方法論記事

リアルタイム共焦点イメージングを備えた、シュワン細胞への遠隔かつ制御可能な機械的刺激のための磁性ナノアクチュエーションプラットフォーム

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DOI:

10.3791/71685

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2026年9月8日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, 2Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, 3International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, 4Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、蛍光標識した超常磁性ナノ粒子、校正済みの電磁石、およびリアルタイム共焦点イメージングを統合し、シュワン細胞を遠隔かつ制御可能に刺激し、その機械感覚応答をダイナミックにモニタリングできる顕微鏡適合型磁気ナノアクチュエーションプラットフォームを紹介します。

要約

機械的な力は細胞の挙動を決定的に制御しますが、既存の機械的刺激手法の多くは直接的な物理的接触や人工的に構築された細胞外環境に依存しており、ダイナミックな生細胞研究における柔軟性に限界があります。本研究では、シュワン細胞に対して遠隔で非接触かつ制御可能な機械的刺激をin vitroで与えるための磁性ナノアクチュエーションプラットフォームを提示します。この統合的なセットアップにより、同一の実験セッション内で遠隔磁気刺激と同期した生細胞イメージングが可能になります。本稿では、蛍光超常磁性ナノ粒子（SPIONs）、およびオプションとしてアクチン標的機能化SPIONs（f-SPIONs）の調製、顕微鏡互換の電磁刺激デバイスの構築と校正、単一粒子および単一細胞レベルでの磁気力の推定、そして磁気アクチュエーションとリアルタイム共焦点イメージングの統合について詳述します。シュワン細胞は極めて高い機械感受性を持つグリア細胞であり、末梢神経の発達、維持、および修復において不可欠な役割を果たしています。機械的刺激に対するこれらの細胞の応答をリアルタイムでモニタリングすることは、機械的な力が細胞骨格の組織化や細胞挙動にどのように影響するかを理解する上で極めて重要です。本プラットフォームは、シュワン細胞のメカノバイオロジーを研究するための再現可能なワークフローを提供し、他の機械応答性細胞種や多細胞システムにも応用可能です。

概要

機械的な刺激は、接着、遊走、増殖、分化、および表現型の可塑性を含む幅広い細胞プロセスを調節しています1,2,3。メカノバイオロジーの研究により、ニューロンとグリア細胞の両方が、発生過程を通じて顕著なメカノセンシティビティ（機械刺激感受性）と応答性を示すことが明らかになっています4,5,6,7。細胞がどのように力を感知し応答するかを調査するために、原子間力顕微鏡（AFM）、マイクロピペット吸引法、光ピンセット、伸展ベースの培養システム、マイクロ流体プラットフォームなど、複数の実験的手法が開発されてきました8,9,10,11,12。これらの技術は、メカノトランスダクション（機械刺激受容）の研究を大きく進展させました。しかし、多くの手法は細胞との直接的な物理的接触を必要とするか、あるいは事前に定義された人工的な機械的環境に依存しているため、遠隔操作が可能で動的に制御でき、かつイメージングと互換性のある刺激には不向きです。

磁性ナノ粒子を介した力の伝達は、遠隔的なメカノスティミュレーションのための代替戦略となります13,14,15,16,17,18。ほとんどの生物学的組織は低い磁化率を示すため、外部から印加された磁場は生物学的試料に直接接触することなく浸透し、細胞や組織に導入された磁気応答性粒子に選択的に作用させることができます。磁場勾配が存在すると、これらの粒子は方向性を持つ力を受け、それを利用してサブ細胞、細胞、あるいは組織レベルで機械的な摂動を加えることが可能です8,9。この手法は、非接触であり、調整可能で、ライブイメージングと互換性があり、さらに、より複雑な生物学的システムへの拡張の可能性があるため、非常に有用です。

シュワン細胞は高度な機械受容性を有するグリア細胞であり19,20、末梢神経の発達、維持、および修復において重要な役割を果たしています21,22。 物理的刺激に対するシュワン細胞の応答をダイナミックに観察することは、力がどのように細胞骨格の組織化や細胞行動を制御しているかを理解する上で重要です。しかし、従来の多くの力導入システムは、リアルタイムの高解像度顕微鏡観察との互換性が十分ではありません。この制限を解消するため、我々は、アクチン細胞骨格を標的とする蛍光磁性超微粒子（f-SPIONs）、共焦点顕微鏡のステージに対応したカスタム電磁デバイス、および力推定のための定量的なフレームワークを組み合わせた磁気ナノアクチュエーションプラットフォームを開発しました。この統合セットアップにより、同一の実験セッション内で、リモート磁気刺激と同期した生細胞イメージングが可能になります。

ここで説明するワークフローには、蛍光磁性スーパー粒子（SPIONs）の調製、f-SPIONsを作製するためのオプションであるファロイジンベースのアクチン標的機能化、ナノ粒子の特性評価、電磁デバイスの構築と電場のキャリブレーション、磁力の推定、およびリアルタイム共焦点イメージングを組み合わせた磁気刺激が含まれます。本プラットフォームはここではシュワン細胞向けに最適化されていますが、他の機械的応答性生体システムにおける関連研究にとっても実用的な枠組みを提供できる可能性があります。

プロトコル

本プロトコルで記述されている実験では、確立されたラットシュワン細胞株（RSC96）を使用しており、ヒトの被験者および生存動物は含まれていません。本研究は、吉林大学第一病院の動物福祉・倫理委員会によって承認された、動物実験を含むより広範な研究プロジェクトの一環として実施されました（承認番号：2022-0045）。

