方法論記事

アレルギー性気道炎症に影響を及ぼす環境毒性物質をスクリーニングするためのSTAT6レポーターアッセイの構築

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DOI:

10.3791/71694

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2026年8月25日

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1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、ヒト気道上皮細胞における安定したSTAT6ルシフェラーゼレポーターアッセイの構築およびバリデーションについて解説します。この手法により、制御されたin vitro条件下でSTAT6活性を調節する環境毒性物質や大気汚染物質の効率的なスクリーニングが可能になります。

要約

大気汚染に関連したアレルギー性気道炎症は、公衆衛生上の懸念として高まっています。アレルギー性気道炎症の中心的なメディエーターであるSignal Transducer and Activator of Transcription 6（STAT6）経路を活性化するインターロイキン-4（IL-4）およびインターロイキン-13（IL-13）は、汚染物質による呼吸器毒性を調節している可能性があります。本研究では、STAT6シグナルを調節する環境毒性物質を評価するため、ヒト気道上皮細胞における安定したSTAT6ルシフェラーゼレポーターアッセイの構築と検証について記述します。ヒト気管支上皮16HBE14o−細胞に、レンチウイルスベクターを用いてSTAT6応答性ルシフェラーゼレポーターを導入し、次にピューロマイシン選択と感染多重度（MOI）の最適化を行い、限界希釈法によるモノクローナル単離を実施しました。継代後も強力で再現性のある誘導を示す安定したクローンを選定しました。レポーターの応答性はIL-4/IL-13刺激によって検証し、STAT6依存性は選択的なSTAT6、STAT5、およびSTAT3阻害剤を用いて確認しました。アッセイの性能はZ′-factor分析によって定量化され、再現性のある信号分離が示されました。さらに、このアッセイを個々の大気汚染成分に適用したところ、benzo[b]fluorantheneおよび粒子状物質がSTAT6レポーター活性を有意に増加させました。本手法は、気道上皮細胞におけるSTAT6活性を測定し、アレルギー性気道シグナルを調節する環境毒性物質の優先順位を決定するための、拡張可能なアプローチを提供します。

概要

大気汚染は、健康への深刻な影響と社会経済的な影響を伴い、世界的に最も差し迫った公衆衛生上の課題の一つとなっています。現在、大気汚染は死亡に至るリスク因子の第2位に位置しており、年間810万人の死亡原因となっています。1,2,3大気汚染物質の中で、粒子径2.5マイクロメートル以下の微小粒子状物質（PM2.5）は、呼吸器系の深部まで到達できるため、健康へのリスクが最も高い。4,5PM2.5への高濃度曝露は、肺機能の低下および呼吸器疾患による入院率の上昇と一貫して関連している。6喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性炎症性疾患の有病率は世界的に増加しており、特に汚染レベルの高いメガシティにおいて不均衡に高まっている。4.

アトピー性喘息などのアレルギー性気道疾患は、主にサイトカインであるインターロイキン-4（IL-4）およびインターロイキン-13（IL-13）の高値と、Signal Transducer and Activator of Transcription 6（STAT6）シグナル伝達経路の活性化を特徴とするタイプ2炎症反応によって媒介されます7。気道上皮細胞において、IL-4およびIL-13によって誘導されるSTAT6のリン酸化は、粘液の過剰分泌と上皮バリアの破壊を促進するため、STAT6はアレルギー性気道病理の中心的な媒介因子であり、適切な治療標的であると考えられています8,9。マウスモデルを用いた実験的証拠では、PM2.5および二酸化硫黄への曝露がSTAT6シグナル伝達を増強し、アレルギー性気道炎症を悪化させることが示されています10,11。しかし、個々の大気汚染物質がヒト気道上皮細胞におけるSTAT6の転写活性を直接的に調節するかどうかについては、系統的な評価が行われていません。

大気汚染は、粒子状物質、多環芳香族炭化水素（PAH）、重金属、無機塩など、化学的に複雑な成分の混合物で構成されており、気道におけるSTAT6活性化に対する各成分の寄与は十分に解明されていません12,13。エンドポイントリン酸化アッセイや一過性転移に基づくレポーターシステムなど、気道上皮細胞におけるSTAT6活性を測定する現在の手法は、大規模な化学物質スクリーニングには適していません。したがって、ヒト気道上皮細胞を用いた安定的な細胞ベースのSTAT6レポータープラットフォームがあれば、アレルギー性気道シグナルを調節する汚染由来化合物を特定するためのスケーラブルなツールとなります。本プロトコルでは、16HBE14o−気道上皮細胞における安定的なSTAT6ルシフェラーゼレポーターアッセイの開発と検証について記述し、環境試料および個々の化学的毒性物質の系統的なスクリーニングに向けたSTAT6活性化の定量的な評価を可能にします。

