脱着電気噴霧イオン化を用いた単細胞質量分析イメージングとオービトラップ質量分析計

サマリー

本プロトコルは、脱着エレクトロスプレーイオン化を用いてOVCAR-8細胞の単一細胞質量分析画像化を用い、Orbitrap質量分析器と結合して高空間分解能のメタボロミクス解析を行うことを説明しています。

要約

脱着エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング(DESI–MSI)は、最小限の試料準備で環境マトリックスを含まない分子イメージングを可能にします。このプロトコルは、DESIをOrbitrap質量分析計と結合したOVCAR-8セルの単一セルMSIのワークフローを記述しています。このシステムはDESIスプレーヤー、改良された質量分析計インターフェース、モーター駆動のXYZステージ、そして高空間分解能イメージング用の光学ブレッドボードを統合しています。細胞は格子状のガラスカバースリップで培養され、塩分干渉を減らすためにアンモニウム・フォーメイト溶液で洗浄され、乾燥させられ、常温条件下で分析されます。溶媒はナノ液体クロマトグラフィーシステムで連続的に供給され、窒素ガスのネブライゼーションは噴霧安定性を維持するために調整されます。また、ラスターイメージング、ピクセル制御、単一セルの定位のための光学から質量分析への画像登録も説明しています。Orbitrap検出による高い質量分解能と質量精度により、密接に関連する分子種の分化や単一細胞メタボロミクス解析の支援が可能です。このプロトコルは、複数のOrbitrap質量分析計プラットフォームを用いて高空間分解能の単一セルMSIを実装するための適応可能な戦略を提供します。

概要

メタボロミクスは、生物システム^1,2,3,4,5の機能状態を反映する小分子代謝物を包括的に特徴づけることを目指します。代謝物は酵素活性の直接産物であるため、細胞の表現型や生化学的調節の動的な読み取りを提供します。しかし、従来のメタボロムワークフローは通常、数千から数百万の細胞間で信号を平均化する大量抽出法に依存しており、そのため細胞の異^質性を曖昧に^{しています。}

単細胞メタボロミクスは、個々の細胞レベルでの分子プロファイリングを可能にすることでこの制約に取り組み、複雑な集団内の代謝多様性を明らかにし、疾患の進行、薬物反応、細胞分化のメカニズム的理解を向上させます。質量分析(MS)は、生物サンプルの分子分析に欠かせないツールです。最近のMS技術の進歩により、サンプル準備、計測、データ解析などにより、MSメタボロミクス研究は単^{細胞レベルで実施}可能となり^ました。

MSイメージング(MSI)は、生物サンプルの空間的に分解された分子解析を可能にするもので、サンプル表面^12,13,14の各定義された空間座標で完全な質量スペクトルを取得することで、正確なサンプル運動、最小化されたサンプリング、効率的なイオン化、データ可視化を統合します。MS画像は、x–y座標で選択された質量対電荷比(m/z)値の強度をプロットすることで再構成され、複雑な生物システム12,13,15,16,17,18の化学的空間情報を保持します。空間的に分解された単一細胞メタボロミクスを達成するには、分子局在を保持しつつ、低存在量の種を検出するのに十分な感度と質量分解能を維持できる分析プラットフォーム^{が必要です。}

単一細胞MSIは、個々の細胞の直径通常5〜20μmの範囲であるため、追加の課題を伴^います。この空間スケールでは、サンプリングイベントごとの分析物質の存在比は非常に限られています。したがって、サンプルの動きの正確な制御、最小化のサンプリング、高いイオン化効率、効率的なイオン伝達など複数の要素が、個々の細胞から解釈可能な分子情報を得るために同様に重要です(^14,22)。マトリックス支援レーザー脱着/イオン化(MALDI)–MSIは、高空間分解能MSI研究で日常的に用いられる真空ベースの技術で、マトリックス沈着と真空操作を必要とします。しかし、MALDIにおけるマトリックス結晶化は、分析物の非局在化や単一細胞スケール(23,24,25,26,27)で導入することがあります。これに対し、環境MSIアプローチは常温条件下で動作し、試料はほとんどまたは全く必要ないため、ほぼ本来の化学状態を維持できます。アンビエントMSI法の中では、DESI²⁸、nano-DESI²¹、空気圧支援型ナノDESI²⁹、単一プローブ8,30,31,32,33,34,35が単一細胞MSI研究に使用されてきました。微小液体抽出に基づく技術、例えばナノDESIや空気圧支援ナノDES、シングルプローブなどは高いサンプリング効率とイオン化を提供しますが、サンプリングプローブ先端で安定した液体橋を維持することに依存する一方で、表面形態の変化やプローブの詰まりなどの液体橋の摂動はMSI実験の質に影響を与える可能性があります^{5,8。21、30、35}。

