このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

ヒト象牙質ディスクを用いた垂直積層型象牙質-歯髄複合体オルガンオンチップデバイスの作製

110 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/71713

⸱

2026年8月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

この記事について

サマリー

ヒト象牙質ディスクとフォトリソグラフィーで作製したマイクロチャネルを組み込んだ、垂直積層型象牙質-歯髄複合体オルガン・オン・ア・チップデバイスの作製およびアセンブリについて記述し、続いて歯髄幹細胞の播種と培養について解説する。

要約

動物モデルや静的な細胞培養などの歯科研究で用いられる従来の前臨床モデルには、象牙質-歯髄界面の生理的条件を再現し、歯科バイオマテリアルに対するヒトの生物学的反応を予測する上で重要な限界があります。Organ-on-a-chip (OoC) 技術は、制御されたマイクロ流体システム内で組織特異的な微小環境の再現を可能にすることで、代替的なアプローチを提供します。本稿では、3層のポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体プラットフォーム内にヒト象牙質ディスクを組み込んだ、象牙質-歯髄複合体OoCデバイスの作製および組み立てに関するステップバイステップのプロトコルを記述します。このプロトコルには、象牙質ディスクの調製、フォトリソグラフィによる微細構造モールドの作製、PDMSのキャスティングと硬化、プラズマ支援による層間接合、デバイスの組み立て、リークテスト、および静的な培養条件下での歯髄幹細胞の播種が含まれます。PDMS層の厚さの制御、プラズマ表面処理、リークを最小限に抑えるためのデバイス内への象牙質ディスクの組み込みなど、デバイスの性能に影響を与える重要な作製パラメータについて議論します。デバイス内での細胞接着と生存率は、走査型電子顕微鏡および共焦点ライブ/デッド染色を用いて評価されました。代表的な結果により、マイクロ流体アセンブリ内への象牙質ディスクの統合、リークのない状態の維持、および象牙質表面への生存した歯髄幹細胞の接着が実証されました。本プロトコルは、歯科バイオマテリアルや微小環境刺激に対する細胞反応を調査する今後の研究を支援し得る、象牙質-歯髄複合体OoCプラットフォーム作製の再現可能な手法を提供します。

概要

動物実験は、病理学的および生理学的プロセスの理解を深める上で長らく重要な役割を担っており、創薬の初期段階においても中心的な役割を果たしてきました1。20世紀を通じて人間の平均寿命は大幅に向上しました。この改善が動物研究のみによるものであるかを正確に定量化することは不可能ですが、現代の多くの医学的治療法が動物モデルを用いて開発または検証されてきたことは広く認められています2。顕著な例としては、ポリオ、麻疹、B型肝炎などのワクチン開発、ペニシリンの安全性と有効性の評価、およびインスリンの製造などが挙げられます。歯科およびバイオマテリアル研究の分野では、これらのモデルは、う蝕のプロセス、象牙質・歯髄複合体の生物学および再生、そして歯周組織の生理病理学的研究において不可欠なものでした3,4。

これらの手法が広く利用されているにもかかわらず、現在の創薬パイプラインでは依然として高い失敗率が見られ、多くの候補薬が、前臨床のラボ設定や動物モデルで有効性と安全性が示されていたにもかかわらず、臨床試験で脱落しています5。この乖離は、種間の解剖学的、遺伝的、および生理学的な差異により、動物モデルの翻訳的な予測能が制限されるという種間差に関連していると考えられています6。加えて、新しい治療アプローチの開発には、依然として多大な時間と費用を要します7。さらに、従来のin vitroモデルは主に、非生理的なプラスチック基質上での単純な二次元（2D）単層培養を用いており、ヒトの口腔内に存在する生化学的および物理的な手がかり、細胞間相互作用、および細胞外マトリックス（ECM）シグナルを再現できていません8,9.。2Dモデルはある程度の実験的な利点を提供しますが、バイオフィルム、バイオマテリアル、象牙質、および歯髄細胞など、複数の構成要素間で同時に起こる複雑な相互作用を本質的に再現することは不可能です10。その結果、ヒトの生物学的反応をより正確に再現できる代替的な実験プラットフォームの開発への関心が高まっています。2022年、FDA近代化法2.0（FDA Modernization Act 2.0）により、医薬品承認プロセスにおける動物実験の義務的要件が撤廃され、前臨床研究におけるオルガンオンチップ（OoC）技術を含む代替プラットフォームの活用の可能性が認められました11。

