ヒト象牙質ディスクを用いた垂直積層型象牙質-歯髄複合体オルガンオンチップデバイスの作製

サマリー

ヒト象牙質ディスクとフォトリソグラフィーで作製したマイクロチャネルを組み込んだ、垂直積層型象牙質-歯髄複合体オルガン・オン・ア・チップデバイスの作製およびアセンブリについて記述し、続いて歯髄幹細胞の播種と培養について解説する。

要約

動物モデルや静的な細胞培養などの歯科研究で用いられる従来の前臨床モデルには、象牙質-歯髄界面の生理的条件を再現し、歯科バイオマテリアルに対するヒトの生物学的反応を予測する上で重要な限界があります。Organ-on-a-chip (OoC) 技術は、制御されたマイクロ流体システム内で組織特異的な微小環境の再現を可能にすることで、代替的なアプローチを提供します。本稿では、3層のポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体プラットフォーム内にヒト象牙質ディスクを組み込んだ、象牙質-歯髄複合体OoCデバイスの作製および組み立てに関するステップバイステップのプロトコルを記述します。このプロトコルには、象牙質ディスクの調製、フォトリソグラフィによる微細構造モールドの作製、PDMSのキャスティングと硬化、プラズマ支援による層間接合、デバイスの組み立て、リークテスト、および静的な培養条件下での歯髄幹細胞の播種が含まれます。PDMS層の厚さの制御、プラズマ表面処理、リークを最小限に抑えるためのデバイス内への象牙質ディスクの組み込みなど、デバイスの性能に影響を与える重要な作製パラメータについて議論します。デバイス内での細胞接着と生存率は、走査型電子顕微鏡および共焦点ライブ/デッド染色を用いて評価されました。代表的な結果により、マイクロ流体アセンブリ内への象牙質ディスクの統合、リークのない状態の維持、および象牙質表面への生存した歯髄幹細胞の接着が実証されました。本プロトコルは、歯科バイオマテリアルや微小環境刺激に対する細胞反応を調査する今後の研究を支援し得る、象牙質-歯髄複合体OoCプラットフォーム作製の再現可能な手法を提供します。

概要

動物実験は、病理学的および生理学的プロセスの理解を深める上で長らく重要な役割を担っており、創薬の初期段階においても中心的な役割を果たしてきました¹。20世紀を通じて人間の平均寿命は大幅に向上しました。この改善が動物研究のみによるものであるかを正確に定量化することは不可能ですが、現代の多くの医学的治療法が動物モデルを用いて開発または検証されてきたことは広く認められています²。顕著な例としては、ポリオ、麻疹、B型肝炎などのワクチン開発、ペニシリンの安全性と有効性の評価、およびインスリンの製造などが挙げられます。歯科およびバイオマテリアル研究の分野では、これらのモデルは、う蝕のプロセス、象牙質・歯髄複合体の生物学および再生、そして歯周組織の生理病理学的研究において不可欠なものでした^3,4。

これらの手法が広く利用されているにもかかわらず、現在の創薬パイプラインでは依然として高い失敗率が見られ、多くの候補薬が、前臨床のラボ設定や動物モデルで有効性と安全性が示されていたにもかかわらず、臨床試験で脱落しています⁵。この乖離は、種間の解剖学的、遺伝的、および生理学的な差異により、動物モデルの翻訳的な予測能が制限されるという種間差に関連していると考えられています⁶。加えて、新しい治療アプローチの開発には、依然として多大な時間と費用を要します⁷。さらに、従来のin vitroモデルは主に、非生理的なプラスチック基質上での単純な二次元（2D）単層培養を用いており、ヒトの口腔内に存在する生化学的および物理的な手がかり、細胞間相互作用、および細胞外マトリックス（ECM）シグナルを再現できていません^8,9.。2Dモデルはある程度の実験的な利点を提供しますが、バイオフィルム、バイオマテリアル、象牙質、および歯髄細胞など、複数の構成要素間で同時に起こる複雑な相互作用を本質的に再現することは不可能です¹⁰。その結果、ヒトの生物学的反応をより正確に再現できる代替的な実験プラットフォームの開発への関心が高まっています。2022年、FDA近代化法2.0（FDA Modernization Act 2.0）により、医薬品承認プロセスにおける動物実験の義務的要件が撤廃され、前臨床研究におけるオルガンオンチップ（OoC）技術を含む代替プラットフォームの活用の可能性が認められました¹¹。