DESIは、帯電した溶媒液滴が表面に衝突し、分析物を抽出し、イオン化種を含む二次液滴を生成する環境電離技術^です。DESIは非接触かつ詰まりのないサンプリングを提供し、ラスタベースのイメージングワークフローに対応しているため、高解像度のOrbitrapプラットフォーム20,37,38,39,40と結合した場合、光学的に識別された単一細胞の高解像度多イオン分子マッピングに適しています。DESIは組織イメージングに広く用いられていますが、技術^{的な課題の}ため単細胞MSIにはほとんど適用^{されていません。}Waters DESI XSとSELECT SERIESサイクリックIMS質量分析計を組み合わせた商業的なセットアップを用いた最近の研究では、複数の細胞株に対して単一細胞分解能が達成可能であることが示されました。DESI–MSIで高い空間分解能を達成するには、イオン化効率、イオン透過率、捕捉速度、スプレーヤーの整列^12、20、28の協調制御が必要です。特に、DESI XSや脱着電気フロー集光イオン化(DEFFI)などの新世代DESIスプレーヤーの設計の進歩により、サンプ^{リングエリアは}大幅に減少^{しました。}さらに、ナノ液体クロマトグラフィー(LC)ポンプによるナノリットル毎分の溶媒流量の低減により、空間閉じ込めが大幅に改善され、単一細胞分子区分²⁸を実現できます。この手法は単一セル解像度のMSIを実現しましたが、特定のベンダー(Waters)の計測機器に依存しています。したがって、単一セルDESI–MSIのより広範な実装には、Orbitrapシステムなどの広く利用可能な高分解能質量分析計と統合可能な戦略が必要であり、高感度、質量精度、分解力を提供します。DESIとOrbitrap質量分析計の組み合わせは、複雑な細胞抽出物20,43,44における密接な間隔かつ等圧種の分化を含む単細胞MSI研究に新たな機会を提供します。

このプロトコルは、Waters DESI XSスプレーヤーとOrbitrap質量分析計を統合し、単一セルMSI研究を行うためのモジュール戦略を説明しています。ワークフローは、細胞の付着と光学相関のためのグリッド付きのカバースリップ、制御されたラスタスキャンのためのモーター駆動のXYZステージ、安定したスプレー形成のためのナノスケール溶媒供給、高解像度オービトラップ検出を統合しています。プラットフォームとしてThermo Orbitrap Tribrid Lumos質量分析計が選ばれましたが、適切な機械的適応と最適化により、他の多くのソースインターフェース形状を備えたOrbitrap質量分析計モデルは、同様のカスタマイズ済みDESI XS構成と組み合わせることが可能です。

プロトコル

OVCAR-8細胞はアメリカ型培養コレクション(ATCC)から入手されました。すべての細胞培養手順は、機関のバイオセーフティガイドラインに従って実施されました。製造元の指示に従い、マイコプラズマ検出キットを用いて細胞のミコプラズマ汚染検査が定期的に行われました。

注意:すべての手順は機関のバイオセーフティガイドラインに従って実施してください。適切な個人用防護具を着用してください。有機溶剤は化学換気フードで取り扱いましょう。

1. グリッド化されたカバースリップ上でOVCAR-8細胞を培養・準備する

1. RPMI-1640培地に胎児用牛血清10%とペニシリン・ストレプトマイシン1%を補足して完全な培地を調製します。ミディアムを37°Cまで温めます。
2. OVCAR-8細胞を10 mLの全培地を含む10 cmの細胞培養皿に保持します。細胞は5%_CO2の加湿インキュベーターで37°Cで培養します。
3. 培養面の約80%が接着細胞で視覚的に占められている時点で、通常2日ごとに配管します。
   1. 10cm培養皿から培地を吸引し、1×/リン酸塩緩衝生理食塩水5mLで細胞を一度洗浄します。
   2. 培養皿に0.25%のトリプシン–エチレンジアミネテトラ酢酸2 mLを加えます。細胞は37°Cで約3分間、または顕微鏡で観察した際に大部分の細胞が培養表面から目に見えて剥がれるまで培養します。
   3. トリプシンを中和するために、事前に温めた完全な培地8mLを加えます。10 mLの血清学ピペットを使い、細胞懸濁液を約15〜20回上下に優しくピペットさせて細胞を分散させます。
   4. 懸濁液1 mLを新鮮な全培地9 mLに移します。
   5. 自動セルカウンターを使ってセル数を数えます。再懸濁セル懸液10μLを追加の希釈なしで直接カウントスライドに注入し、メーカーの指示に従ってセルカウントを行います。
      注:このプロトコルではトリパンブルーのような細胞生存性染料は使用されませんでした。トリプシン化前の細胞形態と付着を目視で評価します。
4. 表紙に細胞を種をまきましょう。
   1. 細胞を完全な培地で最終濃度~1 ×⁶ cells/mLに希釈します。必要なセル懸濁体積を計算_{します。C 1}はカウントセル濃度、V₁は必要なセル懸濁液の体積、_C2は目標濃度、_V2は望ましい最終体積です。
   2. 50μmのグリッド間隔で28mmのグリッド付きガラスカバースリップを6ウェルプレートのウェルに個別に配置します。
      注意:細胞培養使用前にガラスカバースリップをオートクレーブしてください。細胞の成長妨害を最小限に抑えるために、グリッド側を下向きに配置してください。
   3. 各ウェルに2mLの完全培地と200μLの細胞懸濁液(~2×10個⁵ セル/ウェル)を加えます。6ウェルプレートを「X」字型に優しく揺らして、セルがカバースリップ面に均等に分布するようにします。
   4. 細胞を約15〜20時間潜伏させ、細胞の付着を促します。
      注意:細胞の形態を顕微鏡で定期的に観察し、正常な細胞成長を確認しましょう。細胞の増殖が悪い場合は、マイコプラズマ検出キットを使ってマイコプラズマ汚染の可能性を調べてください。