OoC（生体模倣システム）とは、特定の臓器や組織構成要素の構造、機能、および微小環境を再現するように設計されたマイクロ流体デバイスである12。これらのデバイスには、細胞が自然にさらされる生理学的微小環境の主要な側面を再現した、設計済みマイクロチャネル内で培養された生細胞および組織が組み込まれている。構造的な模倣にとどまらず、マイクロチャネルは細胞環境の時空間的な制御を可能にし、組織特異的な機能の維持をサポートする。これにより、従来の培養システムよりも生体内の生理状態に近い実験条件を提供できる12。特に、OoCデバイスのマイクロチャネルは培地の制御された流れを促進し、これにより定着した細胞にせん断応力がかかる13。これらの機械的刺激は、接着、増殖、遊走、遺伝子発現、および細胞間相互作用を含む細胞応答に影響を与える14,15。さらに、培地の連続的な流れは、栄養供給と代謝廃棄物の除去を通じて微小環境の維持に寄与する16。また、従来の2D培養と比較して、一部のOoCプラットフォームでは、3次元（3D）オンチップモデルにおいて、細胞内活性酸素種や細胞生存率を含む酸化ストレス関連のリードアウトの制御が改善されることが報告されている17。したがって、OoCシステムは、制御された実験条件下で組織生理学、バイオマテリアル相互作用、および疾患プロセスを研究するための有望なプラットフォームとして登場した18。歯科研究において、OoC技術は、ますます複雑な口腔組織界面をモデル化するために段階的に適用されてきた19。初期のtooth-on-a-chipプラットフォームは、バイオマテリアル・象牙質・歯髄界面を模倣していたが20、より高度な反復モデルでは、その後、血管系と三叉神経支配が組み込まれ、歯髄象牙質複合体の構造的および機能的な複雑さがより忠実に再現されるようになった21。歯髄以外では、未熟根管の3Dモデルにより、根管洗浄剤の評価や、根尖乳頭由来幹細胞における血管新生芽形成の評価が可能となった22,23。歯周組織レベルでは、gum-on-a-chipプラットフォームを用いて、宿主・微生物相互作用の調査や、治療剤としてのプロバイオティクスの免疫調節能の評価が行われている24。一方で、periodontal ligament-on-chipデバイスは、間質液の流れが血管ネットワークの形成および歯根膜幹細胞スフェロイドの骨分化をどのように調節するかを示している25,26。これらのモデルを補完するように、特化したoral mucosa-on-a-chipおよびdental implant-on-a-chipシステムが、生理学的に関連のある条件下で宿主・材料相互作用や歯科用モノマーの細胞毒性を特性化することで、歯科マイクロ流体研究の範囲をさらに広げている27,28。

OoCシステムは歯科、口腔および顎顔面研究に広く応用されるようになっていますが、作製ワークフローの標準化と再現性の向上に向けた継続的な取り組みが依然として重要です。文献では、異なるデバイス構成や実験的応用を示す複数のtooth-on-a-chipモデルが報告されています20,29,30,31。しかし、デバイスの構造、作製方法、象牙質の組み込み方、および実験パラメータの報告形式にばらつきがあるため、再現性や研究間の直接的な比較が制限される可能性があります。特に、マイクロチャネルの形状、象牙質の統合戦略、および作製アプローチの違いは、デバイス内の生物学的および機械的な微小環境に影響を及ぼす可能性があります。報告されているモデルの中には、象牙質–歯髄界面の側面を再現するために象牙質を組み込んだものがあり20,29,30、一方で代替的な構成を採用したものもあります31。さらに、フォトリソグラフィー、レーザーカット、マイクロフライス加工、3Dプリンティングなどの作製方法は、意図するデバイス設計や用途に応じて、それぞれ固有の利点と制限があります。また、生物学的な有用性を決定づける重要な要因はデバイスの構造的配向であり、具体的にはチャネルと象牙質スライスが水平方向または垂直方向に配置されているか否かです19,32。水平積層構成では、コンパートメントが横に並んで配置されるため、側方向の区画化と細胞のリアルタイム可視化が容易になります。そのため、歯周組織複合体のように、本質的に側方向の空間的組織化を持つ組織のモデル化に特に適しています24,32。しかし、この設計では、コンパートメントの側方向の配置が、窩洞と歯髄の間の象牙質バリアの生体内（in vivo）の配向を忠実に再現できないため、バイオマテリアル-象牙質-歯髄複合体のような垂直な生物学的界面を再現する能力に本質的な限界があります20,32。垂直積層構成では、2つのコンパートメントをy軸方向に重ね合わせ、その間を天然の象牙質スライスで隔てることでこれらの制限を解消しており、完全な象牙質を介した分子輸送の同時定量化と、流出液中で測定される歯髄細胞応答のリアルタイムモニタリングが可能になります30。しかし、この配向における認識された制限は、象牙質-細胞界面の断面イメージングに関わるものです。細胞と細胞外マトリックスが側方向に配置されている水平積層構成と比較して、同一焦点面内で象牙質-細胞界面の断面画像を取得することは、依然として技術的な困難が伴います。文献では複数の象牙質-歯髄複合体on-a-chipモデルが報告されていますが、その大部分はコンパートメントが同一平面上に横に並ぶ水平積層構成を採用しており10,20,21,29、垂直積層構成の中に天然の象牙質スライスを組み込んだものは比較的少数です30。それにもかかわらず、これらのモデル間での作製アプローチや報告パラメータのばらつきが、再現性と研究間比較を制限し続けています33。本論文では、垂直積層型のtooth-on-a-chipデバイスの詳細な作製プロトコルを提供することで、手法の再現性を向上させ、歯科研究コミュニティにおける本プラットフォームのより広範な導入を促進することを目的としています。

