方法論記事

抗線維化薬スクリーニングのためのマウスコラーゲンタイプI α1プロモーター駆動線維芽細胞ベースのアデノウイルスレポーターシステム

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DOI：

10.3791/71678

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2026年8月14日

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1Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education, Shihezi University School of Medicine, 2NHC Key Laboratory of Cardiopulmonary Rehabilitation and Functional Recovery; Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), 3School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences, 4Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, 5State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Institute of Advanced Clinical Medicine, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 7Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, 8Haihe Laboratory of Cell Ecosystem

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、線維芽細胞の活性化を縦断的にモニタリングし、抗線維化化合物のハイスループットスクリーニングを容易にするため、マウス type I collagen プロモーターによって駆動される線維芽細胞ベースのアデノウイルスレポーターシステムの構築について記述します。

要約

心筋線維化は、異常な線維芽細胞の活性化と過剰な細胞外マトリックスの沈着を特徴とするが、縦断的で拡張可能かつ非破壊的なin vitroスクリーニングプラットフォームが欠如しているため、標的特異的な治療法が存在しない。従来のエンドポイントアッセイやリソース消費の激しい幹細胞モデルでは、線維化の進行をリアルタイムでモニタリングすることは本質的に不可能である。これらの制限を克服するため、本プロトコルでは、NIH/3T3線維芽細胞におけるマウスコラーゲンタイプI α1 (Col1a1) プロモーター駆動型アデノウイルスmCherry蛍光レポーターシステム (Ad-mCol1a1p-mCherry) の作製、最適化、および検証について述べる。組換えアデノウイルスのパッケージング、細胞毒性を最小限に抑えるための導入最適化（感染多重度：MOI）、および強固なトランスフォーミング増殖因子ベータ (TGF-β) 誘発性線維化モデルの確立に関する重要な手順を詳細に説明する。細胞固定の必要性を排除することで、本システムは生細胞におけるコラーゲン転写の直接的かつ縦断的なモニタリングを可能にする。本モデルの特異性と信頼性は、TGF-βタイプI受容体 (ALK5) 阻害剤であるSB431542を用いて薬理学的に検証されており、蛍光リードアウトは逆転写定量PCRおよび酵素結合免疫吸着アッセイによって定量された内因性線維化マーカーと相関している。最終的に、この費用対効果の高いプラットフォームは、新規抗線維化剤の高スループットスクリーニングのための利用しやすいツールを提供し、それによってトランスレーショナルな心血管研究を加速させるものである。

概要

心線維化の管理は、臨床的に大きな課題となっています。静止期線維芽細胞が筋線維芽細胞へと異常に活性化し、細胞外マトリックス（ECM）が過剰に沈着することを特徴とする心線維化は、心不全、心筋梗塞、およびその他の心血管疾患に共通する不可逆的な終末経路です1,2,3。しかし、現在の治療戦略には重大な限界があります。利尿薬、β遮断薬、およびレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系阻害薬などの従来の介入策は、主に全身的な血行動態ストレスの緩和や神経体液性活性化の抑制を目的としています4,5,6,7。これらの治療法では、線維芽細胞の活性化を直接的に標的とするか、進行中のコラーゲン沈着を停止させることはできません。さらに、transforming growth factor beta (TGF-β)/Smad経路、酸化ストレス、代謝リプログラミングなどのシグナル伝達カスケードがこの病理を促進していますが、全身性の毒性や非特異的なデリバリー機構のため、これらの知見を直接作用型の抗線維化療法へと変換することは依然として困難です8,9,10。したがって、標的特異的な新しい抗線維化療法の開発が急務となっています。トランスレーショナルリサーチにおける大きなボトルネックは、線維芽細胞の活性化を感度良く動的に報告できる機能評価系の欠如です。従来の実験モデルには、効率的な薬理学的スクリーニングを妨げる重大な限界があります11,12。in vivo動物モデルは、全般的な心リモデリングを再現できますが、種間差、実験期間の長期化、高コスト、および低スループットという課題があります11。

これらの障害を克服するために、さまざまなin vitroスクリーニングプラットフォームが登場していますが、依然として重大な手法上の欠陥が残っています。ハイスループット免疫蛍光アッセイは、破壊的な細胞固定と労力を要する処理が必要であり、線維芽細胞活性化のリアルタイムキネティクスを捉えるのではなく、静止したスナップショットしか提供できません。同様に、ラベルフリーのインピーダンスモニタリングと質量分析（MS/MS）を統合したプラットフォームは、非特異性と低スケーラビリティという課題を抱えています。これは、一般的な細胞毒性によって引き起こされるインピーダンスの低下が、真の抗線維化効果と容易に混同される可能性があるためです。さらに、誘導多能性幹細胞（iPSCs）を利用して細胞骨格マーカー（例：α-smooth muscle actin [α-SMA]/ACTA2）を追跡するCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）エンジニアリング・レポーターシステムは、トランスレーショナルな障壁が高いという問題があります13。これらのiPSCベースのモデルは費用が極めて高く、技術的な要求レベルも厳しいため、日常的なハイスループットスクリーニングへの適用はほとんど不可能です。また、α-SMAなどの細胞骨格マーカーへの依存は、その発現がECMの機能的な分泌や過剰な沈着と厳密に相関しないため、病理学的なエンドポイントを正確に反映していない可能性があります14。したがって、これらのシステムでは、薬理学的介入に対する初期段階の細胞応答を縦断的にマッピングするには不十分です。