プロトコル

本研究では、確立された16HBE14o−ヒト気管支上皮細胞株を使用したため、ヒト被験者の倫理承認は適用されません。

1. 16HBE14oの作製− STAT6活性レポーターを安定的に発現している細胞

注：図1にワークフローの概要を示します。

  1. 細胞培養
    注：すべての手順は、クラスIIバイオセーフティキャビネット内で無菌操作を用いて行う。使用前に、細胞にマイコプラズマ汚染がないことを確認すること。
    1. 16HBE14o−細胞を、10%胎児ウシ血清および1%ペニシリン–ストレプトマイシンを添加した最小必須培地で維持する。細胞を37 °C、5% CO2を含む加湿雰囲気下でインキュベートし、培地を1日おきに交換する。
    2. 細胞が約80%コンフルエンスに達するまで待機する。培養培地を吸引し、細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄する。
    3. 細胞単層を覆う十分な量のリン酸緩衝生理食塩水を加え、37 °Cで20分間インキュベートする。リン酸緩衝生理食塩水を完全に吸引する。
      注：20分間のリン酸緩衝生理食塩水によるインキュベーションは、この細胞株によって形成される密接な細胞間接合の解離を促進させるためのものである。この所要時間は、施設内で最適化された修正手順である。
    4. 細胞単層を覆う十分な量の0.25%トリプシン–エチレンジアミン四酢酸溶液を加える。37 °Cで10分間インキュベートする。
      注：倒立光学顕微鏡を用いて細胞の剥離状態を監視する。必要に応じて培養容器を軽くタッピングし、剥離を促進させる。
    5. 酵素活性を停止させるため、トリプシン–エチレンジアミン四酢酸溶液の量に対して約5倍量の完全培養培地を加える。懸濁液を穏やかにピペッティングし、単一細胞懸濁液を得る。
    6. 細胞懸濁液を15 mL遠心チューブに移す。25 °Cで300 × g、5分間遠心分離する。
    7. 上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを新鮮な培養培地で再懸濁する。懸濁液を穏やかにトリチュレーションし、倒立光学顕微鏡下で単一細胞懸濁液であることを確認する。
    8. 血球計数器を用いて細胞数を数え、その後の実験に必要な密度に細胞濃度を調整する。通常は1:8の分割比を用いる。
      注：培養容器の培養面積および、それに対応するリン酸緩衝生理食塩水とトリプシン–エチレンジアミン四酢酸溶液の量については、補足表1および補足表2を参照すること。
  2. ピューロマイシン誘発細胞毒性の決定
    ​注：レンチウイルス構築物によってコードされる耐性遺伝子に応じて抗生物質を選択すること。
    1. 16HBE14o−細胞を、1ウェルあたり100 µLの完全培養培地を含む96ウェル培養プレートに、1ウェルあたり2 × 104 cellsで播種する。細胞を一晩インキュベートする。
    2. 培養培地を、最終濃度が0.5、1、2、または4 µg/mLとなるピューロマイシン含有新鮮培地に交換する。24、48、および72時間のタイムポイントごとに別々のプレートを用意する。
    3. 各ウェルに5 µLの細胞計数試薬を加える。プレートを37 °Cで1時間インキュベートする。
      注：吸光度測定に影響を及ぼす可能性があるため、ウェル内に気泡が入らないように注意すること。
    4. 650 nmを参照波長として、450 nmでの吸光度を測定する。エンドポイントモードで吸光度を記録する直前に、プレートを15秒間振盪させる。
    5. 式1を用いて細胞生存率14を算出する。
      細胞生存率の算出式、サンプル、コントロール、ブランクのOD450-650。バイオアッセイ分析用数式。
      ここで：
      吸光度方程式 OD450-650、分光光度法で用いられる減算法、数式。
      分光法実験における吸収分析のための光学密度式 (OD450-650)。
      分光データ分析用の光学密度方程式、OD450-650blank=OD450blank-OD650blank。
      注：コントロールは未処理細胞、ブランクはアッセイ試薬を含む細胞不含培地と定義する。48～72時間以内に非導入細胞を完全に排除できる最低のピューロマイシン濃度を選択する。
  3. 最適感染多重度の決定
    注意：レンチウイルス粒子は、登録済みのバイオセーフティレベル2（BSL2）施設において、BSL2条件下で、かつ機関のバイオセーフティ規定に従って取り扱うこと。すべてのウイルス操作はクラスIIバイオセーフティキャビネット内で行う。ウイルスで汚染された消耗品や流出物は、バイオハザード廃棄物として廃棄する前に、10%漂白剤で少なくとも1時間処理すること。
    ​注：感染多重度（MOI）は導入効率に直接影響するため、最適化を行う。
    1. 式2を用いて、必要なレンチウイルスストックの容量15を算出する。
      MOI算出式、ウイルス粒子と標的細胞の比率、分子生物学方程式。
      ここで：
      機能的ウイルスタイター式、T_virus = TU/mL、ウイルス学研究データ分析用方程式。
      ウイルス容量方程式、V_virus=mL単位のウイルス容量、数式、ウイルス学研究、算出方法。