本原稿では、フォトリソグラフィーを用いて作製した金型による3層のポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体プラットフォーム内にヒト象牙質ディスクを組み込んだ、垂直積層型の象牙質-歯髄複合体OoCデバイスの段階的な作製および組み立てプロトコルについて記述します。また、本プロトコルでは、静止条件下でのデバイス内における歯髄幹細胞の播種および培養についても説明します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施され、ヒト試料を用いる研究に関するUniversidad de La Fronteraの倫理委員会によって承認されました。

1. 象牙質ディスクの採取

注意：プロトコルの開始前に、デバイスの設計を準備してください（図 1A–1C）。

  1. 歯の採取と保存
    1. 患者からインフォームドコンセントを得た後、健全なヒトの大臼歯または小臼歯を採取する。
    2. 象牙質の脱水およびタンパク質の変性を防ぐため、すべての検体は0.5%クロラミン溶液中で4°Cに維持する。
    3. 保存期間中、クロラミン溶液を週に1回交換する。
  2. 象牙質ディスクの作製
    1. 円筒形ダイヤモンドバー（直径1 mm、粒度100–150 µm）を装着し、350,000 rpmで動作する高速ハンドピースを用いて、各歯の歯冠の中央3分の1の位置で水平に切断する。
    2. 切断は、約50 mL/minの連続的な注水下で行う。
    3. 髄室および咬合溝や裂溝に存在するエナメル質を避けるため、歯冠の中央3分の1の位置で切断し、主に象牙質組織で構成されるディスクを得る。
      注意：歯の切断は連続的に注水しながら行い、手袋、マスク、保護メガネを含む適切な個人用保護具を着用すること。
  3. 象牙質ディスクの仕上げ
    1. 粒度の小さい順に仕上げディスクを用いて、象牙質ディスクを研磨する。
    2. 最終的な象牙質の厚さが約0.8 mm (±± 0.3 mm)、側面寸法が約5 mm × 5 mm (±± 0.3 mm) になるまで研磨を続ける (Figure 1D)。
  4. 象牙質ディスクの保存
    1. 作製した象牙質ディスクは、OoCデバイスを組み立てるまで0.5%クロラミン溶液中で4°Cに保存する。

マイクロ流体デバイスの組み立て図；ピンセット、パンチツール、液体チャネリングを用いた作製段階。
図1： 象牙質・歯髄複合体オルガン・オン・ア・チップ（OoC）デバイスの設計および作製ワークフロー。 (A) 3層構造を示すデバイスの3次元設計図。(B) 主要寸法を示したデバイス設計の上面図。 (C) 3層デバイス構成の側面図。 (D厚さ約0.8 mm、側面寸法約5 mm × 5 mmで作製した代表的な象牙質ディスク。Eフォトリソグラフィーによって作製され、ポリジメチルシロキサン（PDMS）の上層および下層のキャスティングに使用されるシリコンマスターモールド。F熱重合後、シリコンモールドから硬化したPDMS層を取り除く。G層接合前のPDMS表面のプラズマ処理。Hプラズマボンディングによって組み立てられ、象牙質界面を組み込んだ、最終的な3層構造の象牙質・歯髄複合体OoCデバイス。Iリークテストおよびマイクロ流体実験の準備のため、チューブに接続された組み立て済みのデバイス。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 象牙質–歯髄複合体OoCデバイスの作製

