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方法論記事

発達中の ショウジョウバエ の視葉におけるハイブリダイゼーション連鎖反応FISHの

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DOI:

10.3791/71681

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2026年7月17日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, New York University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University, 3Department of Biology, The City College of New York

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ショウジョウバエのメラノガスター幼虫視葉におけるハイブリダイゼーション連鎖反応蛍光性交配(HCR-FISH)を行うために必要な手順を説明しています。プローブ設計、ハイブリダイゼーション、増幅、組織マウントの手順が詳細に記載され、発達中の視葉の可視化を容易にします。

要約

神経発達を理解するには、遺伝子がいつどこで発現するかを正確に特徴づける必要があります。イン シチュ ハイブリダイゼーションのような技術は、発達中の組織における遺伝子発現の可視化を長らく可能にしてきました。イン シチュ ・ハイブリダイゼーションはショ ウジョウバエのメラノガスター 胚で広く用いられていますが、視覚システム開発への応用はいくつかの技術的課題により制限されています。例えば、長いプローブは視葉への浸透がうまくいかず、ホースラディッシュペルオキシダーゼのような拡散性触媒リポーターに依存するプロトコルは、ホールマウント製剤で信号対雑音比が低いことが多いです。ハイブリダイゼーション連鎖反応蛍光原 位 ハイブリダイゼーション(HCR-FISH)はこれらの多くの制約を克服し、より堅牢なシグナル検出を可能にします。従来のFISHと同様に、DNAプローブモノマーは組織内のRNA配列にハイブリダイズします。しかしHCR-FISHでは、蛍光共役増幅プローブが安定したヘアピン構造を形成し、追加のモノマーの重合を引き起こし、信号強度を増幅します。多重プローブセットの使用により、より短いオリゴヌクレオチド(~45 nt、従来のFISHでは最大1,000 nt)の使用も可能となり、プローブの浸透性が向上し、ホールマウント試料での染色の均一化を実現できます。本記事ではショ ウジョウバエ の幼虫視葉に最適化されたHCR-FISHプロトコルについて説明します。このプロトコルは、既存のHCR-FISHアプローチを適応させ、固定条件の最適化とプローブおよびヘアピン濃度の上昇により、信号強度と組織浸透性を向上させています。試薬リストと段階的な手順も提供されています。発生神経生物学における応用の可能性も示されており、新生児ニューロンの可視化や、内因性タグ付けタンパク質や抗体染色などの従来の方法では十分な情報を提供できない場合の遺伝子発現パターンの特性評価が挙げられます。

概要

脳がどのように組み立てられているかを理解するには、存在する細胞タイプの多様性と、各細胞タイプ1内で発現する遺伝子レパートリーの両方を特定する必要があります。単細胞RNAシーケンシングの最近の進歩により、研究者はこれらの問題に高解像度で解明できるようになりました。しかし、多くの単細胞アプローチでは空間情報を保持できず、転写細胞型クラスターを発達中の脳内の位置にマッピングするための追加の実験が必要です。

GAL4-UASのような二元遺伝子発現システムは位置情報を提供しますが、定量的ではありません。さらに、遺伝子発現とレポーター検出の間の遅延は、発生初期段階における生理学的に重要な発現パターンを曖昧にしてしまうことがあります。免疫染色は組織特異的発現パターンを決定するために広く使われるもう一つの手法です。しかし、分泌されるタンパク質はしばしば拡散的で、正確な局所定位が困難です。

イン・シチュ・ハイブリダイゼーション(ISH)などのヌクレオチド標識法も、遺伝子発現5に関する空間情報を得るために広く用いられています。ISHでは、標識されたDNAオリゴヌクレオチドが関心のある逆相補RNA配列に結合します。初期のISH法では放射性標識DNAプローブ6が使用されていましたが、後のプロトコルではジゴキシゲニン、フルオレセイン、ロダミン7,8,9などの安全なラベルが組み込まれました。科学者たちはISHをショウジョウバエメラノガスターに迅速に応用し、ポリテン染色体の組織を特徴づけ、ホールマウント胚における曲背などのギャップ遺伝子の発現パターンのマッピングに応用しました10,11。