OoC（生体模倣システム）とは、特定の臓器や組織構成要素の構造、機能、および微小環境を再現するように設計されたマイクロ流体デバイスである¹²。これらのデバイスには、細胞が自然にさらされる生理学的微小環境の主要な側面を再現した、設計済みマイクロチャネル内で培養された生細胞および組織が組み込まれている。構造的な模倣にとどまらず、マイクロチャネルは細胞環境の時空間的な制御を可能にし、組織特異的な機能の維持をサポートする。これにより、従来の培養システムよりも生体内の生理状態に近い実験条件を提供できる¹²。特に、OoCデバイスのマイクロチャネルは培地の制御された流れを促進し、これにより定着した細胞にせん断応力がかかる¹³。これらの機械的刺激は、接着、増殖、遊走、遺伝子発現、および細胞間相互作用を含む細胞応答に影響を与える^14,15。さらに、培地の連続的な流れは、栄養供給と代謝廃棄物の除去を通じて微小環境の維持に寄与する¹⁶。また、従来の2D培養と比較して、一部のOoCプラットフォームでは、3次元（3D）オンチップモデルにおいて、細胞内活性酸素種や細胞生存率を含む酸化ストレス関連のリードアウトの制御が改善されることが報告されている¹⁷。したがって、OoCシステムは、制御された実験条件下で組織生理学、バイオマテリアル相互作用、および疾患プロセスを研究するための有望なプラットフォームとして登場した¹⁸。歯科研究において、OoC技術は、ますます複雑な口腔組織界面をモデル化するために段階的に適用されてきた¹⁹。初期のtooth-on-a-chipプラットフォームは、バイオマテリアル・象牙質・歯髄界面を模倣していたが²⁰、より高度な反復モデルでは、その後、血管系と三叉神経支配が組み込まれ、歯髄象牙質複合体の構造的および機能的な複雑さがより忠実に再現されるようになった²¹。歯髄以外では、未熟根管の3Dモデルにより、根管洗浄剤の評価や、根尖乳頭由来幹細胞における血管新生芽形成の評価が可能となった^22,23。歯周組織レベルでは、gum-on-a-chipプラットフォームを用いて、宿主・微生物相互作用の調査や、治療剤としてのプロバイオティクスの免疫調節能の評価が行われている²⁴。一方で、periodontal ligament-on-chipデバイスは、間質液の流れが血管ネットワークの形成および歯根膜幹細胞スフェロイドの骨分化をどのように調節するかを示している^25,26。これらのモデルを補完するように、特化したoral mucosa-on-a-chipおよびdental implant-on-a-chipシステムが、生理学的に関連のある条件下で宿主・材料相互作用や歯科用モノマーの細胞毒性を特性化することで、歯科マイクロ流体研究の範囲をさらに広げている^27,28。

OoCシステムは歯科、口腔および顎顔面研究に広く応用されるようになっていますが、作製ワークフローの標準化と再現性の向上に向けた継続的な取り組みが依然として重要です。文献では、異なるデバイス構成や実験的応用を示す複数のtooth-on-a-chipモデルが報告されています^20,29,30,31。しかし、デバイスの構造、作製方法、象牙質の組み込み方、および実験パラメータの報告形式にばらつきがあるため、再現性や研究間の直接的な比較が制限される可能性があります。特に、マイクロチャネルの形状、象牙質の統合戦略、および作製アプローチの違いは、デバイス内の生物学的および機械的な微小環境に影響を及ぼす可能性があります。報告されているモデルの中には、象牙質–歯髄界面の側面を再現するために象牙質を組み込んだものがあり^20,29,30、一方で代替的な構成を採用したものもあります³¹。さらに、フォトリソグラフィー、レーザーカット、マイクロフライス加工、3Dプリンティングなどの作製方法は、意図するデバイス設計や用途に応じて、それぞれ固有の利点と制限があります。また、生物学的な有用性を決定づける重要な要因はデバイスの構造的配向であり、具体的にはチャネルと象牙質スライスが水平方向または垂直方向に配置されているか否かです^19,32。水平積層構成では、コンパートメントが横に並んで配置されるため、側方向の区画化と細胞のリアルタイム可視化が容易になります。そのため、歯周組織複合体のように、本質的に側方向の空間的組織化を持つ組織のモデル化に特に適しています^24,32。しかし、この設計では、コンパートメントの側方向の配置が、窩洞と歯髄の間の象牙質バリアの生体内（in vivo）の配向を忠実に再現できないため、バイオマテリアル-象牙質-歯髄複合体のような垂直な生物学的界面を再現する能力に本質的な限界があります^20,32。垂直積層構成では、2つのコンパートメントをy軸方向に重ね合わせ、その間を天然の象牙質スライスで隔てることでこれらの制限を解消しており、完全な象牙質を介した分子輸送の同時定量化と、流出液中で測定される歯髄細胞応答のリアルタイムモニタリングが可能になります³⁰。しかし、この配向における認識された制限は、象牙質-細胞界面の断面イメージングに関わるものです。細胞と細胞外マトリックスが側方向に配置されている水平積層構成と比較して、同一焦点面内で象牙質-細胞界面の断面画像を取得することは、依然として技術的な困難が伴います。文献では複数の象牙質-歯髄複合体on-a-chipモデルが報告されていますが、その大部分はコンパートメントが同一平面上に横に並ぶ水平積層構成を採用しており^10,20,21,29、垂直積層構成の中に天然の象牙質スライスを組み込んだものは比較的少数です³⁰。それにもかかわらず、これらのモデル間での作製アプローチや報告パラメータのばらつきが、再現性と研究間比較を制限し続けています³³。本論文では、垂直積層型のtooth-on-a-chipデバイスの詳細な作製プロトコルを提供することで、手法の再現性を向上させ、歯科研究コミュニティにおける本プラットフォームのより広範な導入を促進することを目的としています。

