マウス背根神経節の解離と分離

サマリー

背根神経節(DRG)は一次感覚神経細胞体を含み、末梢感覚信号を脊髄に中継します。このプロトコルは、構造的に完全な神経節の標準化された分離、解剖学的節節識別、初心者ユーザー向けの直感的な指導、そして手技的組織損傷の軽減を支援するマウスDRG解離の方法を説明しています。

要約

一次感覚ニューロンの細胞体を含む背根神経節(DRG)は、末梢組織から脊髄への感覚信号伝達の重要な中継構造として機能します。これらは痛み、神経損傷、神経変性疾患の研究において重要な役割を果たします。完全なDRG組織の取得は、感覚ニューロンの機能的性質、分子発現、病理的変化を調査する上で極めて重要です。しかし、DRGは小型で椎管内深くに位置するため、正確な同定と分離には大きな技術的課題があります。本研究では、マウスDRGの分離のための標準化されたプロトコルを開発しました。この方法は、DRGの解剖学的局在、椎管の露出、そして神経節分離に関わる重要なステップを詳細に記述します。手術全体は代表的な画像とビデオ記録で説明されています。このアプローチは、解剖学的指導によるセグメント識別を伴い、構造的に完全なDRGの取得を支援し、H&E染色や免疫蛍光分析に適しています。従来のDRG解離法と比較して、この方法は節節的に特定された神経節の標準化された回収を可能にし、初心者ユーザーに直感的な解剖学的指導を提供し、手技的な組織損傷を軽減します。

概要

一次感覚ニューロンの細胞体を含む背根神経節(DRG)は、機械的、熱的、侵害受容刺激を含む末梢感覚信号を脊髄に伝達するための重要な構造^です。DRGを記述する高品質な資料は現在存在しますが、単一の標本内で胸部から仙骨へのDRGを正確に識別・分離し、組織採取時のDRG損傷リスクを最小限に抑えるためには、詳細な手順的指導が必要です。

DRGニューロンは末梢感覚経路の重要な構成要素です。軸索は二分し、一方は末梢組織に伸び、もう一方は脊髄の背角に突き出ています。これにより、痛みの伝達、神経損傷、炎症反応、さまざまな神経疾患の病因に重要な役割を果たし^ます。さらに、DRGは神経損傷修復、慢性疼痛のメカニズム、感覚ニューロンの可塑性、神経免疫調節などの研究分野でも大きな注目を集めています^5,6。免疫組織化学的染色、RNAシーケンス解析、一次神経培養、電気^{生理学的研究}など、さまざまな実験研究でDRG組織が完全な状態を必要とします7。したがって、構造的に無傷で正確にセグメント同定されたDRG組織の取得は、感覚神経回路、神経分子特性、病理学的変化の研究において不可欠です。

DRGは椎間孔の近くに位置し、背根を介して脊髄に接続されています。小型で骨構造に囲まれていること、そして周囲の解剖学的構造の複雑さから、完全な隔離はかなりの技術的課題をもたらします。さらに、明確な解剖学的ランドマークや標準化された手順の欠如は、組織採取時の構造的損傷や節間誤認のリスクを高めます。

既存のマウスDRG解剖法と比較して、本研究で確立された方法はいくつかの利点があります。まず、以前に報告されているマウスDRG分離法は、一般的に動物から脊柱を除去し、その後分離した脊椎の節節と正中線開口を行い、その後DRGを椎間孔から剥離します。この過程で、脊柱の切断や繰り返しの切断はDRGに機械的損傷を引き起こしやすく、特定の節節の省略や節節識別の不明瞭さを引き起こすこと^{もあります。}対照的に、我々の方法はマウスの現場で直接実施され、椎骨の事前分離や切断をせずに実施されるため、組織採取時のDRG損失リスクを低減します。手術中、器具は主に神経節自体を掴んだり引っ張ったりするのではなく、DRGを取り巻く骨構造や結合組織に適用されるため、その完全性を保ちます。