広範な用途があるにもかかわらず、幼虫の視葉のような厚い全マウント製剤での採用にはいくつかの技術的制約がありました。多くのインシチュプロトコルは、ホースラディッシュペルオキシダーゼのような拡散性触媒リポーターに依存しており、しばしば低い信号対雑音比を生じていました12。さらに、多くのアプローチでは特異性を高めるために単一の配列を標的とした長いプローブが用いられていました。ショウジョウバエ胚やポリテン染色体では効果的ですが、長いプローブは幼虫脳への浸透が不十分で、しばしば不均一な標識(10,11,13)を生じさせます。

単一分子蛍光ISH(smFISH)およびハイブリダイゼーション連鎖反応蛍光生原ハイブリダイゼーション(HCR-FISH)の開発により、これらの制限の多くが解消されました(14,15)。単一の遺伝子領域に短いプローブを並べることで、smFISHは平均プローブ長を約1,000 ntから約40nt16に短縮します。これにより、プローブの貫通力が大幅に向上しつつ、強い信号強度を維持します。HCR-FISHは、位置精度を高め、信号出力を増幅する蛍光共役増幅器プローブを使用することで、信号対雑音比をさらに向上させます。重要なのは、この増幅ステップが転写本濃度に線形にスケールし、遺伝子発現レベルの定量的測定を可能にすることである。

HCR-FISHは標的配列に相補的なイニシエータープローブから始まります。これらの標識されていないDNAオリゴヌクレオチドは、蛍光標識されたH1増幅プローブの入力ドメインに結合する単鎖イニシエーター配列を含んでいます。H1増幅器はヘアピン構造を採用し、イニシエーター配列に結合するまで触媒の不活性を維持します。結合すると、H1増幅器は開いて配列を露出し、その配列はパートナープローブであるH2に結合します。この相互作用によりH2ヘアピンが開き、別のH1プローブに結合できるようになります(図1)15。H1/H2結合の繰り返しサイクルは、蛍光信号を増幅しつつ背景雑音を低減する安定したポリマーを生成します。各イニシエーター配列は対応するH1/H2ペアに特異的であるため、異なるイニシエーター配列と蛍光色素を持つ複数のプローブを同時に用いて、同じサンプル内の複数の遺伝子を標識することができます。

figure-introduction-1
図1:HCR-FISHワークフローのグラフィカルな表現。 イニシエーター配列を含むDNAプローブは標的RNA転写産物にハイブリダイズします。蛍光標識されたDNA増幅ヘアピンはイニシエーター配列に結合し、連続重合を経て安定した二本鎖増幅鎖を形成します。直接蛍光色素共役は信号増幅と信号対雑音比を向上させます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

最近のHCR-FISHの改良により、その利用性はさらに高まりました。分割イニシエータープローブ設計により増幅特異性が向上し、HCRイニシエーターに結合した二次抗体は同時に免疫組織化学とHCR-FISH18を可能にします。さらに、拡張された蛍光分子オプションにより、最大10個の遺伝子を同時に多重化してイメージングすることが可能です。

HCR-FISHの初期の概念実証実験はゼブラフィッシュ(Danio rerio)で行われましたが、この方法は多くのシステムで広く利用されており、特に抗体が高価または入手困難な非モデル生物で広く使われています15。プローブ合成は、数か月かかる可能性のある抗体生成のより速い代替手段を提供します。したがって、HCR-FISHは単一細胞RNAシーケンシングデータセットで特定された候補遺伝子の迅速な検証方法を提供します。既存の遺伝子モデル生物においても、HCR-FISHはGAL4リポーターや免疫組織化学が特定の細胞集団を十分に標識できなかった場合に、新生ニューロンを空間的にマッピングする貴重な方法を提供します。