本原稿では、フォトリソグラフィーを用いて作製した金型による3層のポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体プラットフォーム内にヒト象牙質ディスクを組み込んだ、垂直積層型の象牙質-歯髄複合体OoCデバイスの段階的な作製および組み立てプロトコルについて記述します。また、本プロトコルでは、静止条件下でのデバイス内における歯髄幹細胞の播種および培養についても説明します。

プロトコル

本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施され、ヒト試料を用いた研究に関するラ・フロンテラ大学倫理委員会の承認を得ている。

1. 象牙質ディスクの採取

注：プロトコルを開始する前に、デバイスの設計を準備してください（図 1A–1C）。

1. 歯の回収と保存
   1. 患者からインフォームドコンセントを得た後、健康なヒトの大臼歯または小臼歯を回収する。
   2. 象牙質の脱水およびタンパク質の変性を防ぐため、すべての検体を0.5%クロラミン溶液中で4°Cで保存する。
   3. 保存期間中、クロラミン溶液を週に1回交換する。
2. 象牙質ディスクの作製
   1. 円筒形ダイヤモンドバー（直径1 mm、粒度100–150 µm）を備え、350,000 rpmで回転する高速ハンドピースを用いて、各歯の歯冠の中央3分の1の部位を水平に切断する。
   2. 約50 mL/minの連続的な注水下で切断を行う。
   3. 歯髄腔および咬合面溝や裂溝にあるエナメル質を避けるため、切断位置を歯冠の中央3分の1に設定し、主に象牙質組織で構成されるディスクを得る。
      注意：歯の切断は連続的な注水下で行い、手袋、マスク、保護メガネを含む適切な個人用保護具を着用すること。
3. 象牙質ディスクの仕上げ
   1. 粒度の小さい順に仕上げディスクを用いて、象牙質ディスクを研磨する。
   2. 最終的な象牙質の厚さが約0.8 mm (±± 0.3 mm)、側面の寸法が約5 mm × 5 mm (±± 0.3 mm) になるまで研磨を続ける (Figure 1D)。
4. 象牙質ディスクの保存
   1. 作製した象牙質ディスクを、OoCデバイスの組み立てまで0.5%クロラミン溶液中で4°Cで保存する。

図 1：象牙質–歯髄複合体オルガンオンチップ（OoC）デバイスの設計および作製ワークフロー。（A）3層構造を示すデバイスの3次元設計図。（B）主要寸法を記載したデバイス設計の上面図。（C）3層デバイス構成の側面図。（D）厚さ約 0.8 mm、平面寸法約 5 mm × 5 mm で作製された代表的な象牙質ディスク。（E）フォトリソグラフィーで作製され、上層および下層のポリジメチルシロキサン（PDMS）層のキャスティングに使用されたシリコンマスターモールド。（F）熱重合後、シリコンモールドから剥離された硬化PDMS層。（G）層接合前に行われるPDMS表面のプラズマ処理。（H）プラズマ接合により組み立てられ、象牙質界面を組み込んだ最終的な3層象牙質–歯髄複合体OoCデバイス。（I）漏れ試験およびマイクロ流体実験の準備のため、チューブに接続された組み立て済みデバイス。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