第二に、既存の手法には、異なるDRGセグメントを特定するための明確で安定した解剖学的ランドマークが欠けていることが多いです。DRGに接続された神経は、脊柱切除時に頻繁に断断されるため、神経経路や分岐パターンから個々のDRGの節位を正確に特定することは困難になります。対照的に、私たちの方法は マウスの現場 で直接実施されるため、DRGや接続された神経、周囲の構造間の自然な解剖学的関係を保持し、神経接続や局所的な解剖学的ランドマークに基づいて異なるDRGセグメントの同定を可能にします。L2とL3の形態的特徴を主要な解剖学的基準点として用い、L3–L5と坐骨神経との解剖学的関係を組み合わせ、続いて前側および尾側両方向で隣接する節の逐次的な同定を提案します。

さらに、この方法は椎骨および椎管の露出、椎管の開口とその後の脊髄露出、DRGの露出、そして立体顕微鏡誘導による定位と解離など、主要なステップを比較的体系的に記述します。ワークフローは明確で、解剖学的なランドマークも明確に定義されているため、特に初心者にとって手続きの標準化や再現性の向上につながる可能性があります。この方法で得られるDRGは良好な組織の完全性を保ち、免疫蛍光やH&E染色を含む下流解析に適しています。

本研究では、マウスDRGの標準化された解剖および分離法を確立し、解剖学的局在のための回路図、サンプリング手順の代表画像およびビデオ記録を提供しました。この方法は、単一の標本で胸部から仙骨レベルまでのDRGの分離を支援しつつ、組織採取時のDRG損傷リスクを低減します。

プロトコル

すべての動物実験は、上海東病院の動物ケア・利用委員会が承認したプロトコルに厳密に従って実施されました。本研究で記述された解剖手技は、成体のC57BL/6マウス(オスまたはメス、生後12週、25〜30g)を用いて実施されました。 図1 は、このプロトコルで使用される解剖器具を示しています。

1. 準備

注意:灌流固定検体については、固定剤への曝露を避けるために適切な保護措置を講じてください。解開はフムフードや換気の良いベンチで行い、手袋、防護服、安全ゴーグルなどの適切な個人用防護具を着用してください。

1. マウスは、周囲温度約24°C、相対湿度55%で12時間の明暗サイクルに保ち、自由に餌と水 を摂ってください 。
2. 解剖を始める前に、呼吸が完全に止まるまで二酸化炭素チャンバーで安楽死させてください。死亡を確認した後、動物を解剖板に仰向けに置き、ピンで四肢を固定して安定した姿勢を保ちます。
3. 胸部腹部の毛に70%エタノールをスプレーして毛の汚染を減らし、手術室を清潔に保ちましょう。
4. ハサミを使って胸部と腹部の正中線に沿って皮膚を開けます。切開部を腹側の正中線に沿って頭蓋方向に広げ、胸郭を完全に露出させます。胸骨の下端を持ち上げ、肋弓の両側に沿って胸壁を切って胸腔を開き、心臓を露出させます。心臓をはっきり見るために、胸骨や肋骨の一部を切除してください。
5. 右心房にハサミで小さな切開をして、血液と灌流の出口を作ってください。20mLの注射器に冷却したPBS(4°C)を充填し、心臓の頂点近くの左心室にゆっくりと針を挿入します。針を安定させ、心室壁を貫通しないようにしてください。
6. パーフューズはPBSをゆっくりと均等に冷却し、肝臓が青白くなり、排出液がクリアになり、ほとんどの血液が洗い流されるまで続けます。その後、PBSを20mLの予冷4%パラホルムアルデヒド(4°C)に置き換え、四肢が硬直し、尾が巻き、組織が赤から淡い色に変わるまでゆっくりと一定のペースで灌流を続けます。これにより固定はほぼ完了しました。
7. 灌流後、針を抜き、胸腔内の残留液体を除去し、直ちに組織採取に進みます。非固定組織が下流解析に必要な場合は、予冷却されたPBSのみを灌流し、4%パラホルマルデヒド固定ステップは省略してください。
   注意:検査中は、心臓破裂や過剰な圧力による組織の腫れを防ぐために、ゆっくりと一定かつ均一な灌流速度を維持してください。上記のすべての処置は室温で行います。

