化溶液を除去します。
   8. 細胞をPBSで一度洗浄してください。
4. 蛍光染色とイメージング
   1. 使用直前に着色剤を準備してください。PBS中にFアクチン染色染料を希釈して最終濃度1μMにし、DAPIをすぐに使える核染色剤として使用します。使用前に染色液をよく混ぜてください。
      注:ファロイジン系染色試薬はFアクチンの可視化の代替として使用されることがあります。
   2. 使用直前に、光遮蔽条件下でFアクチンと核染色液を1:1の比率(等体積)で混ぜてください。
   3. 調理済みの染色液を培養皿に加えます。
   4. 細胞を暗闇で37°Cで30分間培養します。
   5. 染色液を除去してください。
   6. 細胞をPBSで3回洗い、1回の洗いにつき500μLを1分ずつ洗います。
   7. 画像作成中に細胞の乾燥を防ぐためにPBSを1mL添加します。
   8. ニコン製の逆立共焦点顕微鏡(×20対物レンズ搭載)で画像を取得します。DAPIには405nm励起、Fアクチン染色には488nm励起、MitoTracker染色には665nm励起を使用します。光保護条件下で1024×1024ピクセルの解像度で画像を撮影します。
   9. サンプルごとに少なくとも5つのランダムに選ばれた視野を用いて質的評価を行います。細胞間膜結合内のTNT様構造およびミトコンドリア関連蛍光シグナルの存在を評価する(図2Aおよび2B)。
      注意:蛍光損失とTNTの構造破壊を最小限に抑えるため、染色直後に画像を取得してください。

図2:アストロサイト-ニューロン共培養系におけるミトコンドリアおよびTNTの蛍光染色。 (A) ガラス底培養皿で培養されたアストロサイトおよびニューロンにおける核、ミトコンドリア、Fアクチン染色を示す代表的な共焦点顕微鏡画像。アストロサイトは不規則な星状または多角形の形態を持ち、細胞突起が伸びていましたが、神経細胞は丸または楕円形で細い神経石様の突起を呈しました。(B) パネルAのボックス領域の拡大図。白い矢印は細胞間のミトコンドリア関連TNT様構造を示しています。これら二つの細胞集団は主にその特徴的な細胞形態に基づいて区別されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. TNT中のミトコンドリアおよびMiro1に対する免疫蛍光共局所染色