2. 象牙質-歯髄複合体OoCデバイスの作製

1. ワークスペースおよび材料の準備
   1. 材料および器具の準備
      1. リストに記載されているすべての材料および器具を準備します。 材料リスト デバイス作製を開始する前に。
      2. デバイスを組み立てる前に、生検パンチを準備します。
      3. すべての作製手順は、清潔で防塵された環境で行ってください。
      4. デバイスの作製および組み立ての全工程において、手袋、保護メガネ、および適切な個人用保護具を着用してください。
         注：プロトコルを開始する前に、フォトリソグラフィー法で作製した型を準備してください（図1E).
2. 微細構造金型の作製
   1. シリコンウェハの調製
      1. 4インチの片面研磨シリコンウェハー（N型、Asドープ、CZ成長法）上にモールドを作製する。 <100> オリエンテーション, 500 ±± 25 µm 厚さ、TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, 抵抗率 0.001–0.005 Ω·cm).
      2. ウェハーをアセトン、イソプロパノール、超純水の順に、超音波洗浄機を用いてそれぞれ10分間ずつ洗浄する。
      3. 圧縮空気を用いてウェハを乾燥させる。
      4. ウェハーを〜でベークする 200°C ホットプレート上で10分間加熱し、残留水分を除去する。
      5. ウェハーを室温（RT）まで冷却します。 20°C–25°C).
   2. 表面活性化およびフォトレジスト塗布
      1. レベル7の空気プラズマで120秒間動作させた真空プラズマクリーナーを用いて、シリコンウェハーの表面を活性化させる。
      2. GM 1060エポキシ系ネガ型フォトレジストを、300 rpmで10秒間スピンコートし、塗布する。
      3. 加速 200 rpm/s で、565 rpm で 100 秒間、次いで 965 rpm で 1 秒間のスピンコートを継続する。
      4. コーティングしたウェハーを10分間静置します。
      5. 以下でプリベイク（予備焼成）を行う。 65°C 10分間。
      6. 以下の温度でプリベイク（予備焼成）を継続します。 95°C 1時間。
      7. ウェハーを室温まで冷却します。
   3. 露光および現像
      1. ダイレクトレーザーリソグラフィーシステムを用い、1,950 mJ/cm²の露光量でフォトレジストを露光する。².
      2. 以下でポストベイク（後焼き）を行う。 65°C 10分間。
      3. 以下で焼成を継続します。 95°C 30分間。
      4. ウェハーを室温まで冷却する。
      5. ウェハーを10分間静置します。
      6. PGMEA中で4分間現像を行う。
      7. 残留フォトレジストがある場合は、30秒間隔で現像時間を延長してください。
      8. イソプロパノールでリンスし、現像を停止させます。
      9. 圧縮空気を用いてウェハを乾燥させる。
   4. ハードベイク
      1. 以下の温度でハードベイクを行う。 135°C 2時間。
      2. 幅1mmのマイクロチャネルを含むマイクロ構造マスターモールドを用意し、 50 µm 高さにおいて。
3. PDMS混合物の調製および脱気
   1. PDMS混合物の調製
      1. PDMSベースと硬化剤を10:1の重量比で混合します。
      2. プラスチック製ビーカーに入れ、ガラス棒を用いて混合物を約5分間手動で撹拌する。
      3. 混合中は、ゆっくりと絶え間なく円を描くように混ぜ続けてください。
         注：混合時に気泡が混入しないように注意してください。
   2. 脱気
      1. PDMS混合物を、真空ポンプに接続した真空デシケーター内に入れます。
      2. 混合物を約700 mmHgで5分間脱気する。
      3. 真空を短時間解除し、表面の気泡を消滅させる。
      4. 真空を再度適用してください。
      5. 目に見える気泡がなくなるまで、このサイクルを繰り返します。
         注：全脱気時間は通常、約30分です。
4. モールドへのPDMSのキャスティング
   1. モールドの作製
      1. 型を平らな面に置きます。
      2. 圧縮空気を用いて金型を洗浄してください。
      3. パターニングされた表面に直接触れないようにしてください。
      4. 型にほこりや汚染物質が付着していないことを確認してください。
   2. PDMSの分注
      1. 象牙質埋没層を作製するため、象牙質ディスクの周囲に約8 gのPDMSを分注します。
      2. PDMSの高さを象牙質ディスクの厚さ（0.8）に合わせて調整します。 ±± 0.3 mm）。
      3. PDMSが象牙質表面を覆わないようにしてください。
      4. 各マイクロチャネル層を作製するため、モールドユニットあたり約0.26 gのPDMSを分注します。
      5. 金型を軽く叩くか、振動を加えて微細構造への充填を促進させます。
      6. PDMSを最小の微細構造まで浸透させてください。
      7. PDMS表面に触れないように、蓋またはフラットカバーでモールドを覆います。
         注：象牙質埋込層の厚さは約0.8 mmで、各マイクロチャネル層の厚さは約0.4 mmであり、デバイスの総厚は約1.6 mmとなる。
         注：共焦点イメージングを行う予定がある場合は、共焦点対物レンズの作動距離に応じて層の厚さを調整してください。
5. 硬化
   1. 型をオーブンに入れ、以下の温度に設定します。 50°C.
   2. PDMSを4時間キュアする。
6. PDMS層の除去
   1. 硬化済みPDMSの除去
      1. 硬化したPDMS層を型から慎重に剥がします（図1F).
      2. 微細構造を損傷させないよう、PDMSレイヤーを慎重に扱ってください。
7. PDMS層の接合および入口・出口ポートの作製
   1. 入口ポートおよび出口ポートの作製
      1. 1 mmのバイオプシーパンチを用いて、指定の入口および出口の位置に穿孔を作成します。
      2. パンチングの際は、マイクロチャネル側を上に向けた状態で配置してください。