対照的に、本プロトコルでは、線維芽細胞の活性化をモニタリングするための非破壊的かつ堅牢なプラットフォームを構築することを目的として、コラーゲンI型α1（Col1a1）プロモーターによって駆動される縦断的な機能的レポーターシステムについて記述します。I型コラーゲンは心臓のリモデリング中に沈着する主要なECM成分であるため、そのコード遺伝子であるCol1a1の転写活性化を捉えることは、線維芽細胞活性化の直接的かつ病理学的に関連したリードアウトとなります。このCol1a1プロモーターベースのモデルは、線維化プロセスの分子レベルでの継続的なモニタリングを可能にし、メカニズムに基づく薬剤スクリーニングに最適化された、感度が高く、縦断的で定量可能なプラットフォームを提供します。

プロトコル

すべての実験が施設および国のガイドラインに従って実施されたことを確認します。本研究では、確立されたNIH Swissマウス胚線維芽細胞株（NIH/3T3）およびmCol1a1p-mCherryレポーターシステムのみを使用し、脊椎動物、胚、またはヒト被験者を一切含んでいないため、本論文に記載された手順について機関審査委員会の倫理的承認は不要でした。

組換えアデノウイルスベクターを用いたすべての手順は、機関のバイオセーフティ規制および標準的なバイオセーフティレベル2（BSL-2）の実務に従って実施されました。ウイルスの取り扱い、導入、保存、および廃棄物処理は、認定済みの生物安全キャビネットおよび適切な個人用保護具を使用して行われました。アデノウイルス物質を含む液体廃棄物は、廃棄前に調製直後の漂白剤溶液を用いて除染し、汚染された消耗品は機関のバイオセーフティプロトコルに従ってオートクレーブ滅菌しました。偶発的な流出が発生した場合は、機関の流出対応手順に従い、承認された抗ウイルス剤を用いて直ちに消毒しました。

1. 実験ワークフローの概要

  1. ステップ2に記載に従い、マウスCol1a1プロモーター駆動型組み換えアデノウイルスを作製する。
  2. ステップ3に記載に従い、NIH/3T3線維芽細胞におけるウイルス導入条件を最適化する。
  3. ステップ4に記載に従い、TGF-β応答性in vitro線維化リポーターモデルを構築する。
  4. ステップ4に記載に従い、時間および濃度依存的なTGF-β刺激を用いて、モデルの安定性、特異性、および生物学的再現性を検証する。
  5. ステップ5に記載に従い、SB431542を用いて薬理学的阻害を行う。
  6. ステップ5に記載に従い、ダウンストリームの酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）および定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析を行う。
    注：実験ワークフローの概略については、図1Aを参照すること。実験器具および試薬については、材料表を参照すること。

mCol1a1p-mCherryアデノウイルスレポーター図解。PCR、プラスミドクローニング、線維芽細胞スクリーニングプロセス。
図1mの確立およびバリデーションのワークフローCol1a1p-mCherry 線維芽細胞におけるアデノウイルスレポーターシステム (Aアデノウイルス（AdV）mの構築に関する概略図Col1a1p-mCherry レポーターシステムと、NIH/3T3線維芽細胞におけるモデル検証のための実験ワークフロー。このワークフローには、プロモーターのクローニング、組換えアデノウイルスの構築、HEK293細胞でのウイルスパッケージング、感染多重度（MOI）の最適化、およびその後のハイコンテント蛍光スクリーニングが含まれる。BAd-mに感染させたNIH/3T3線維芽細胞の代表的な蛍光画像Col1a1p-mCherry MOI 0、1、10、100、および10のアデノウイルス。核をHoechst 342（青）で染色し、 mCherry 蛍光（赤）は〜を示す Col1a1 プロモーター活性。蛍光強度はハイコンテントイメージングを用いて定量し、核数で標準化した。その後の一連の実験では、形態学的変化を最小限に抑えつつ、堅牢かつ均一なリポーター発現が得られたことから、MOIを10とした。スケールバー＝ 200 µmこの図は、BioRender.comの承認済みライセンスを使用して作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. mCol1a1プロモーターアデノウイルスの構築、パッケージング、および増幅

