ネットワーク薬理学、分子ドッキング、細胞実験検証を通じた四近人の腎細胞癌に対する機構のスクリーニング

サマリー

本研究は、多方法解析と in vitro 検証を通じてRCCに対するシコニンの主要な標的および経路を特定し、さらなる機構的研究の枠組みを提供しました。

要約

腎細胞癌(RCC)は尿路系で最も一般的な腫瘍の一つであり、最も高い死亡率を誇ります。過去の研究では、シコニンが腎細胞癌を治療できることが示されていますが、そのメカニズムはまだ明確ではありません。したがって、本研究はネットワーク薬理学、分子ドッキング、細胞増殖、移動、アポトーシスを含むin vitro機能的アッセイを用いて、腎細胞癌治療におけるシコニンのメカニズムをウェスタンブロット(WB)で検証することを目指しました。四子ニン標的はPharmMapper、SwissTargetPrediction、その他のデータベースを用いてスクリーニングされ、オンラインメンデル遺伝の人間(OMIM)、GeneCards、その他のデータベースからRCC関連標的を特定しました。潜在的な治療対象は交差解析によって得られました。タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを構築し、Cytoscapeを用いてコアターゲットをスクリーニングし、分子ドッキングを用いてシコニンと主要ターゲット間の結合親和性を解析しました。合計374のシコニン標的と1,087のRCC関連標的を収集し、98の重複標的遺伝子が同定されました。6つのコアターゲット(SRC、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PTPN11、PIK3R1)が同定されました。Gene Ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の解析により、シコニンは主にタンパク質キナーゼ活性、HIF-1、IL-17シグナル伝達経路の調節を通じて抗RCC効果を発揮することが示されました。分子ドッキングにより、シコニンはこれらのコアターゲットと強い結合親和性を持つことが確認されました。ヒトRCCカキ-1および786-O細胞を用いたin vitro研究では、シコニンが細胞増殖と移動を線量依存的に有意に抑制し、細胞アポトーシスを促進し、カスパーゼ3およびカスパーゼ8活性をアップ調節することが示されました。ウエスタンブロット実験では、シコニンがコアターゲットタンパク質の発現を調節し、HIF-1シグナル伝達経路を抑制することがさらに確認されました。本研究は、腎細胞癌に対するシコニンの薬理学的メカニズムを体系的に明らかにし、シコニンを新規の抗RCC薬剤として開発・応用するための理論的基盤を提供します。

概要

腎細胞癌(RCC)は尿路系で最も一般的な悪性腫瘍であり、世界中の腎悪性腫瘍の約90%、成人悪性腫瘍の約2%〜3%を占めています。GLOBOCAN 2022のデータによると、2022年の世界で腎細胞癌の新規症例は約434,800件、死亡者数は155,953人で、RCCの発生率と死亡率は継続的に上昇傾向を示しています。アメリカがん協会は、2025年だけで米国内で腎細胞癌の新規症例が80,980件、死亡者が14,510人と推定されています。腎細胞癌は尿路系悪性腫瘍の中で最も死亡率が高く、転移性または薬剤耐性のRCC患者は依然として予後が悪いです。標的治療と免疫療法の広範な応用により、RCCの臨床治療において顕著な進展が見られました。進行性または転移性腎細胞癌の第一選択の標準治療は、主に免疫チェックポイント阻害薬の併用レジメン、または免疫チェックポイント阻害薬と抗血管新生性チロシンキナーゼ阻害剤を組み合わせたレジメンを採用します。治療法の継続的な進歩にもかかわらず、多くの患者が依然として病気の進行、薬剤耐性、治療不耐症を経験しています。したがって、明確なメカニズム、安全性、有効性を持つ新規抗RCC薬の開発は依然として^{緊急の臨床}的ニーズです^1,2,3。