1. アストロサイトシーディングとミトコンドリア標識
   1. 種子で一次ラットのアストロサイトを35mmのガラス底培養皿に単離し、1皿あたり3個×10個^4細胞の 密度で35mmのガラス底培養皿に移しました。DMEM/F-12全培地2mLに、10%のFBSと1%のトリプル抗生物質混合物(ペニシリンG、ストレプトマイシン、アンフォテリシンB)を補足します。細胞は37°Cで、5%のCO₂を含む加湿インキュベーターで培養します。
   2. 細胞を約24時間潜伏させ、付着が起こるまで続けます。
   3. 細胞付着後は、培養皿を薄暗い環境の清潔な作業台に移します。
      注意:TNTの完全性を保つために、取り扱い中の不必要な動きや振動を最小限に抑えてください。
   4. 光の遮蔽条件下で培地を優しく取り除きます。培地除去時にTNTを破壊しないように注意してください。
      注意:培地除去時には細胞表面を完全に乾燥させないように注意してください。TNTは崩壊して培養基質に付着する恐れがあります。
   5. DMSOで50μgの凍結乾燥ミトトラッカー染料を再構成し、1 mMのストック溶液を準備し、ストック溶液を−20°Cで保存します。 使用前に、ストック溶液を完全なDMEM/F-12培地400μLに10%のFBSおよび1%のトリプル抗生物質混合物を加えて希釈し、最終的なMitoTracker濃度50μMを得ます。
      注意:蛍光染料は調製および培養過程で直射光から保護してください。
   6. ミトコンドリア染色液を培養皿に加えましょう。
   7. 細胞は37°Cの加湿インキュベーターで、5%のCO₂を含む環境で30分間、光の遮られた環境で培養します。
   8. ミトコンドリア染色液は光遮蔽条件下で除去してください。
   9. カルシウムとマグネシウムイオンを含まないPBS500μL(pH 7.3–7.5)で細胞を優しく洗浄します。洗浄中に細胞間TNTを乱さないように、培養皿の壁に沿ってPBSをゆっくり加えたり取り除いたりします。
   10. PBSは慎重に取り外してください。
2. アストロサイト-ニューロン共培養
   1. 種子を不死化したマウス海馬神経細胞を3回(P3)でアストロサイトを含む培養皿に3〜10個の密度で植え付け×1皿あたり。DMEMとDMEM/F-12の1:1混合培地に10%のFBSおよび1%のトリプル抗生物質混合物を補足した合計2mLの細胞を追加します。トランスウェル挿入なしで直接接触法で共培養を確立します。細胞は37°Cで、5%のCO₂を含む加湿インキュベーターで培養します。
      注意:既存のTNT構造の破壊を最小限に抑えるために、神経細胞を優しく添加してください。
   2. 標準的なインキュベーター条件下で24時間共培養を維持しつつ、取り扱い手順中のサンプルを不必要な光曝露から保護します。
3. 固定と透過化
   1. 培地は光の遮られた環境で除去してください。
   2. 細胞をPBSで一度洗浄してください。
   3. 細胞を、パラホルマルデヒドを含む市販の4%組織細胞固定液(pH 7.2–7.4)で、薄暗がりの環境下でRTで30分間固定します。
      注意:固定液は適切な個人用保護具を使用して取り扱い、すべての手順を機関の化学物質安全ガイドラインに従って行ってください。
   4. 固定液を取り除きます。
   5. 細胞をPBSで一度洗浄してください。
   6. 500μLの即使用済みTriton X-100透過液で、薄暗い環境でRTで20分間細胞を透過化します。
      注意:トリトンX-100は脆弱なTNT構造を破壊する可能性があります。透過化時の過度な攪拌を最小限に抑えましょう。
   7. 透過化溶液を除去します。
   8. 細胞をPBSで一度洗浄してください。
4. ブロッキングと免疫蛍光染色
   1. 薄暗い環境でRTで1時間、5%のヤギ血清で細胞をブロックします。ブロッキング溶液は、ヤギ血清をPBSに1:20で希釈して準備します。
   2. ブロッキング液を除去してください。
   3. PBS中に希釈したウサギモノクローナル抗Miro1抗体を希釈比1:100で使用。希釈した一次抗体溶液を培養皿に加え、4°Cで一晩(12〜16時間)培養します。
      注意:蛍光標識サンプルは染色作業中、直射光から保護してください。
   4. 一次抗体溶液を除去します。
   5. 細胞をPBSで3回洗い、1回の洗いにつき500μLを1分ずつ洗います。
   6. 蛍光ヤギの抗ウサギIgG二次抗体をPBS中に希釈し、希釈比を1:100でします。各培養皿に希釈した二次抗体溶液500μLを加え、光保護条件下で1時間培養します。
      注:本研究には一次抗体なし対照群は含まれていません。今後の実験では、染色特異性をさらに検証するために適切な免疫蛍光コントロールを取り入れるべきです。
   7. 蛍光二次抗体溶液を除去してください。
5. 蛍光カウンターステインとイメージング
   1. 使用直前に着色剤を準備してください。PBS中にFアクチン染色染料を希釈して最終濃度1μMにし、DAPIをすぐに使える核染色剤として使用します。使用前に染色液をよく混ぜてください。
      注:ファロイジン系染色試薬はFアクチンの可視化の代替として使用されることがあります。
   2. 染色液を培養皿に加えます。
   3. 細胞を暗闇で37°Cで30分間培養します。
   4. 染色液を除去してください。
   5. 細胞をPBSで3回洗い、1回の洗いにつき500μLを1分ずつ洗います。
   6. 画像作成中に細胞の乾燥を防ぐためにPBSを1mL添加します。
   7. ニコン製の逆立共焦点顕微鏡(×20対物レンズ搭載)で画像を取得します。5μmのステップサイズでZスタック画像を40μmの総イメージング範囲(8つの光学断片)で収集します。DAPIには405nm励起、Fアクチン染色には488nm励起、Miro1免疫染色には594nm励起、MitoTracker染色には665nm励起を使用します。光保護条件下で1024×1024ピクセルの解像度で画像を撮影します。
   8. サンプルごとに少なくとも5つのランダムに選ばれた視野を用いて質的評価を行います。TNT様構造、ミトコンドリア関連蛍光シグナル、およびMiro1と細胞膜結合内のミトコンドリア関連染色との見かけ上の共局在を評価します(図3A–3C)。
      注意:蛍光損失とTNTの構造破壊を最小限に抑えるため、染色直後に画像を取得してください。