      静的平衡、方程式：N_cells = 標的細胞数、教育研究用図表。
      注：本プロトコルで使用したSTAT6ルシフェラーゼレポーターレンチウイルスストックの機能的タイターは5 × 107 transducing units/mLであった。標的細胞数2 × 104 cellsに対し、MOI 20は1ウェルあたり8 µLのレンチウイルスストックに相当する。タイターが異なるウイルス調製物を使用する場合は、ウイルス容量を再計算する必要がある。
    2. 16HBE14o−細胞を、1ウェルあたり100 µLの完全培養培地を含む96ウェル白色クリアボトムプレートに、1ウェルあたり2 × 104 cellsで播種する。細胞が約80%コンフルエンスに達するまで一晩インキュベートする。
    3. 培養培地を、5 µg/mL polybreneおよびMOI 1、5、10、20のSTAT6ルシフェラーゼレポーターレンチウイルスを含む新鮮培地に交換する。レンチウイルスを含まない非導入モックコントロールウェルを設ける。
      注：各MOIに必要なレンチウイルス容量をストックの機能的タイターから算出すること。
    4. 細胞をレンチウイルス粒子とともに48時間インキュベートする。導入培地を新鮮な培養培地に交換し、さらに24時間インキュベートする。
    5. 培養培地を、インターロイキン-4およびインターロイキン-13をそれぞれ10 ng/mL含む新鮮培地に交換する。細胞を24時間インキュベートする。
    6. 各ウェルに25 µLのルシフェラーゼアッセイ試薬を加える16。プレートを遮光し、室温で20分間インキュベートする。
    7. プレートを20秒間直線的に振盪させる。フルプレート読み取りおよびゲイン設定120を用いて、エンドポイントモードで発光を測定する。
      注意：最大信号を捉えるため、ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加してから1時間以内に発光を記録すること。試薬メーカーの安全性および取り扱い説明書に従うこと。
      注：すべての吸光度および発光測定において、同一のマルチモードマイクロプレートリーダーおよび取得設定を使用すること。
  4. 導入細胞の選別
    1. 16HBE14o−細胞を、24ウェル培養プレートに2 × 105 cells/mLで播種する。細胞を一晩インキュベートする。
    2. 培養培地を、MOI 20のSTAT6ルシフェラーゼレポーターレンチウイルスおよび5 µg/mL polybreneを含む新鮮培地に交換する。細胞を48時間インキュベートする。
    3. 導入培地を新鮮な培養培地に交換する。細胞をさらに24時間インキュベートする。
    4. 培養培地を吸引し、1 µg/mLピューロマイシンを含む新鮮培地を加える。選択培地を2日ごとに交換しながら、5日間インキュベートする。
    5. 非導入モックコントロールウェルのすべての細胞が死滅するまで、ピューロマイシンによる選別を継続する。
      ​注：耐性遺伝子の発現を可能にするため、抗生物質による選別を開始する前に、導入後少なくとも24時間の時間を置くこと。
  5. 限界希釈法による単一細胞クローンの分離
    1. ピューロマイシンで選別したSTAT6レポーター細胞を剥離し、細胞数を数える。連続希釈により、5 cells/mLの単一細胞懸濁液を調製する。
      ​注：希釈中の細胞凝集を防ぐこと。必要に応じて懸濁液をセルストレーナーに通す。
    2. 96ウェル培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液200 µLを分注し、1ウェルあたり平均約1細胞の密度にする。
    3. 24時間以内に倒立顕微鏡で各ウェルを観察し、単一細胞を含むウェルを特定する。2つ以上の細胞、または空間的に離れた複数の細胞焦点を含むウェルは除外する。
    4. 最初の1週間、選択したウェルを監視してクローン増殖を確認する。3日ごとに培養培地を交換する。
    5. 元の96ウェルプレートで、細胞がコンフルエンスに達するか、約20日間かけて各クローンを拡大させる。各クローンを順次、6ウェルプレート、次にT-25培養フラスコへと継代する。
      注：T-25フラスコに移す前に、6ウェルプレートで約6日間培養するか、適切なコンフルエンスに達した時点で移すこと。
      ​一時停止点：クローンの拡大を継続するか、または90%胎児ウシ血清と10%ジメチルスルホキシドを含む1 mLの凍結保存培地を用い、1バイアルあたり1 × 106 cellsで凍結保存する。
    6. 拡大した各クローンを、96ウェル白色クリアボトムプレートに2 × 105 cells/mLで播種する。細胞を一晩インキュベートする。
    7. 培養培地を、IL-4およびIL-13をそれぞれ10 ng/mL含む新鮮培地に交換する。細胞を24時間インキュベートする。
    8. ステップ1.3.6–1.3.7に記載の方法でルシフェラーゼ活性を測定する。個々のクローン間で誘導されたレポーター活性を比較する。
    9. 継代数を増やしながらルシフェラーゼアッセイを繰り返す。継代を通じて一貫したサイトカイン誘導レポーター活性を維持するクローンを選択する。
      注：基底発光が低く、連続継代後も一貫したサイトカイン誘導活性化信号を維持できるクローン3を選択した。