四こ닌はラディックス・アルネビアから抽出される主要なバイオアクティブ成分であり、その誘導体アセチルシコニンは顕著な抗RCC薬理学的効果を示しています。既存の証拠は、シコニンが多標的および多経路の調節機構を通じて抗RCC活性を発揮することが示されています。機構的には、シコニンは腫瘍抑制遺伝子TEKの発現をアップレギュレートし、AKT/mTORシグナル伝達カスケードのリン酸化を抑制することで、RCC細胞の増殖、移動、侵入を抑制します^。さらに、シコニンは細胞内活性酸素種(ROS)の蓄積を誘導し、ミトコンドリア機能障害を引き起こし、RCC^{細胞における}アポトーシス、ネクロプトーシス、オートファジーなどの多重プログラム細胞死パターンを開始します。また、miR-15bやmiR-99bなどのマイクロRNAの発現を調節し、MAPK/ERK経路を通じてFOXO1やPDCD4を含むアポトーシス関連標的遺伝子を調節し、これらの調節効果は明らかな細胞株特異性を示します⁶。特に、シコニンはスニチニブ耐性RCC細胞株に対して強力な抗腫瘍活性を保持し、ネクロソーム複合体の活性化、AKT/mTOR経路の阻害、G2/M細胞周期停止の誘導により治療効果を発揮^します。シコニンの抗RCC効果は既存の実験研究によって部分的に検証されていますが、主要な治療標的、主要なシグナル伝達ネットワーク、そしてシコニンのRCCに対する分子調節メカニズムは依然として不明です。さらに、ハブターゲットの体系的な予測、分子検証、実験的確認が依然として不足しており、現在の研究における重要な空白を生んでいます。

ネットワーク薬理学と分子ドッキングは、現代の自然薬研究や薬理学的メカニズム探求において補完的な技術的アプローチとして機能します。系統的な観点から、ネットワーク薬理学は生物活性化合物と疾患関連標的間の多標的・多経路的全体的な相互作用特性を体系的に解読できます。これに対し、分子ドッキングは小分子化合物とコアターゲットタンパク質間の結合親和性および安定した相互作用パターンの分子レベルでの検証を可能にします。これら二つの手法の組み合わせにより、全体的なターゲット予測と分子検証の体系的なクローズドループ研究を構築します。実験的検証とネットワーク薬理学および分子ドッキングを組み合わせることは、自然薬研究における主流のアプローチであり、疾患の病因の明確化や化合物薬理学的メカニズムの解明を促進し、基礎研究や薬剤のトランスレーショナル応用のための理論的枠組み^{を提供します。}

本研究では、腎細胞癌治療におけるシコニンの候補標的を予測するためにネットワーク薬理学を応用しました。分子ドッキングを用いて理論的に潜在的標的を検証し、主要な作用標的は最終的に in vitro 実験で決定され、さらにWestern Blot(WB)実験で確認されました。この研究の全過程は 図1に示されています。

プロトコル

本研究で使用されたすべてのヒト細胞株は認証済みの商業細胞バンクから購入され、新しいヒト組織や患者サンプルは採取されませんでした。したがって、この in vitro 細胞ベースの研究には倫理的承認は必要ありませんでした。

シコニンターゲットの取得と予測
キーワード「shikonin」はPubChemデータベースで検索されました。シコニンのSDF構造をダウンロードし、その簡略分子入力行記法(SMILES)を得ました。各ターゲットデータベースの要件に従い、潜在的なシコニンターゲットは2026年3月3日^10、11、12日にPharmMapper、SwissTargetPrediction、HERB、SEAサーチサーバーのデータベースから予測・収集されました。

腎細胞癌標的の取得
腎細胞癌をキーワードにし、ヒト由来の疾患標的を治療標的データベース(TTD)、OMIM、GeneCardsから取得し、種はホモ・サピエンスに限定され、関連スコアは50>。当初は合計1148標的が取得され、要約と複化を経て最終的に1087の独自の腎細胞癌関連標的(^13、14、15)を獲得しました。

腎細胞癌治療におけるシコニンの交差標的の同定
シコニンおよび腎細胞癌標的の予測遺伝子標的は、オンライン解析ツールであるVenny 2.1に入力されました。重なり合うターゲットは交差解析によって特定され、ベン図で可視化されました。

構成要素-標的-疾患ネットワークの確立
四近人を研究の核となる出発点として、これらのコアターゲットとRCC間の生理学的関連情報を統合し、Cytoscape可視化ソフトウェアを用いて「成分-標的-疾患」三元系の分子相互作用ネットワークを構築しました。

腎細胞癌治療におけるシコニンのタンパク質相互作用ネットワーク構築およびコア標的獲得
タンパク質相互作用データベースSTRINGは、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを構築するためのコアツールであり、タンパク質間の相互作用関係のマイニングと可視化を可能にします。本研究では、シコニンがんと腎細胞癌の重複標的をSTRINGデータベースに提出し、種はホモ・サピエンスに設定されてさらなる検索を行いました。続行ボタンをクリックして、その後の分析をしてください。分析結果ページ下部の設定モジュールでは、最低必要相互作用スコアが信頼レベル0.900に設定されていました。同時に、ネットワーク内の無関係なタンパク質や切り離されたノードは隠され、最適化されたPPIネットワークの相互マッピングが得られました。データはTSV形式で保存され、Cytoscapeソフトウェアにインポートされました。対応するパラメータはノードサイズと色陰が対応する値を反映するように調整され、エッジの太さはバインディングレートスコアを反映しています。PPIネットワークマップは^16、17日に確立されました。