本記事では、第3齢幼虫ショ ウジョウバエ 視葉に最適化されたHCR-FISHプロトコルについて説明します。このプロトコルは、他の生物で発表されていた手法を、ショ ウジョウバエ の視覚系で利用するために応用しています。 ショウジョウバエ 免疫組織化学に一般的に用いられる固定条件は、FISH応用に最適化されました。信号強度と組織浸透性を向上させるために、プローブおよびヘアピンの濃度が増加しました。試薬消費を減らし、小さな組織サンプルの取り扱いを簡素化するためにスポットプレートの代わりにPCRチューブが使用されました。さらに、ショ ウジョウバエ の脳が他の昆虫システムに比べて小さいため、洗浄および雑種化の時間も短縮されました。

代表的な応用例は、このアプローチが発生中の特定の神経集団に対して位置情報を提供できることを示しています。これらの実験は、突然の転写など特定の転写物が、抗体染色やレポーターラインよりもHCR-FISHの方が早期に検出できることを示しています。ショウジョウバエの視覚系発達研究におけるHCR-FISHの潜在的な課題、トラブルシューティング戦略、応用についても議論しています。

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プロトコル

すべての ショウジョウバエのメラノガスター 実験は、ニューヨーク市立大学、コロンビア大学、ニューヨーク大学の研究生物の管理と利用に関するガイドラインに従って実施されました。このプロトコルで使用される研究ツールは 材料表に記載されています。

1. バッファーの準備

注: すべての試薬はヌクレアーゼフリーチューブでフィルターチップを使って準備します。
注: 処置中は手袋を着用してください。作業開始前にRNase除染液で作業面を清掃してください。

  1. ヌクレアーゼフリー溶液を準備する
    1. PBS-Tをヌクレアーゼフリー水に20倍PBS、トリトンX-100、グリシンを希釈し、最終濃度1倍PBS、1%(v/v)トリトンX-100、1 mMグリシンに仕上げます。
    2. SSCを20xとTween-20をヌクレアーゼフリー水で希釈し、0.1%(v/v)Tween-20を含む5xSSCを製製します。
    3. 20xPBSをヌクレアーゼフリー水に希釈して1xPBSを製製します。

2. プローブの設計

  1. 商業的にプローブを設計するには、対象種のアイソフォームを選択し、ベンダーのウェブインターフェースを使って目的の増幅器に合わせたプローブを注文します。
    注: 市販のHCRプローブ化学およびイニシエーター配列は、Molecular Instrumentsによって独自かつ特許を取得しています。
    1. 転写株特異的またはプレmRNA検出を望む場合は、ウェブインターフェースで標的領域を修正してください。
    2. 高度発現の転写本に対して約20本のプローブを注文します。全マウントショ ウジョウバエ 製剤において、低存在量転写本として最大40本のプローブを使用します。
      注: プローブ結合部位の少ないため、より短い転写産物には特化したオリゴを注文します。
  2. プローブを手動で設計するには、ターゲットトランスクリプトのFASTAシーケンスをダウンロードしてください。単一のアイソフォームを標的にするか、すべてのアイソフォームを標的とするかを判断します。
    注: RNAシーケンシングデータセットから特定された構成性エクソンや高発現アイソフォームを優先してシグナルを改善します。
    1. プレmRNA検出用のプローブを設計するなら、イントロン-エクソン接合部をまたぐプローブを設計してください。成熟した転写を検出するためにスプライス接合部をまたぐプローブを設計します。イントロニックプローブを使って核内の新生転写産物を検出します。
      注: イントロニックプローブは成熟細胞質の転写産物と共局在在しない場合があり、細胞同定のために追加のマーカーを必要とする場合があります。
    2. プローブセットのサイズを決定します。より大きなプローブセットを設計できない場合は、短時間転写本には最低約5本のプローブを使用します。標準的な用途には20本のプローブを使用し、全マウントサンプルでは最適な感度を得るために約40本のプローブを使用します。
    3. 自分でプローブを設計する場合は、25個のn-n配列を2bpスペーサーで区切り、各オリゴの5'端に分割イニシエーター配列を加えてください。
      注: 第1世代の分割イニシエータ配列は公開されていますが、次世代の商用イニシエータ配列は独自仕様です。
    4. 自分でプローブを設計する場合は、プローブ配列を検証してください。各セット内のプローブの融点が似ていることを確認してください。プローブ間の100%同一性を確認してください。
      注: 強いGリッチ領域を避け、プローブ間でGC含有量をほぼ同じように維持する。BLAST25を用いて反復配列を最小限に抑え、ターゲット外結合を評価する。
    5. 適切な場合は公開されているプローブ設計ソフトウェアを使用してください 26,27。
      注: オープンソース設計ツールは、商用プローブ設計パイプラインの最適化された性能を再現できない場合があります。