1. 蛍光磁性超粒子の調製

  1. オレイン酸被覆Fe₃O₄ナノ粒子の合成。
    ​注：オレイン酸被覆Fe₃O₄ナノ粒子は、既報20,23の熱分解法により合成した。
    1. 反応フラスコに、2 mmolのFe(acac)₃、6 mmolのオレイン酸、6 mmolのオレイルアミン、および5 mmolの1,2-ヘキサデカンジオールを、20 mLのベンジルエーテルに加える。
    2. 窒素雰囲気下で、均質な前駆体溶液が得られるまで15分間攪拌する。
    3. 20 °C/minの速度で、混合物を200 °Cまで加熱する。
    4. 200 °Cで30分間反応を維持する。
    5. 温度を265 °Cまで上げ、混合物を30分間還流させる。
    6. 反応混合物を室温まで自然冷却する。
    7. 磁気分離によりFe₃O₄ナノ粒子を回収する。
    8. ナノ粒子をエタノールで3回洗浄する。
    9. 精製したナノ粒子をトルエンに再分散させる。
  2. Fe₃O₄·Cy3.5スーパー粒子の構築。
    ​注：Fe₃O₄·Cy3.5スーパー粒子は、既報20,24,25に従い調製した。
    1. 50 mLの三口丸底フラスコ内で、28 mgのオレイン酸被覆Fe₃O₄ナノ粒子を4 mLのトルエンに分散させる。
    2. 12.5 mgのドデシル硫酸ナトリウムと3 mgのシアニン3.5（Cy 3.5）を12.5 mLの水に含ませた水相を調製する。
    3. トルエン中のFe₃O₄ナノ粒子懸濁液（4 mL中に28 mg；7 mg/mL）を、水性界面活性剤/色素溶液と混合し、水中油型マイクロエマルションを形成させる。
    4. 安定したエマルションが得られるまで十分に混合する。
    5. 三口丸底フラスコを60 °Cに加熱し、300 rpmで6時間連続的に攪拌する。
      注：減圧蒸留やロータリーエバポレーターによる蒸発操作は不要である。
    6. 上述の条件下でトルエンを蒸発させ、Fe₃O₄ナノ粒子の凝集を誘導する。使い捨て転送ピペットを用いて、溶液の少量を試験管に移し、静置する。相分離が起こらなければ、トルエンが完全に除去されたことを示す。
    7. Fe₃O₄·Cy3.5スーパー粒子懸濁液を15 mL遠心チューブに移す。室温で2,370 × gで5分間遠心分離してスーパー粒子を回収し、ペレットを乱さないように上清を慎重に捨てる。
    8. ペレットを超純脱イオン水に再分散させ、再び室温で2,370 × gで5分間遠心分離する。上清を捨て、この洗浄手順を3回繰り返して、残留する遊離のCy3.5色素とドデシル硫酸ナトリウムを除去する。
  3. スーパー粒子のポリドーパミン（PDA）被覆。
    ​注：ポリドーパミン被覆スーパー粒子は、既報20,26に従い調製した。
    1. Fe₃O₄·Cy3.5スーパー粒子懸濁液を室温で2,370 × gで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
    2. ペレットを10 mM Tris緩衝液（pH 8.5）に再分散させる。
    3. 懸濁液に26 mgのドーパミンモノマーを加える。
    4. アルカリ条件下、室温で3時間攪拌する。
    5. 懸濁液を室温で2,370 × gで5分間遠心分離する。
    6. 上清を除去し、ペレットを超純水に再分散させてFe₃O₄·Cy3.5@PDA粒子（SPIONs）を得る。
  4. 任意で粒子をファロイジン-Alexa Fluor 350で機能化する。
    ​注：市販のファロイジン-Alexa Fluor 350を用いてスーパー粒子の表面機能化を行った20。
    1. 100 unitのファロイジン-Alexa Fluor 350を含む水溶液5 mLを調製する。
    2. 2 mgの粒子を含むFe₃O₄·Cy3.5@PDA懸濁液200 µLを溶液に加える。
    3. 室温で24時間、穏やかに攪拌する。
    4. 混合物を室温で2,370 × gで5分間遠心分離する。
    5. 上清を捨て、ペレットを脱イオン水に再分散させる。
    6. 最終的なFe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin（f-SPIONs）製剤を、使用まで遮光して保存する。