  1. ワークスペースおよび材料の準備
    1. 材料および器具の準備
      1. リストに記載されているすべての材料および器具を準備します。 材料リスト デバイス作製を開始する前に。
      2. デバイスを組み立てる前に、生検パンチを用意する。
      3. すべての作製手順は、清潔でダストフリーな環境で行ってください。
      4. デバイスの作製および組み立ての全工程において、手袋、保護メガネ、および適切な個人用保護具を着用してください。
        注意：プロトコルの開始前に、フォトリソグラフィーで作製したモールドを準備しておくこと（図1E).
  2. 微細構造モールドの作製
    1. シリコンウェーハの調製
      1. 4インチの片面研磨シリコンウェハー（N型、Asドープ、CZ法成長）上にモールドを作製し、 <100> 配向, 500 ±± 25 µm 厚さ、TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm、比抵抗 0.001–0.005 Ω·cm)。
      2. ウェハをアセトン、イソプロパノール、超純水の順に、それぞれ超音波洗浄機で10分間ずつ順次洗浄する。
      3. 圧縮空気でウェハーを乾燥させる。
      4. ウェハを〜で焼成する 200°C ホットプレート上で10分間加熱し、残留水分を除去する。
      5. ウェハーを室温（RT）まで冷却します。 20°C–25°C).
    2. 表面活性化およびフォトレジスト塗布
      1. 真空プラズマクリーナーを用い、レベル7の空気プラズマで120秒間処理し、シリコンウェーハ表面を活性化させる。
      2. GM 1060エポキシ系ネガ型フォトレジストを、300 rpmで10秒間スピンコートして塗布する。
      3. 加速速度200 rpm/sで、565 rpmで100秒間、次いで965 rpmで1秒間、スピンコートを継続する。
      4. コーティングしたウェハーを10分間静置する。
      5. 以下の温度でプリベイク（予備焼成）を行う。 65°C 10分間。
      6. 以下の温度でプリベイクを継続します。 95°C 1時間。
      7. ウェハーを室温まで冷却させる。
    3. 露光および現像
      1. ダイレクトレーザーリソグラフィーシステムを用い、1,950 mJ/cm²の露光量でフォトレジストを露光します。2.
      2. 以下でポストベイクを行う。 65°C 10分間。
      3. 次のような温度で、焼成後の加熱を継続します。 95°C 30分間。
      4. ウェハーを室温まで冷却する。
      5. ウェハーを10分間静置する。
      6. PGMEA中で4分間現像する。
      7. 残留フォトレジストがある場合は、30秒間隔で現像時間を延長してください。
      8. イソプロパノールで洗浄し、現像を停止させる。
      9. 圧縮空気を用いてウェハーを乾燥させます。
    4. ハードベイク
      1. 以下の温度でハードベークを行う。 135°C 2時間。
      2. 幅1mmのマイクロチャネルを有する微細構造マスターモールドを入手し、 50 µm 高さにおいて。
  3. PDMS混合液の調製および脱気
    1. PDMS混合液の調製
      1. PDMSベースと硬化剤を10:1の重量比で混合します。
      2. プラスチック製ビーカーに入れ、ガラス棒を用いて約5分間手動で混合物を撹拌する。
      3. 混合中は、ゆっくりと絶えず円を描くように混ぜ合わせてください。
        注意：混合時に気泡が混入しないようにしてください。
    2. 脱気
      1. PDMS混合物を、真空ポンプに接続した真空デシケーターに入れる。
      2. 混合物を約700 mmHgで5分間脱気する。
      3. 真空状態を短時間解除し、表面の気泡を消させます。
      4. 再び真空を引く。
      5. 気泡が見えなくなるまで、このサイクルを繰り返します。
        注：全脱気時間は通常、約30分です。
  4. モールドへのPDMSのキャスティング
    1. モールドの作製
      1. 型を平らな面に置いてください。
      2. 圧縮空気を用いてモールドを洗浄する。
      3. パターン形成された表面に直接触れないようにしてください。
      4. モールドにほこりや汚染物質が付着していないことを確認してください。
    2. PDMSの分注
      1. 象牙質埋込層を作製するため、象牙質ディスクの周囲にPDMSを約8 g分注する。
      2. PDMSの高さを、象牙質ディスクの厚さ（0.8 ± 0.3 mm）に合わせるよう調整します。
      3. PDMSが象牙質表面を覆わないようにしてください。
      4. 各マイクロチャネル層を作製するため、モールド1ユニットあたり約0.26 gのPDMSを分注します。
      5. 型を軽く叩くか、振動を加えることで、微細構造への充填を促進させます。
      6. PDMSを微細構造の隅々まで浸透させる。
      7. PDMS表面に触れないように、蓋またはフラットカバーを用いて型を覆います。
        注：象牙質埋没層の厚さは約0.8 mm、各マイクロチャネル層の厚さは約0.4 mmであり、デバイス全体の厚さは約1.6 mmとなる。
        注：共焦点イメージングを予定している場合は、共焦点対物レンズの作動距離に応じて層の厚さを調整してください。
  5. 硬化
    1. 型を、以下の温度に設定したオーブンに入れます。 50°C.
    2. PDMSを4時間硬化させる。
  6. PDMS層の除去
    1. 硬化済みPDMSの除去
      1. 硬化したPDMS層をモールドから注意深く剥がします（図 1F).
      2. 微細構造を損傷させないよう、PDMS層は慎重に取り扱ってください。
  7. PDMS層の接合および入口・出口ポートの作製
    1. 入口ポートおよび出口ポートの作製
      1. 1 mmの生検パンチを用い、指定の入口および出口の位置に穿孔を作成します。
      2. パンチングの際は、マイクロチャネル側を上に向けて配置してください。
