FTY720は耐性急性骨髄性白血病細胞におけるドキソルビシン感受性を高めます

サマリー

本プロトコルは、FTY720が抵抗性急性骨髄性白血病細胞におけるドキソルビシン感受性を高める方法を、細胞生存率、アポトーシス、細胞内ドキソルビシン蓄積、薬物排出トランスポーター発現、およびラパマイシンシグナル伝達のプロテインキナーゼB/機構的標的を評価することで評価します。

要約

化学療法耐性は、耐性白血病が細胞内薬物曝露を減少させ、アポトーシスを回避するため、急性骨髄性白血病の効果的な治療における大きな障壁となっています。FTY720はスフィンゴシン-1-リン酸受容体調節因子であり、複数の腫瘍モデルで抗増殖および化学感作活性を報告しています。しかし、FTY720がドキソルビシン耐性急性骨髄性白血病細胞におけるドキソルビシン感受性を高めるかどうか、またこの効果が薬物排出トランスポーターやタンパク質キナーゼB/ラパマイシンシグナル伝達の機構的標的の変化と関連しているかどうかは、依然として十分に定義されていません。本研究では、FTY720単独およびドキソルビシンと併用した場合、親の急性骨髄性白血病細胞株(HL60およびK562)およびそのドキソルビシン耐性誘導体(HL60/AおよびK562/A)に対する効果を評価しました。細胞生存率はCell Counting Kit-8アッセイで評価され、アポトーシスはAnnexin V/プロピジウムヨウ化フローサイトメトリーで測定され、細胞内ドキソルビシン蓄積はフローサイトメトリーで定量化され、P-グリコプロテイン、多剤耐性関連タンパク質1、プロテインキナーゼB/ラパマイシン経路タンパク質の機構的標的、およびアポトーシス関連タンパク質はフローサイトメトリーおよびウェスタンブロッティングで調査されました。FTY720は耐性白血病細胞において用量依存性細胞毒性とドキソルビシン感受性の増加を示しました。併用治療により、細胞生存率が低下し、細胞細胞分離が増加し、細胞内ドキソルビシンの蓄積が促進され、P-糖タンパク質および多剤耐性関連タンパク質1の発現が減少しました。FTY720処理はタンパク質キナーゼBおよびラパマイシンの標的のリン酸化の減少とも関連しており、一方でプロテインキナーゼBアクチベーターSC79はシグナル伝達、トランスポーター発現、アポトーシスの変化を部分的に逆転させました。これらの発見は、FTY720がHL60/AおよびK562/A細胞におけるドキソルビシン感受性を高め、この効果がタンパク質キナーゼB/ラパマイシンシグナル伝達の機構的標的の減少、薬物排出トランスポーター発現の減少、細胞内ドキソルビシン蓄積の増加、アポトーシスの増加と関連していることを示しています。本研究はin vitro 細胞株モデルに限定されていたため、治療的結論を導く前に原発性白血病サンプルおよび in vivo システムでのさらなる検証が必要です。

概要

急性骨髄性白血病は、造血幹細胞および前駆細胞の悪性転換に起因する異質な血液悪性腫瘍です。成人における急性白血病の最も一般的な形態であり、長期生存率の低下と関連しています。治療戦略は改善されましたが、シタラビンとアントラサイクリンを組み合わせた誘導化学療法は依然として治療の基盤となっています。しかし、多くの患者は一次耐性や後天性耐性を発症し、再発、難治性疾患、悪い臨床転帰につながります(^1,2,3)。したがって、ドキソルビシン感受性を低下させるメカニズムの理解は、急性骨髄性白血病研究において重要な課題であり続けています。