2. ナノ粒子の特性評価

  1. 形態およびサイズの決定。
    1. 装置の要件に従い、透過電子顕微鏡（TEM）または高分解能透過電子顕微鏡（HRTEM）用のナノ粒子サンプルを調製する。
    2. 画像を撮影し、粒子全体の形態、コアシェル構造、および平均粒径を決定する（図 1）。
    3. 動的光散乱（DLS）用のナノ粒子水懸濁液を調製する。
    4. 流体力学的直径および多分散指数（PDI）を測定する。
    5. 電子顕微鏡とDLSの結果を比較し、処方の均一性とコロイド挙動を評価する。
  2. 磁気特性の決定。
    1. 超伝導量子干渉計（SQUID）分析に適した、乾燥または濃縮したナノ粒子サンプルを調製する。
    2. 300 Kで磁気ヒステリシス曲線を記録する。
    3. 飽和磁化、残留磁化、および保磁力を決定する。
    4. 粒子が、残留磁化および保磁力が無視できる超常磁性挙動を示すことを確認する。
  3. 蛍光特性の決定。
    1. 超純脱イオン水中でf-SPION懸濁液を調製し、懸濁液を石英キュベットに移す。
    2. 蛍光分光光度計を用いて、フォトルミネッセンススペクトルを記録する。
    3. 洗浄および再懸濁後も蛍光信号が検出可能であることを確認する。
  4. 標的化処方を用いた際のアクチン関連局在の検証。
    1. RSC96細胞を入手する。
      注意：本研究で使用したRSC96細胞は、一次ラットシュワン細胞の長期培養により確立された自発的に形質転換されたラットシュワン細胞株であり、中国科学院細胞バンク（中国、上海、CSTR: 19375.09.3101RATGNR6）から入手し、マイコプラズマおよび真菌汚染が陰性であることを確認した。継代数3～10の細胞を使用した。
    2. 10%胎児牛血清（FBS）および1%ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（100 U/mLペニシリンおよび100 µg/mLストレプトマイシン）を添加したDulbecco改変イーグル培地（DMEM）で細胞を培養する。
    3. RSC96細胞を35 mm細胞培養用顕微鏡ディッシュあたり1 × 105 cellsの密度で播種し、細胞を接着させるため、5% CO₂を含む加湿雰囲気下、37 °Cで24時間培養する。
    4. 既存の培養液を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を2回洗浄した後、15 µg/mLのf-SPIONsを含む完全培養液を加える。f-SPIONsとともに細胞を12時間インキュベートする。
    5. 培養液を吸引し、内部に取り込まれていない粒子を完全に除去するため、1 mMのデフェロキサミンを含む氷冷PBSで細胞を2回洗浄する。
    6. 共焦点画像を撮影し、粒子内の細胞内分布を評価する。細胞内構造の高分解能光学切片を得るため、イメージングパラメータをピンホール1 Airy unit (AU)、zステップ0.43 µmに設定する。
    7. 粒子がアクチン関連の細胞領域に濃縮しているかを確認する。

3. 電磁刺激装置の構築と校正（図2）

  1. 電磁装置を組み立てます。
    1. 共焦点顕微鏡のステージおよび生細胞チャンバーに適合するサイズの小型電磁コイルシステムを構築する (図2A,B).
    2. コイルを制御可能な電源または外部電流源に接続します。
    3. COMSOL Multiphysics 4.3bを用いて、傾斜磁場環境を数値シミュレーションする（図2C,D).
    4. 異なる入力電流において、電磁石が対応する勾配磁場（GMF）を生成していることを確認します（図2G).
  2. 磁束密度を測定し、傾斜磁場を校正する。
    1. 電磁石を培養皿の横に配置し、ポールチップを皿の中心に向け、皿の外壁から1 mmの距離に置きます（図2E,F).
    2. 以降のすべての生細胞磁気力刺激およびイメージング実験において、電磁石と培養皿の間のこの相対的な幾何学的配置を維持してください。
    3. 培養皿底面のポジショニンググリッドを空間的な基準として用い、デジタルガウスメーターを使用して、刺激領域内のあらかじめ定義された位置における磁束密度を測定する。
    4. 磁束密度の空間的変化から局所磁場勾配を算出する。
    5. 実験的に測定および算出した磁場勾配値を用いて、数値シミュレーションによる磁場勾配のキャリブレーションとバリデーションを行う。

4. プラットフォームによって提供される磁力の推定

  1. 力推定モデルを定義する。
    1. 不均一磁場中における磁性ナノ粒子の力の方程式27,28を使用する：
      教育用磁場相互作用に関する静的平衡方程式 F=(m·∇)B
    2. 印加磁場に対する超常磁性的な配向を仮定し、方程式を以下のように簡略化する：
      磁場研究用磁力方程式 \(F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}\)
      ここで：
      F はナノ磁力
      m は磁気双極子モーメント
      物理図表における磁束を示すベクトル解析記号のNabla B方程式 は磁場勾配
      dB/dr は対応する磁場発生装置によって生成される磁場勾配 (T/m) である。
    3. すべての計算において、校正済み装置で測定された磁場勾配を使用する。
  2. 単一ナノ粒子に作用する力を推定する。
    1. HRTEM画像から粒子の平均寸法を決定する。
    2. 球状幾何学を仮定して磁性コアの体積を算出する。
    3. コアの磁性分率に基づき、Fe₃O₄固有の磁気体積を推定する。
    4. 以下の式に従って磁気双極子モーメントを算出する：化学質量計算式 \(m=\rho \cdot V \cdot M_m\)、化学量論用方程式
      ここで：
      Mm は、与えられた磁場強度下におけるf-SPIONsの質量磁化 (16 A·m2/kg) を表す。
      ρ は Fe₃O₄ の密度 (5.24 g/cm3) である。
      ​V は各f-SPION内の Fe₃O₄ 磁性コアの体積 (5.89 × 10⁻17 cm3) である。
    5. 双極子モーメントに測定された磁場勾配を乗じ、単一ナノ粒子に作用する力を推定する (教育用、静的平衡力方程式 Ff-SPION；記号)。
  3. シュワン細胞1個あたりのナノ粒子の取り込み量を推定する。
    1. 35 mm細胞培養用顕微鏡ディッシュに、RSC96シュワン細胞を1ウェルあたり 5 × 105 cells で播種する。
    2. 標準的な培養条件下で24時間インキュベートする。
    3. 培地を 15 µg/mL の f-SPIONs を含む新鮮な培地に交換する。
    4. さらに12時間インキュベートする。
    5. 1 mM デフェロキサミンを含む氷冷リン酸緩衝生理食塩水で細胞を2回洗浄する。
    6. 細胞を回収し、計数する。
    7. 誘導結合プラズマ発光分光法 (ICP-AES) を用いて細胞内鉄含有量を測定する。
    8. 細胞あたりの平均鉄質量を粒子1個あたりの鉄質量で除し、細胞1個あたりに取り込まれた粒子数を算出する 医学画像研究におけるSPIONsの細胞取り込み方程式 (n_cell^f-SPIONs)。
  4. 単一のシュワン細胞に加わる力を推定する。
    1. 以下の式に従って細胞レベルの力を算出する：
      力バランス解析、静的平衡方程式 F_cell=n^f-SPIONs_cell·F_f-SPION；公式
      ここで：
      教育用、静的平衡力方程式 Ff-SPION；記号 は単一の f-SPION に及ぼされる磁力である。
      SPION濃度方程式 \( n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} \)、科学的表記、図解 は細胞1個あたりに取り込まれた f-SPIONs の数である。
      Fcell は単一の細胞に及ぼされる磁力である。
    2. 算出された値を、単一のシュワン細胞に加わる推定磁力 (Fcell) として報告する。
    3. この値は直接的な細胞内力の測定ではなく、モデルに基づく推定値であることを明記する。