2. アンモニウム・フォーミン(AF)溶液による細胞洗浄

注意:使用前に新鮮なAF溶液を準備してください。

1. 使用直前に等張性AFウォッシュバッファーを準備してください。AFを0.45gの重さで、LC/MSグレードの水50mLに溶かして最終AF濃度0.14 M(w/w/w0.9%)を準備します。pH ^5.45は調整しないでください。
   注意:調理当日に新たに調製されたAF溶液を使用してください。使用まで溶液は氷状(0°C–4°C)に保ちます。
2. 6ウェルプレートの各ウェルから培養培地を吸引します。すぐに各ウェルに2mLの冷水溶液を加えます。
3. 滅菌鉗子を使い、細胞で覆われた表面を上向きに保ちながら、接着細胞を含むカバースリップを優しく井戸から持ち上げます。カバースリップを2〜3秒間、冷たい0.9% AF溶液2mLをあらかじめ充填した別のウェルに短く置きます。
4. すすぎを繰り返し、各すすぎごとに新鮮なAF溶液で合計2回すすぎます。最終洗浄後、AF溶液からカバースリップを取り出し、DESI–MSI分析前に化学煙幕の室温で約20〜30分間自然乾燥させます。
   注意:洗浄時に細胞を乱さないように、優しくすすすぎてください。

3. 修正されたFAIMSベースのMSインターフェースの製造

1. FAIMS Pro電極イオン源ハウジングアダプターを分解して内部電極領域にアクセスします。アダプターがFAIMS Proインターフェース構成を搭載したThermo Orbitrap質量分析計に対応しているか確認してください。
2. FAIMSの電極部品、内部配線、電極アセンブリ、Oリング、支持内部構造物を取り外します。外部ハウジングシェル、取り付けフランジ、質量分析計によるアダプタ認識に必要なインターフェース検出ピンを保持します。
3. 標準的な機械工場の加工手順で円形開口部を修正します。開口部を拡大し、突出したオービトラップの入口/イオンファンネルアセンブリの周囲に十分なクリアランスを確保します。
4. 切削後は加工された刃を滑らかにし、毛玉を除去します。改造された開口部により、質量分析計上のハウジングアダプターの位置が妨げられずに設置可能であることを確認してください。
5. ハウジングアダプターの2本の脚の長さをノコギリで調整します。脚を最終的な長さ約2 1/4インチにトリミングし、光学ブレッドボードと接続できるようにします。
   注意:適切な加工工具を使用し、残りのハウジングの構造的な強度を損なわないようにしてください。
6. アルミニウム製の光学ブレッドボード(10インチ×12インチ×0.5インチ、1/4インチから20インチのタップ穴)を準備します。改変されたFAIMSアダプターの下にブレッドボードを水平に位置させます。
7. 改造されたFAIMSアダプターを光学式ブレッドボードに接続するには、2つの取り付けブラケットを使用します。必要に応じてブラケットをトリミングして重量を減らし、ブレッドボードをオービトラップの入口に対して適切に配置できるようにします。
8. 修正されたFAIMSインターフェースを、機械的に互換性のある取り付けハードウェアで光学ブレッドボードに固定し、ブレッドボードの1/4インチ-20タップドホールパターンに合わせます。イメージング実験中の安定した位置を確保すること。
   注意:ステージ移動やデータ取得時の振動を最小限に抑えるために、インターフェースがしっかりと固定されていることを確認してください。
9. 光学ブレッドボードのFAIMS ハウジング接触部の真下に、浅い溝を機械加工または切断します。溝のサイズと位置を調整し、改造されたFAIMSハウジングの安定した座着とオービトラップ入口に対する位置合わせを確保する。
   注意:溝のサイズはFAIMSハウジングアダプターのベースを収容し、位置の再現性を向上させてください。
10. 取り付けられたインターフェースを質量分析計の入口に合わせます。固定された取り付けフランジが楽器に正しく取り付けられているか、そして光学式ブレッドボードがインターフェースの下で水平に保たれているかを確認してください。
11. DESIスプレーヤーを設置する前に、改造された円形開口部がOrbitrapの入口/イオンファンネルアセンブリの周囲に障害物のないクリアランスを確保することを確認してください。