2. DRGと隣接神経(図2)

1. 椎骨および椎管の露出(3〜5分)
   1. ネズミを伏せにして解剖板に固定します。ハサミで背側皮膚の正中線に沿って縦方向の切開を行い、尾から首に向かって切開を伸ばします。
   2. ハサミを使って背側の皮膚を下の結合組織から切り離し、両側の皮膚を反射させて背側筋を完全に露出させます。結合組織の表面に付着した毛髪を吸収性ペーパーで拭き取るか、生理食塩水で手術部位を洗い流して手術部位を清潔に保ちます。
   3. 背側筋と結合組織を脊柱の両側に沿って縦方向に切開し、椎骨構造を完全に露出させます。
      注意:背側組織の切開時に、ハサミが胸腔や腹腔に深く入り込むのを防ぎ、その後の解離手術に影響を及ぼす可能性があります。
   4. 骨ロンジュールで結合組織と脊椎を覆う残存筋を慎重に除去します。残留組織が視認を妨げる場合は、必要に応じてハサミでトリミングして椎骨を完全に露出させます。次に、ハサミで背側から頸椎を切断し、脊柱の頭蓋端を頭部から切り離し、次の工程を容易にします。
2. 椎管を開けて脊髄を露出させます(図3;8〜10分)。
   1. 頸椎管のレベルに微細に曲がったハサミを挿入し、椎板の両側に沿って切って管を開きます。
      注意:処置中に脊髄の損傷を避けるよう注意してください。
   2. 背側の椎板を除去し、脊髄の背側部分を徐々に露出させます。
   3. 脊椎の縦軸に沿って、マイクロカーブドハサミで背側板を切り取り、胸部から仙骨部へと徐々に伸ばし、脊髄の背側面を完全に露出させます。
3. DRGの露出(図4;8〜10分)
   1. 脊髄の背側面を完全に露出した後、骨ロンジュールを使って両側の椎管構造を優しく開き、左右の操作を交互に行います。
   2. 椎管が両側で完全に分離されたら、立体顕微鏡で椎間孔内に位置するDRGを観察します。
4. DRGの識別(図5;8–10分)
   1. 椎管が両側で完全に反射され、脊髄が完全に露出したら、脊髄の背側表面から伸びる背根神経束を立体顕微鏡で観察します。背根を横方向にたどると、椎間孔近くのDRGが楕円形または卵形構造であることがわかります。
   2. 同定時にDRGが脊髄神経の背根と椎間孔の境界に位置していることを確認し、各脊髄節で両側性のペアとして配置されていることを観察してください。DRGは感覚ニューロンの細胞体から形成される神経節であり、一方は脊髄の背側角に、反対側は末梢組織に伸びています。
   3. 立体顕微鏡を使って、DRGを淡い黄色または灰白色、軽度に膨らんだ構造で、形状が豊かで境界が比較的明確であることを識別します。
5. DRGのセグメント別同定および解剖を行う(図6;8–10分)
   1. 顕微鏡下で顕微鏡下で顕微外科用鉗子を使い、背根神経束を優しく持ち上げ、付着したDRGの完全な露出を実現します。
   2. DRGの分岐的同一性を判定するために以下の特徴を用いてください:多分岐神経線維(>2枝)に接続されたDRGをL2およびより多くの頭蓋DRGとし、分岐した神経線維(2枝のみ)に接続されたDRGをL3およびより尾側のDRGと指定します。次に、椎間孔の位置に応じて上下に残るDRGセグメントを順に特定します。
      注:L3–L5 DRGから生じる神経線維は合流して坐骨神経を形成します。
   3. 顕微外科的湾曲ハサミや顕微外科用鉗子を用いて、DRGを囲む結合組織や神経線維を慎重に分離し、神経節を椎間孔周囲の組織から徐々に解放します。
   4. DRGと脊髄をつなぐ背根神経線維を切断し、同時に末梢に伸びる神経束を切断して神経節を隔離します。
   5. 顕微外科用鉗子を使ってDRGを慎重に隔離してください。長期保存とその後の免疫蛍光分析が必要な場合は、直ちに分離したDRGを4%パラホルムアルデヒドを含む0.5 mL遠心分離機チューブに入れ、組織を3時間固定します。固定後、組織を0.1 M PBS(主成分:NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4)で3×5分洗浄し、30%ショ糖溶液に移して脱水させ、底部に沈むまで続けます。最後に組織をOCTに埋め込み、−80°Cで長期保存します。