  1. 組換えアデノウイルスベクターの構築
    1. 2354 bpのマウス遺伝子をクローニングする Col1a1 〜の上流にあるプロモーター断片（ゲノム座標：chr1:9482479–94827132；転写開始点［TSS］に対し−271から+83 bp） mCherry レポーター遺伝子をpDC315アデノウイルスシャトルベクターに導入します。
      注：～の完全な配列は Col1a1 プロモーターおよびpDC315-mの詳細Col1a1p-mCherry プラスミドマップは以下に提供されています。 補足ファイル 1 および 補足図1.
    2. BamHIおよびKpnIを用いてpDC315ベクターを線状化する。15～25 bpのホモロジーアームを含むプライマーを用いて、プロモーターインサートを増幅する。
      注：効率化のため、相同組換えベースのシームレスクローニング戦略を使用してください。 in vitro 組み換え
    3. PCRスクリーニングおよびサンガーシーケンシングにより、得られたプラスミドを確認する。
      注：プロモーターとレポーターの接合配列を注意深く確認し、フレームシフトや未熟停止コドンが存在しないことを確実にしてください。
    4. 細胞内Cre媒介再組換えによるAdMaxシステムを用いた組換えアデノウイルスの作製。
      注：pBHGloxΔE1,3Creバックボーンプラスミドは、E1/E3が欠損した非複製性Ad5ゲノムと、シャトルベクター上のloxP部位との部位特異的組換えを促進するCreリコンビナーゼ発現カセットを含有している。
    5. 検証済みpDC315-mを用いてHEK293細胞に共導入するCol1a1p-mCherry シャトルベクターおよびpBHGloxΔE1,3Creアデノウイルスバックボーンプラスミド。
  2. アデノウイルスのパッケージングおよび増幅
    1. HEK293細胞を、10%胎児ウシ血清（FBS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で維持する。継代数の少ない細胞を使用する（<アデノウイルスパッケージング用に（20継代まで）使用します。
    2. トランスフェクションの24時間前に、トランスフェクション時にコンフルエンスが50%–60%になるよう、HEK293細胞を30%–40%のコンフルエンスで播種する。
    3. HEK293細胞に〜を共導入する 5 µg シャトルプラスミドおよび 5 µg Lipofectamine 200 トランスフェクション試薬を用いた pBHGloxΔE1,3Cre ヘルパープラスミド。
      注：DNAと試薬の比率を1:1に維持してください（10 µg 全DNAを 10 µL トランスフェクション試薬）。
    4. トランスフェクションした細胞を以下の条件で培養します。 37°C 5% CO₂条件下で培養し、細胞変性効果（CPE）を毎日観察する。
      注意：初期の細胞変性効果（CPE）が現れるまでに7～14日かかる場合があります。培地が酸性に傾いた（黄色くなった）場合は、細胞を刺激しないように注意しながら、緩やかな半分培地交換を行ってください。
    5. 細胞の円形化や収縮を特徴とする典型的なCPEが観察され、少なくとも50%の細胞が培養面から脱離した時点で、細胞および上清を回収する。
      注：通常、この段階にはトランスフェクション後10〜15日で到達します。
    6. サンプルを−で凍結させ、凍結融解サイクルを3回繰り返します。70°C 30分間行い、～の中で解凍させます。 37°C 恒温水槽
    7. 細胞溶解を促進するため、各解凍ステップの後に懸濁液を30秒間ボルテックスしてください。
      注：～での長時間のインキュベーションを避けてください。 37°C ウイルスの安定性を維持するため、融解時に。
    8. ウイルス溶解液の10倍段階希釈系列を調製します（10−1 10まで−13完全DMEMを用いて。添加する。 90 µL 各ウイルスの希釈液を、96ウェルプレートに播種したHEK293細胞に、希釈段階あたり10ウェルの繰り返しで添加する。
      注：1 × 10以上のウイルス力価9 下流の精製工程に向けた十分な増幅エンドポイントとして、PFU/mLを定義した。
    9. 10 mLの粗ウイルス溶解液を、以下を用いて清澄化します。 0.45 µm 細胞残渣を除去するためのフィルター。
    10. Benzaonaseヌクレアーゼ（10 U/mL）を用いて、精製したライセートを以下の条件で処理します。 37°C 30分間。
    11. 製造元の指示に従い、Adeno-X Virus Purification Kitを用いて組換えアデノウイルスを精製します。
      注：あらかじめ平衡化した精製フィルターにロードする前に、ライセートを1×希釈バッファーで混合してください。フィルターを1×洗浄バッファーで洗浄し、3 mLの1×溶出バッファーを用いて精製ウイルスを溶出させます。
    12. プレートを10日間インキュベートし、光学顕微鏡下で細胞変性効果（CPE）を評価する。特徴的な細胞の円形化および剥離に基づき、CPE陽性を判定する。CPEのスコアリングに基づき、Spearman–Karber法を用いて感染性ウイルス力価を算出する。
      注意：最終的なウイルスストックが、少なくとも1 × 10に達するようにしてください。11 下流アプリケーションのためのPFU/mL。
    13. 精製したアデノウイルスを分注し、ウイルスストックを−で保存する。80°C.
      注：精製したアデノウイルスの分注試料は、−で保存すること。80°C 長期保存に用いる。ウイルスの感染性を維持するため、凍結融解の繰り返しを避けること。

3. 細胞培養およびウイルス感染条件の最適化

  1. 10% FBSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEM/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)を用いて、NIH/3T3線維芽細胞を維持する。
    注：細胞の状態を一定にするため、元のフラスコ内でコンフルエンスが70%～80%に達した継代数3～8回の細胞を使用してください。
  2. NIH/3T3線維芽細胞を、4 × 10^4 cells/wellの密度で384ウェルプレートに播種します。3 1ウェルあたりの細胞数 40 µL 完全培地
  3. 細胞を〜でインキュベートします。 37°C 細胞を接着させ、対数増殖期に移行させるため、5% CO₂条件下で12時間培養する。
    注：細胞分布の不均一およびエッジエフェクトを最小限に抑えるため、インキュベーション前にプレートを室温で20〜30分間静置してください。最も外側のウェルには、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水（PBS）または滅菌水を満たしてください。
  4. 非感染コントロールとともに、1～1,0の感染多重度（MOI）の範囲で、組換えアデノウイルスを細胞に感染させる。
    注：次の方程式を用いて、必要となるアデノウイルスの量（体積）を算出してください。

    ウイルス量算出式 V=N×MOI/T、ウイルス学研究および解析のための数式。
    ここで、Vはアデノウイルスストックの量（mL）、Nはウェルあたりの播種細胞数（4 × 103）、MOIは目的の感染多重度、Tは感染性ウイルス力価（PFU/mL）である。本研究で使用したウイルスストックの感染性力価は1 × 1011 ステップ 2.2.12 に記載の Spearman–Karber 法で決定した PFU/mL。
  5. 添加するウイルスストックの容量が、ウェルの総容量の10%を超えないようにしてください。
    注意：ウイルスストック量を過剰に加えると、培地のpHが変化し、非特異的な細胞毒性が誘発される可能性があります。
  6. ウイルス含有培地を、以下のものに置換します。 40 µL 感染後24時間に、新鮮な完全培地を添加する。
    注：ステップ 3.1 と同様に、10% FBS および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した DMEM/F12 を使用すること。
  7. 低速の自動液体分注機を使用するか、各ウェルの上部の側壁にマルチチャンネルピペットのチップを慎重に当てて、培地交換を行う。
    注意：細胞の脱落を最小限に抑えるため、384ウェルプレートを扱う際は標準的な真空吸引を避けてください。
  8. 可視的かつ均一な結果をもたらす最小のウイルス量として、最適MOIを定義します。 mCherry 非感染のコントロール細胞と同等の細胞形態および核数を維持したまま、蛍光を示した。
    注：Hoechst染色による核数のカウントおよび蛍光イメージングを用いて、レポーターの発現を評価すること。細胞は、円形化や剥離を起こさず、特有の紡錘形形態を維持している必要がある。MOIが高すぎると、基底レベルの（発現を）誘導する可能性がある。 mCherry 細胞ストレス応答を介した活性化。異なるMOIにおける代表的な蛍光結果を以下に示す。 図1B.
  9. 以降のすべての実験に用いる最適化されたMOIを選択する。
    注：本研究では、以降の実験においてMOIを10に設定した。