4. DESIスプレーヤーとオービトラップインターフェースの組み立て

1. DESIスプレーをカスタマイズされたFAIMSフレーム、モーター駆動のXYZステージ、ガスレギュレーター、光学ブレッドボードからなる統合セットアップに取り付けます。CONEX-MFACCコントローラーで制御されるモーター付きステージを使用します。
2. x軸を左から右へのラスター走査方向として定義し、y軸を上から下へのラインステップ方向と定義します。取得前にz軸の位置を設定し、画像撮影中は固定しておきましょう。
3. ステージの移動範囲はx方向に約1mm、y方向に約1mmです。取得中にz軸の動きを適用しないでください。
4. DESIスプレーヤーは試料表面に対して約70°の角度で配置します。サンプルをスプレーヤーの真下に置き、スプレーヤーの先端は物理的に接触せずにオービトラップの入口にできるだけ近づけます。
5. DESI接地金属を質量分析計の下の接地源に接続します。ステージコントロールソフトウェア(図1)を使ってラスタの動きを制御します。
   注:本研究で使用されたDESIスプレーヤーは、DESI–MSI機器を持つユーザーのみが利用可能です。
6. ステージの移動や位置決めにはモーター駆動のXYZステージコントローラーを使いましょう。運転前に電圧線、窒素ガス管、溶剤管、接地線を接続してください。
7. オービトラップイオン源入口に合わせて設計されたカスタム製造のステンレス製イオン転送チューブ(外径1/16インチ×内径0.033インチ)を設置します。イオントランスファーチューブをオービトラップ入口と直接合わせ、外側に十分に伸ばしてDESIプルームの障害物のないアクセスを可能にする位置に配置してください。
   注意:イオントランスファーチューブは質量分析計の設定に合わせてカスタマイズしてください。適切な加工手順でイオン転送チューブを製作してください。
8. DESIスプレーヤーのサンプル表面およびオービトラップ入口に対する位置を改善するために、曲げられた形状のイオン転送チューブを使用します。
9. スプレーヤーを試料表面に対して約70°の角度で整列させ、DESIの噴霧プルームが試料表面に接触せずにオービトラップ入口領域と交差するようにします。
10. 取得時の安定した質量スペクトルと一貫した正規化レベル(NL)値の存在によって、安定した噴霧プルームを定義します。スプレーヤーの位置を調整し、安定したイオン信号が確認されるまで続けます。
11. スプレーヤーから表面までの距離を約1.0〜1.5mmに設定し、開始条件として設定します。NL値を監視しながら手動でスプレーヤーの位置を微調整し、最も安定したイオン信号を得ることができます。

図1。統合脱着電気噴霧イオン化(DESI)-質量分析イメージング(MSI)セットアップをオービトラップ質量分析計と連結。 DESIスプレーヤーは、改良型高磁場非対称波形イオン移動度分光法(FAIMS) アダプター、モーター駆動のXYZステージ、ガスレギュレーター、光学式ブレッドボードからなる統合プラットフォームに搭載されています。溶媒はナノ液体クロマトグラフィーシステムで供給され、窒素ガスは約12 psiで供給され、スプレー安定化が行われます。図はまた、イオン化電圧接続、溶媒ライン、そしてオービトラップ入口に対するスプレーヤーの位置を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

5. 溶媒供給および噴霧条件の設定

1. DESI–MSI分析前に、メタノール/水/蟻酸(98:2:0.1、v/v/v)からなる新鮮な噴霧溶媒を準備します。
   注:最適化後にアセトニトリル系溶媒や異なるメタノール/水比を含む他のDESI互換溶媒系を使用することがあります。このプロトコルでは、メタンオール/水/蟻酸(98:2:0.1、v/v/v)が標準開始条件として用いられました。これは、安定したプルーム形成、溶媒拡散の低減、単細胞DESI–MSI実験中の再現性の正イオンモード脂質シグナルを提供したためです。
   注意:メタノールは可燃性かつ有毒です。蟻酸は腐食性があります。溶剤は化学換気フードで扱います。
2. 報告された実験では、Ultimate 3000ナノLCシステムをアイソクラティック溶媒ポンプとして750 nL/minで運用して溶媒を供給しました。ナノLCコンセントをPEEKチューブ(外径1/16インチ×内径0.005インチ)でDESIスプレーヤーに接続します。
3. C18カラム(例:nanoEase M/ZペプチドBEH;130 Å、1.7 μm、300 μm × 150 mm)を直列に設置し、低流量で安定した噴霧形成に十分な背圧を確保します。
4. 質量分析法を正イオンモードに設定し、オービトラップ検出、噴霧電圧0.85 kV、オービトラップ分解能120,000、m/zレンジを150–1200に設定します。
5. 正規化されたAGCターゲットを100%に設定し、最大注入時間を100ms、RFレンズを45%、マイクロスキャンを1に設定します。クアドルーポールのアイソレーションとソース断片化を無効にしてください。
6. 窒素発生器または液体窒素源から約12psiの窒素シースガスを供給し、DESI噴霧のプルームを安定化させます。開始動作圧力は12 psiにし、必要な場合のみ手動で微調整を行い、NL値を改善し、質量スペクトルを安定させる。