2. STAT6活性リポーターアッセイの確立およびバリデーション

注：図 2にワークフローの概要を示します。

  1. STAT6活性レポーターアッセイのバリデーション
    1. STAT6レポーター細胞を、1ウェルあたり100 µLの完全培地を用いて、2 × 105 cells/mLの密度で96ウェルホワイトクリアボトムプレートに播種する。細胞を一晩インキュベートする。
    2. 培地を、最終濃度がそれぞれ10 ng/mLとなるIL-4およびIL-13を含む新鮮な培地に交換する。同時に、以下の選択的阻害剤を添加する：100 nM AS1517499（STAT6阻害剤）、2.5 µM AC-4-130（STAT5阻害剤）、または2.5 µM Stattic（STAT3阻害剤）。
    3. 0.1% ジメチルスルホキシド（DMSO）を含むビークルコントロールを設ける。細胞を24 hインキュベートする。
    4. 手順1.2.3～1.2.5に記載されている細胞計数アッセイを用いて、細胞生存率を測定する。
    5. 手順1.3.6～1.3.7に記載されている方法で、ルシフェラーゼ活性を測定する。
    6. 各ウェルの発光信号を、対応する細胞生存率で正規化する。正規化された値を、サイトカイン処理したコントロール群に対する相対値として算出する。
      注：細胞生存率の低下は、STAT6活性とは独立してルシフェラーゼ信号を減少させることがある。細胞生存率が許容範囲内であることを確認した上で、レポーター活性を解析すること。
  2. アッセイの堅牢性の評価
    1. 陽性コントロール群および陰性コントロール群の両方について、21個の複製ウェルを用いてZ′-因子を算出し、アッセイの堅牢性を評価する。
    2. 式3を用いてZ′-因子を算出する。
      静的平衡方程式、Z-因子の公式、アッセイ品質管理のための数式。
      ここで：
      静的平衡方程式、σₚはコントロールの標準偏差を示す、教育用数式例。
      標準偏差の方程式、σn、陰性コントロールの精度に関する統計分析に使用。
      式 μ<sub>p</sub>=陽性コントロールの平均信号；統計データ分析の概念。
      静的平衡、式 μn= 陰性コントロールの平均信号、教育的分析。
      注：Z′-因子が0.5から1.0の間であれば、そのアッセイはハイスループットスクリーニングに適していることを示す。

3. 環境毒性物質スクリーニングにおけるSTAT6レポーターアッセイの応用

注意：多環芳香族炭化水素および重金属塩は、毒性があり、発がん性の可能性がある物質として取り扱ってください。適切な個人用保護具を使用し、すべての操作を認定された化学薬品用ドラフトチャンバー内で行い、汚染された廃棄物は施設内の有害廃棄物処理手順に従って廃棄してください。

  1. 環境毒性物質スクリーニング
    1. STAT6レポーター細胞を、1ウェルあたり100 µLの完全培地を用いて、2 × 105 cells/mLの密度で96ウェル白色透明底プレートに播種する。細胞をオーバーナイトで培養する。
    2. 培地を、目的の最終濃度（本プロトコルでは10 µM）に調整した各試験化合物含有の新鮮な培地に置換し、IL-4およびIL-13を添加せずに細胞を処理する。
    3. 0.1%ジメチルスルホキシドを含む陰性対照群と、IL-4およびIL-13をそれぞれ10 ng/mLで含む陽性対照群を設ける。細胞を24時間培養する。
    4. ステップ1.2.3～1.2.5に記載の細胞計数アッセイを用いて、細胞生存率を測定する。
    5. ステップ1.3.6～1.3.7に記載の手法でルシフェラーゼ活性を測定する。
    6. 各ウェルのルミネッセンス信号を、対応する細胞生存率の値で標準化する。標準化した結果を陰性対照群に対する相対値として的に表す。
    7. 細胞生存率を80%未満に低下させる化合物は、STAT6レポーター活性の解析から除外する。
      注：細胞生存率の低下はSTAT6経路の活性とは独立してルミネッセンスに影響を及ぼす可能性があるため、細胞毒性条件下で得られたレポーター信号は信頼性が低いものとして扱う。

結果

安定選択に最適なピューロマイシン濃度を決定するため、親細胞である16HBE14o−細胞をさまざまな濃度（0.5–4 µg/mL）のピューロマイシンで処理し、細胞生存率アッセイを用いて24、48、および72時間後の細胞生存率を評価した。ピューロマイシンは用量および時間依存的に細胞生存率を低下させ、48–72時間後にはすべての濃度で生存率が20%未満に低下した（Figure 3）。1 µg/mLの濃度は、非導入細胞を完全に除去し、48時間以内に残存生存シグナルを約4.5%まで低下させた最低濃度であった（p < 0.0001）。ピューロマイシン濃度をさらに上げても、細胞生存率にさらなる低下は見られなかった。したがって、その後の導入細胞の選択には、1 µg/mLのピューロマイシンを採用した。