3. 脳の解剖、固定、プリハイブリダイズ

  1. プローブのハイブリッドバッファーを37°Cまで予備加熱。
    注意: プローブハイブリダイゼーションバッファーにはホルマミドが含まれています。適切な個人用防護具を着用しながら化学換気フードの下で取り扱いましょう。
  2. 各プローブを最終濃度1μMに希釈し、ヌクレアーゼフリーの蒸留水を使用します。
  3. 解剖皿に約250μLのヌクレアーゼフリーPBSを分割投与します。
  4. さまよう第3齢幼虫をピンセットを使ってPBSに移植します。一方の鉗子で腹部を支え、もう一組の鉗子で口のフックを掴みます。口のフックを体から引き離し、脳と腹側神経(VNC)を隔離します。
  5. VNCは保持しながら脂肪体や唾液腺を除去してください。解離した脳を氷のように冷たい非ヌクレアーゼPBS600μLのチューブに移します。
    注: 組織の乾燥を防ぐため、解剖中は視葉を水に浸しておきましょう。
  6. 約6つの視葉が採取されるまで解剖を繰り返します。組織分解を最小限に抑えるため、20分以内に完全な解離を行ってください。
  7. 16%のパラホルムアルデヒド(PFA)を200 μL加え、最終的なPFA濃度を4%にします。チューブを優しく逆さにして混ぜ、室温で15分間孵化させます。
    注意: PFAは有毒で変異原性があります。手袋を着用したまま化学換気フードの下で扱ってください。
  8. 試料から固定液を除去し、指定された化学廃棄物として堆積します。600μLのコールド・ヌクレアーゼフリーPBSで3回洗浄し、解剖皿を使って洗浄液を捕捉します。
    注: 洗浄液の組織損失を調べ、脱臼した脳を解剖顕微鏡で回収します。
  9. 脳を100μLの予温プローブハイブリダイゼーションバッファーを含むPCRチューブに移します。
    チューブを軽く動かして優しく混ぜ、室温で10分間孵育します。
    注: 脳が水中に浸かり、管壁に付着しないように注意してください。

4. プローブのハイブリダイズ

  1. プローブハイブリダイゼーションバッファにセットした各プローブを0.4 pmol加え、最終体積100 μLで4 nMのプローブ溶液を準備します。
    注: 初期染色で信号強度が低い場合は、プローブ濃度を最大16 nMまで上げます。
  2. 組織を乱さずにプレハイブリダイゼーションバッファーを除去します。各サンプルに希釈したプローブ溶液を加えます。
  3. サンプルは37°Cでヌーテーターに16〜24時間培養します。