6. ラスタイメージングおよびピクセル制御の実施

1. グリッド化されたカバースリップを基準に、光学的に可視化された単一セルを含む関心領域を特定します。隣接細胞から明確に視覚的に分離し、形態が完全な、破片や細胞クラスターとの明らかな重なりがない孤立細胞を選びます。
2. Fance Stage Controllerソフトウェア⁴⁶を使ってラスター領域を定義します。ラスタステップサイズを0.01mm、ステージ速度を0.01mm/s、滞留時間を20秒に設定します。
3. 各線を左から右にラスタスキャンし、その後Y方向の次の線へ移動します。ラスタライン間の直交ステップサイズを10μmに設定します。
4. オービトラップの取得速度に応じて段の速度を調整し、望ましいスキャン方向のピクセル寸法(例:約2.5〜6.5μm)を実現します。スキャン方向ピクセル寸法は次の関係式で計算します:スキャン方向ピクセル寸法=ステージ速度×1スキャンあたりの取得時間。
5. 段速0.01 mm/s(10 μm/s)を用い、102秒で376回のスキャンを取得することで、1回あたり0.271秒の取得時間と約2.7 μmのスキャン方向ピクセル寸法を実現します。段の動きと質量スペクトルの取得を同期させるには、Orbitrapの取得タイミングを段移動と滞留タイミングの合計パラメータよりやや短く設定します。
   注:直交ピクセル寸法はプログラムされたステップサイズとステージの物理的・機械的制限によって決まり、スキャン方向寸法はステージ速度とスペクトル取得速度によって決まります。
6. 選択された質量範囲でイメージングデータを取得し、あらかじめ定義されたラスタ領域が完成するまで行います。0.01 mmのラインステップと0.01 mm/sの段速で取得した1 mm×1 mmのイメージング領域の場合、総取得時間は約4〜5時間です。
7. 取得時にRAWデータファイルを生成し、指定されたx–yラスタ座標および対応する機器メソッドの時間が完了したら取得を停止します。ここで説明する正イオンモードの条件下では、各ラスタラインは通常約50MBのRAWファイルを生成し、合計101本のラスタラインに対して約5GBのデータが得られます。

7. 光学からMSへの画像登録

1. AF洗浄・乾燥後、DESI取得前の選定グリッド領域の細胞の明視野画像を、10×対物レンズを備えた明視野顕微鏡で撮影します。
2. ProteoWizard⁴⁸のmsConvertを使ってRAWファイルをmzMLファイルに変換します。mzMLファイルをimzMLコンバー^ター49を使ってimzML形式に変換します。
3. 取得したデータフォーマットに合ったセントロイド/プロファイル変換設定を使用してください。imzMLファイルを直接METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ にアップロードして画像の可視化を行います。
4. 可視化前に正規化、ホットスポット除去、追加の画像補正を適用しないでください。グリッドランドマークを位置基準として手動で光学画像とMS画像を整列させます。
5. 既知の画像寸法とグリッド間隔を使って光学画像を拡大縮小します。MS画像を手動で重ね合わせて、光学的に可視化された細胞位置と局在するイオン信号の対応関係を評価します。
6. 明視野画像中の単離細胞と対応するMSイオン分布間の視覚的一致により単一細胞の局在を確認します。

結果

このプロトコルの成功裏の実行により、光学的に識別された単一細胞が局所的な分子イオン信号に対応するDESI–MSIデータセットが生成されます(図2)。DESI–MSI解析前に取得されたブライトフィールド顕微鏡画像は、個々のOVCAR-8セルの目視識別を可能にし、グリッド化されたカバースリップを位置基準として光学からMSへの画像登録を促進します。代表的なDESI–MSIイオン画像は、対応する明示場画像で特定された個々の細胞と空間的に相関する局所的なイオン分布を示しています(図2A–2D)。

図2。OVCAR-8細胞の明視野顕微鏡とMSIの比較。 (A) 10×倍率で取得したOVCAR-8細胞のブライトフィールド顕微鏡画像。(B–D)DESI–MSIを用いて5.5 μm×10 μmのピクセルサイズで取得したMS画像。代表イオン分布は、(B) m/z 317.111、(C) m/z 808.562、(D) m/z 788.616 の分布を示しています。スケールバー=50μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

個々の細胞は複数の脂質関連イオンと小分子を含む完全な質量スペクトルを生成します。単一の分子マーカーに依存するのではなく、各細胞は多イオン分子プロファイルを示し、それが化学的な指紋として機能します。m/z 317.111、m/z 808.562、m/z 788.616の代表的なイオン画像は、隣接する細胞間で不均一な分子分布を示し、単一細胞レベルで測定可能な代謝異質性を示しています(図2B–2D)。METASPACEに基づく注釈は、m/z 808.562およびm/z 788.616で検出されたイオンは主にホスファチジルコリンおよびホスファチジルタンノールミン脂質種と関連している一方、m/z 317.111は複数の候補的な小分子およびジペプチド関連種に対応していることを示唆しました。これらの結果は、プラットフォームが環境条件下で光学的に識別された単一細胞から空間的に局在する分子特徴の検出を可能にすることを示しています。仮注釈付き種、MS/MSで同定された種、代表的なMS画像、質量スペクトルなどの追加結果は、過去の研究²⁰で提供されています。

統合されたDESI–MSIプラットフォームは、DESIスプレーアー、改良されたFAIMSアダプター、モーター駆動のXYZステージ、そしてOrbitrap入口に隣接する光学式ブレッドボードで構成されています(図1)。このセットアップにより、安定した溶媒の供給、制御されたステージの動き、そして環境単一細胞イメージング実験において、DESIスプレープルームと質量分析計の入口の整列が可能になります。 図3 に示されたカスタマイズされたイオン転送管は、DESIソース領域とオービトラップ入口間のイオン伝導を可能にします。曲げた毛細管形状により、DESIスプレーヤーのサンプル表面および入口領域に対する位置調整が容易であり、イオン輸送の妨げられずに維持されます。