上記のPPIネットワークに基づき、コアターゲットは正確にスクリーニングされました。CytoHubbaプラグインはCytoscapeの Apps モジュールで開かれ、 計算 ボタンをクリックすると計算プログラムが始まりました。 MCCアルゴリズム はオプションごとにランク付けされたトップ6ノードから選ばれ、計算を完了するために 送信 ボタンをクリックして行いました。上位6つのコアターゲットは美化とデータダウンロードのために選別されました。

腎細胞癌治療におけるシコニンのGO濃縮解析およびKEGG経路解析
MetascapeデータベースはGO濃縮解析に使用されました。本研究では、シコニン標的と腎細胞癌の交差点をデータベースに取り込みました。まず、選択した種はホモ・サピエンス(人間)で、その後カスタム分析モードが選ばれました。GO機能的濃縮分析は、分子機能、細胞成分、生物学的プロセスの3つの次元について実施されました。p値カットオフは0.01に設定され、濃縮分析ボタンをクリックしてマイクロクレジットプラットフォームを用いた分析を行い、腎細胞癌治療におけるシコニンのGO濃縮解析可視化を構築しました^18,19。

KOBAS 3.0データベースを用いて、シコニンがんと腎細胞癌の重なり標的に対するKEGGシグナル伝達経路濃縮解析を行い、このデータベースは遺伝子の経路注釈および濃縮統計解析を実現しています。遮蔽された交差点標的はKOBAS 3.0データベースにインポートされました。選択された種の供給源はH. sapiens(ヒト)で、スクリーニングタイプはKEGGシグナル伝達経路に限定され、濃縮解析のp値閾値は<0.01に設定されました。解析の結果、KEGG経路の濃縮結果が得られました。濃縮解析結果に基づき、p値を選別の基準として用い、上位10のKEGGシグナル経路をスクリーニングしました。可視化処理はマイクロシグナリングプラットフォームの助けを借りて完了し、最終的にKEGGの濃縮サンキー図バブルチャートが作成され、^20,21を保存しました。

分子ドッキング検証
四近人の三次元(3D)構造はPubChemデータベースから取得され、Open Babelソフトウェアを用いて標準PDB形式に変換されました。ネットワーク薬理学解析で特定されたコアターゲットの三次元タンパク質構造は、RCSBタンパク質データベースおよびAlphaFoldデータベースからPDB形式でダウンロードされました。標的タンパク質の結晶構造には、PIK3CA(PDB ID: 9B4T)、PIK3CD(PDB ID: 8BCY)、PIK3R1(PDB ID: 7CIO)、PTPN11(PDB ID: 9R16)、SRC(PDB ID: 9NS1)、PIK3CB(AlphaFold予測構造、AF-Q8BTI9-F1-model_v6)が含まれていました。水分子やヘテロアトムは除去され、極性水素が追加され、AutoDockツールを使ってガスタイガー電荷が割り当てられました。AutoDock Toolsソフトウェアを用いて、分子ドッキング用のターゲットタンパク質全体を覆う適切なサイズのドッキングボックスを選択しました。最後に、最適な結合エネルギーを持つターゲット-アクティブ成分ペアの可視化が得られました。PyMolソフトウェアを用いて結合部位、結合相互作用の種類と距離を解析し、三次元立体構造可視画像^22,23の生成に使われました。

細胞毒性検査
Caki-1細胞は96ウェルの培養プレートに1ウェルあたり5,000個の密度で接種され、それぞれ12.5、25、50、100μmol/Lのシコニン濃度で処理され、それぞれ12時間および24時間処理されました。786-O細胞では、同じ濃度勾配で24時間処理のみが行われました。シコニンが両細胞株に及ぼす細胞毒性効果はMTTアッセイを用いて評価されました。すべての実験は生物学的三重化で行われ、各状態に対して3回の技術的再現が行われました。結果はIC₅₀ 値で表されます。両細胞株間で全体的な抑制傾向は一貫していましたが、シコニンはCaki-1細胞に対してより強い細胞傷害を示します。そのため、Caki-1細胞が後続の機能実験に選ばれました。

スクラッチウーンドアッセイによるシコニンのCaki-1細胞移動への影響
対数相のCaki-1細胞と786-O細胞は6ウェルプレートにシードされました。各ウェルの底部には無菌の200μLピペットチップを使って平行なスクラッチラインが作成されました。一晩の付着後、PBSを用いて培養細胞を洗浄しました。細胞は異なる濃度のシコニン(12.5、25、50、100μmol/L)で12時間処理されました。12時間後、同じ部位の引っかき部分の変化を顕微鏡で観察しました。