        注：構造的な損傷を避けるため、PDMS層をカッティングマットの上に置いてください。
      3. 上層に、上部マイクロチャネルに対応する2つの穿孔を作成する。
    2. PDMSレイヤーの洗浄
      1. イソプロピルアルコールまたはエタノールを用いてPDMS層を洗浄します。
      2. 滅菌済み粘着テープを用いて、残留したダスト粒子を除去する。
      3. 組み立て前に、すべての接合面に汚染物質が付着していないことを確認してください。
    3. PDMS表面のプラズマ活性化
      1. プラズマ処理のため、上層および中層のPDMSレイヤーを配置します（図1G).
      2. 周囲空気を作動ガスとし、約25 Wで動作するハンドヘルドコロナプラズマ処理装置を用いて、表面を活性化させる。
      3. プラズマ源とPDMS表面との間の作動距離を約1 mmに維持してください。
        注意：プラズマ処理は適切な換気下で行い、プラズマによって生成されるオゾンへの直接的な曝露を避けてください。
      4. プラズマ処理装置を起動し、5秒間安定させます。
      5. 処置前に、均一なプラズマビームが生成されていることを確認する。
      6. 最上層のPDMSを、約5 mm/sの速さで連続的に往復運動させながら10秒間処理する。
      7. 同様の動作および距離で、中間のPDMS層を10秒間処理します。
      8. 接合の直前に、最上層にさらに1秒間のプラズマ処理を施す。
    4. 上層および中層の接合
      1. プラズマ処理直後に、上のマイクロチャネルを象牙質ディスクに合わせて配置してください。
      2. 上層と中層を接合させます。
      3. 接合したアセンブリを、～の温度に設定したオーブンに入れます。 75°C 5分間。
      4. インキュベーション中に結合を定着させる。
        注：象牙質ディスクとマイクロチャネルは肉眼で確認でき、追加のアライメントツールなしで位置合わせが可能です。
    5. 下部マイクロチャネルポートの作製
      1. 接合された上層および中層に対し、下部マイクロチャネルに対応する2か所の穿孔を行います。
      2. アライメントを確実にするため、2つの層を同時にパンチしてください。
        注：この手順では、上層に4か所、中層に2か所の穿孔を作成します。
      3. パンチで穴を開ける前に、接合したアセンブリを硬いカッティングマットの上に置いてください。
      4. 一定の下降圧をかけながら、一動作で押し下げます。
        注：剥離のリスクを最小限に抑えるため、回転力や側方からの力を加えないようにしてください。
      5. イソプロピルアルコールで湿らせた滅菌済みの低発塵ガーゼを用いて、穿刺部位の残渣を除去します。
      6. 十分な照明の下で、穿孔部およびその周囲の接合領域を検査してください。
      7. 次へ進む前に、剥離、破れ、または穿孔の不完全さがないことを確認してください。
    6. 下層の接合
      1. ステップ2.7.4に記載のとおり、下層をプラズマ処理する。
      2. 下層マイクロチャネルの入口ポートおよび出口ポートを、上層および中層の穿孔に合わせて配置してください。
      3. 最下層を接合し、デバイスの組み立てを完了させる。
        注：アライメントを容易にするため、接合前に底層の外表面に流入口と流出口の位置をマークしておくこと。
        注：文献にある通り、プラズマチャンバーはプラズマペンよりも強力な接合を提供する場合がある。36.
        注：完成したデバイスは、象牙質界面を組み込んだ3層構造のマイクロ流体プラットフォームで構成されています（図1H）。下側の象牙質面はモデルの歯髄側を表し、上側の象牙質面は歯科用バイオマテリアルや細菌調製液を塗布するための歯冠側を表しています。
  8. マイクロ流体デバイスのリークテスト
    1. 組み立てた装置の検査
      1. 組み立てた装置にずれがないか確認してください。
      2. アセンブリに接合不全や目に見える漏れがないか検査してください。
    2. リークテスト（漏洩試験）
      1. 19G Luer-lockニードルをインレットポートに接続します（図1E).
      2. 針をマイクロフルイディクスポンプのチューブに接続します。
      3. パンチで開けたポートにニードルハブを軽く押し込み、気密性を確保します。
      4. 滅菌済みPBSまたは培地を、以下の流速で注入してください。 10 µL/min.
      5. 少なくとも5分間、液体を流し続けてください。
      6. 流動中に、すべての接着界面、チャンネル辺縁、および象牙質ディスクの境界を確認してください。
      7. 注入中および注入後、十分な照明の下でデバイスを観察してください。
      8. 液体の蓄積、濡れ、または液滴の形成がないことを確認してください。
      9. 漏れが検出されない場合、そのデバイスをリークフリー（漏れなし）として分類します。
      10. 漏出が認められるデバイスは廃棄してください。
        注：細胞播種または実験に使用する前に、作製したすべてのデバイスでリークテストを実施すること。
  9. マイクロ流体デバイスの滅菌および保存
    1. 滅菌
      1. 組み立てたデバイスの上面を、ラミナーフローキャビネット内でUV光（254 nm）に30分間曝露させる。
      2. 底面をさらに30分間UV光にさらしてください。
      3. マイクロチャネルを70%エタノールで20分間フラッシュする。
      4. 残留エタノールを除去するため、滅菌PBSでマイクロチャネルを3回洗浄する。
    2. 保存
      1. 滅菌済みのデバイスを、直ちに細胞培養実験に使用してください。
      2. あるいは、デバイスを滅菌済みPBSに浸した状態で、以下の温度で保存してください。 4°C 使用するまで、滅菌容器内で保管します。
        注意：デバイス組み立て後にクロラミンやその他の消毒液を使用しないでください。PDMSがこれらの化合物を吸収し、細胞生存率に悪影響を及ぼす可能性があります。