5. 磁気刺激とリアルタイム共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）イメージングの併用

  1. シュワン細胞に磁性ナノ粒子を導入する。
    1. イメージング対応のibidi培養ディッシュまたはマイクロ流体培養チャンバーにシュワン細胞を播種する。
    2. 細胞を接着させ、回復させる。
    3. 既存の培地を、以下を含む新鮮な培養培地に交換します。 15 µg/mL f-SPIONs
    4. f-SPIONを導入させるため、細胞を12時間インキュベートする。
    5. 次へ進む前に、細胞形態を確認してください。
  2. 非内部移行粒子を除去する。
    1. ナノ粒子を含む培地を除去する。
    2. 1 mM デフェロキサミンを含むPBSで細胞を2回洗浄する。
    3. 洗浄溶液を、イメージング対応の生細胞用培地に交換する。
    4. イメージング前に、細胞外粒子のバックグラウンドが低いことを確認してください。
  3. 電磁石装置を共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）イメージングシステムに統合します。
    1. 電磁石をあらかじめ校正された位置に配置し、生細胞培養チャンバーに取り付けます。
    2. 組み立て済みの生細胞培養チャンバーを共焦点顕微鏡のステージ上に設置します（図3）。培養皿が有効刺激領域内に配置されていることを確認します（図3A).
    3. あらかじめ設定したパラメータに従って電磁石に通電し、培養皿の領域内で勾配磁場への曝露が有効に行われていることを確認する（図3B).
    4. 対物レンズが干渉することなく焦点面に到達できることを確認してください。
    5. デバイスが対物レンズの配置やステージの移動を妨げていないことを確認してください。
    6. 電磁石の動作中に発生する熱を考慮し、あらかじめ決定した最適な培養条件に従って生細胞チャンバー構成部品の温度設定を調整し、内部環境を～に維持してください。 37 °C および5% CO₂（図3C).
    7. システム全体が正常かつ安定して動作していることを確認してください。
  4. 機能的Ca2+イメージング2生細胞における⁺イメージング。
    1. 以下の成分を含むKrebs–Ringer液（pH 7.4）を用いて細胞をインキュベートする。 3 µM Fluo-4 AMおよび0.1% Pluronic F-127を 37 °C 30分間。
    2. インキュベーション後、培養物をPBSで2回洗浄し、イメージングのためにCLSMシステムの生細胞イメージングプラットフォームへ移送する（図4A).
    3. ibidi培養ディッシュ底面のポジショニンググリッドを用いて、あらかじめ定義した5か所の部位を撮影します。
    4. 各イメージング視野を等分に25個の領域に分割し、その領域内の実際の細胞密度に応じて、各領域から0〜3個の細胞を選択して蛍光定量を行う。
    5. 個々の細胞の完全な輪郭を関心領域（ROI）として定義し、ROI内の蛍光強度の変化（ΔF）を解析することで、磁気誘導性カルシウム応答をモニタリングします。
    6. 蛍光強度の変化をΔF = (F刺激 - F0）。刺激前後の蛍光強度の変化（ΔF/F）を検討する。0）10%を超えるものをカルシウム応答イベントとする。
      注：F非刺激 磁気力刺激前の蛍光強度 F を表す0 はベースラインの蛍光強度を表し、F刺激 磁気力刺激後の誘発蛍光強度を示す。
    7. 背景補正を行うため、細胞のない領域で測定した平均背景蛍光強度を、各ROIの蛍光強度値から差し引きます。
    8. 1回の実験につき培養皿を1枚用い、独立した実験を3回行う。
  5. タイムラプスイメージングを行い、撮像中に磁気刺激を適用する。
    1. タイムラプスイメージングのパラメータを次のように設定する：1フレームあたりの取得間隔を2.1秒、総取得時間を650秒とし、1 AUを用いた標準的な高解像度光学切片イメージングを行う。
    2. 細胞イメージング中、磁気力刺激がない状態（F=0）での細胞内カルシウム蛍光強度を記録するため、電流を入力せずに50秒間連続して画像を撮影する。非刺激) (図 2H および 図 4B).
    3. 最初の50秒間に記録された蛍光強度を正規化し、これをベースライン蛍光強度（F0）として定義します。0).
    4. 続いて、電磁石に3.0 Aの定電流を入力し、磁性ナノ粒子を導入したシュワン細胞を3.25 T/mの勾配磁場に曝露させ、これにより磁気力刺激を加えました。磁気力刺激中の細胞内カルシウム蛍光強度（F刺激) (図2H および 図4C).
    5. 蛍光強度の変化をΔF/Fとして定量的に算出する0 (図4D,E).
  6. 統計解析を行い、Caを分析する2蛍光データ。
    1. 各細胞について、解析したタイムシリーズ全体のΔF/F₀の中央値を算出し、この値を細胞レベルのCaとして使用します。2正の応答指標
    2. 各実験条件について独立した実験を3回行い、各実験では条件につき1枚の培養ディッシュを使用してください。記述的な提示のために、3回の独立した実験で解析した細胞をプールし、nを各群で解析した細胞の総数として報告してください。
    3. Kolmogorov-Smirnov検定を用いて、細胞レベルのΔF/F₀データの正規性を評価する。
    4. Caが2蛍光応答データが非正規分布である場合は、データを中央値および四分位範囲（IQR）で提示してください。
    5. 既報に従い、ノンパラメトリックなFriedman検定を用いて群間差を分析し、続いてペアごとの比較のためにWilcoxon符号付き順位検定を行った。
    6. 検討する P < 統計的有意性を示すために0.05とする。