レンチウイルス導入効率を最適化するため、16HBE14o−細胞にSTAT6ルシフェラーゼレポーターレンチウイルスを、感染多重度（MOI）1、5、10、および20で48時間導入し、続いてIL-4およびIL-13（各10 ng/mL）で24時間刺激してSTAT6シグナルを活性化した。図4に示すように、相対発光量（RLUs）はMOI依存的に増加した。MOI 20で最大のレポーター誘導が認められ、非刺激対照群と比較して発光量が約50倍に増加した（p < 0.0001）。これらの結果に基づき、以降の実験ではMOI 20を選択した。

最適化された条件下でトランスダクションおよびピューロマイシン選択を行った結果、非トランスダクション細胞は広範な細胞死に至った一方で、トランスダクション細胞は正常な形態と生存能を維持した（図 5）。その後、生存細胞を限界希釈法にかけ、STAT6レポーター単クローン細胞株を樹立した。

単一細胞から由来する3つのモノクローナルレポーター細胞株を用いて、STAT6レポーター活性を評価した。すべてのクローンで、基底状態のルミネッセンス値は低かった（<1,000 RLU）。IL-4およびIL-13による刺激は、クローン2および3において強力なレポーター活性を誘導し、ルミネッセンス値は20,000 RLUを超え、20倍以上の誘導に対応していた（Figure 6A）。クローン3は基底状態のルミネッセンス値が最も低かったため、その後の特性評価に選定した。クローン3のレポーター活性を継代回数（P9–P21）に応じて評価し、長期的な安定性を確認した。Figure 6Bに示すように、STAT6依存的なレポーター誘導は、評価した継代範囲全体で安定していた。正常な増殖速度を示し、基底状態のルミネッセンスが約1,000 RLU未満であり、かつサイトカイン刺激後に20倍以上の誘導を示すクローンを、以降の実験に適していると判断した。

IL-4およびIL-13はSTAT3やSTAT5を含む他のSTATファミリーメンバーを活性化させる可能性があるため、レポーターアッセイの特異性をさらに評価した17,18。STAT6レポーター細胞を、STAT6、STAT5、またはSTAT3を標的とする選択的阻害剤の存在下または不在下で、IL-4およびIL-13により24時間刺激した19,20,21。すべての処理条件下で細胞生存率は90%以上に維持された（STAT6阻害剤AS1517499、100 nM：98.4%；STAT5阻害剤AC-4-130、2.5 µM：97.4%；STAT3阻害剤Stattic、2.5 µM：96.2%；Figure 7A）。STAT6の阻害はルシフェラーゼ活性を著しく低下させたが（p < 0.0001）、STAT5またはSTAT3の阻害はレポーター活性に有意な影響を及ぼさなかった（それぞれp = 0.2593およびp = 0.8857；Figure 7B）。これらの結果から、レポーターの活性化は主にSTAT6依存的であることが確認された。

IL-4およびIL-13で刺激した細胞を高シグナルコントロール、STAT6阻害剤で処理した細胞を低シグナルコントロールとしてZ'-factorを算出し、アッセイの堅牢性を評価した。その結果、Z'-factorは0.703 ± 0.097となり、アッセイ性能が極めて高く、シグナルウィンドウが広く、ハイスループットスクリーニングに適していることが示された。

最後に、STAT6レポーターアッセイを用いて、粒子状物質の選択的な環境構成成分がSTAT6シグナル伝達を調節する能力があるかをスクリーニングした。24時間の処理後、benzo[b]fluoranthene (10 µM) はSTAT6レポーター活性を約1.75倍に有意に増加させた (p = 0.0006) 一方、粒子状物質 (100 µg/mL) はレポーター活性を約1.5倍に増加させた (p = 0.0398; 図8)。対照的に、CdCl2、HgCl2、NiSO4 (各10 µM) を含む残りの多環芳香族炭化水素および重金属化合物は、レポーター活性を有意に変化させなかった。総合すると、これらの結果は、STAT6レポーターアッセイが安定し、特異的かつ堅牢であり、STAT6シグナル伝達を調節する環境化合物のハイスループットスクリーニングに適していることを示している。

細胞導入の概略図；STAT6ルシフェラーゼレポーター；抗生物質選択；MOIの最適化。
図 1: 16HBE14o− STAT6レポーター細胞の作製ワークフロー。STAT6ルシフェラーゼレポーターを安定的に発現する16HBE14o−細胞を作製するためのプロトコルの概略図。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

STAT6レポーター細胞アッセイのプロセス図：IL4/13刺激、CCK8、ルシフェラーゼ添加、結果。
Figure 2: STAT6レポーターアッセイの構築および適用のワークフロー。アッセイのバリデーションおよび環境毒性物質のスクリーニングに向けたSTAT6レポーターアッセイの概略図。こちらのリンクから、この図の拡大版をご覧いただけます。