         注：構造的な損傷を防ぐため、PDMS層をカッティングマットの上に置いてください。
      3. 上層に、上部マイクロチャネルに対応する2つの穿孔を作成します。
   2. PDMSレイヤーの洗浄
      1. イソプロピルアルコールまたはエタノールを用いて、PDMS層を洗浄します。
      2. 滅菌済み粘着テープを用いて、残留したダスト粒子を除去する。
      3. 組み立て前に、すべての接合面に汚染物質が付着していないことを確認してください。
   3. PDMS表面のプラズマ活性化
      1. プラズマ処理のため、上層および中層のPDMSレイヤーを配置します（図1G).
      2. 周囲空気を作業ガスとして用い、約25Wで動作するハンドヘルドコロナプラズマ処理装置を使用して、表面を活性化させる。
      3. プラズマ源とPDMS表面との間の作業距離を約1 mmに維持してください。
         注意：プラズマ処理は適切な換気条件下で行い、プラズマによって発生するオゾンに直接さらされないようにしてください。
      4. プラズマ処理装置を起動し、5秒間安定させます。
      5. 処理前に、均一なプラズマビームが生成されていることを確認してください。
      6. 約5 mm/sの速度で連続的に往復運動させながら、最上層のPDMSを10秒間処理する。
      7. 同様の動作と距離で、中間のPDMS層を10秒間処理します。
      8. 接合の直前に、最上層にさらに1秒間のプラズマ処理を施してください。
   4. 上層および中層の接合
      1. プラズマ処理直後に、上部のマイクロチャネルをデンチンディスクに合わせて配置してください。
      2. 上層と中層を接合します。
      3. 接合したアセンブリを、～の温度のオーブンに入れます。 75°C 5分間。
      4. インキュベーション中に結合を定着させる。
         注：象牙質ディスクとマイクロチャネルは肉眼で確認できるため、追加のアライメントツールを使用せずに位置合わせが可能です。
   5. 下部マイクロチャネルポートの作製
      1. 接合された上層および中層を貫通するように、下部のマイクロチャネルに対応する2か所の穿孔を行います。
      2. アライメントを確実にするため、2つの層を同時にパンチしてください。
         注：この手順では、上層に4か所、中層に2か所の穿孔を形成します。
      3. パンチ処理を行う前に、接合したアセンブリを硬いカッティングマットの上に置いてください。
      4. 一定の下向きの圧力を加え、一度の動作で押し下げます。
         注：剥離のリスクを最小限に抑えるため、回転方向または側方への力を加えないでください。
      5. イソプロピルアルコールで湿らせた滅菌済みの低低リンターガゼを用いて、穿孔部位からデブリを除去します。
      6. 十分な照明の下で、穿孔箇所およびその周囲の接合領域を検査してください。
      7. 次へ進む前に、剥離、破れ、または穿孔の不備がないことを確認してください。
   6. 底層の接合
      1. ステップ 2.7.4 に記載されている手順に従い、最下層をプラズマ処理します。
      2. 下層マイクロチャネルの入口ポートおよび出口ポートを、上層および中層の穿孔に合わせて配置します。
      3. 最下層を接合し、デバイスの組み立てを完了させる。
         注：アライメントを容易にするため、接合前にボトムレイヤーの外表面に入口と出口の位置を印付けてください。
         注：文献で報告されている通り、プラズマチャンバーはプラズマペンよりも強力な結合を可能にする場合があります。³⁶.
         注：完成したデバイスは、象牙質界面を組み込んだ3層構造のマイクロ流体プラットフォームで構成される（図1H）。象牙質の下表面はモデルの歯髄側を表し、象牙質の上表面は歯科用バイオマテリアルまたは細菌製剤を曝露させるための歯冠側を表しています。
8. マイクロ流体デバイスのリークテスト
   1. 組み立てた装置の検査
      1. 組み立てた装置にズレがないか確認してください。
      2. アセンブリを検査し、不完全な接合や目に見える漏れがないかを確認してください。
   2. リークテスト
      1. 19Gルアーロック針を入口ポートに接続します（図 1E).
      2. ニードルをマイクロ流路ポンプのチューブに接続します。
      3. ニードルハブをパンチされたポートに軽く押し込み、気密性を確保します。
      4. 滅菌PBSまたは培地を、以下の流速で注入します。 10 µL/min.
      5. 5分以上、流体を流し続けてください。
      6. フロー中に、すべての接着界面、チャネル辺縁、および象牙質ディスクの境界を確認してください。
      7. 注入中および注入後に、十分な照明の下でデバイスを観察してください。
      8. 液だまり、濡れ、または液滴の形成がないことを確認してください。
      9. 漏洩が検出されない場合は、当該デバイスをリークフリー（漏洩なし）として分類してください。
      10. 漏出が認められるデバイスは廃棄してください。
          注：細胞播種または実験に使用する前に、作製したすべてのデバイスに対してリークテスト（漏出試験）を実施してください。
9. マイクロ流体デバイスの滅菌および保存
   1. 滅菌
      1. ラミナーフローキャビネット内で、組み立てたデバイスの上面をUV光（254 nm）に30分間曝露させる。
      2. 底面をさらに30分間、UV光にさらします。
      3. マイクロチャネルを70%エタノールで20分間洗浄する。
      4. 残留したエタノールを除去するため、滅菌PBSでマイクロチャネルを3回洗浄します。
   2. 保存方法
      1. 滅菌済みのデバイスを、直ちに細胞培養実験に使用してください。
      2. あるいは、デバイスを滅菌PBSに浸した状態で以下に保存してください。 4°C 使用時まで滅菌容器内で保管します。
         ​注意：デバイスの組み立て後にクロラミンなどの消毒液を使用しないでください。PDMSがこれらの化合物を吸収し、細胞の生存率を低下させる可能性があるためです。