4. TGF-β刺激を用いたモデル安定性の評価

  1. ステップ3.9で決定した最適MOIである10で、NIH/3T3線維芽細胞に組換えアデノウイルスを感染させる。
  2. TGF-β刺激の12時間前に、0.2% FBS含有DMEM/F12を用いて線維芽細胞を血清飢餓状態にする。
    注：血清飢餓は、細胞を同期させ、Col1a1プロモーターの基底活性を最小限に抑えるために行った。
  3. 0.1% 牛血清アルブミン（BSA）含有4 mM HClを用いて、10 µg/mLの組換えヒトTGF-βストック溶液を調製する。
    注：凍結融解の繰り返しを避けるため、TGF-βストック溶液を小分注し、−80°Cで保存する。
  4. 6つの独立した生物学的反復において、0–40 ng/mLの範囲のTGF-β濃度勾配で細胞を処理する。
    注：0 ng/mLの条件を非刺激コントロール群とした。
  5. 刺激した細胞を37°C、5% CO₂で24、48、または72時間インキュベートする。累積的な光毒性を最小限に抑えるため、各イメージング時間点ごとに別のパラレルプレートを使用する。
  6. イメージングの前に、最終濃度2.5 µg/mLのHoechst 342溶液で細胞を15分間染色する。
    注：10 mg/mLのHoechst 342ストック溶液を滅菌PBSで1:4,0の比率で希釈して染色液を調製する。光退色を最小限に抑えるため、遮光条件下で染色を行う。
  7. 10×ドライ対物レンズを装着したハイコンテンツイメージングシステムを用いて、蛍光画像を取得する。
  8. 各実験条件について、384ウェルプレート形式の1ウェルあたり5つの非重複視野を撮影する。
    注：比較可能性を確保するため、すべての実験群で同一のイメージング設定を維持する。ライブセルイメージング中は、自動レーザーオートフォーカスを使用し、環境制御条件を37°C、5% CO₂に維持する。
  9. 561 nmの励起光、Bandpass 60/52 (BP600/52) 透過フィルター、および20 msの露光時間を用いて、mCherry蛍光画像を取得する。
  10. 405 nmの励起光、BP45/45 透過フィルター、および30 msの露光時間を用いて、Hoechst蛍光画像を取得する。
    注：カメラゲインを1.0に設定し、線形な蛍光検出を維持し空間分解能を最大化するため、1 × 1ビニングを用いてすべての画像をフル解像度で取得する。
  11. CellPathfinder画像解析ソフトウェアを用いて、取得した画像を解析する。
  12. 参照核径を20 µm、面積範囲を20–40 µm2として、Hoechstチャンネル内の核をプライマリオブジェクトとして識別する。
  13. 参照細胞径を60 µmとして、核の境界から拡張させることで、mCherryチャンネル内の細胞質関心領域（ROI）を定義する。
    注：セグメンテーション中に「Exclude Edge」フィルターを適用し、画像端に接している不完全な細胞を除去する。
  14. 識別された各細胞の平均蛍光強度を算出し、撮影した5つの全視野から1ウェルあたりの平均蛍光強度を決定する。