0.5-4µg/mLのピューロマイシンを24-72時間処理した際の細胞生存率を示す棒グラフ。統計解析結果を含む。
図 3: 安定細胞選択のための最適ピューロマイシン濃度の決定。親株16HBE14o−細胞をピューロマイシン（0.5, 1, 2, または 4 µg/mL）で24, 48, または 72 時間処理した。ビークル対照細胞には0.1% ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した。細胞生存率は細胞生存率アッセイを用いて測定した。細胞生存率は、ブランク値を差し引き、ビークル対照で正規化した後、450 nmと650 nmの吸光度差から算出した。データは、テクニカルデュプリケートを含む3回の独立した生物学的反復（n = 3）の平均値 ± SDとして的に示した。統計的有意性は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびそれに続くDunnettの多重比較検定を用いて決定した。ビークル対照との比較におけるp値を示す。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ルミネッセンス対MOIの棒グラフ。RLU倍率変化のデータ解析および統計的p値。
図 4: レンチウイルス導入効率の最適化。16HBE14o−細胞に、感染多重度（MOI）1、5、10、または20でSTAT6ルシフェラーゼレポーターレンチウイルスを48時間導入した。24時間の回復期間後、細胞をIL-4およびIL-13（各10 ng/mL）で24時間刺激した。（A）模擬導入細胞および指定されたMOIでレポーターを導入した細胞における相対ルミネッセンス単位（RLU）。統計解析は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）の後、Dunnettの多重比較検定を用いて行った。（B）非刺激のMOI 20コントロールに対する、サイトカイン刺激後の誘導倍率。統計解析は、対応のないStudentのt検定を用いて行った。データは3回の独立した生物学的反復（n = 3）の平均値 ± SDで示す。p値を表示している。こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ピューロマイシン曝露下の細胞形態。50 μmスケールでの変動を示す顕微鏡画像。
図 5: ピューロマイシン選択後の細胞の代表的な画像。16HBE14o−細胞にSTAT6ルシフェラーゼレポーターレンチウイルスを導入した群、または導入しなかった群（MOI = 20）に対し、その後1 µg/mLのピューロマイシンで5日間処理した。画像は、同一の撮影条件下で位相差倒立顕微鏡を用い、100倍の倍率で取得した。未処理の親細胞は正常な上皮単層を形成した（左）。ピューロマイシン処理をした非導入細胞は、広範な細胞死および剥離を示したが（中央）、ピューロマイシンで選択された導入細胞は生存し、正常な形態を維持していた（右）。スケールバー = 50 µm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ルミネッセンスアッセイの結果；細胞クローンおよび継代におけるコントロール群とIL刺激群を比較した棒グラフ。
Figure 6: STAT6レポータークローンの同定およびレポーターの安定性評価。限界希釈後、3つのモノクローナルSTAT6レポーター細胞株を拡大し、IL-4およびIL-13（各10 ng/mL）で24時間刺激した。(A>) サイトカイン刺激後の各レポータークローンのルシフェラーゼ活性を、未刺激のコントロールと比較した結果。(B>) クローン3におけるSTAT6レポーター活性の継代（P9–P21）に伴う安定性。データはテクニカルデュプリケートの平均値 ± SDとして示している。こちらの画像をクリックして拡大表示してください。

薬剤処理した細胞アッセイにおける細胞生存率（%）と標準化されたルミネッセンスを比較した棒グラフ。
図 7: 細胞生存率に影響を与えることなく、STAT6レポーター活性を選択的に抑制。STAT6レポーター細胞を、STAT6阻害剤AS1517499 (100 nM)、STAT5阻害剤AC-4-130 (2.5 µM)、またはSTAT3阻害剤Stattic (2.5 µM) の存在下で、IL-4およびIL-13 (各10 ng/mL) により24時間刺激した。サイトカイン刺激したビークルコントロール群には0.1% DMSOを添加した。(A) 細胞生存率は、細胞生存率アッセイを用いて測定した。(B) サイトカイン刺激コントロールで標準化したSTAT6依存性ルシフェラーゼ活性。データは3つの独立した生物学的繰り返し (n = 3) の平均値 ± SDとして示す。p値は図中に記載している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

化学的処理と対照サンプルを比較した、正規化ルミネッセンスアッセイ結果の棒グラフ。
図 8: 環境毒性物質によるSTAT6調節効果の評価。STAT6リポーター細胞を、粒子状物質（100 µg/mL）または多環芳香族炭化水素（PAHs）および重金属（各10 µM）を含む指定の環境毒性物質で24時間処理した。STAT6依存的なルシフェラーゼ活性を、ビヒクル対照（0.1% DMSO）に対して正規化した。データは、3回の独立した生物学的反復（n = 3）の平均値 ± SDとして提示している。統計的有意性はビヒクル対照との比較により決定し、p値を示した。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足表1： 16HBE14o−細胞培養における培養容器の仕様および継代パラメータこちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