ドキソルビシン耐性は多因子のプロセスです。耐性白血病細胞は、アデノシン三リン酸結合カセット薬物排出トランスポーター(P-グリコプロテインはアデノシン三リン酸結合カセットサブファミリー1)や多剤耐性関連タンパク質1(アデノシン三リン酸結合カセットサブファミリー1)の発現または活性増加により、細胞内薬物曝露を減少させることができます。.タンパク質キナーゼBおよびラパマイシンシグナル伝達の機構的標的の活性化も、白血病細胞の生存を促進し、アポトーシスを抑制し、治療抵抗性に寄与します⁵。これらのメカニズムが合わさることで、細胞内ドキソルビシンの蓄積が減少し、細胞毒性の有効性が低下します。多剤耐性トランスポーターの直接的な薬理学的標的化は、毒性、限定的な有効性、補償的耐性機構のため、困難な課題となっています⁶.同様に、タンパク質キナーゼB阻害剤およびラパマイシンシグナル伝達の機構的標的は、用量依存性の毒性、効果の制限、経路適応に関する翻訳上の課題に直面しています^7,8。

FTY720はフィンゴモドとも呼ばれ、米国食品医薬品局(FDA)により多発性硬化症治療に承認されたスフィンゴシン-1-リン酸受容体調節剤であり、抗がん剤として注目を集め^{ています。}免疫調節活性に加え、FTY720は前立腺がん、肝細胞癌、肺がん、大腸がん、多発性骨髄腫、乳がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、膠芽腫(10,11,12,13,14,15,16)など、複数の前臨床腫瘍モデルにおいて抗増殖、プロアポトーティック、治療感作効果を示しています^{。17、18、19}。過去の研究では、FTY720が乳がんにおけるドキソルビシン活性を高め、シスプラチン耐性非小細胞肺がん細胞におけるシスプラチン感受性を高め、ホスホイノシチド3-キナーゼシグナル伝達20,21,22の調節を通じてシスプラチン耐性メラノーマ細胞の再感作が示されています。これらの発見は、FTY720が抵抗性がん細胞における生存シグナル伝達および薬物保持機構の両方に影響を与える可能性を示唆しています。しかし、FTY720がドキソルビシン耐性急性骨髄性白血病細胞におけるドキソルビシン感受性を高めるかどうか、またこの効果が細胞内ドキソルビシン蓄積、薬物排出トランスポーター発現、アポトーシス、タンパク質キナーゼB/ラパマイシンシグナル伝達のメカニズム的標的の協調変化と関連しているかどうかは、依然として十分に定義されていません。

本研究は、ドキソルビシン耐性急性骨髄性白血病細胞モデルHL60/AおよびK562/A、およびそれらの親細胞モデルを用いてこのギャップを埋めるために設計されました。FTY720は、薬物排出トランスポーターの発現を減少させ、細胞内ドキソルビシンの蓄積を促進し、アポトーシスを促進することでドキソルビシン感受性を高める可能性があると仮説が立てられました。タンパク質キナーゼB/ラパマイシンシグナル伝達のメカニズム的標的が関連する調節経路として関与しています。この仮説を評価するために、FTY720単独またはドキソルビシン併用治療後の細胞生存率、半最大阻害濃度値、アポトーシス、細胞内ドキソルビシン蓄積、トランスポーター発現、シグナル伝達タンパク質の変化を評価しました。すべての実験が細胞株モデルで行われたため、これらの発見は臨床的有効性の直接的な証拠ではなく、 in vitro の機構的証拠として解釈されています。

プロトコル

本研究は、確立されたヒト急性骨髄性白血病細胞株およびそのドキソルビシン耐性誘導体を用いて実施されました。ヒト参加者、動物、または一次患者由来サンプルは含まれていませんでした。したがって、ヒト被験者研究や動物倫理の承認は機関審査委員会の承認を必要としませんでした。細胞株は中国天津の中国医学科学院血液学研究所から取得され、福建医科大学聯合病院の福建血液学研究所で管理されています。細胞の同一性は実験前に核型および形態学的評価によって確認され、すべての細胞培養はマイコプラズマ汚染の検査を受けました。プロトコルで使用される化学物質、機器、ソフトウェアは 材料表に記載されています。