図3:アストロサイト-ニューロン共培養系におけるTNTにおけるミトコンドリアとMiro1の共定位染色。 (A) ガラス底培養皿で培養されたアストロサイトおよびニューロンにおける核、ミトコンドリア、Miro1、Fアクチン染色を示す代表的な共焦点顕微鏡画像。白い矢印は、TNT様構造内のミトコンドリア関連シグナルとMiro1との見かけ上の共局所領域を示します。(B) 隣接するセル間に形成されたTNT様構造を示す三次元再構築Zスタック画像。(C) 隣接するセル間に伸びるTNT様構造を示す同じZスタック画像の横向き再構成。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

アストロサイト単一培養製剤では、Fアクチン染色および核染色後に隣接細胞間に薄い膜突起が観察されました(図1A および 1B)。隣接するアストロサイト間に複数のTNT様構造が広がり、個々のアストロサイトは周囲の複数の細胞としばしば接続を形成していました。TNT様構造の保存が成功したのは、洗浄や固定作業中の優しい取り扱いに関連していました。培地除去や洗浄時の過度な機械的攪乱により、これらの膜接続部の検出性低下と構造的破壊が生じ、誤った試料取り扱いによるTNT様構造の破壊が示されています(図1C および 1D)。

アストロサイト-ニューロン共培養製剤において、ミトコンドリア関連蛍光シグナルが、MitoTracker染色および共焦点イメージング後に隣接細胞をつなぐTNT様構造内で観察されました(図2A および 2B)。これらの構造はFアクチンおよび核染色とともに可視化され、TNT様結合の形態学的評価を支援しました。適切な光保護と洗浄強度の最小化により、画像作成中の蛍光信号およびTNT形態の保存が改善されました。

免疫蛍光共局在実験では、アストロサイト-ニューロン共培養中のTNT様構造内で、ミトコンドリア関連染色およびMiro1免疫染色に対応する重なり蛍光シグナルが観察されました(図3A)。これらの観察は、Miro1とTNT様構造内に局在するミトコンドリアとの潜在的な関連を示唆しています。三次元再構築されたZスタックイメージングは、隣接セル間に伸びるTNT様構造の存在をさらに支持しました(図3B および 3C)。TNTの保存、蛍光信号強度、画像品質は、固定、透過性、イメージング条件の影響を受けました。

ディスカッション

上記の実験プロトコルの最初の重要なステップは、固定前の遮光前処理です。TNT様構造は非常に脆弱であり、インキュベーターから取り出した後も光保護状態を維持することは、サンプル準備中の蛍光信号強度と構造の完全性を維持するために重要です。第二の重要なステップは、流体の流れによるTNT様構造の破壊を最小限に抑えるため、穏やかな操作を用いてPBS洗浄を行うことです。これらの重要な取り扱い手順の遵守は、TNT様構造の形態と安定性を維持し、その後の画像結果の一貫性を向上させるのに役立ちます。過剰な吸引、長時間の洗浄、強い流体攪拌は、試料処理中にTNT様構造の崩壊や破片を引き起こすことがあります。TNTは非常に動的な性質を持つため、光に敏感です。光曝露による光毒性はTNTの破壊を引き起こすことがあり、これらの構造を可視化しにくく^します。したがって、TNT関連の実験中は光保護条件を維持する必要があります。

細胞内のミトコンドリア運動は、特にニューロンにおける細胞エネルギー分布に寄与します。研究により、ミトコンドリアはアクチンフィラメントや微小管に沿って移動できることが示されています¹²。最近の研究では、TNTが神経細胞間のミトコンドリア移動に関連する長距離細胞間通信構造として機能できることも示されています¹³。本研究で述べた方法論的アプローチにより、神経細胞培養系におけるTNT様構造およびミトコンドリア関連蛍光信号の可視化が可能となります。過去の研究では、パーキンソン病や脳虚血損傷などの神経疾患において、神経細胞間のミトコンドリア移動が組織修復や神経保護過程に寄与する可能性が示されています(^14,15)。本研究で述べた手法を用いて、アストロサイト間およびアストロサイトとニューロン間にTNT様構造が観察され、これらの構造内に局在するミトコンドリア関連蛍光信号も観察されました。

前回の研究¹⁰で指摘されているように、MitoTracker染色は染料漏れや非ミトコンドリア信号伝達の影響を受け、データの信頼性を低下させる可能性があります。この制約に対処するため、今後の研究では遺伝的にコードされたミトコンドリア標識など、より堅牢な手法を用いてより決定的な結果を得るべきです。現在の実験条件下では、主に細胞形態に基づいて2つの細胞型が区別されており、このアプローチは細胞型識別特異性を低下させる可能性があります。今後の研究では、共培養解析の精度を向上させるために細胞型特異的蛍光標識を組み込むべきです。Miro1は外ミトコンドリア膜に局在する適応タンパク質であり、ニューロンにおけるミトコンドリア輸送過程に関与しているとされています(^16,17)。本研究で述べた免疫蛍光共局在プロトコルを用いると、TNT様構造内でミトコンドリア関連染色とMiro1免疫染色に対応する蛍光信号の重複が観察されました。これらの観察は、Miro1とTNT様構造内に局在するミトコンドリアとの潜在的な関連を示唆しています。しかし、従来の共焦点顕微鏡の空間分解能は、薄膜突起内の分子共局在の決定的な評価を制限する場合があります。