付録表2： STAT6活性測定法の比較。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

IL-4/IL-13–JAK–STAT6シグナリングは、重要な治療ターゲットであるだけでなく、喘息やアレルギー性鼻炎を含むアレルギー性疾患の病態形成における主要な駆動因子でもあります22。本プロトコルでは、STAT6活性の調節因子を同定するための、簡便で安定した細胞株ベースのリポーターアッセイについて説明します。このアッセイは、広範な環境化合物のSTAT6調節効果を評価するために適用でき、概念実証スクリーニング研究（図8）で示されているように、ハイスループットスクリーニングに容易に適応可能です。ルシフェラーゼリポーターと並行して細胞生存率アッセイを組み合わせることで、化合物誘発性の細胞毒性に起因する混絡効果を最小限に抑えながら、STAT6パスウェイの調節を定量的に評価することができます。

この手法の特徴は、安定的に形質導入されたヒト気管支上皮16HBE14o−細胞を使用している点にあります。この細胞は、汚染物質によって誘発されるIL-4/IL-13シグナル伝達がアレルギー性気道炎症に寄与するという、生理学的に関連性の高い細胞型です。STAT6活性を測定する既存のアプローチには、実用上の重要な制限があります。ウェスタンブロッティングや酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によるSTAT6のリン酸化または下流の標的タンパク質の検出は、手間がかかり、スループットが相対的に低くなります。一過性導入によるルシフェラーゼレポーターアッセイは、STAT6の転写活性を直接的に測定できますが、導入効率の変動やバッチ間のばらつき、さらに各実験ごとに導入を繰り返す必要があるため、再現性とスループットが低下します。

本研究で述べられている安定レポーター細胞株は、これらの制限の多くを克服している。レポーター構築物がゲノムに組み込まれ、クローン選択されているため、レポーターの発現は細胞集団全体で均一であり、継代後も再現性が維持され、一過性 transfection に伴うばらつきが排除される。発光信号は生細胞で測定され、細胞生存率の並行測定により標準化することで、細胞毒性によるアーティファクトを除外することができる。さらに、このアッセイは96ウェル形式と容易に適合し、中〜高スループットのアプリケーションへの適用が可能である。本アッセイの Z′0.703というZ'-factorが示されたことは、高信号コントロールと低信号コントロールが極めて良好に分離していることを意味し、ハイスループットスクリーニングへの適用可能性が確認された。STAT6活性測定に一般的に用いられる手法の比較は、以下に示す。 補足表2それにもかかわらず、本アッセイでは内因性標的遺伝子の発現ではなく、STAT6応答性プロモーターの活性化を報告しているため、MUC5ACやCCL26などの下流のSTAT6標的を用いた直交的検証は引き続き重要である。

STAT6レポーターアッセイの確立および適用を成功させるためには、いくつかの重要なステップがあります。レンチウイルスの感染多重度（MOI）の最適化は不可欠です。ウイルス入力が不十分であれば導入効率が低下し、一方でウイルスへの過剰な曝露は細胞ストレスを誘発し、細胞生存率を損なう可能性があるためです。同様に、ピューロマイシン選択濃度の最適化により、耐性を持つレポーター細胞の生存能を維持しつつ、非導入細胞を除去する必要があります。レンチウイルス導入および抗生物質選択への感受性は細胞型によって異なるため、安定したレポーター細胞株を確立する前に、これら両方のパラメータを経験的に最適化させるべきです。16HBE14o−細胞株は、機能的な密接結合を形成し粘液を産生するため、気道炎症の研究に広く用いられている不死化ヒト気管支上皮細胞株です8,23。レポーター作製に選択する細胞は、機能的なIL-4およびIL-13受容体を発現し、完全な下流のJAK-STATシグナル伝達能を保持している必要があります24。安定したレポーター細胞株を確立する前に、サイトカイン刺激に対する応答性、経路特異的阻害剤による抑制、および選択したアッセイ条件下での細胞毒性効果の不在を確認し、レポーター構築物を検証する必要があります。これらの検証ステップを経ることで、レポーター活性の変化が非特異的な細胞ストレスではなく、STAT6依存的なシグナル伝達を正確に反映していることを保証できます。

本手法には、いくつかの限界があることも考慮すべきである。レンチウイルスベクターは宿主ゲノムにランダムに組み込まれるため、基礎的なレポーター活性、誘導能、および長期的な発現安定性にクローン間のばらつきが生じる可能性がある。加えて、本アッセイはSTAT6応答性プロモーターの活性化を測定するものであるため、上流の受容体活性化や下流の内在性シグナル伝達イベントを直接的に評価するものではない。安定レポーター細胞を長期にわたって培養すると、エピジェネティックなサイレンシングや導入遺伝子の発現低下を招く可能性がある。これらの影響を最小限に抑えるために、継代数の少ないマスターセルバンクを確立し、規定の継代範囲内でレポーターの応答性を定期的に検証する必要がある。さらに、本アッセイは、ヒト気道上皮細胞の原代細胞や、完全自動の高スループットスクリーニングプラットフォームにおいてはまだ検証されていない。最後に、本研究で評価した環境毒性物質は、包括的な化学物質ライブラリーではなく、コンセプト実証のためのパネルである。