1. 細胞培養と耐性表現型の確認

ヒトHL60およびK562急性骨髄性白血病細胞およびそのドキソルビシン耐性誘導体HL60/AおよびK562/Aは、中国天津の中国医学科学院血液学研究所から入手されました。細胞は、ロズウェルパーク記念研究所の1640培地に胎児用牛血清10%とペニシリンストレプトマイシン1%を補足し、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで37°Cで培養しました。

HL60/A細胞は1 μg/mLドキソルビシンを含む完全培地に、K562/A細胞は耐性表現型を保存するために5 μg/mLドキソルビシンを含む全培地で維持されました。ドキソルビシンは、治療アッセイ中の急性薬物選択効果を避けるため、実験試験の1か月前に培養培地から除去されました。

実験前に、親細胞と耐性細胞間のドキソルビシン半最大阻害濃度値を比較することで耐性表現型が再確認されました。薬剤フリー培養1か月後の耐性安定性は、ドキソルビシン感受性アッセイの繰り返しと基礎P-糖タンパク質および多剤耐性関連タンパク質1の発現を調べることで評価されました。培養は、耐性誘導体が親誘導体よりも高いドキソルビシン半最大阻害濃度値と高いトランスポーター発現を保持している場合にのみ実験に用いられました。

2. 薬剤の調製および治療設計

FTY720、ドキソルビシン、SC79は製造元の指示に従って標準溶液として調製されました。FTY720とSC79はジメチル硫酸に溶解され、推奨溶媒でドキソルビシンを準備し、取り扱い時に光から保護されました。作業液は処理前に全培養培地で新たに希釈されました。最終的なジメチルスルホキシド濃度は処理群間で同一であり、0.1%を超えませんでした。

車両対照群は対応する処理群と同じ最終ジメチルスルホキシド濃度を受けました。併用処理実験では、感光濃度として5μM FTY720が用いられました。特に明記がない限り、HL60/A細胞に対して4μM、K562/A細胞に対して8μMで使用されました。

3. 細胞生存率アッセイおよび半最大阻害濃度計算

細胞は100μLの完全培地中、1ウェルあたり10×⁴ セルずつの96ウェルプレートにシードされました。FTY720単剤検査では、HL60、K562、HL60/A、K562/A細胞を0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μMのFTY720で48時間処理しました。ドキソルビシン感受性試験では、HL60/AおよびK562/A細胞に対し、5 μM FTY720の有無にかかわらず、48時間連続的にドキソルビシン濃度を処理しました。

細胞の生存可能性は、製造元の指示に従いCell Counting Kit-8アッセイを用いて測定されました。処理後、各ウェルにCell Counting Kit-8試薬を加え、プレートを37°Cで2時間培養しました。吸収はマイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定されました。

相対セル生存率は次のように計算されました:相対セル生存率 = [(処理済み井戸の吸収率 - ブランク井戸の吸収) / (車両制御井戸の吸収率 - 空白井戸の吸収率)] × 100%

半最大阻害濃度値は、GraphPad Prismバージョン9.5の4パラメータロジスティック線量応答モデルを用いた非線形回帰を用いて算出されました。各実験は3つの独立した生物学的複製を含み、処理条件ごとに3つの技術井戸が使用されました。

4. 薬剤併合分析

FTY720がドキソルビシン感受性に与える影響は、FTY720の有無におけるドキソルビシンの用量-応答関係を比較することで評価されました。HL60/AおよびK562/A細胞は、ドキソルビシン単独またはドキソルビシンとFTY720の併用で48時間処理されました。

細胞生存率はCell Counting Kit-8アッセイを用いて評価され、半分最大阻害濃度値は4パラメータロジスティック線量応答モデルを用いた非線形回帰を用いて算出されました。ドキソルビシン感受性の変化は、投与群間の用量反応曲線の変化および半最大阻害濃度値の差に基づいて解釈されました。

実験は完全な固定比線量マトリックス研究として設計されていなかったため、正式な組み合わせ指数分析は行われませんでした。したがって、結果は決定的な薬理学的相乗効果ではなく、ドキソルビシン感受性の変化の証拠と解釈されました。