5. ELISAおよび定量リアルタイムPCRを用いたモデル信頼性の検証

  1. ステップ3.9に記載されている通り、最適化された10のMOIで、再組用アデノウイルスをNIH/3T3線維芽細胞に感染させる。
  2. TGF-β刺激の30～60分前に、SB431542で細胞を前処理する。
    注：20 mMのSB431542ストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO）で調製し、分注して−で保存する。20°C.
  3. 細胞を10 ng/mLのTGF-βおよび最終濃度1、5、10、および...のSB431542で処理する。 15 µMSB431542処理を行わず、0.1% (v/v) DMSOを含むビークルコントロール群を含める。
    注：すべての処理群において、最終DMSO濃度を0.1% (v/v) に維持してください。
  4. 2段階希釈法を用いて、TGF-β作動液を調製します。
    注：～を希釈してください。 100 µg/mL TGF-βストック溶液（0.1% BSA含有4 mM HClで調製）を、滅菌PBSで1:10に希釈した後、さらに完全培地で希釈して最終的に10 ng/mLの作動濃度とする。
  5. 処理した細胞を6ウェルプレートに入れ、24時間、以下の条件でインキュベートする。 37°C 5% CO₂条件下で。
  6. ELISA解析のため、各ウェルから2 mLの培養上清を回収する。
  7. 回収した上清を1,0 × gで5分間遠心分離し、 4°C 細胞残渣を除去するために。
  8. 清澄化した上清を分注し、−で保存する。80°C ELISA分析まで。
    注：清澄化した上清は－で保存可能です。80°C ELISA分析の前。
  9. 上清を除去した後、接着細胞を氷冷PBSで穏やかに洗浄する。
  10. 各ウェルにTRIzol試薬を1 mL直接加え、細胞を溶解させる。
    注：サンプルをマイクロ遠心チューブに移す前に、ライセートを数回ピペッティングし、完全に均質化してください。RNAライセートは−で保存可能です。80°C RNA抽出の前。
  11. 逆転写定量PCR（RT-qPCR）分析のため、溶解物から全RNAを抽出する。
  12. 以下を用いて逆転写を行う。 1 µg 全RNA
    注：以下の反応条件で逆転写反応を行ってください。 25°C 10分間、 42°C 15分間、そして 85°C 2分間。
  13. PerfectStart Green qPCR SuperMixを用いて定量PCRを行う。各反応液を最終容量として以下で調製する。 20 µL 含有する 5 µL 相補的DNA（cDNA）テンプレート
  14. 以下のサイクリング条件を用いてqPCR反応を行います。初期変性は 94°C 30秒間行い、続いて40サイクル、 94°C 5秒間、 60°C 15秒間行い、 72°C 10秒間。
    注：増幅後、産物の特異性を確認するために融解曲線分析を行ってください。
  15. 正規化 Col1a1 内部標準として18S rRNAに対する遺伝子発現量。
    注：すべてのプライマー配列は以下に記載されています。 補足表1.
  16. 製造元の指示に従い、ELISAを用いて精製した上清中の分泌コラーゲンIタンパク質レベルを定量する。マウスI型コラーゲンELISAアッセイの標準曲線の範囲は0.78〜50 ng/mLであり、アッセイの検出感度は0.37 ng/mLである。
  17. すべての標準試料および検体をテクニカルデュプリケート（技術的反復）で分析し、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmにおける光学密度（OD）を測定する。
    注：分泌物のアッセイ感度を最大化するため、希釈していない精製上清を使用してください。 Col1a1 検出

結果

mCol1a1p-mCherry組換えアデノウイルスの構築およびパッケージングの概略図をFigure 1Aに示す。マウスCol1a1プロモーターをmCherryレポーター遺伝子上流にクローニングしてアデノウイルスベクターに組み込み、次にHEK293細胞を用いてウイルスのパッケージングおよび増幅を行った。このワークフローは、ウイルス感染、線維化刺激、薬理学的介入、および蛍光ベースのシグナル読み出しを含む主要な実験ステップを示している。この概略図は、レポーターシステムの導入に関する視覚的な枠組みを提供し、その後の機能検証実験の解釈を裏付けるものである。

最適なウイルス感染条件を決定するため、NIH/3T3線維芽細胞にmCol1a1p-mCherryアデノウイルスをさまざまなMOIで感染させた。図1Bに示すように、MOIの上昇に伴いmCherryの蛍光強度が増加した。低MOIでは、レポーターの発現が弱く不均一であり、定量分析には不適切な条件であった。高MOIでは、細胞の丸まりや剥離を含む形態の変化が見られ、細胞毒性の影響が示唆された。MOI 10では、細胞形態を維持したまま強力で均一な蛍光が得られたため、これを以降の実験における最適条件として採用した。

最適化したMOIにおいて、NIH/3T3線維芽細胞を濃度の異なるTGF-βで刺激した。刺激後24、48、および72時間でレポーターの蛍光を測定した。図2A–Cに示すように、すべてのタイムポイントにおいて、mCherryの蛍光強度は濃度依存的に増加した。信号強度は24～72時間にわたって漸増しており、時間依存的な応答が示された。これらの結果はポジティブな結果であり、本レポーターシステムが線維化刺激に対して経時的かつ再現性高く応答することを示している。

mCherryの細胞内強度に対するTGF-βの影響を示す蛍光顕微鏡画像および棒グラフによる結果。
図 2mの時間および用量依存的な活性化Col1a1p-mCherry 変換成長因子ベータ（TGF-β）刺激によるレポーター。 Ad-mに感染させたNIH/3T3線維芽細胞Col1a1p-mCherry 最適化したMOIでアデノウイルスを感染させた後、濃度の異なるTGF-βで刺激した。代表的な蛍光画像および、それに対応する定量解析結果を以下に示す。 mCherry レポーター活性を24時間後に示します（A)、48時間（B）、および72時間（C刺激後。 mCherry 蛍光（赤色）は、〜を反映している Col1a1 プロモーター活性を測定し、核をHoechst 342（青）で対比染色した。蛍光強度はハイコンテンツイメージングを用いて定量し、核数で標準化した。データは、条件ごとに6つの独立した生物学的反復試行から得られた平均値 ± 標準誤差（SEM）として提示している。統計学的比較は、一元配置分散分析（ANOVA）およびそれに続くTukeyの多重比較検定を用い、未処理のコントロール群に対して行った。イメージングパラメータは、すべての実験条件で一定に維持した。スケールバー = 200 µm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

パスウェイの特異性を評価するため、TGF-β刺激下でNIH/3T3線維芽細胞をTGF-β type I 受容体（ALK5）阻害剤であるSB431542で処理しました。図3A–Cに示されるように、SB431542は用量依存的にmCherryの蛍光強度を低下させました。レポーター活性の抑制は、検討したすべての時間点において観察され、阻害剤の濃度が高くなるほど抑制効果が強くなりました。これらの結果は肯定的な結果であり、レポーターの活性化がTGF-βシグナリングに依存しており、薬理学的に調節可能であることを示しています。