結果

高分解能透過電子顕微鏡（HRTEM）により、最終的なナノ粒子製剤は、表面修飾後にクラスター化した磁性コアと外殻を有することが示された（図 1）。最終的な f-SPIONs の平均全径は 63.36 ± 16.65 nm であり、Fe₃O₄ 含有の磁性コアは約 56.60 ± 6.19 nm、ポリドパミンおよび phalloidin-Alexa Fluor 350 で構成される外殻の平均厚さは約 5.79 ± 1.36 nm であった。これらの結果から、磁気駆動および蛍光ベースの可視化に適したスーパーパーティクル構造の構築に成功したことが確認された。

磁気ヒステリシス解析により、粒子は残留磁化および保磁力がほぼゼロであり、顕著な超常磁性挙動を示すことが明らかになった。10,000 Oe (1.0 T) の印加磁場下において、飽和磁化は約 35 A·m2/kg に達した（図 5）。磁場勾配がない状態では、f-SPIONs は水性媒質中で良好な分散性を示した（図 6A）。勾配磁場にさらされると、f-SPIONs は鋭敏な磁気応答性を示した（図 6B）。さらに蛍光解析により、粒子は合成および表面修飾後も光学的な検出能を保持していることが確認された（図 7）。

電磁刺激装置をライブセルイメージングシステムに正常に統合した（図 3）。磁場校正の結果、本装置は細胞培養領域全体にわたって安定した勾配磁場を生成することが示され（図 2E,F）、現在の実験構成におけるin vitroの勾配磁場は約3.25 T/mであった（図 2G）。

共焦点イメージングにより、蛍光磁性ナノ粒子がシュワン細胞へ効率的に取り込まれたことが示されました（図 7）。洗浄後、蛍光シグナルは培地中の遊離粒子ではなく、主に細胞に関連して保持されていました。アクチン標的製剤については、共焦点イメージングにより、粒子がアクチンに関連する細胞領域に集積していることがさらに示されました。

タイムラプス共焦点イメージングにより、磁気刺激と生細胞イメージングを同一の実験ワークフロー内で実施でき、かつ刺激期間中を通じて細胞への安定した光学的アクセスが維持されることが実証された (図2H および 図4A)。

定量的要約により、ナノ粒子の設計、デバイスの校正、および細胞内への取り込み量がさらに関連付けられました。3.25 T/m のin vitro勾配磁場において、単一の f-SPION に作用する磁力は約 1.59 × 10-5 pN と推定されました。細胞内鉄定量に基づくと、各 RSC96 シュワン細胞は約 9.30 ± 2.88 × 103 個の粒子を取り込んでおり、これは1細胞あたり約 0.15 ± 0.05 pN の推定総磁力に相当します。

ベースラインの蛍光と比較して、f-SPIONsを介した磁気刺激下において、RSC96細胞は活性なCa2+ダイナミクスを示し、Ca2+蛍光信号が有意に増加した（図4D）。Ca2+蛍光信号の定量分析により、磁気刺激群におけるRSC96細胞内のCa2+蛍光強度の変化（ΔF/F0）（62.96 [35.07–91.67]）は、正常対照群（-5.74 [-15.66–1.20]）、f-SPIONs対照群（-16.70 [-22.02–-12.00]）、および勾配磁場対照群（-12.90 [-21.24–-6.97]）よりも有意に高かったことが明らかになった（図4E）。