5. アネクシンVおよびプロピジウムヨウ化物フローサイトメトリーによるアポトーシス解析

HL60/AおよびK562/A細胞は、4 ×^{10 5} cells/mLの6ウェルプレートにシードされ、48時間にわたりビークル、FTY720単独、ドキソルビシン単独、またはFTY720とのドキソルビシン併用処理を行いました。併用治療として、HL60/A細胞では5μM FTY720を4μMドキソルビシン、K562/A細胞では8μMドキソルビシンを組み合わせました。

処理後、培養培地に懸浮した細胞を含む細胞を採取し、冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水で2回洗浄しました。細胞はアポトーシス検出キットメーカーが推奨する濃度でAnnexin V結合バッファーに再懸濁されました。各サンプルは5μLのAnnexin V-フルオレセインイソチオシアネートまたはAnnexin V-アロフィコシアニンと5μLのプロピジウムヨウ化物で染色され、その後暗室室温で15分間培養されました。

サンプルはすぐにフローサイトメトリーで分析されました。補正ゲートとクアドラントゲートの設定には、染色されていないコントロール、単一ステインコントロール、蛍光マイナス1コントロールが使用されました。破片は前方散乱および側散乱ゲーティングを用いて排除されました。初期のアポトーシス細胞はアネクシンV陽性細胞とプロピジウムヨウ化陰性細胞として定義され、後期アポトーシスまたは死死細胞はアネクシンV陽性細胞およびプロピジウムヨウ化物陽性細胞とされました。総アポトーシスは、早期および後期アポトーシス細胞の分数の合計として計算されました。各サンプルに対して少なくとも10,000件の生存可能な単細胞イベントが取得されました。

6. 細胞内ドキソルビシン蓄積アッセイ

HL60/AおよびK562/A細胞は、4 ×^{10 5} cells/mLの6ウェルプレートにシードされ、一晩培養しました。細胞はその後、車両制御、ドキソルビシン単独、または5 μM FTY720とのドキソルビシン併用で処理されました。HL60/A細胞は4μMドキソルビシンで処理され、K562/A細胞は8μMドキソルビシンで処理されました。細胞は37°Cで4時間培養され、光から保護されました。

処理後、細胞を採取し、冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水で2回洗浄して細胞外ドキソルビシンを除去しました。細胞はリン酸緩衝塩水に再懸浮させられ、ドキソルビシンの内在蛍光を用いたフローサイトメトリーで分析されました。未処理の細胞を背景の自己蛍光の定義に用い、ドキソルビシン処理細胞を蛍光陽性の基準として用いました。細胞内ドキソルビシンの蓄積は、破片および集合除去後の中央値蛍光強度として定量化されました。各独立実験内で中央値蛍光強度値をドキソルビシン単独群に正規化しました。

7. P-糖タンパク質および多剤耐性関連タンパク質1の発現のフローサイトメトリクス解析

HL60/AおよびK562/A細胞は6ウェルプレートに2 ×^{10 6} Cell/mLでシードされ、5 μM FTY720または車両制御で24時間処理されました。処理後、細胞は氷のように冷たいリン酸塩緩衝塩水で2回洗浄され、100μLの細胞染色緩衝液に再懸濁されました。

細胞は、製造者推奨の希釈でフィコエリスリン結合抗P糖タンパク質抗体およびAlexa Fluor 647結合抗多剤耐性関連タンパク質1抗体で染色されました。ゲート設定および補正には、マッチドアイソタイプ対照群、未染色対照群、単染色対照群、蛍光マイナス1対照群が含まれていました。サンプルは暗所で4°Cで30分間インキュベートされ、細胞染色バッファーで2回洗浄され、500μLのセル染色バッファーに再懸濁されてから取得されました。

フローサイトメトリーはBD FACScanフローサイトメーターを用いて実施されました。各サンプルに対して少なくとも10,000件の生存可能な単細胞イベントが取得されました。P-糖タンパク質および多剤耐性関連タンパク質1の発現レベルは、対応するアイソタイプコントロールシグナルを差し引いた後の中央値蛍光強度として定量化されました。正規化された値は、各独立した実験内の車両対照群に対して表現されました。