蛍光顕微鏡、mCherry、Hoechst、24-72時間 TGF-β+SB43アッセイ、強度分析、グラフ
図3SB431542は、TGF-βにより誘導されるm...の活性化を抑制する。Col1a1p-mCherry 時間および用量依存的にレポーターを（発現/活性化させた）。 Ad-mに感染させたNIH/3T3線維芽細胞Col1a1p-mCherry アデノウイルスを、TGF-β（10 ng/mL）および濃度を増して加えたTGF-βタイプI受容体（ALK5）阻害剤SB431542（0、1、5、10、および 15 µM（図のパネルではSB43と略記）。代表的な蛍光画像および対応する定量分析結果を24時間後に示します（A）、48時間（B）、および72時間（C）処理後。 mCherry 蛍光（赤）が反映している Col1a1 プロモーター活性を測定し、核をHoechst 342（青色）で対比染色した。蛍光強度はハイコンテンツイメージングを用いて定量化し、核数で標準化した。データは、条件あたり6つの独立した生物学的反復試行の平均値 ± 標準誤差（SEM）として的に提示している。統計学的比較は、TGF-β処理群を対照として、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびそれに続くTukeyの多重比較検定を用いて行った。イメージングパラメータは、すべての実験条件で一定に維持した。スケールバー = 200 µm. こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

レポーター活性が内因性の線維化応答を反映しているかを確認するため、最適化した感染、刺激、および阻害条件下でNIH/3T3線維芽細胞を解析した。レポーターシステムのバリデーションに使用した実験ワークフローを図4Aにまとめている。線維化関連マーカーをタンパク質およびmRNAレベルで測定した。図4B–Cに示すように、ELISAにより、TGF-β刺激後に線維化関連タンパク質の分泌が増加し、SB431542処理によってそれが減少することが示された。同様に、RT-qPCRでは、Col1a1を含む線維化関連遺伝子の発現に相応の変化が認められた。蛍光読み取り値、タンパク質分泌、および遺伝子発現の一致は、ポジティブなバリデーション結果であり、本レポーターシステムがこれらの条件下で線維化活性化を反映していることを示している。

モデル検証のための実験ワークフロー。ELISA、Col1a1 mRNAのRT-qPCR解析、コラーゲン分泌。
図4mのバリデーションCol1a1p-mCherry 逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）および酵素結合免疫吸着法（ELISA）によるレポーターシステム。 (Aレポーターシステムの検証における実験ワークフローの概略図。NIH/3T3線維芽細胞をTGF-β（10 ng/mL）で刺激し、TGF-β受容体阻害剤SB431542（SB43）を濃度を上げて処置した。下流解析のため、細胞溶解液および培養上清を回収した。B) の定量分析 Col1a1 SB431542の濃度勾配条件下でのTGF-β刺激下におけるRT-qPCRによるメッセンジャーRNA（mRNA）発現量の決定。相対的 Col1a1 mRNA発現レベルは18SリボソームRNA（18S rRNA）で標準化し、未処理の対照群に対する相対的な倍数変化（fold change）として的に示した。C) パネルBと同じ実験条件下で、ELISAを用いて細胞培養上清中の分泌型I型コラーゲン量を定量した。I型コラーゲン濃度はng/mLで表示している。データは、条件ごとの6つの独立した生物学的反復試行の平均値 ± 標準誤差（SEM）として示した。統計的比較は、TGF-β処理群を対照として、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびそれに続くTukeyの多重比較検定を用いて行った。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1. アデノウイルス・リポーターベクターの構築に使用したマウス Col1a1 プロモーター断片の完全な塩基配列。 2354 bpのプロモーター領域は、ゲノム座標chr1:9482479–94827132 (NC_07.7) に対応し、TSSに対して−271から+83 bpにわたる。このプロモーター断片を、組換えアデノウイルス・リポーターシステムの構築のため、シャトルベクターpDC315の mCherry リポーター遺伝子の上流にクローニングした。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表 S1. RT-qPCR解析に使用したプライマー配列。 Col1a1および内部参照遺伝子である18S rRNAのフォワードおよびリバースプライマー配列を5′–3′方向で記載している。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図 S1. pDC315-mCol1a1p-mCherry アデノウイルスシャトルベクターのプラスミドマップ。 再組換えアデノウイルスレポーター構築物を生成するため、相同組換えベースのシームレスクローニング戦略を用いて、2354 bp のマウス Col1a1 プロモーター断片を mCherry レポーター遺伝子上流に挿入した。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

心筋線維化は心不全の進行に寄与しますが、効果的な抗線維化療法の開発は、縦断的なスクリーニングプラットフォームの不足によって制限されています2,13。ウェスタンブロッティング、RT-qPCR、免疫蛍光染色などの抗線維化有効性を評価する従来の手法は、細胞の溶解または固定を必要とするエンドポイント測定に依存しています。これらのアプローチでは、生存細胞における線維化進行のリアルタイムモニタリングができず、縦断的な解析やハイスループット解析への適用が制限されます。さらに、プラスミド転写やレンチウイルス統合による安定したレポーター細胞株の作製は、線維芽細胞における低い転写効率、ランダムなゲノム統合に伴う変動、および継代に伴うレポーター発現の漸次的なサイレンシングによって制限されることが多くあります15。

NIH/3T3線維芽細胞への遺伝子導入にはレンチウイルスベクターが頻繁に用いられますが、本研究では線維芽細胞の生理学的忠実性を維持するため、特にアデノウイルスリポーターシステムを利用しました。レンチウイルスは宿主ゲノムに恒久的に組み込まれるため、挿入変異誘発のリスクが内在しており、TGF-β誘発性の線維化のような複雑なカスケードを評価する際には、内在性のシグナル伝達ネットワークを不注意に破壊してしまう懸念があります。対照的に、アデノウイルスベクターはエピソームとして存在するため、ゲノムの完全性が保証されます。さらに、安定したレンチウイルス細胞株に必要とされる長期的な抗生物質選択を回避することで、治療誘発性の表現型シフトを防ぎ、ハイスループットスクリーニングに適した迅速かつ強力で非常に効率的な一過性発現が可能となります。