大気汚染、特に微小粒子状物質（PM2.5）は、ブラックカーボン、無機塩類、多環芳香族炭化水素、および重金属を含む、化学的および物理的に多様な構成成分の複雑な混合物で構成されています12,13。排出源や大気中での処理工程の違いにより、粒子組成に大きな差異が生じ、それが異なる健康への悪影響に寄与している可能性があります。その結果、疫学研究やin vivo研究において、アレルギー反応の原因となる特定の成分を特定することは依然として困難です。本研究で記述されているSTAT6レポーターアッセイは、個々の空気伝播毒性物質、発生源を特定した粒子状物質抽出物、または化学的に定義された粒子分画のSTAT6調節活性をスクリーニングするための実用的なin vitroプラットフォームを提供します。このプロトコルは、メカニズム研究における候補毒性物質の優先順位付けを促進し、複雑な大気汚染混合物のリスク指向的な評価を支援することが期待されます。

開示事項

著者は利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、タイ国家研究評議会（NRCT）（助成金番号：N42A680388）およびマヒドン大学（戦略的研究基金：2025）（助成金番号：35）の支援を受けて実施されました。図1および図2は、BioRender.com（Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h）を使用して作成されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200072細胞解離試薬
15 mL コニカル遠心チューブCorningCLS430791滅菌ポリプロピレン製遠心チューブ
16HBE14o- ヒト気管支上皮細胞株Gift from Dr. Nawiya Huipao (Prince of Songkla University, Thailand) and Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (University of California San Francisco, USA)RRID:CVCL_0112ヒト気管支上皮細胞株（継代数 35–40）；マイコプラズマ陰性が確認されており、分化した気道上皮の形態およびバリア特性を保持している。参考文献: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
24ウェル 透明 平底 組織培養処理プレートCorning3527細胞培養プレート
6ウェル 透明 平底 組織培養処理プレートCorning3516細胞培養プレート
96ウェル 透明 平底 ポリスチレン 組織培養処理マイクロプレートCorning3599細胞生存率アッセイプレート
96ウェル 白色 底面透明 ポリスチレン 組織培養処理マイクロプレートCorning3610ルミネッセンスアッセイプレート
AC-4-130 (STAT5 阻害剤)MedChemExpressHY-124500選択的 STAT5 阻害剤
AS1517499 (STAT6 阻害剤)MedChemExpressHY-100614選択的 STAT6 阻害剤
ベンゾ[b]フルオランテンAccuStandardH-128N多環芳香族炭化水素
クラス II バイオセーフティキャビネットNuaireNU-543-400E無菌的な細胞培養操作用
塩化カドミウム (CdCl2)Sigma202908重金属化合物
Cell counting kit-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301細胞生存率アッセイ
細胞培養フラスコ、25 cm² (T-25)Corning430639組織培養フラスコ
CO2 インキュベーターNuaireNU-5710E37 °C、5% CO2、加湿雰囲気で維持
ジメチルスルホキシド (DMSO)SigmaD2650溶媒（最終濃度 0.1%）および凍結保存剤（10%）
ウシ胎児血清 (FBS)SigmaF7524培地添加剤（10%）および凍結保存培地（10%）
血球計数器BOECOBOE14手動細胞計数用
倒立位相差光学顕微鏡ZEISSPrimovert細胞形態観察用
ルシフェラーゼアッセイシステム (ONE-Step)BPS Bioscience60690ルシフェラーゼレポーターアッセイ
塩化水銀 (HgCl2)Sigma215465重金属化合物
マイクロプレートリーダーBioTekSynergy Neo2Gen5 ソフトウェア (v3.08.01) で制御されるマルチモードマイクロプレートリーダー/ルミノメーター。15–20 s の直線振盪後、650 nm を参照として 450 nm で吸光度を測定。20 s の直線振盪後、検出器ゲイン 120 のエンドポイントモードでルミネッセンスを測定。
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Gibco11095-080基礎培養培地
硫酸ニッケル (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203重金属化合物
粒子状物質 (PM)National Institute of Standards and TechnologySRM 2975粒子状物質の標準参照物質
ペニシリン-ストレプトマイシン (100×)Gibco15140122抗生物質添加剤（最終濃度 1%）
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco18912014洗浄緩衝液
ポリブレンSigmaTR-1003-Gレンチウイルス導入促進剤
ピューロマイシンMedChemExpressHY-B1743A安定細胞選別用抗生物質
組換えヒト IL-13Thermo Fisher ScientificA42526刺激用サイトカイン
組換えヒト IL-4Thermo Fisher ScientificA42602刺激用サイトカイン
STAT6 ルシフェラーゼレポーターレンチウイルスBPS Bioscience78799レンチウイルスレポーター構築物；ストックタイター 5 × 107 TU/mL
Stattic (STAT3 阻害剤)MedChemExpressHY-13818選択的 STAT3 阻害剤

参考文献

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