8. ウェスタンブロッティングおよびデンシトメトリック定量化

所定の処置後、細胞は採取され、冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水で2回洗浄されました。全タンパク質は、プロテアーゼおよびリン酸化酵素阻害剤を補足した放射免疫沈殿アッセイバッファーを使用して抽出されました。タンパク質濃度はビシンコニン酸タンパク質アッセイキットを用いて測定されました。

1レーンあたり合計30μgのタンパク質が、ナトリウムドデシル硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離され、ポリビニリデンジフッ化物膜に移されました。膜は、室温で1時間、トリス緩衝食塩水(Tween 20含有)で5%無脂肪乳または5%牛血清アルブミンで封じました。

膜は4°Cで一晩、全タンパク質キナーゼB、リン酸化タンパク質キナーゼB、ラパマイシンの全機構標的、リン酸化機構標的、切断カスパーゼ-3、切断されたポリ(アデノシン二リン酸-リボース)ポリメラーゼ、P-グリコプロテイン、多剤耐性関連タンパク質1、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素に対する一次抗体とともに培養されました。洗浄後、適切なホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体と室温で1時間インキュベートしました。タンパク質バンドは、化学発光検出の強化を用いて可視化されました。

バンド強度はImageJソフトウェアバージョン1.53tを用いて定量化されました。リン酸化されたタンパク質キナーゼBは全タンパク質キナーゼBに正規化され、リン酸化されたラパマイシンのメカニシス標的は全メカニシス的標的に正規化されました。P-グリコプロテイン、多剤耐性関連タンパク質1、切断カスパーゼ-3、切断されたポリ(アデノシンジリン酸-リボース)ポリメラーゼはグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素に正規化されました。正規化された値は比較に応じて、車両対照群またはドキソルビシン単独群に対するフォールド変化として表されました。ウェスタンブロット解析は3つの独立した生物学的複製を用いて実施されました。トリミングされていないウェスタンブロット画像は公開データリポジトリに保存されるか、補足ファイルとしてアップロードされました。

9. SC79救助実験

タンパク質キナーゼBシグナル伝達がFTY720の観察された効果と関連しているかどうかを調べるために、HL60/AおよびK562/A細胞は、タンパク質キナーゼBアクチベーターであるSC79の有無にかかわらずFTY720で処理しました。細胞は5μM FTY720で12時間前処理され、その後30μM SC79または車両制御でさらに12時間処理されました。

治療後、リン酸化タンパク質キナーゼB、リン酸化機構ラパマイシン標的、P-糖タンパク質、および多剤耐性関連タンパク質1レベルをウェスタンブロッティングで評価しました。並行して、ドキソルビシン、FTY720、SC79治療後のアポトーシスVおよびヨウ化プロピジウム染色で評価されました。救済効果は経路関連証拠として解釈されました。遺伝的過剰発現やノックダウン実験が行われていなかったため、因果結論は慎重に述べられました。

10. 統計分析とデータ報告

統計解析はGraphPad Prism(バージョン9.5)およびIBM SPSS Statistics(バージョン23.0)を用いて実施されました。生物学的複製は、独立した培養細胞を用いて異なる日に独立した実験を行うものと定義されました。技術的再現とは、同じ生物学的実験内で繰り返される井戸または繰り返し測定と定義されました。

データは特に指定がない限り平均±標準誤差として提示されました。2群比較は、データが近似正規分布の場合、非ペアの両側Student氏t検定を用いて分析されました。3つ以上のグループ間の比較は、分散の一方向分析とTukeyの事後検定を用いて分析されました。薬物濃度や治療状態など2つの独立した要因を対象とした実験は、分散の双方向解析と適切な多重比較補正を用いて分析されました。

正規性仮定が支持されない場合は、ノンパラメトリック検定が用いられました。可能な限り正確なp値が報告されました。統計的有意性は、多重比較の補正後 p < 0.05 と定義されました。すべての図の凡例は、生物学的複製数、使用される統計的検定、誤差バーの意味、および有意性閾値を示していました。個々の生物学的複製値は、可能な限り散布図で示されるか、棒グラフに重ねて表示されました。