これらの技術的な制限に対処するため、mCol1a1プロモーター駆動型mCherryアデノウイルスレポーターシステムは、線維芽細胞の活性化をin vitroでモニタリングする方法を提供します。このシステムは、アデノウイルスによる導入と、線維芽細胞の活性化およびECM沈着に関連する転写マーカーであるマウスCol1a1プロモーターを組み合わせたものです16。Col1a1プロモーター活性を蛍光レポーターに結合させることで、生存細胞における線維化の転写応答の可視化と定量化が可能になります。レポーターの蛍光は、複数のタイムポイントにおけるTGF-β刺激後に増加し、線維芽細胞活性化の経時的な進行を反映します。ALK5阻害剤であるSB431542によるレポーター活性の抑制は、パスウェイ依存的な制御を示しています。RT-qPCRおよびELISAで測定した、レポーター蛍光と内因性の線維化関連遺伝子およびタンパク質発現との相関は、これらの条件下で線維化応答をモニタリングするための本手法の有用性を支持しています。

近年の研究では、薬剤スクリーニングやターゲット探索のために、iPSC由来心臓細胞とCRISPR-Cas9ベースの遺伝的摂動を組み合わせて利用しています11,13。例えば、CRISPRを用いて構築された蛍光リポーターiPSC由来心臓線維芽細胞が、大規模な化合物スクリーニングアプローチに適用されています11,17。これらの手法は高い遺伝的精度を提供しますが、分化に長い時間を要すること、技術的な複雑さ、バッチ間の変動、および実験コストの増加が伴います13,18。対照的に、本稿で述べるアデノウイルスリポータープラットフォームは、ゲノム編集や長期の細胞分化を必要とせず、より迅速な導入を可能にします。これらのアプローチは相補的に使用することができ、mCol1a1p-mCherryリポーターシステムを初期スクリーニングツールとして利用し、その後の検証にiPSCベースのモデルを適用することが可能です11。

ここで述べるmCol1a1p-mCherryレポーターシステムは、線維芽細胞ベースのモデルを用いて、代謝調節剤や天然物を含む候補化合物をスクリーニングする方法を提供します。本プロトコルの再現性を確保するためには、いくつかの重要なステップとトラブルシューティングへの配慮が必要です。第一に、アデノウイルス調製物の純度が不可欠です。精製されていないウイルス溶解物を使用すると、宿主細胞の残渣や細胞毒性成分が混入し、NIH/3T3線維芽細胞に非特異的な影響を与え、レポーターの読み取り結果を混乱させる可能性があります。さらに、後続のスクリーニングへの適用において厳格な再現性とバッチ間の整合性を確保するため、すべてのウイルス調製物は標準化された精製を行い、エンドポイント希釈法によって厳密に定量しました。体積量ではなく、機能的なウイルス力価（PFU/mL）に基づいた正確に定義された感染多重度（MOI）を適用することで、バッチ間の変動を解消し、これによりすべての独立した実験ランにおいてレポーター応答を標準化することに成功しました。第二に、このMOIの最適化において、ウイルス接種液の量が全培養液量の10%を超えないようにすることが重要です。ウイルスバッファーが過剰になると、培地のpHや浸透圧が変化し、TGF-β刺激とは無関係に細胞ストレス応答を誘発する可能性があります。

さらに、ハイコンテントイメージング用の384ウェルプレートの取り扱いには技術的な課題があります。NIH/3T3線維芽細胞は、培地交換や洗浄ステップの際に剥がれやすい傾向があります。分注速度を低く設定した自動液体分注機の使用や、ピペットチップをウェルの側壁に沿わせて角度をつけるなどの穏やかな液操作により、細胞の脱落を抑えることができます。Col1a1プロモーターの基底活性を最小限に抑え、S/N比を向上させるには、TGF-β刺激の前に12–24 hの血清飢餓処置を行うことが有効です。複数のタイムポイント（例：24, 48, 72 h）にわたる連続的なライブセルイメージングでは、累積的な光毒性や、Hoechst染色の繰り返しによるDNA結合の影響を最小限にするため、露光条件を最適化するか、タイムポイントごとに個別の実験プレートを並行して使用する必要があります19

本手法にはいくつかの限界がある点に留意する必要がある。第一に、本システムは不死化線維芽細胞株に基づいているため、in vivoにおける心線維芽細胞の細胞異質性を完全には再現していない。第二に、レポーターはCol1a1の転写活性化を反映しており、転写後調節や細胞外マトリックスの成熟は捉えていない。今後の改良として、生理学的な妥当性を高めるために、初代心線維芽細胞の使用、共培養システム、または三次元モデルの導入が考えられる。要約すると、本プロトコルでは、線維芽細胞の活性化をモニタリングするためのCol1a1プロモーター駆動型アデノウイルスレポーターシステムについて述べている。本手法は、ウイルス導入、薬理学的調節、および相補的な分子アッセイを統合することで、生細胞における縦断的かつ非破壊的な解析を可能にする。このアプローチは、制御されたin vitro条件下での化合物スクリーニングや、線維化シグナル伝達プロセスの研究に応用できる可能性がある。