細胞間のTNT様構造の存在を確認するためにZスタックイメージングを実施し、これらの膜結合の構造的検証を支持しました。本プロトコルはほとんどの実験環境に適していますが、固定細胞の共焦点イメージングは、サンプル処理時に脆弱なTNT様構造を失われる可能性があり、これにより正確なTNT定量が制限される可能性があります。¹⁸。さらに、固定細胞の画像診断ではミトコンドリアの移動方向性を明確に特定できず、今後の研究でさらなる研究が求められます。このプロトコルは、神経細胞培養系におけるTNT様構造、ミトコンドリア関連シグナル、関連タンパク質の染色のための標準化された実験ワークフローを提供します。制御されていない洗浄・固定手順と比較して、このプロトコルは画像作成中の穏やかなサンプル取り扱いと蛍光保存を重視しています。これらの手法は、TNT関連画像診断研究における実験の一貫性と再現性の向上に役立つ可能性があります。

まとめると、本研究はTNTの質的評価およびTNT様構造を介したミトコンドリア輸送の調査のための実践的かつ広く応用可能な実験室プロトコルを提供します。しかし、固定や洗浄などのサンプル処理工程は、ライブセルイメージング手法と比べて定量の変動をもたらす可能性があります。さらに、共焦点顕微鏡は超分解能顕微鏡よりも空間分解能が低いため、TNTの詳細な構造特性評価が制限されます。さらに、MitoTrackerベースのミトコンドリア染色は色素漏れや非特異的なシグナル伝達の影響を受けており、今後の研究で検証され、実験的精度の向上が期待されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1% triple antibiotic mixture	バイオシャープ	BL142A	細胞培養中の細菌および真菌汚染を防ぐ
4% 組織細胞固定液	ソラビオ	P1110	細胞固定試薬
Anti-Miro1 抗体	アブカム	AB319154	Miro1に対する一次抗体
アストロサイト	実験室で分離した一次細胞	NA	アストロサイトは、生後1〜3日のSDラット子宮内の脳皮質から分離されました。分離した細胞の純度はGFAP染色により95%以上であることを確認し、すべての実験で3世代目（P3）の細胞を使用
アストロサイト細胞培養培地（DMEM/F-12）	ギブコ	6125011	DMEMとF-12を1:1（v/v）の比率で混合し、10%の胎児ウシ血清（FBS）と1%のトリプル抗生物質を添加
共焦点顕微鏡	ニコン AX	ECLIPSE TI2-E	ニコンAX共焦点顕微鏡（日本、ニコン社）をNIS-Elements（バージョン5.4）で制御して画像を取得
DAPI	サービスバイオ	G1012-100ML	核染色染料
DMSO	バイオフロックス	1084ML100	蛍光染料のストック溶液調製に使用する溶媒
F-アクチン染色染料	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A57243	細胞骨格構造およびトンネルナノチューブの可視化のためのF-アクチン染色試薬
胎児ウシ血清	エクセルバイオ	FSD500	細胞培養に必要な栄養素を提供
蛍光二次抗体（ヤギ抗ウサギIgG）	ABクロナル	AS039	免疫蛍光染色のための二次抗体
ガラス底細胞培養皿	NEST	801001	共焦点顕微鏡用イメージング皿
ヤギ血清	ソラビオ	210C051	免疫蛍光染色用のブロッキング試薬
ミトトラッカー ディープレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	M22426	ミトコンドリア染色染料
ニューロン	CAS 細胞バンク	HT22-GNM47	不死化されたマウス海馬ニューロン細胞をDMEM完全培地で培養した。3世代目（P3）の細胞を収集し、その後の実験に使用。
ニューロン細胞培養培地（DMEM）	サービスバイオ	G4511-500ML	グルタプラスとピルビン酸ナトリウムを添加し、HEPESを除去したDMEMを10%の胎児ウシ血清（FBS）と1%のトリプル抗生物質で補完
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	サービスバイオ	G4203-500ML	固定と染色中に使用する洗浄バッファー
トリトン X-100	ソラビオ	P1080	細胞透過性試薬