図3。Orbitrap MSI用のカスタマイズイオントランスファーチューブ。 DESIスプレーヤーとOrbitrap Fusion Lumos質量分析計を結合するために使用された特注製造のイオン転送チューブの写真。図は、環境単一セルMSI実験中のイオン伝導に用いられる曲げたトランスファーキャピラリー形状と取り付けアセンブリを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4 は、光学式ブレッドボードとモーター駆動のXYZ段と統合された改良型AIMSアダプターを示しています。上図(図4A)はサンプルステージと改造アダプターのオービトラップ入口に対する位置を示し、下図(図4B)はイメージングプラットフォームを支える取り付けブラケットと段の組み立てを示しています。統合アセンブリの機械的安定性は、画像取得時のラスタ移動の一貫性を維持し、位置ドリフトを最小限に抑えるために重要です。

図4。光学ブレッドボードおよびモーター駆動のXYZ段と統合された改良型高場非対称波形イオン移動度分光法(FAIMS)アダプター。 (A) オービトラップ入口とサンプルステージに隣接する改造アダプターの上図。(B) 下図は、イメージングプラットフォームを支え整列するために使用された改造ブラケット、光学式ブレッドボード、モーター駆動のXYZステージアセンブリを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

オービトラップ検出による高い質量分解能により、密接に間隔をあげる等圧的な脂質種の区別が可能となり、低質量分解能システムと比較して分子特異性や画像コントラストが向上します。段階速度とスペクトル取得速度の同期により、小さなピクセル寸法を実現できます。例えば、2.7 μm×10 μmといったピクセル寸法は、急速取得可能なOrbitrapプラットフォームと最適化されたラスタパラメータ⁴²を用いて達成されています。高空間分解能のイメージングにより、隣接する細胞間の分子区分が可能であり、隣接する細胞領域間の信号重複を最小限に抑えます。

成功したDESI–MSI実験は、安定した噴霧条件、ラスタライン全般のイオン強度の一貫性、そして光学画像内の個々の細胞に対応する分子信号の空間的局在が特徴です。最適でない実験では、不安定なスプレー形成、適切なスプレーの整列、過剰な溶媒拡散、採取時のサンプル移動などにより、拡散したイオン分布、低い信号強度、不均一なラスターパターン、細胞の定位喪失を引き起こすことがあります。スプレーの整列、溶媒流量、段速度、試料の位置の綿密な最適化により、単一細胞イメージング実験中の空間精度とイオン信号の安定性が向上します。

ディスカッション

このプロトコルは、高精度な段制御、ナノスケール溶媒送達、光学的ターゲット化、高空間分解能質量分析を統合することで、高質量分解能オービトラップ質量分析計を用いた環境単一細胞DESI–MSIを可能にします。これらの要素の組み合わせにより、単一セルレベルでのDESI–MSIの適用を歴史的に制限してきた複数の技術的障壁に対処しています。特に、スプレーの安定性、イオン伝導、取得タイミングの協調制御により、個々の細胞に対応する極めて小さなサンプリング体積から分子信号を確実に検出できます。このワークフローで性能を左右する中心的な要因は、DESI噴霧のプルームの安定性と閉じ込めです。マイクロメートルスケールの空間分解能では、溶媒流量、ガス圧、またはスプレーヤーの位置の微小な摂動が有効サンプリング面積を大きく変えることがあります。ナノスケールの溶媒供給と適切な背圧の組み合わせにより、噴霧の安定性が向上し、溶媒の拡散を抑え、空間的な忠実度が向上します。さらに、スプレーヤーから表面までの距離と角度を一定に保つことは、再現性のあるイオン化効率のために非常に重要です。形状のわずかな偏差でも、特に異種細胞サンプルを解析する際には信号強度に大きな変動が生じることがあります。実際には、DESIスプレー条件の最適化は、取得時に総イオン電流、スペクトル安定性、NL値(通常は約10⁵〜10⁶)を監視することで実証的に行われました。スプレーの位置、溶媒流量の安定性、ガス圧、そしてDESIプルームのオービトラップ入口に対する整列の反復調整により、再現可能な信号品質が達成されました。

イオン伝達効率は、分析物の存在比が個々の細胞内で本質的に低いため、単一細胞スケールでのもう一つの重要な制約を示しています。これらの空間スケールでは、効率的イオン伝導が一部の実装でイオン化効率よりも実用的な制約となることがあります。なぜなら、最終的に質量分析器の入口に到達する脱着イオンはごく一部に過ぎないからです。したがって、サンプリング領域から質量分析器入口へのイオンの効率的な移動が不可欠です。このプロトコルで使用される改良型AIMSハウジングアダプターは、DESIスプレー源と熱質量分析計とのインターフェースを提供し、Orbitrap Tribrid、Exploris、Astralシリーズプラットフォームなど複数の機器モデルとの互換性を可能にしています。改造されたFAIMSハウジングアダプターと光学ブレッドボードの統合も機械的安定性を提供し、長時間のイメージング実験中のずれを最小限に抑えます。ステージの動きと質量スペクトル取得の同期は、高い空間分解能を達成するために同様に重要です。DESI–MSIでは、スキャン方向のピクセル次元は段速度と獲得速度の関係によって決まり、直交次元はプログラムされたステップサイズによって定義されます。これらのパラメータを正確に制御することで、正確なサンプリングが可能になります。多くの哺乳類細胞は通常直径約5〜20μmであるため、隣接細胞間の信号重なりを最小限に抑え、分子特徴を個々の細胞領域に位置づけるためには、数マイクロメートルに近いピクセルサイズが必要です。しかし、名目上のピクセルサイズは必ずしも真のサンプリングフットプリントに対応しません。なぜなら、溶媒プルームと試料表面の相互作用によって横方向の拡散や隣接ピクセル間の部分的な信号重なりが生じる可能性があるからです。したがって、報告されたピクセル寸法は厳密な幾何学的定義ではなく、効果的な空間分解能の文脈で解釈されるべきです。本研究で使用されたカスタマイズされたイオン転送管は、標準イオン転送管の形状に基づいて設計され、イオン透過特性を保ちつつDESIソース構成との統合を可能にするよう設計されました。