3. 歯科髄幹細胞の接着性と生存率の評価

1. 象牙質表面の前処理
   1. デバイスに10% EDTAを注入します。
   2. EDTA溶液を象牙質表面に15分間接触させたままにする。
   3. マイクロチャネル内の流動を維持するため、3分ごとに0.5 mLのEDTAを注入してください。
   4. 超純水で象牙質ディスクを3回洗浄する。
   5. 各洗浄を5分間行う。
      注：EDTA処理によりスメア層が除去され、象牙質マトリックスタンパク質が露出します。
      注意：皮膚および眼への刺激を避けるため、EDTA溶液を取り扱う際は手袋と保護メガネを着用してください。
2. 歯髄幹細胞の播種
   1. 歯髄幹細胞の拡大培養
      1. T75フラスコに、密度1の条件で歯髄幹細胞を播種する。 × 10⁶ フラスコあたりの細胞数。
      2. 細胞を以下の条件でインキュベートします。 37°C および5% CO2₂ 約80%のコンフルエンシーに達するまで。
      3. トリプシンを用いて細胞を剥離させる。
      4. 完全培地を用いてトリプシンを中和してください。
      5. 細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを得る。
      6. トリパンブルーを用いて細胞生存率を評価する。
      7. 生存率90%以上の細胞懸濁液を使用してください。
   2. 細胞懸濁液の調製
      1. あらかじめ温めておいた細胞懸濁液を、以下の条件で準備します。 37°C.
      2. 完全培地を用いて、細胞濃度を100,000 cells/mLに調整する。
      3. 最終懸濁液量を1～2 mLに調製します。
         注：本研究では、継代数5の細胞を使用した。
   3. 細胞播種
      1. 細胞懸濁液を下側マイクロチャネルの入口ポートに注入します。
      2. 細胞播種後、デバイスを反転させる。
         注：デバイスを反転させることで、象牙質表面への細胞の沈降が促進され、細胞接着が向上します。
   4. インキュベーション
      1. 反転させたデバイスをシャーレの中に配置します。
      2. 蒸発を最小限に抑えるため、シャーレに1 mLの培地を加えます。
      3. デバイスを以下の条件でインキュベートします。 37°C および5% CO2₂ 24時間。
      4. インキュベーション期間中、静置培養条件を維持してください。
         注：本研究では、動的フローバリデーションは実施していない。
         注：本プロトコルでは、デバイスの初期検証および細胞接着能評価のための静止培養条件について記述します。
   5. 初期デバイスバリデーション
      1. 走査電子顕微鏡を用いて細胞接着を評価する。
      2. 分析前に、デバイスを分解して象牙質ディスクを回収してください。
3. 走査電子顕微鏡観察のための試料作製
   1. サンプルの回収および洗浄
      1. 24時間のインキュベーション後、装置を分解する。
      2. 象牙質ディスクを回収し、培養プレートまたはシャーレに転送します。
      3. 細胞を播種した象牙質表面を上向きに配置します。
      4. 1 mLのPBSを用いて、象牙質ディスクを2回洗浄します。
   2. 固定
      1. 0.1 M Sorensenリン酸緩衝液で調製した2.5%グルタルアルデヒドを2 mL加える。
      2. サンプルを室温で30分間インキュベートする。
         注意：グルタルアルデヒドは毒性があり、皮膚、眼、および呼吸器系に刺激を引き起こす可能性があります。固定の手順は、適切な個人用保護具を着用し、化学薬品用ドラフトチャンバー内で実施してください。
   3. 固定後の洗浄
      1. グルタラールデヒド溶液を除去します。
      2. 室温で、超純蒸留水を用いて象牙質ディスクを3回洗浄してください。
   4. SEM解析
      1. 環境走査電子顕微鏡を用いてサンプルを分析します。
      2. 低真空条件（25 Pa）で顕微鏡を操作してください。
      3. 加速電圧を10.0 kV、作動距離を7.0 mmに設定する。
      4. 反射電子3D検出モード（BSE-3D）を用いて画像を取得する。
      5. 以下の条件で画像を撮影します。 ×200倍（図 2A).
4. 共焦点顕微鏡による細胞生存率の評価
   1. 試料調製
      1. ステップ 3.2 に記載されている方法で、細胞を播種し、培養する。
      2. デバイスを24時間、以下の条件でインキュベートします。 37°C および5% CO2₂.
      3. 装置を分解し、象牙質表面を露出させます。
      4. あらかじめ加温したHBSSを含むウェルプレートに、象牙質ディスクを移す。⁺/+ Ca添加済み²⁺ およびMg²⁺.
   2. サンプルの洗浄
      1. HBSSで象牙質ディスクを2回洗浄する。⁺/⁺.
      2. 染色の前に、残留した血清およびフェノールレッドを除去してください。
         注：残留した血清およびフェノールレッドにより、背景の自家蛍光が増加する可能性があります。
   3. 生細胞染色
      1. 新鮮なCalcein AMワーキングソリューションを以下で調製します。 2 µM HBSS中で⁺/⁺.
      2. 象牙質表面を完全に覆うのに十分な量の染色液を加えてください。
      3. サンプルを20分間、次の条件でインキュベートします。 37°C 暗所にて。
      4. インキュベーション後、染色液を除去する。
   4. 死細胞染色
      1. プロピジウムイオダイド（Propidium Iodide）作業溶液（1–2 µg/mL HBSS中にて⁺/⁺).
      2. サンプルを～で5～8分間インキュベートする。 37°C 暗所で。
      3. インキュベーション時間は10分を超えないようにしてください。
      4. HBSSでサンプルを2回洗浄します。⁺/⁺.
      5. イメージングまで、サンプルをバッファーに浸漬したまま維持してください。
   5. 共焦点顕微鏡による画像取得
      1. 染色の後30分以内に共焦点画像を取得する。
      2. グリーンチャンネルとレッドチャンネルで順次画像を撮影する。
      3. 使用法 λ_例 490 nmおよび λ_em 生細胞イメージングには515 nmを使用します。
      4. 使用方法 λ_例 535 nmおよび λ_em 死細胞イメージングには617 nmを用います。
         ​注意：インキュベーションおよびイメージングの手順の間、蛍光染色溶液および染色済み試料を遮光してください（図 2B).