3. 歯髄幹細胞の接着性と生存率の評価

  1. 象牙質表面のプレコンディショニング
    1. デバイス内に10% EDTAを注入する。
    2. EDTA溶液と象牙質表面を15分間接触させる。
    3. マイクロチャネル内の流体を維持するため、3分ごとに0.5 mLのEDTAを注入する。
    4. 象牙質ディスクを超純水で3回洗浄する。
    5. 各洗浄を5分間行う。
      注意：EDTA処理によりスメア層が除去され、象牙質マトリックスタンパク質が露出する。
      警告：皮膚や目への刺激を避けるため、EDTA溶液を取り扱う際は手袋と保護メガネを着用すること。
  2. 歯科髄幹細胞の播種
    1. 歯科髄幹細胞の拡大培養
      1. T75フラスコに歯科髄幹細胞を1フラスコあたり1 × 106 cellsの密度で播種する。
      2. 細胞を37°C、5% CO2条件下で、コンフルエンシーが約80%に達するまでインキュベートする。
      3. トリプシンを用いて細胞を剥離させる。
      4. 完全培地を用いてトリプシンを中和する。
      5. 細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを回収する。
      6. トリパンブルーを用いて細胞生存率を評価する。
      7. 生存率が90%以上の細胞懸濁液を使用する。
    2. 細胞懸濁液の調製
      1. 細胞懸濁液を37°Cに予熱して調製する。
      2. 完全培地を用いて、細胞濃度を100,000 cells/mLに調整する。
      3. 最終懸濁液量を1–2 mLとする。
        注意：本研究では継代数5の細胞を使用した。
    3. 細胞の播種
      1. 下部マイクロチャネルのインレットポートに細胞懸濁液を注入する。
      2. 細胞播種後、デバイスを反転させる。
        注意：デバイスを反転させることで、象牙質表面への細胞の沈降が促進され、細胞接着が向上する。
    4. インキュベーション
      1. 反転させたデバイスをペトリ皿の中に配置する。
      2. 蒸発を最小限に抑えるため、ペトリ皿に1 mLの培地を加える。
      3. デバイスを37°C、5% CO2条件下で24時間インキュベートする。
      4. インキュベーション期間中は静置培養条件を維持する。
        注意：本研究ではダイナミックフローの検証は行わなかった。
        注意：本プロトコルでは、初期のデバイス検証および細胞接着評価のための静置培養条件について記述している。
    5. 初期デバイス検証
      1. 走査電子顕微鏡を用いて細胞接着を評価する。
      2. 解析前にデバイスを分解し、象牙質ディスクを回収する。
  3. 走査電子顕微鏡用サンプルの調製
    1. サンプルの回収と洗浄
      1. 24時間のインキュベーション後、デバイスを分解する。
      2. 象牙質ディスクを回収し、培養プレートまたはペトリ皿に移す。
      3. 細胞を播種した象牙質表面を上向きに配置する。
      4. 1 mLのPBSを用いて象牙質ディスクを2回洗浄する。
    2. 固定
      1. 0.1 M Sorensenリン酸緩衝液で調製した2.5%グルタルアルデヒドを2 mL加える。
      2. サンプルを室温（RT）で30分間インキュベートする。
        警告：グルタルアルデヒドは毒性があり、皮膚、目、および呼吸器への刺激を引き起こす可能性がある。固定操作は、適切な個人用保護具を着用し、化学薬品用ドラフトチャンバー内で行うこと。
    3. 固定後の洗浄
      1. グルタルアルデヒド溶液を除去する。
      2. 室温（RT）で超純蒸留水を用いて象牙質ディスクを3回洗浄する。
    4. SEM解析
      1. 環境走査電子顕微鏡を用いてサンプルを解析する。
      2. 低真空条件（25 Pa）で顕微鏡を操作する。
      3. 加速電圧10.0 kV、作動距離7.0 mmに設定する。
      4. 反射電子3D検出モード（BSE-3D）を用いて画像を取得する。
      5. 200倍の倍率で画像を撮影する（図 2A）。
  4. 共焦点顕微鏡による細胞生存率の評価
    1. サンプル調製
      1. ステップ 3.2に従って細胞を播種し、培養する。
      2. デバイスを37°C、5% CO2条件下で24時間インキュベートする。
      3. デバイスを分解し、象牙質表面を露出させる。
      4. Ca2+およびMg2+を添加し、予熱したHBSS+/+を含むウェルプレートに象牙質ディスクを移す。
    2. サンプルの洗浄
      1. HBSS+/+を用いて象牙質ディスクを2回洗浄する。
      2. 染色の前に、残留した血清およびフェノールレッドを除去する。
        注意：残留した血清やフェノールレッドは、背景の自家蛍光を増大させる可能性がある。
    3. 生存細胞の染色
      1. HBSS+/+を用いて、2 µMの新鮮なCalcein AMワーキングソリューションを調製する。
      2. 象牙質表面を完全に覆うのに十分な量の染色液を加える。
      3. サンプルを37°Cの暗所で20分間インキュベートする。
      4. インキュベーション後、染色液を除去する。
    4. 死細胞の染色
      1. Propidium Iodideワーキングソリューション（HBSS+/+中で1–2 µg/mL）を加える。
      2. サンプルを37°Cの暗所で5–8分間インキュベートする。
      3. インキュベーション時間は10分を超えないようにすること。
      4. HBSS+/+を用いてサンプルを2回洗浄する。
      5. イメージングまでサンプルを緩衝液に浸したままにする。
    5. 共焦点顕微鏡による画像取得
      1. 染色後30分以内に共焦点画像を取得する。
      2. 緑色チャンネルと赤色チャンネルで順次画像を取得する。
      3. 生存細胞のイメージングにはλex 490 nmおよびλem 515 nmを使用する。
      4. 死細胞のイメージングにはλex 535 nmおよびλem 617 nmを使用する。
        注意：インキュベーションおよびイメージングの手順中、蛍光染色溶液および染色済みサンプルを光から保護すること（図 2B）。