3. 神経節の構成を確認する。

1. H&E染色結果(図7)
   1. 単離されたDRGを直ちに従来の組織学的固定剤(例えば4%パラホルムアルデヒド)に固定します。固定後、組織を0.1 Mリン酸塩緩衝液で洗浄し、標準組織学的手順に従って脱水、クリアリング、パラフィン埋め込みを行い、4〜6μmの組織断片を下流染色分析のために準備します。
   2. 切片にヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行い、DRGの全体的な構造と細胞形態を評価します。染色切片を使って神経節の細胞構成や組織組織を特定し、採取したDRGの品質を判断します。
   3. H&E染色された切片を顕微鏡で調べ、DRGが主に多数の感覚神経細胞体で構成されていることを確認しましょう。大きく丸い卵形の体性を持つニューロンを特定し、その明確に見える核や一部のニューロンに見られる顕著な核小体を観察します。また、ニューロンを囲む特徴的なリング状の配置で密接に離れた衛星グリア細胞の存在も確認してください。
   4. 神経節の内部を調べ、神経線維束や結合組織隔を特定し、全体の組織構造が整備して明確に組織されていることを確認します。細胞境界が明確に定義されていること、明らかな組織破壊や構造的乱れがないことを確認してください。
   5. H&E染色におけるDRG分離の成功を、全体構造の保存、明確な細胞形態、明らかな機械的損傷の存在によって確認すること。解剖や処理中に発生する細胞構造の乱れ、不明瞭な組織マージン、局所的な組織破壊を観察することでサンプル損傷を検出します。これらのH&Eの知見を、DRG収集の質と組織の完全性を評価するための実用的な基盤として活用してください。
2. TUBB3免疫蛍光染色の結果(図8)
   1. 分離したDRGをすぐに4%パラホルマルデヒドで3時間固定します。固定が完了したら、組織を0.1 M PBSで3回洗い、洗うごとに5分間の時間を確保します。次に、組織を30%ショ糖溶液に浸して底に沈殿させ、OCTに埋め込み、8〜12μmで凍結切片を切断して下流免疫蛍光染色を行います。
   2. 切片を室温に温め、PBSで3×5分洗い流し、Tris-EDTA抗原抽出液で抗原抽出を行います。区画を自然に室温まで冷やし、PBSで3×5分洗い、室温で5%BSAで30〜60分ブロックします。ブロッキング工程の後、蛍光色素標識されたTUBB3一次抗体を適用し、切片を4°Cで一晩培養します。 翌日、切片をPBSで3回洗い、核をDAPIで染色し、切片を取り付け、蛍光顕微鏡で画像を撮影します。
   3. DRGの断片を検査し、良好に保存された標本が明確な神経節の輪郭、完全な組織構造、整然とした細胞配列を示すことを確認する。主に感覚神経細胞体や神経線維でTUBB3免疫蛍光を観察し、神経節内の全体的なニューロン分布を定義します。DAPIカウンターステインを用いて、より大きなTUBB3陽性細胞を感覚ニューロンとして識別し、これらの細胞の周囲に分布する小さなDAPI陽性核はサテライトグリア細胞核に一致する形態パターンを示すことに注意してください。組織連続性の崩れ、TUBB3信号の不規則な局在、不明瞭な神経形態、または背景信号の局所的増加による解離または処理関連損傷を特定します。
   4. DRG組織の完全性の補助指標としてTUBB3免疫蛍光染色を適用します。DRG分離の成功を認めるのは、保存された神経節の輪郭、感覚神経細胞体および神経線維における明確な蛍光シグナル、明確な細胞形態、そして最小限の背景染色によるものである。