図2:dentin–pulp complex OoCデバイス内における歯髄幹細胞の接着性と生存能の代表的な評価。 (A) OoCデバイス内で24時間の静置培養後、象牙質表面に接着した歯髄幹細胞（白のアスタリスク）を示す走査電子顕微鏡像。24時間の培養後、接着細胞はマイクロチャネルに露出した象牙質表面の54.35 ± 0.92%を覆っていた。PDMSで覆われた象牙質領域（黒のアスタリスク）に細胞は観察されず、デバイス層間が効果的に封止されていることが示されている。スケールバー = 200 µm。 (B>) 24時間の静置培養後、緑色に染色され象牙質表面に接着した生存歯髄幹細胞（白の矢印）を示す共焦点顕微鏡像。赤色に染色された非生存細胞も観察される（青の矢印）。スケールバー = 50 µm。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

結果

tooth-on-a-chipデバイスの作製は、図1A–1Iに示すワークフローに従って行われました。これには、象牙質ディスクの調製（図1D）、フォトリソグラフィーによるモールドの作製（図1E）、硬化済みPDMS層の剥離（図1F）、接合前のプラズマ活性化（図1G）、最終デバイスの組み立て（図1H）、およびデバイスのマイクロ流路系への接続（図1I）が含まれます。得られたデバイスは3層のPDMSアセンブリで構成されており、象牙質ディスクが中間層に完全に組み込まれ、象牙質表面の両側に上下のマイクロチャネルが配置されています（図1H）。

この段階での良好な結果は、目に見える気泡や剥離がないこと、および入口ポートからPBSまたは培地を注入した際に液漏れなく流体が通過することによって定義されました(Figure 1I)。マイクロチャネルポートの不整合、不完全なプラズマ接合、または象牙質–PDMS界面での漏れは、アセンブリの失敗を示しており、作製手順を繰り返す必要がありました。

計30台のデバイスを作製したが、そのうち約20%が作製または試験中に故障した。故障の主な原因は、プラズマボンディングの不完全さによるマイクロチャネル境界外への液漏れであり、少なではあったがデバイスの他の領域での剥離による故障も見られた。象牙質–PDMS界面での漏れや、マイクロチャネルの入口および出口ポートのずれに起因する故障は認められなかった。

24時間の静置培養後、象牙質表面に線維芽細胞様の形態を示す歯髄幹細胞が付着していることが確認され、細胞播種が成功したことが示された。走査電子顕微鏡を用いて、細胞の接着とデバイスの完全性の両方を評価した（Figure 2A）。本プロトコルを用いた結果、培養24時間後、マイクロチャネルにさらされた象牙質表面の54.35 ± 0.92%を付着細胞が覆っていた。陽性結果は、付着細胞がマイクロチャネル領域内のみに存在し、PDMSで覆われた象牙質表面には細胞が付着していないことで証明された（Figure 2A）。この空間的な分布は、デバイス層間の封止が成功し、デバイスが適切に組み立てられたことを裏付けている。逆に、マイクロチャネルの境界外に細胞が存在する場合はリークを示しており、陰性結果とみなされるべきである。