オービトラップ質量分析計による高い質量分解力と質量精度は、個々の細胞内に存在する複雑な代謝物と脂質の混合物を分解するために不可欠です。検出された多くの分子特徴は、正確な質量測定とMETASPACE解析を用いて仮に注釈付けされました。複数の候補割り当てが単一のm/z値に対応する可能性があるため、追加のMS/MS検証および直交分子確認戦略は、今後の研究で分子同定をさらに強化する可能性があります。正イオンモードでは、DESIスペクトルはしばしば密集または等圧的なm/z値を持つリン脂質種が優勢です。高解像度オービトラップ検出により、これらの種の区別が可能となり、分子特異性が向上し、スペクトルの曖昧さが軽減されます。この機能は、限られたイオン数に依存することで細胞の異質性の誤解釈につながる単一細胞解析において特に重要です。この適応性は、適切な改良を加えた対応するインターフェースを用いた他の質量分析プラットフォームにも同様の戦略が適用可能であることを示唆しています。これらの利点にもかかわらず、いくつかの制限を考慮する必要があります。まず、現在の作業で使用されているDESIソースはDESI–MSIシステムを持つユーザーのみが利用可能であり、DESIスプレーヤー/オービトラップシステムの構築はDESIソースの入手可能性によって制限される可能性があります。しかし、DEFFIを含む代替のDESIデバイスは、高空間解像度MSI研究にも実装される可能性があります(^42,47)。次に、このプラットフォームの実装には、計測器インターフェースの加工や取り付け部品の製造など、かなりのカスタマイズが必要です。これらの要件は、機器開発や機械製造の経験がない研究室のアクセスを制限する可能性があります。現在の実装では、FAIMSインターフェースハウジングがDESIスプレーヤーアセンブリをオービトラップ入口に対して位置決めするための便利な機械的取り付けプラットフォームとして機能しています。したがって、FAIMS互換のOrbitrapシステムや基本的な加工支援を持つ実験室では、この構成の実装がより実用的です。しかし、DESI源をオービトラップインレットに機械的に結合するというより広い概念は、AIMSインターフェースハードウェアを改造せずに代替設計を用いて実現可能です。第三に、低溶媒流量は空間閉じ込めを改善するものの、全体のイオン収率を低下させる可能性があるため、感度と空間分解能のバランスを取るための慎重な最適化が必要です。

もう一つ重要な考慮点は、サンプリング中の分析物の非局在化の可能性です。DESIは常温条件下で動作し、マトリックス塗布を必要としませんが、溶媒液滴と試料表面の相互作用により、特に高溶解度の種では分析物の再分布を引き起こすことがあります。したがって、溶媒の容積を最小化し、噴霧条件を最適化することは、単一細胞レベルでの空間的整合性を保つために極めて重要です。同様に、等張性アンモニウム・フォーマテを用いた洗浄手順は、単一細胞MSワークフローで報告されているように、細胞の完全性を維持し細胞種を保存しながら塩関連イオン抑制を低減^{できます。}

今後の開発により、このプラットフォームの性能と適用性がさらに向上する可能性があります。例えば、高速なデータ取得システムとの統合により、より小さな実効ピクセルサイズや高スループットのMSI実験が可能になります。自動アライメントシステムやリアルタイムフィードバック制御の導入により、変動性を減らし再現性を向上させる可能性があります。さらに、このアプローチを蛍光イメージングや標的標識戦略などの補完的な手法と組み合わせることで、細胞型同定が向上し、マルチモーダル解析が可能になります。