結果

DRG分離を成功させるには、明らかな圧迫、圧迫、破損が見られない神経節の完全性を保つ必要があります。側面に連結された神経線維を優しく持ち上げ、徐々に神経節を周囲組織から解放し、神経節が完全に動員されてから切断し、切断して完全に除去します。処置中は器具による直接的な神経節体への牽引を避けてください。分離後は、椎間孔内にできる限りDRGの固有形態を保持してください。周囲の付着組織を除去した後、孤立した神経節は平らで楕円形かつ半透明のように見えるべきです。これらの形態的特徴を持つサンプルは、成功裏に採取されたとみなすことができます。

対照的に、分離に失敗した場合は、神経節体の構造的損傷が特徴で、連結した神経線維の牽引による破裂や、ピンセットやハサミでの不適切な操作による穿刺などがあります。さらに、原来の扁平な楕円形の破壊や、圧縮による明らかな構造変形や組織損傷も、分離に失敗した証拠とみなすべきです(図9)。

ディスカッション

DRGは末梢感覚神経系の重要な構成要素として、機械的、熱的、侵害受容の感覚情報を中枢神経系に伝達する上で重要な役割を果たします。^9,10,11。DRGニューロンは特徴的な擬二極性形態を示し、一方の突起は末梢組織にまで広がり、もう一方は脊髄の背角に投射されます。これにより、生理的および病理的条件下で感覚信号伝達、神経損傷修復、慢性疼痛において重要な役割を果たします 12,13,14.本研究で確立された解剖法は、胸部から仙骨レベルまでのマウスDRGの曝露、同定、隔離を体系的に記述します。他のDRG分離法と比較して、このプロトコルは胸部から仙骨への神経節の回復を支援し、セグメント識別のための解剖学的指導を改...

材料

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この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5 mL 遠心管	未指定	未指定	固定DRGの保存に使用
20 mL 注射器	未指定	未指定	心臓灌流に使用
30% シュクロス溶液	未指定	未指定	OCT埋め込み前の組織脱水に使用
4% パラホルムアルデヒド	Servicebio	G1101
5% BSA	Solarbio	SW3015
70% エタノール	未指定	未指定	解剖前の毛の汚染を減らすために使用
吸収紙	未指定	未指定	結合組織から毛を除去するために使用
成体C57BL/6マウス	Vital River	未指定	男性または女性; 12週齢; 25–30 g
Alexa Fluor 488共役ヤギ抗ウサギIgG	Servicebio	GB25303
抗TUBB3抗体	Proteintech	CL488-66375	TUBB3免疫蛍光に使用
二酸化炭素チャンバー	未指定	未指定	安楽死に使用
DAPI	Servicebio	G1012
解剖ボード	未指定	未指定	解剖中のマウスを固定するために使用
蛍光顕微鏡	未指定	未指定	蛍光標識された断面のイメージングに使用
Friedman-Pearson骨骨抜き	RWD	S21022-14	論文から抜粋：骨抜き（RWD、S21022-14）
H&E染色ソリューションキット	Servicebio	G1005
マイクロサージカルカーブシザー	ASSI	SDCT16R8	論文から抜粋：マイクロカーブシザー（ASSI、SDCT16R8）
マイクロサージカルフォーセプス	Fine Science Tools	11254-20	論文から抜粋：マイクロサージカルフォーセプス（FST、11254-20）
OCT化合物	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
ピン	未指定	未指定	解剖ボード上で四肢を固定するために使用
生理食塩水	未指定	未指定	手術部位をすすぐために使用
はさみ	Fine Science Tools	14060-09	論文から抜粋：はさみ（FST、14060-09）
ステレオ顕微鏡	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	10447197	論文から抜粋：ステレオ顕微鏡（Leica、10447197）
Tris-EDTA抗原回収ソリューション	Solarbio	C1038

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