5. プローブ信号の増幅

  1. 増幅バッファーを室温に保ちます。サンプルごとに約200μLの増幅バッファを準備します。
  2. 平衡洗浄バッファー。温水プローブ洗浄バッファーを水浴で37°Cまで行う。
    注意: プローブウォッシュバッファーにはホルマミドが含まれています。化学換気フードの下に置く。
  3. プローブ溶液を取り出し、再利用のために-20°Cで保存します。
    注: プローブ溶液を染色強度が下がるまで再利用してください。
  4. 37°Cで予熱したプローブウォッシュバッファーで4回、各10分間洗浄します。 サンプルを室温で5分ずつ2回洗い、5回SSCTで洗います。
  5. ヘアピンなしで100μLの増幅バッファーを追加します。室温で30分間孵育します。
  6. サーモサイクラーを95°Cまで加熱します。 それぞれ3μMヘアピンストックを2μLずつ、PCRチューブに加えます。各ヘアピン種ごとに1本ずつ用意してください。
    注: 染色で粒点が薄くなったり信号対雑音比が低い場合は増幅器濃度を上げてください。
  7. ヘアピンは95°Cで90秒間孵化します。チューブは光から守り、室温で少なくとも30分間培養してください。
  8. 増幅溶液を準備しろ。ヘアピンを増幅バッファーで1サンプルあたり100μLの最終体積にまとめます。
  9. サンプルから増幅バッファーを除去してください。ヘアピン入り増幅バッファを追加してください。
    光を遮ったノテーター(ホイルで包んで)で室温で一晩培養します。
  10. 増幅溶液を除去してください。サンプルを5回SSCTの150μLで5分間2回洗浄します。150μLの5倍SSCTをニューテーターで3回、10分間洗浄します。ヌクレアーゼフリーPBSで洗剤を2回短く洗い、洗剤を除去します。

6. イメージングのための脳のマウント

  1. ガラススライドにイメージングスペーサーのシールを貼り付けます。鉗子の底端で優しく押さえて、閉じ込められた気泡を取り除きます。
  2. 鉗子を使って脳を腹側神経索を通して二分します。
  3. 脳をスペーサーウェルの中央に置く。視葉を上向きに組織を横方向に配置します。
  4. 空気の泡を発生させずに井戸を満たすために、約25μLのアンチフェードマウント培地を十分に加えます。鉗子を使って均等に装着媒体を分散させてください。
  5. サンプルの上にカバースリップを敷き、ネイルポリッシュで密封します。

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結果

発生神経生物学を研究する科学者にとって、HCR-FISHはショ ウジョウバエ 視葉内の遺伝子発現パターンの可視化や発育中のニューロンの空間的位置を決定するための堅牢な手法を提供します。

ショウジョウバエの視葉(図2A)では、延髄神経皮内のニューロンは、空間的にパターン化された神経上皮である外側増殖中心(OPC)から派生した神経幹細胞(ニューロブラスト)から生じています(図2B)28。これらの神経芽細胞は連続的な転写因子を発現し、時間とともに神経の多様性を生み出します。したがって、ニューロンは出生順29、30、31、

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ディスカッション

本研究はショ ウジョウバエのメラノガスター 幼虫視葉でのHCR-FISHの適応を説明しています。従来の インシチュその場所 ハイブリダイゼーション手法は、プローブの貫通が限られ信号強度が低いため、幼虫脳組織全体で性能が悪いことが多いです。ここで示すプロトコルは、発達中の視葉の染色品質を改善するためのいくつかの重要なステップを最適化しています。 ショウジョウバエ の免疫組織化学で一般的に用いられる固定条件は、組織の形態を保存しつつRNAの完全性を維持するよう適応されました。プローブと増幅器の濃度が増加すると、特に アラプトのような弱い発現の転写物に対して信号強度と信号対雑音比が改善されました。さらに、プローブの長さを短くすることで、約100μm厚さの幼虫脳全体、DAPI染色で浸透が限られている領域を含む組織の浸透性が向上しました(図2D)。

このプロトコルの成功裏の実装には、いくつかの技...