技術的な考慮を超えて、このプラットフォームは生物学および生物医学研究に広範な影響を持ちます。個々の細胞レベルでの分子プロファイルを環境条件下で特徴付ける能力は、複雑系における細胞の異質性を研究する新たな機会をもたらします。DESI–MSIはすでに腫瘍微小環境、神経疾患、宿主–病原体相互作用、薬剤耐性細胞集団の研究において組織レベルで成功裏に応用されています(12,15,16,35)。DESI–MSIを単一細胞レベルに拡張することで、隣接する細胞間の局所的な化学的異質性の区分、希少細胞亜集団の特定、そしてバルク組織測定では隠されがちな分子マーカーの発見能力がさらに向上する可能性があります。しかし、本研究は単層細胞培養モデルを簡略化したもので実施されており、異なる細胞モデル、組織、オルガノイド、3次元培養など他の複雑な生物システムとの適合性を示すためにはさらなる研究が必要です。現在のワークフローは、さらなる検証と最適化を経て、ますます異質化する生物学的環境に向けて高空間分解能のDESI測定を拡張するための基盤を提供する可能性があります。この方法は空間的な文脈を保持しつつ詳細な分子情報を提供するため、画像診断とオミクスベースのアプローチをつなぐ架け橋として機能します。まとめると、このプロトコルはオービトラップ質量分析計上で単一細胞分解能のDESI–MSIを達成するための柔軟かつ適応可能な枠組みを確立します。イオン化効率、イオン伝達、空間制御、質量分解能に関連する主要な課題に取り組むことで、このアプローチは個々の細胞の詳細な分子特性解析を可能にします。さらなる最適化と検証が必要ですが、この手法は単細胞および空間メタボロミクス研究における環境MSIの利用拡大の基盤を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
−80 °C freezer	Eppendorf New Brunswick	U700	生物学サンプルの調製前の保管。
6" vertical bracket for breadboards, 1/4"-20 holes (2 pieces)	Millipore Sigma	VB01A	カスタムスプレーヤーマウントアセンブリの機械的サポートと安定化
アセトニトリル	Fisher Chemical	240744	DESI互換溶媒の調製と最適化のための有機溶媒
アンモニウムホルミット	Thermo Fisher Scientific	401152500	DESI–MSI前のセル洗浄用の等張アンモニウムホルミット洗浄バッファーの調製
明視野顕微鏡	Fisher Scientific	12575252	DESI–MSI取得前の付着細胞の光学イメージングと可視化
C18カラム	Waters	186009259	安定したナノフローDESIスプレー形成のためのインラインバックプレッシャー生成
銅線	N/A	N/A	スプレーヤーマウントの製作中の電気接続と接地
DESI XSスプレーヤー	Waters	700014033	単一細胞DESI–MSI実験のためのアンビエントDESIイオン化源
エポキシ樹脂	Devcon	20945	カスタムスプレーヤーマウントのコンポーネントの機械的安定化と固定
FAIMS Pro電極イオン源ハウジングアダプター	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	カスタムOrbitrap互換DESIインターフェースの修正と製作
ギ酸	Ward’s Science	470301-120	DESIスプレー溶媒調製の酸修正剤
メタノール	Fisher Chemical	A456-4 Optima	DESIスプレー溶媒調製の有機溶媒
ガスレギュレーター	Millipore Sigma	23831-U	DESI操作中の窒素シースガス圧の制御
グリッド付きガラスカバースリップ	Ibidi	10817	細胞培養基質と光学からMS画像への位置登録のための位置参照
接地線	N/A	N/A	DESIスプレーヤーとインターフェースアセンブリの電気接地接続
インキュベーター	HeraCell	51026282	制御された温度とCO2条件下での哺乳類細胞培養の維持
LC/MSグレードの水	Thermo Fisher Scientific	W6500	アンモニウムホルミット洗浄バッファーとDESIスプレー溶液の調製
METASPACEプラットフォーム	METASPACE	https://metaspace2020.eu	クラウドベースのMS画像視覚化と空間メタボロミクスデータ分析
改良型FAIMSインターフェース	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	DESIスプレーヤーとOrbitrap質量分析器の結合のためのカスタマイズされたインターフェース
電動XYZステージ	Newport Corporation	CONEX-MFACC	DESI–MSI取得中のラスタ移動の制御
MycoAlert PLUSマイコプラズマ検出キット	Lonza	LT07-703	培養細胞におけるマイコプラズマ汚染の定期的なモニタリング
ナノ液体クロマトグラフィーシステム	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	DESIスプレー生成のためのナノフロー溶媒供給システム
光学ブレッドボード	Thorlabs	MB1012	DESIスプレーヤーと改良されたインターフェースアセンブリの機械的サポートプラットフォーム
Orbitrap Fusion Lumos質量分析器	Thermo Fisher Scientific	UVPD	DESI–MSIデータ取得のための高解像度Orbitrap質量分析器
PEEKチューブ	IDEX	1535	ナノLCシステムとDESIスプレーヤー間の溶媒ライン接続
ペニシリン＆ndash;ストレプトマイシン	Gibco	15140-122	哺乳類細胞培養培地用抗生物質サプリメント
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	VWR	0780-50L	細胞移植中の培養細胞の洗浄溶液
RPMI-1640培地	Gibco	11875093	OVCAR-8細胞の維持のための哺乳類細胞培養培地
ステージ制御ソフトウェア	Lasken Group	バージョン6	ラスタ走査、ステージ移動、および画像取得パラメータのソフトウェア制御
ステンレススチールチューブ	MicroGroup	316H16H	Orbitrapインターフェース統合用のカスタム製作イオン転送チューブ（1/16" OD、0.033" ID）
250 µLシリンジ	Hamilton	1725LTN250UL	溶媒のロードとナノフロー溶媒供給
合成胎児牛血清（FBS）	HyClone	SH3006603	完全な哺乳類細胞培養培地の調製用血清サプリメント
TC20自動細胞カウンター	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	カバースリップに播種する前の培養細胞の自動カウント
100mmの組織培養皿	Fisher Scientific	FB012924	付着OVCAR-8細胞培養の拡大と維持
トリプシン-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	移植中の付着細胞の酵素的剥離
UV硬化樹脂	Prime Dental	6.03	カスタムDESIスプレーヤーマウントのコンポーネントの製作と安定化
Xcaliburソフトウェア	Thermo Fisher Scientific	4.7	機器制御、Orbitrapメソッド設定、および質量スペクトルデータ取得