シコニンがCaki-1細胞の成長活性に与える影響を計算する公式は次の通りです:移動度 = [(0時間のスクラッチ面積 − 12時間のスクラッチ面積)/0時間のスクラッチ面積] × 100%。

Caspase-3およびCaspase-8の活動の決定
対数成長段階のCaki-1細胞を採取し、細胞濃度を5 ×^{10 6} Cells/mLに調整し、その後12時間の培養を行いました。Caki-1細胞は異なる濃度のシコニン(12.5、25、50、100μmol/L)で処理され、24時間培養された後、カスパーゼ検査キットに記載された通り細胞検出が行われました。

シコニンがCaki-1細胞のアポトーシス率に与える影響
対数成長のCaki-1細胞を6ウェル培養プレートにシードしました。対照群不在の状態で、細胞は12.5、25、50、100μmol/Lの濃度でシコニンを24時間処理しました。細胞はPBSに優しく再懸濁され、採取され、カウントされました。合計10個×⁵ 個の再懸濁細胞が300 × gで5分間遠心分離されました。上澄液は廃棄され、細胞ペレットは195μLのAnnexin V-FITC結合バッファーに優しく再懸濁されました。その後、5μLのAnnexin V-FITCを加え、続いて10μLのヨウ化プロピジウム染色液を穏やかに混ぜて加えました。細胞は室温(20–25°C)で暗闇の中、15分間インキュベートされてから分析されました。

細胞シグナル伝達経路解析
Caki-1細胞は12.5、25、50、100μmol/Lのシコニンで処理されました。24時間後、細胞は冷たいPBSで採取され、プロテアーゼ阻害剤を含む細胞溶解バッファーで溶解され、タンパク質濃度を測定しました。タンパク質は10%ドーデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル上で単離されました。PVDF膜への移管後、5%BSAで3時間ブロッキングし、その後4°Cで別の一次抗体と共に一晩培養しました。その後、膜は1:3000の希釈で二次抗体と共にインキュベートされました。タンパク質バンドはECL検出システムで検出され、ImageJソフトウェアを用いて定量的に解析されました。

統計解析
実験結果は平均±標準偏差(x ± s、n = 3)として提示されました。パラメトリック統計解析以前は、正規性はシャピロ・ウィルク検定で検証され、分散の均質性はレヴェーン検定で評価されていました。分散の一方向解析(ANOVA)とTukeyの事後検定を組み合わせて、SPSSソフトウェアを用いて実施しました。統計グラフはGraphPad Prismソフトウェアで作成されました。独立標本t検定はグループ間のペア対比較に用いられ、p < 0.05は統計的に有意な差を示しました。

結果

シコニンターゲットの取得と予測
前述の4つのデータベースを用いて、潜在的なシコニンターゲットを予測し、統合と要約を経て426のターゲットを特定しました。まとめられた目標は重複除去され、 図2Aに示されるように374の目標が実現しました。

腎細胞癌標的の取得
3つのデータベースに関連するデータをまとめて合計1,147件のターゲットを獲得し、合計1,087件の腎細胞がんターゲットを要約・重複化後に取得しました。

腎細胞癌治療におけるシコニンの交差標的の同定
シコニンの予測標的と腎細胞癌関連標的を交差させることで、98の重複標的が特定され、図 2Bに示されるように腎細胞癌治療におけるシコニンの主要な標的となりました。

構成要素...

ディスカッション

PIK3CAは正式にはホスファチジルノシトール4,5-ビスリン酸3-キナーゼ触媒サブユニットαアイソフォームとして知られています。PIK3CAはPI3K/AKT/mTOR経路の中心的成分であり、腎細胞癌(RCC)の発生、発生、治療において重要な役割を果たします。研究により、PIK3CAはこのサブタイプの高頻度変異遺伝子であることが示されており(6/57、11%)、その変異はPI3K/AKT経路の異常活性化と直接関連しています。さらに、免疫チェックポイント阻害薬とチロシンキナーゼ阻害薬(ICI/TKI)の併用治療法に良好に反応し、客観的な寛解率および疾患制御率は従来の治療法よりも有意に優れています²⁴。研究によると、PIK3CAはRCCで最も頻繁に変化する遺伝子の一つであり、クリア細胞癌などの主要なサブタイプにも変異があることが示されています。その異常な活性化は腫瘍血管新生と増殖を促進する可能性があり、またチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)治療抵抗の重要なメカニズムでもあります²⁵