TEM画像におけるナノ粒子の構造。クラスター化したナノ粒子の詳細を示す電子顕微鏡分析。
図1: HRTEMによるf-SPIONsの形態およびコア・シェル構造。(A) f-SPIONsは球状で、Fe₃O₄ナノ粒子とCy3.5からなる内部磁性コアを持つ典型的なコア・シェル構造を示す。(B) 外殻はPDAとphalloidin-Alexa Fluor 350で構成されている。パネルBの画像は、パネルAの赤枠で囲まれた領域の代表的な拡大図であり、白線と矢印は測定されたシェル厚を示している。パネルBのスケールバーは10 nmを表す。3回の独立した測定を行い、計680個のナノ粒子を分析した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

銅線と鉄心を備えた電磁装置の図；磁場シミュレーション；グラフ化された磁場。
図 2: 生細胞磁気刺激用カスタム電磁石の構造、校正、および動作。(A,B) 電磁石コイルは、1.1 mmのエナメル銅線を鉄心に410回巻いて作製した。コイルの外径は60 mm、内径は20 mm、長さは110 mmで、直流抵抗は約1.2 Ωであった。極片のサイズは13.0 mm × 12.0 mm × 3.0 mm（長さ × 幅 × 高さ）であり、1J50パーマロイを用いて作製した。(C,D) 電磁石の最大入力電流は3 Aを超えないようにした。入力電流3 Aにおいて、極片付近に約6.7 T/mの磁場勾配が発生した。(E,F) 入力電流3 Aにおける、極片付近の培養皿内における勾配磁場の分布。細胞イメージング領域全体で、平均約3.25 T/mの静的磁場勾配が発生した。(G) 1 A、2 A、3 Aの異なる入力電流で電磁石により生成された磁場勾配。(H) 本研究における生細胞タイムラプスイメージング、電流印加、および勾配磁場曝露のプロトコル。電流を入力せずに50 s間、タイムラプス画像を連続的に取得した。その後、3.0 Aの一定の連続電流を印加し、10 min間タイムラプスイメージングを継続した。DC: 直流。GMF: 勾配磁場。パネルE、F、GはLiuら20から許可を得て改変した。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

CLSMイメージング、電磁石、ヒーター、および直流電源を備えた生細胞培養チャンバー。
図3: 生細胞培養チャンバーへの電磁石の組み込み。 (A) 細胞培養皿の領域に勾配磁場を印加するため、生細胞培養チャンバー内の校正された位置に配置されたカスタム小型電磁石。 (B) CLSMイメージングシステム、磁気ナノアクチュエーションプラットフォーム、および外部直流電源の統合セットアップ。 (C) 細胞培養チャンバーの各構成要素の温度設定を最適化することで、電磁石の動作中に培養皿内の温度を安定させている。 (D) 細胞培養チャンバーの各構成要素の温度設定パラメータ。CLSM: 共焦点レーザー走査顕微鏡。PV: 実測値。SV: 設定値。Top Heater: トップカバーヒーターの温度。Stage heater: 顕微鏡ステージおよび培養チャンバー底面の加熱温度。Bath heater: ウォーターバスの温度。Lens heater: 対物レンズヒーターの温度。Temp sensor: 温度プローブによって測定された実際の温度。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

磁気ナノアクチュエーション図；f-SPIONs、カルシウムイオン、DIC顕微鏡、蛍光結果。
図4磁気力刺激下におけるシュワン細胞のカルシウム応答の代表的な画像. (A) 磁気刺激とライブセルカルシウムイメージングのための統合ワークフロー2+ 磁気ナノアクチュエーションプラットフォームにおけるイメージング。B) ベースラインCa2+ 磁気刺激前に取得した蛍光画像（F非刺激). (C) カルシウム2+ 磁気刺激後に取得した蛍光画像 (F刺激）、蛍光強度の変化（ΔF）を示している。D時間分解Ca²⁺測定2+ 磁気刺激の前後にモニターした信号波形。E) Caの変化に関する定量分析および比較2+ 異なる実験群間における蛍光強度（ΔF/F₀）。DIC：微分干渉コントラスト。F非刺激磁気力刺激前の蛍光強度。F0：ベースライン蛍光強度。F刺激：磁気力刺激後の誘発蛍光強度。ΔF：蛍光強度の変化。「Normal」は正常対照群、「f-SPIONs+GMF」は磁気ナノアクチュエーション群、「f-SPIONs」はf-SPIONs対照群、「GMF」は勾配磁場対照群を表す。3回の独立した実験を行い、各実験において1つの実験条件につき1つの培養ディッシュを用いた。各細胞について、解析した時系列におけるΔF/F₀の中央値を細胞レベルの応答指標として使用した。データは中央値および四分位範囲（IQR）で示し、nは3回の独立した実験を通じて解析した細胞の総数を示す。統計解析は、Liuらによって以前に報告された方法に従い、フリードマン検定およびそれに続くウィルコクソン符号付き順位検定を用いて行った。パネルEの定量データは、Liuらから許可を得て改変して引用した。20. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

磁化対磁場グラフ、300Kにおけるヒステリシスループ、磁気特性分析、チャート。
図 5: f-SPIONsの超常磁性。 (A) 典型的な超常磁性挙動を示すf-SPIONsの磁気ヒステリシスループ。 (B) ゼロ磁場付近のヒステリシスループの拡大図。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

磁場実験：バイアルを伴うコイル。分散に対するGMFのON/OFF効果（PDI: 0.16）。
図 6: f-SPIONsの水系分散性と勾配磁場応答性。 (A) 勾配磁場がない場合、f-SPIONsは水系媒体中で良好に分散したままである。 (B) 勾配磁場を印加すると、f-SPIONsは磁場勾配の方向に沿って急速に移動し、蓄積する。GMF: 勾配磁場。PDI: 多分散指数。矢印は勾配磁場の方向を示す。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