結果

FTY720は親細胞およびドキソルビシン耐性急性骨髄性白血病細胞の生存率を低減させました

HL60、K562、HL60/A、K562/Aの細胞は、FTY720(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μM)の濃度を増加させて48時間曝露し、細胞生存率はCell Counting Kit-8アッセイを用いて測定されました。FTY720は4細胞株すべてで濃度依存的に細胞生存率を低下させました(図1A)。計算された半最大阻害濃度値はHL60細胞で17.347 ± 1.549 μM、HL60/A細胞で12.207 ± 0.860 μMでした。対応する値は、K562セルで1.138μM±15.457、K562/Aセルで20.677±2.083μMでした(図1Bおよび表1)。

ディスカッション

化学療法耐性は、急性骨髄性白血病治療の効果的な障害の一つであり続けています。誘導療法に反応しないか、初期反応後に再発した患者では、シタラビン系およびアントラサイクリン系レジメンへの曝露にもかかわらず耐性白血病細胞が持続することがあり、薬剤感受性を高めるアプローチの特定は重要な実験的・^{臨床的課題}となっています。ドキソルビシンは広範な抗腫瘍活性を持つアントラサイクリンですが、臨床的利用は累積毒性や悪性細胞が細胞内薬物曝露を減少させたりアポトーシス誘導を弱める機構を獲得したりする能力によって制限^{されています。}この文脈では、用量の増量のみに頼らずにドキソルビシン感受性を高める薬剤が、耐性克服に役立つ実験的手がかりを提供する可能性があります。