電子顕微鏡と蛍光顕微鏡の比較、細胞構造解析。
図2: 象牙質-歯髄複合体OoCデバイス内における歯髄幹細胞の接着性と生存率の代表的な評価。 (A) OoCデバイス内で24時間の静置培養後、象牙質表面に接着した歯髄幹細胞（白アスタリスク）を示す走査電子顕微鏡像。24時間の培養後、接着細胞はマイクロチャネルに露出した象牙質表面の54.35 ± 0.92%を覆っていた。PDMSで覆われた象牙質領域（黒アスタリスク）には細胞は見られず、デバイス層間の効果的な封止が示されている。スケールバー = 200 µm。 (B) 静置培養24時間後、緑色に染色され象牙質表面に接着した生存歯髄幹細胞（白矢印）を示す共焦点顕微鏡像。赤色に染色された非生存細胞も観察される（青矢印）。スケールバー = 50 µm。 こちらのリンクから、この図の拡大版をご覧いただけます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

tooth-on-a-chipデバイスの作製は、図1A–1Iに示すワークフローに従って行われました。これには、象牙質ディスクの調製（図1D）、フォトリソグラフィーによるモールドの作製（図1E）、硬化済みPDMS層の剥離（図1F）、接合前のプラズマ活性化（図1G）、最終デバイスの組み立て（図1H）、およびデバイスのマイクロ流路系への接続（図1I）が含まれます。得られたデバイスは3層のPDMSアセンブリで構成されており、象牙質ディスクが中間層に完全に組み込まれ、象牙質表面の両側に上下のマイクロチャネルが配置されています（図1H）。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究では、象牙質と歯科用パルプ幹細胞を組み込んだ垂直積層型トゥースオンチップ（tooth-on-a-chip）デバイスの作製に関するステップバイステップのプロトコルを記述し、静的培養条件下におけるデバイス内での代表的な細胞接着性と生存能を実証します。本プロトコルは、象牙質界面のin vitro研究に適した象牙質-歯髄複合体OoCプラットフォームの作製および組み立てのための再現可能なワークフローを提供するために開発されました。このようなワークフローの確立は特に重要です。なぜなら、我々の最近の系統的レビューにおいて、象牙質-歯髄複合体のマイクロフルイディクスモデルの分野は依然として発展途上の段階にあり、デバイスの構造や材料において方法論的な不均一性が高く、それが現在のトゥースオンチップモデルの再現性と標準化を著しく損なっていることが強調されたためです34。詳細で再現可能なプロトコルを提供することで、本研究はこれらの制限に対処し、より定義された生物学的モデルの開発に寄与します。口腔生物学に適用されるOoC開発のより広い文脈において、Françaらは15