Fe3O4ナノ粒子を用いた細胞イメージング。DIC、Cy3.5、ファロイジンのマージを示す蛍光顕微鏡像。
図 7: シュワン細胞におけるf-SPIONの内部移行のCLSM蛍光イメージング。 (A) f-SPIONs (15 µg/mL) と12時間共インキュベーションし、その後洗浄したシュワン細胞のCLSMイメージング（pinhole = 1 AU; z-step = 0.43 µm）。細胞形態が維持されており、細胞外粒子のバックグラウンドが最小限であることが示されている。 (B) Cy3.5チャンネル（Ex/Em: 561–568/607 nm）で検出された赤色蛍光は、シュワン細胞内にCy3.5標識f-SPIONsが存在することを示している。 (C) Alexa Fluor 350チャンネル（Ex/Em: 350–360 nm/440–460 nm）で検出された青色蛍光は、ファロイジン-Alexa Fluor 350機能化モジュールの導入が成功したことを裏付けている。 (D) マージ画像では、赤色と青色の蛍光信号の間に大幅な空間的重複が見られ、磁性-蛍光スーパー粒子の構築が成功したことと一致している。DIC：微分干渉コントラスト。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ディスカッション

酸化鉄ナノ粒子は、良好な生体適合性を備えた磁性ナノ材料として広く認識されています。超常磁性Fe₃O₄ナノ粒子は、汎用される磁気共鳴画像法（MRI）の造影剤として、臨床画像診断に幅広く応用されてきました29,30。我々のグループによる最近の研究20では、f-SPIONsが極めて低い細胞毒性と優れたバイオセーフティを示すことが実証されました。f-SPIONsを機械的アクチュエータとして用い、制御可能な電磁石と組み合わせたナノ磁気駆動プラットフォームは、シュワン細胞の細胞骨格ダイナミクスを効果的に活性化し、機械受容性Piezo1イオンチャネルの開口を誘導して経細胞膜Ca2⁺流入を誘発し、その結果として細胞内の遺伝子発現の「リプログラミング」と表現型変化を促進しました20。

このプラットフォームを正常に実装するためには、いくつかのステップが特に重要です。最初の重要なステップは、ナノ粒子の調製です。粒子は、合成および表面修飾の後も、良好に分散し、磁気応答性を持ち、光学的に検出可能である必要があります。どの段階であっても凝集が起こると、細胞内取り込みの均一性が低下し、有効な磁気特性が変化し、生細胞イメージングの品質が損なわれる可能性があります。

2番目の重要なステップは、細胞への導入および洗浄の手順です。ナノ粒子の濃度とインキュベーション時間は、細胞外への過剰な蓄積や細胞形態への悪影響を及ぼすことなく、検出可能なレベルの細胞内導入を達成するのに十分である必要があります。特に、蛍光イメージングを用いて細胞内局在を評価する場合、内部に取り込まれていない粒子や膜に結合した粒子を完全に除去することが不可欠です。洗浄が不十分な場合、局在パターンの誤認を招く可能性があり、細胞レベルでの力学的推定値に歪みが生じることもあります。

3番目の重要なステップは、試料に対する磁気刺激装置の幾何学的な位置合わせです。磁力は局所的な磁場勾配に直接依存するため、電磁コイルと試料平面の相対的な位置は、キャリブレーション時の構成と一致している必要があります。コイルと試料の距離や位置合わせのわずかな変化であっても、実効的な刺激条件を変化させる可能性があります。

このプラットフォームは、取り組む生物学的な問いに応じて変更することが可能です。一般的な磁気負荷および力の伝達で十分な場合は、アクチン標的化機能を持たせていないPDAコーティング蛍光スーパー粒子（SPIONs）を使用できます。アクチンが豊富な領域の近傍への細胞内局在を目的とする場合は、代わりにファロイジン機能化製剤（f-SPIONs）を使用できます。このモジュール性は、本プラットフォームの実用的な利点です。

本手法にはいくつかの限界がある。第一に、算出された細胞あたりの磁性粒子の取り込み数は集団平均値であり、単一細胞レベルでの粒子負荷量には必然的に不均一性が認められる。第二に、本研究で報告した磁力値はモデルに基づく推定値であり、細胞内機械的負荷を直接的に測定したものではない。第三に、本プロトコルは主にin vitroイメージング条件下で培養されたシュワン細胞向けに設計および開発されたものである。高密度な三次元細胞培養系や組織においては、ナノ粒子の取り込み、細胞内分布、光学的なアクセス可能性、および機械的カップリングが二次元培養とは異なる可能性があるため、大幅な最適化が必要となる場合がある。最後に、オプションであるアクチン標的化戦略は、アクチン関連領域への粒子の局在化の可能性を高めるが、生細胞内のすべてのアクチン富化構造に対して均一または特異的な標的化を保証するものではない。