開示事項

著者らに開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（H.X.に割り当てられた助成金番号 32371158）および国家重点R&Dプログラム（2023YFA1800902、H.X.へ）、 "天池人材" プログラム、北京大学 血管恒常性とリモデリング国家重点実験室 オープンプロジェクト（202404：R.Z.、202403：Y.M.W.）、北京大学 教育省 新疆地方病および民族病重点実験室 オープンプロジェクト（KF202404：H.X.）。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
384ウェル ガラスボトム マイクロプレートCellvis, USAP384-1.5H-N細胞播種、ウイルス感染、染色、および蛍光イメージングに使用される384ウェル ガラスボトムプレート。
アデノウイルス バックボーンプラスミドMicrobix, CanadapBHGloxΔE1,3Creフルレングス組換えアデノウイルスゲノムの作製に使用されるプラスミド。
アデノウイルス シャトルベクター：pDC315-mCol1a1p-mCherryGeneChem, ChinaカスタムサービスmCherry発現を誘導する2354 bpのマウスCol1a1プロモーターを含む組換えアデノウイルス シャトルベクター。
ベンゾナーゼ ヌクレアーゼMerck Millipore, USA70664-3アデノウイルスの精製時に、混入した核酸を除去するために使用されるエンドヌクレアーゼ。
生物安全キャビネット（クラスII）Esco Lifesciences Group, SingaporeAC2-4S1組換えアデノウイルスの取り扱いおよび無菌的な細胞培養手順に使用される認定生物安全キャビネット。
細胞培養培地（完全DMEM/F12）HyClone, USA12800-017NIH/3T3およびHEK293細胞の維持に使用される完全培地。
CellPathfinder 画像解析ソフトウェアYokogawa Electric Corporation, JapanVersion 3.08.01自動蛍光定量および細胞セグメンテーションに使用される画像解析ソフトウェア。
CellVoyager CV8000 ハイコンテンツスクリーニングシステムYokogawa Electric Corporation, JapanCV8000mCherryおよびHoechstの蛍光取得に使用されるハイコンテンツイメージングシステム。
CO2 細胞培養インキュベーターThermo Fisher Scientific, USA3111哺乳類細胞培養用に、37 °C、5% CO2に維持された加湿インキュベーター。
ジメチルスルホキシド (DMSO)Sigma-Aldrich, USAD2650SB431542の調製に使用される溶媒。
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)Servicebio, ChinaG4610NIH/3T3線維芽細胞に使用される基礎培養培地。
胎児ウシ血清 (FBS)Ausbian, AustraliaVS500T完全培地の調製に10% (v/v) で使用される血清サプリメント。
Hoechst 33342 蛍光染色剤Invitrogen, USAH3570蛍光イメージングおよび核数の正規化に使用される核染色剤。
HEK293細胞ATCC, USACRL-1573アデノウイルスの産生および増幅に使用されるパッケージング細胞株。
ヒト組換え TGF-β1MedChemExpress, ChinaHY-P78214NIH/3T3線維芽細胞において線維化活性を誘導するために使用されるサイトカイン。
画像取得ソフトウェアYokogawa Electric Corporation, JapanVersion 3.08.01.03自動蛍光画像取得および顕微鏡制御に使用されるソフトウェア。
脂質ベースのトランスフェクション試薬Invitrogen, USA11668-019HEK293細胞へのアデノウイルスプラスミド導入に使用されるトランスフェクション試薬。
マイクロセントリフュージチューブAxygen, USAMCT-150-CRNAライセートの保存およびサンプル処理に使用されるチューブ。
マイクロプレートリーダーTecan, SwitzerlandSparkELISA吸光度測定に使用されるマルチモードマイクロプレートリーダー。
マウス Type I コラーゲン ELISA キットMeike Biotechnology, ChinaMK6778A培養上清中の分泌型 Type I コラーゲンを定量するために使用されるELISAキット。
NIH/3T3 マウス線維芽細胞Procell Life Science, ChinaCL-0171レポーターモデルの構築および検証に使用されるマウス線維芽細胞株。
PacI 制限酵素New England Biolabs, USAR0547Sアデノウイルスプラスミドの直線化に使用される制限酵素。
ペニシリン–ストレプトマイシン溶液Gibco, USA15140-122細菌汚染を防止するために1% (v/v) で添加される抗生物質溶液。
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen Biotech, ChinaAQ602定量PCR分析に使用されるSYBR GreenベースのqPCRマスターミックス。
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Servicebio, ChinaG4202細胞の洗浄および試薬調製に使用される緩衝液。
pDC315-EGFP シャトルベクターGeneChem, ChinaN/Aレポータープラスミド構築に使用される親アデノウイルス シャトルベクター。
qPCR システムApplied Biosystems, USAQuantStudio 5定量的遺伝子発現解析に使用されるリアルタイムPCRシステム。
制限酵素 (BamHI および KpnI)Abclonal, ChinaRK21101, RK21104シャトルベクターの直線化に使用される制限酵素。
逆転写キットTransGen Biotech, ChinaAT311RT-qPCR前のcDNA合成に使用される逆転写キット。
RNA溶解試薬Invitrogen, USA15596026培養細胞から全RNAを抽出するために使用される試薬。
SB431542MedChemExpress, China301836-41-9薬理学的抑制実験に使用される TGF-β type I 受容体阻害剤。
サンガーシーケンシングサービス／試薬Shanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., Chinaカスタムサービスプラスミド配列の確認に使用されるシーケンシングサービス／試薬。
セロロジカルピペットCorning, USA4488細胞培養手順中の液体操作に使用される滅菌ピペット。
T30 サーマルサイクラーLongGene Scientific Instruments, ChinaT30逆転写およびPCR増幅に使用されるサーマルサイクラー。
トリプシン-EDTA溶液Gibco, USA25200-056日常的な細胞継代に使用される細胞解離試薬。
ウイルス精製キットTakara Bio USA631533組換えアデノウイルスの精製に使用されるキット。
ウォーターバスShanghai Yiheng Scientific Instruments, ChinaHWS-12アデノウイルスの凍結–融解サイクル中に使用される温度制御ウォーターバス。

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