本研究では、FTY720がドキソルビシン耐性急性骨髄性白血病細胞モデルにおけるドキソルビシン感受性を高める可能性があるかどうかを評価しました。FTY720は親細胞および抵抗性白血病細胞の細胞...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェル組織培養プレート	Corning / Costar	3516または実験室検証済み同等品	処理、アポトーシス、ドキソルビシン蓄積、タンパク質発現実験に使用。
96ウェル組織培養プレート	Corning / Costar	3599または実験室検証済み同等品	Cell Counting Kit-8アッセイに使用。
Alexa Fluor 647マウス免疫グロブリンG1アイソタイプコントロール	BioLegend	400130または実験室検証済み同等品	Alexa Fluor 647結合抗体染色のアイソタイプコントロール。試薬バイアルから正確なカタログ番号を使用してください。
Alexa Fluor 647結合抗ヒト多剤耐性関連タンパク質1/ABCC1抗体	BioLegend	370103	多剤耐性関連タンパク質1のフローサイトメトリック検出に使用。一部のBioLegend MRP1フォーマットは中止または交換されたため、製品の利用可能性を確認する必要があります。
プロピジウムヨウ化物付きアネキシンVアポトーシス検出キット	BioLegend	640914または実験室検証済み同等品	フローサイトメトリーによるアネキシンVおよびプロピジウムヨウ化物アポトーシス分析に使用。アネキシンV-アロフィコシアニンがアネキシンV-フオレセインイソチオシアネート代わりに使用された場合は、正確なキットカタログ番号に置き換えてください。
ビシホコニン酸タンパク質アッセイキット	Thermo Fisher Scientific / Beyotime / 実験室検証済みサプライヤー	実際のカタログ番号を使用	タンパク質濃度測定に使用。
二酸化炭素細胞培養インキュベーター	Thermo Fisher Scientific / Eppendorf / 実験室検証済み機器	ラボ記録からモデルを挿入	37 °Cと5%の二酸化炭素で細胞を維持。
カスパ-3抗体	Cell Signaling Technology	9662; RRID:AB_331439	ウェスタンブロットで全長および切断型カスパ-3を検出。切断型カスパ-3特異的抗体を使用した場合は、正確なカタログ番号に置き換えてください。
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies	CK04	細胞生存率と半数阻害濃度アッセイに使用。
細胞染色バッファー	BioLegend	420201	フローサイトメトリー染色中の抗体希釈と洗浄に使用。
切断型ポリ（アデノシン二リン酸リボース）ポリメラーゼ抗体	Cell Signaling Technology	94885; RRID:AB_2800237	切断型ポリ（アデノシン二リン酸リボース）ポリメラーゼのウェスタンブロット抗体。
CompuSyn	ComboSyn, Inc.	バージョン1.0または実験室検証済みバージョン	完全な組み合わせ用量データが利用可能な場合、Chou-Talalay組み合わせ指数分析に使用。
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich / Merck	D2650または実験室検証済み同等品	FTY720およびSC79ストック溶液の担体。最終濃度は0.1%を超えなかった。
塩酸ドキソルビシン	ラボ購入記録から実際のサプライヤーを使用	実際のカタログ番号とロット番号を使用	耐性維持および処理アッセイに使用されるアントラサイクリン。この項目は実験で実際に使用された試薬と一致しなければなりません。
エンハンスドケミルミネッセンス基質	Thermo Fisher Scientific / MilliporeSigma / 実験室検証済みサプライヤー	実際のカタログ番号を使用	ウェスタンブロット信号検出に使用。
胎児ウシ血清	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10099-141または実験室検証済み同等品	培養培地に10%添加。すべての実験で一貫して熱不活性化または非熱不活性化血清を使用してください。
フローサイトメーター	BD Biosciences	BD FACScanまたは実際の機器モデル	アポトーシス、細胞内ドキソルビシン蓄積、トランスポーター発現アッセイに使用。利用可能な場合、補足方法にレーザー/フィルター設定を記録してください。
フローサイトメトリー分析ソフトウェア	BD Biosciences / FlowJo / 実験室検証済みソフトウェア	ラボ記録からバージョンを挿入	補償、ゲーティング、および中央値蛍光強度分析に使用。
FTY720 / フィンゴリモド塩酸塩	ラボ購入記録から実際のサプライヤーを使用	実際のカタログ番号とロット番号を使用	薬物処理試薬。この項目は実験で実際に使用された試薬と一致しなければなりません。実験がその製品で行われた場合を除き、異なるサプライヤーに置き換えないでください。
グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素抗体	Abcam	ab181602	ウェスタンブロット用のローディングコントロール。提出前に製品インサートからRRIDを確認してください。
GraphPad Prism	GraphPad Software	バージョン9.5	用量反応曲線フィッティング、半数阻害濃度計算、および統計分析に使用。
HL60ヒト急性骨髄性白血病細胞	中国医学科学院血液学研究所、天津、中国	この研究では商業的にカタログ化されていません	ヒト急性骨髄性白血病親株細胞株。使用前に核型と形態で認証済み。公開リファレンスが必要な場合は、HL60はRRID:CVCL_0002に対応します。
HL60/Aドキソルビシン耐性細胞	中国医学科学院血液学研究所、天津、中国	商業的にカタログ化されていません	HL60細胞のドキソルビシン耐性派生物。無薬培養前に1 µg/mLドキソルビシンで耐性を維持。
ウマラジキサンペルオキシダーゼ結合ウサギIgG二次抗体	Cell Signaling Technology / Abcam / 実験室検証済みサプライヤー	実際のカタログ番号を使用	ウェスタンブロット用二次抗体。ラボ記録から正確なサプライヤーとカタログ番号を挿入してください。
IBM SPSS Statistics	IBM	バージョン23.0	統計分析に使用。
ImageJ	米国国立衛生研究所	バージョン1.53t	ウェスタンブロット密度測定定量に使用。
K562ヒト白血病細胞	中国医学科学院血液学研究所、天津、中国	この研究では商業的にカタログ化されていません	ヒト白血病親株細胞株。使用前に核型と形態で認証済み。公開リファレンスが必要な場合は、K562はRRID:CVCL_0004に対応します。
K562/Aドキソルビシン耐性細胞	中国医学科学院血液学研究所、天津、中国	商業的にカタログ化されていません	K562細胞のドキソル