これらの制限はあるものの、本磁気ナノアクチュエーションプラットフォームは、既存の力伝達技術に対していくつかの明確な手法上の利点を有しています。例えば、原子間力顕微鏡（AFM）は精密な局所的な力適用を可能にしますが、ターゲットとの直接的な機械的接触が必要であり、長期間の生細胞イメージングとの統合が必ずしも容易ではありません8。ストレッチベースのシステムやエンジニアリング基板は、細胞集団レベルで機械的な刺激を提供できますが、あらかじめ定義された材料界面に依存しており、リモートでの細胞内力伝達には適していません10。光ピンセットは力適用において高い空間分解能を提供しますが、レーザー誘起による組織損傷のリスクが伴います8。マイクロピペットベースの手法は操作が比較的簡単ですが、スループットと力の分解能が比較的低くなります12。マイクロ流体システムは、せん断応力や流体圧などの特定の機械的微小環境を構築するのに有利ですが、複雑な細胞環境の再現や、複数の機械的刺激モードの統合において技術的な課題があります11。対照的に、本プラットフォームは、リモートでの非接触刺激、制御可能な磁気アクチュエーション、蛍光ベースの粒子トラッキング、およびリアルタイム共焦点イメージングとの直接的な互換性を、単一のワークフロー内で統合しています。

同様の一般的な戦略を、他の機械刺激応答性細胞や、より複雑な生物学的モデルに適応させることが可能です。また、神経オルガノイドや上皮嚢胞、またはMadin-Darby canine kidney (MDCK) 様上皮などの、より密な多細胞系へ拡張できる可能性があります。このような環境では、機械的に結合した三次元試料における粒子の浸透、粒子の分布、および力の推定に関して、さらなる最適化が必要となります。これらの課題はあるものの、現在のワークフローは、生体システムにおける磁気機械刺激戦略のより広範な展開に向けた実用的な基盤を提供します。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（助成番号 82571677 および 82001304、Y.W.宛）、吉林省医療・ヘルスケア人材特別プログラム（助成番号 JLSRCZX2025-134、Y.W.宛）、および吉林大学ベスンプログラムプロジェクト（助成番号 2024B19、Y.W.宛）の支援を受けて実施されました。著者らは、ナノ材料の設計、合成、および特性評価にご協力いただいた吉林大学化学学院（超分子構造・材料国家重点実験室）および中国科学院長春応用化学研究所に感謝いたします。また、CLSMイメージングにご協力いただいた吉林大学第一附属病院翻訳医学研究所に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-ヘキサデカンジオールSigma-Aldrich213748工業用グレード、90％。熱分解合成に使用。
35 mm ibidi µ-ディッシュibidi80156シュワン細胞の培養およびイメージングに使用
ベンジルエーテルSigma-Aldrich10801498%; Fe用溶媒3O4 ナノ粒子合成
共焦点レーザー走査顕微鏡NikonAXR (Ti2-E)ライブセルイメージングおよび蛍光イメージングに使用される 
カスタム電磁石特注の該当なしin vitroにおける勾配磁場生成のための小型単極電磁石 
シアニン3.5カルボン酸Duofluor Inc.D10128Feに使用される蛍光染料3O4·Cy3.5スーパーパーティクルアセンブリ；分子量 593.20；保存温度 -20 °C、遮光して 
デフェロキサミンメシル酸塩Sigma-AldrichD9533非内部移行および膜結合鉄を除去するために使用される鉄キレート剤
デジタルガウスメーター磁気攪拌機WT103カスタム電磁石によって生成される磁束密度の測定および勾配磁場の校正に使用される
塩酸ドーパミンSigma-AldrichH8502≥98% (TLC)；ポリドパミンコーティングに使用
動的光散乱装置Malvern InstrumentsZetasizer Nano-ZS流体力学的直径およびPDI（多分散指数）の測定に使用 
Fluo-4 AM Invitrogen, Thermo Fisher ScientificF14201生細胞Ca2+測定に使用されるカルシウムインジケーター2+ イメージング
蛍光分光光度計島津製作所RF-6000フォトルミネッセンス特性評価に使用 
高分解能透過電子顕微鏡日本電子JEM-F200ナノ粒子の形態およびコアのHRTEM観察に使用–殻構造 
誘導結合プラズマ発光分光光度計PerkinElmerOptima 3300 DV細胞内鉄定量に使用される
アセチルアセトナト鉄(III)、Fe(acac)3Sigma-AldrichF30097%；Feの前駆体3O4 ナノ粒子合成
ライブセルステージトップインキュベーター東海HITTENP&CO2磁気刺激中の生細胞共焦点イメージングに使用 
オレイン酸Sigma-AldrichO1008≥99% (GC)；Fe用表面リガンド3O4 ナノ粒子合成
オレイルアミンSigma-AldrichO7805工業グレード、70%；ナノ粒子合成用リガンド
ファロイジン–Alexa Fluor 350Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA22281オプションのアクチン標的機能化試薬 
プルロニック F-127 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificP3000MP生細胞Ca²⁺測定におけるFluo-4 AMのローディングを促進するために使用されます。2+ イメージング
プログラマブルDC安定化電源同門eTM-L605SPL (60 V, 5 A)in vitroでの勾配磁場生成用カスタム電磁石に電力を供給するために使用される
RSC96シュワン細胞中国科学院細胞バンク該当なしラット由来シュワン細胞株 
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)Sigma-Aldrich436143ACS試薬、 ≥99.0%；油中水型マイクロエマルション用界面活性剤
SQUID磁力計Quantum Design Inc.MPMS-XL300 Kでの磁気ヒステリシス測定に使用 
トルエンSigma-Aldrich244511無水、99.8%；スーパーパーティクルアセンブリ用溶媒
透過電子顕微鏡FEIEP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin細胞および神経組織の超微形態観察に使用される 

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