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開示事項

著者たちは競合する金銭的利害関係がないと宣言しています。

謝辞

著者らは、分子機器HCR-FISHプローブおよびdpp-GAL4へのアクセスを提供してくれたクロード・デスプランに感謝しています。UAS-スティンガーフライライン。また、著者らはMolecular InstrumentsのAneesh Acharya氏とHarry Choi氏にHCR-FISH実装に関する技術的フィードバックと議論を提供してくださったことに感謝しています。このプロトコルは、MegYounger 22、Hunter Whitbeck、Bogdan Sieriebriennikov、Amanda Araujo、Gomes Ferreira、Yen-Chung Chen、Yanqiqi Zengによって開発された既存および未発表のHCR-FISH手法を応用しています。ボグダン・シェリエブリエンニコフはヒューマンフロンティア科学プログラム(LT000010/2020-L)の支援を受けました。ジェニファー・マリンは国立衛生研究所R00助成金の支援を受けEY032269。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10% Tween-20Bio-Rad Laboratories1662404NA
20x PBS, pH7.4Growcells.comMRGF-63962.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4 
20x SSCQuality Biological351-003-1313M NaCl, 0.3M Sodium Citrate
37 °C incubatorFisher Scientific (Isotemp)15-015-2633NA
37 °C water bathFisher ScientificFSGPD15DNA
Aluminum foilReynolds Wrap/Fisher Brand15-078-291NA
Antibody: Mouse-anti-AbruptDSHBAbrupt; RRID: AB_528344 Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFPMillipore SigmaCatalog# 06-896; RRID: AB-619712Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFPLife Technologies#11122; RRID: AB_221569Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-DllGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherinDSHBDN-Ex #8, RRID: AB_528121Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxNGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jamGift from D. Godt-Dilution: 1:2,000
Antibody: Donkey anti-Rat 405Jackson ImmunoResearchCode # 712-475-150; RRID: AB_2340680Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488Jackson ImmunoResearchCode #703-545-155; RRID: AB_2340375Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488Jackson ImmunoResearchCode #715-545-151; RRID: AB_2341099Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488Jackson ImmunoResearchCode #711-545-152; RRID: AB_2313584Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555Thermo ScientificCatalog #A-31572; RRID: AB_162543Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunoResearchCode #712-165-153; RRID: AB_2340667Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647Jackson ImmunoResearchCode #706-605-148; RRID: AB_2340476Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647Jackson ImmunoResearchCode #712-605-153; RRID: AB_2340694Dilution: 1:200
Antifade mountantThermo Fisher ScientificS36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936)
Confocal MicroscopeZeissLSM-880NA
Cover slips (22 x 30)VWR16004-332NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAGBDSC38626; RRID: BDSC_38626NA
Fly: D. melanogaster: Canton SBDSC64349; RRID: BDSC_64349NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4BDSC1553; RRID: BDSC_1553NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTBBDSC83660; RRID: BDSC_83660NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;BDSC32198; RRID: BDSC_32198NA
Fly: D. melanogaster: UAS-StingerBDSC84277; RRID: BDSC_84277NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4BDSC600136; RRID: BDSC_600136NA
ForcepsDumont#5 or #55sNA
Glass slidesVWR16005-106NA
GlycineMillipore SigmaG7126-10MGNA
HCR Amplification bufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR-Gold AmplifiersMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR HiFi ProbesMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR Probe Hybridization BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
HCR Probe Wash BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
Nail polish (clear)Electron Microscopy Sciences72180NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)Thermo Fisher ScientificAM9937NA
Nutating mixerCorning/Fisher Scientific10-320-100NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)Electron Microscopy Sciences15710Toxic
PCR Machine/Thermal CyclerBio-Rad1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL) USA Scientific#1402-2400NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)Fisher ScientificFB0875714NA
RNase ZAPThermoFisher ScientificAM9780NA
Slide spacer stickersSUNJinIS016 (iSpacer stickers (0.2 mm deep))NA
Sylgard elastomer kit (for making dissecting dishes)Fisher ScientificNC9285739NA
Triton X-100Merck Millipore SigmaX100NA

参考文献

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