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
786-O	American Type Culture Collection (ATCC)	RRID: CVCL_1051 (ATCC CRL-1932)	ヒト透明細胞腎細胞癌細胞株
AlphaFold データベース	欧州分子生物学研究所 (EMBL) - EBI	AlphaFold タンパク質構造データベース	タンパク質構造予測データベース (AlphaFold タンパク質構造データベース)
AutoDock Tools ソフトウェア	スクリップス研究所	1.5.7	リガンド-タンパク質結合予測のための分子ドッキングソフトウェア
Caki-1	American Type Culture Collection (ATCC)	RRID: CVCL_0234  (ATCC HTB-46)	ヒト透明細胞腎細胞癌細胞株
Caki-1 細胞	牡丹江師範大学	HTB-46 (RRID: CVCL_0234)	ヒト透明細胞腎細胞癌細胞株
Caspase 3 および caspase 8 検出キット	クレディ・スイスのバイオテクノロジー株式会社 (中国・泉州)	Caspase-3 活性測定キット、Cat. No. RX302848M、Caspase-8 活性測定キット、Cat. No. RX302849M	細胞アポトーシスを評価するためのカスパセ活性の検出に使用
Cytoscape ソフトウェア	Cytoscape コンソーシアム	3.9.1	生物学的ネットワークの構築と可視化に使用
DMEM 培地	Hyclone	SH30022.01	Caki-1 および 786-O 細胞培養用の培地
胎児ウシ血清	Gbico	10099-141	Caki-1 および 786-O 細胞の成長用培養補助剤
GeneCards	ワイツマン科学研究所	https://www.genecards.org/	ターゲット遺伝子の注釈のための包括的なヒト遺伝子データベース
GraphPad Prism	GraphPad, San Diego, CA, USA	version 8.3.0	統計グラフの作成に使用
HERB データベース	中国科学院	http://herb.ac.cn	伝統的な中医薬成分-標的データベース
ImageJ ソフトウェア	米国国立衛生研究所 (NIH)	Fiji	細胞形態とウェスタンブロットバンド定量の画像解析ソフトウェア
倒立顕微鏡	オリンパス, IX73, 日本	100× 倍率。	シコニン処理後の細胞形態の変化を観察するために使用
KOBAS 3.0 データベース	北京大学	http://bioinfo.org/kobas/	遺伝子オントロジーおよび経路エンリッチメント分析ツール
Metascape データベース	メモリアル・スローン・ケタリング・がんセンター	https://metascape.org/gp/index.html)	遺伝子機能エンリッチメントおよびネットワーク分析ツール
Microcredit プラットフォーム	国家生物情報センター (中国)	http://www.bioinformatics.com.cn/	データ処理のためのオンラインバイオインフォマティクス分析プラットフォーム
MTT アッセイキット	Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (北京, 中国)	Cat. No. M8180	細胞生存率検出 (抗増殖アッセイ) に使用
OMIM	ジョンズ・ホプキンス大学医学部	https://www.omim.org/	メンデル遺伝 (ヒト遺伝性疾患データベース)
PharmMapper データベース	上海理工大学	https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/	小分子薬物標的予測データベース
PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, および PTPN11	Santa Cruz Biotechnology, Inc. (ダラス, TX, USA)	Santa Cruz Biotechnology, Inc. (ダラス, TX, USA)	ターゲットタンパク質のウェスタンブロット分析用の一次抗体
PyMol ソフトウェア	Schrödinger, Inc.	2.2.0	タンパク質構造解析用の分子可視化ソフトウェア
RCSB タンパク質データベース	RCSB タンパク質データバンク (ラトガース大学)	https://www.rcsb.org/	分子モデリング用タンパク質構造データベース (PDB)
SEA Search Server データベース	カリフォルニア大学サンフランシスコ校	https://sea.bkslab.org	標的予測のための類似性アンサンブルアプローチ
シコニン (純度 98%	中国原産の葉状生物	Y0001439	本研究で腎細胞癌 (RCC) の治療に使用した小分子化合物
SPSS	IBM, Armonk, NY, USA	version 20.0	統計分析に使用
STRING	欧州分子生物学研究所 (EMBL)	https://stringdb.org/	タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークデータベース
SwissTargetPrediction データベース	スイス情報生物学研究所	https://www.swisstargetprediction.ch/	創薬用小分子標的予測ツール
治療標的データベース	上海薬物研究所	https://ttd.idrbrab.cn	治療標的および薬物のデータベース
Venny 2.1	スペイン国立生物技術センター (CNB-CSIC)	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)	データ交差分析用のベン図ツール