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益がないこと、および開示すべき利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、ラ・フロンテーラ大学研究局のプロジェクトDIM24-0004およびプロジェクトPP24-0031、チリ国家研究開発庁（ANID）のFONDECYT Regular No. 1260116、およびFONDECYT de Iniciación No. 11230701の支援を受けて行われました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
生物学的および化学的材料
アセトンExpertQSOLV 8シリコンウェーバーの洗浄
Alpha MEM 培地CytivaSH30265.02歯髄幹細胞培養培地
クロラミン (0.5%)Merck7080-50-4象牙質ディスク用保存液
歯髄幹細胞該当なし該当なし初代細胞培養。ステップ 3.2.1 および 3.2.2 を参照
EDTA (10%)WinklerN2222158Eスメア層の除去
エポキシ系ネガフォトレジストGersteltecGM1060フォトリソグラフィー用モールド作製
0.1 M Sorensen’s リン酸緩衝液含有グルタルアルデヒド (2.5%)Sigma-Aldrich210908-06SEM固定
健康なヒトの歯（大臼歯または小臼歯）該当なし該当なしヒトサンプル
イソプロパノールExpertQSOLV 16ウェーバー洗浄、現像停止、およびPDMS洗浄
LIVE/DEAD 生細胞・死細胞染色キットSigma-Aldrich451蛍光生存率染色 
PBS (リン酸緩衝生理食塩水)Corning46-013-CM洗浄およびリークテスト
PDMSベースおよび硬化剤 (ポリジメチルシロキサン)DowSylgard 184デバイス作製
PGMEASigma Aldrich484431フォトレジスト現像
トリパンブルーSigma Aldrich T8154-100ml細胞生存率評価
トリプシンCorning25-053-CI細胞剥離
超純水CytivaSH30529.01洗浄液
消耗品およびラボウェア
19G 注射針VmaticVCB19050デバイスとマイクロポンプまたはシリンジの接続
バイオプシーパンチ (直径: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073入口および出口ポートの作製
カッティングマットNicecool該当なしパンチング時の表面保護
歯科用仕上げディスク (例: Sof-Lex)3MSof-Lex象牙質の研磨
メスルーバー-バーブアダプター (雌)Runze FluidicsRH-M016チューブ接続
ガラス製またはプラスチック製撹拌棒Duran該当なしPDMSの混合
皮下注射用シリンジCranberrypc-12246細胞播種およびリークテスト
糸くずの出ない滅菌ガーゼLinderson該当なしパンチング後の残渣除去
メスルルーバーアダプター (雄)Runze FluidicsRH-G016チューブ接続
混合容器Duran該当なしPDMSの調製
ペトリ皿 (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219細胞培養/インキュベーション
ポリテトラフルオロエチレンベースCCTVal該当なし中間象牙質層の作製
シリコンウェーバーJiaozuo Commercial FineWin該当なしモールド作製
シリコーンチューブRunze Fluidics96421流体接続
T75 フラスコCorning 353136歯髄幹細胞の拡大培養
ウェルプレートSPL Life Sciences30006共焦点染色およびイメージング準備
装置および器具
エアドライヤーMETALPLANTITAN-040圧縮空気の乾燥
圧縮空気源SCHULZCSD-18.1モールドおよび表面の洗浄
共焦点顕微鏡Olympus該当なしモデル: FV1000
直接描画リソグラフィーシステムHeidelberguPG 101フォトレジスト露光
環境走査型電子顕微鏡Hitachi該当なしモデル: Quanta 400 
高速ハンドピースNakanishi該当なしモデル: Pana-max2
ホットプレートLabTechEH20A Plusウェーバーおよびフォトレジストのベイク
層流キャビネットBioBaseBBS8V1708313Dデバイスの滅菌
マイクロ流体ポンプNew Era該当なしモデル: 1002X-ES。10 µL/min でのリークテスト
微細構造モールド (フォトリソグラフィーにより作製)CCTVal該当なしモールド作製の仕様についてはステップ 2.2 を参照
オーブンまたはインキュベーターMemmertUN11050°C でのPDMS硬化および 75°C での接合強化
真空プラズマ洗浄チャンバーFari PlasmaGD-5ウェーバーのプラズマ活性化
ハンドヘルドコロナプラズマ Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACPDMSのプラズマ活性化
超音波洗浄機Elma SonicS 10 (H)ウェーバー洗浄
真空チャンバーまたはデシケーター (250 mm)Winglass該当なしPDMSの脱泡
真空ポンプROCKER300PDMSの脱泡

参考文献

  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

Organ on a Chip PDMS

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。