生死染色を用いた共焦点顕微鏡観察により、デバイス内での細胞生存率の非破壊的な評価が可能となった。良好な結果は、緑色蛍光を示し線維芽細胞様の形態を持つ生存細胞が支配的であり、赤色に染色された非生存細胞がわずかに見られることによって特徴づけられた（図 2B）。対照的に、非生存細胞の割合が高い場合は、象牙質のプレコンディショニングが不十分であるか、洗浄が不適切であるか、あるいは培養条件が不適切であることを示している。

プロトコルの最適化において、あらかじめ凹部を設けた固定型を用いて、中間PDMS層内に象牙質ディスクを配置する初期の作製戦略を検討した(図 3A)。この手法は、ディスクの配置を標準化し、ディスクとPDMSの界面における漏れを低減することを目的としていたが、実際には非効率であることが判明した。象牙質ディスクの凹部に対応する領域を硬化したPDMS層から手作業で切り出す必要があったため、ディスクの縁と切り出されたPDMSの端との精密な適合を確実に得ることができず、その結果、作製したデバイスの約50%で界面の隙間に起因する漏れが生じた(図 3A)。

図3:象牙質-歯髄複合体OoCデバイスの最適化過程で特定された、不成功に終わった作製アプローチを示す代表的な画像。 (A) 標準的な象牙質ディスクの配置（白矢印）のために設計された固定リセスを持つシリコンモールド。手動の検体調製に起因する象牙質ディスク寸法の固有のばらつきにより、固定されたモールド形状への確実な適合を達成できず、作製したデバイスの約50%で界面の隙間と漏出が生じた。 (B) ディスク-PDMS界面に封止材を塗布した後の象牙質表面の走査電子顕微鏡像。露出した象牙質（黒アスタリスク）と封止材の付着物（白アスタリスク）が示されている。封止材が象牙質表面に意図せず広がったことで、細胞接着が損なわれ、細胞コロニー形成に利用可能な表面積が減少した。スケールバー = 100 µm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この制限に対処するため、ディスクとPDMSの界面に封止材を塗布しました。しかし、走査電子顕微鏡（図 3B）で示されたように、この手法では封止材が象牙質表面に広がり、被覆領域における細胞接着を妨げるという新たな欠点が生じました。これらの不十分な結果により、初期の作製戦略における2つの重要な限界が浮き彫りになりました。それは、手動で切削したPDMSの凹部と象牙質ディスクとの間の不十分な適合と、封止材に伴う細胞接着性の低下です。

ディスカッション

本研究では、象牙質と歯科用パルプ幹細胞を組み込んだ垂直積層型トゥースオンチップ（tooth-on-a-chip）デバイスの作製に関するステップバイステップのプロトコルを記述し、静的培養条件下におけるデバイス内での代表的な細胞接着性と生存能を実証します。本プロトコルは、象牙質界面のin vitro研究に適した象牙質-歯髄複合体OoCプラットフォームの作製および組み立てのための再現可能なワークフローを提供するために開発されました。このようなワークフローの確立は特に重要です。なぜなら、我々の最近の系統的レビューにおいて、象牙質-歯髄複合体のマイクロフルイディクスモデルの分野は依然として発展途上の段階にあり、デバイスの構造や材料において方法論的な不均一性が高く、それが現在のトゥースオンチップモデルの再現性と標準化を著しく損なっていることが強調されたためです³⁴。詳細で再現可能なプロトコルを提供することで、本研究はこれらの制限に対処し、より定義された生物学的モデルの開発に寄与します。口腔生物学に適用されるOoC開発のより広い文脈において、Françaらは¹⁵、象牙質ディスクと牙質芽細胞様細胞を組み込んだマイクロフルイディクス・トゥースオンチップモデルを用いてこの分野を切り拓き、動的なマイクロフルイディクス環境で象牙質-歯髄界面を再現し、歯科材料に対する細胞毒性反応を評価できることを実証しました。この画期的な貢献以来、歯科組織生物学、バイオマテリアル相互作用、および口腔微生物学の多様な側面に取り組む多くの口腔OoCプラットフォームが文献で報告されており³⁴、このアプローチは活発かつ急速に拡大している研究分野として確立されています。本プロトコルは、標準的なマイクロフルイディクス設備を持つ研究グループでも利用可能な、垂直積層型トゥースオンチッププラットフォームの詳細かつ再現可能な作製ワークフローを提供することで、この分野に貢献します。

デバイスの作製と性能を成功させるためには、プロトコルのいくつかのステップが極めて重要です。特に、モールドへのPDMSの流し込みでは、均一な層の厚さと適切なマイクロチャネルの形成を得るために、慎重な制御が必要です。PDMS層の厚さは、予定している後続のアプリケーションに応じて選択する必要があります。例えば、共焦点顕微鏡観察では、象牙質表面に付着した細胞を光学的に可視化するために、PDMS層を十分に薄くする必要があります。しかし、層が薄すぎると、作製および組み立ての手順において操作が困難になる場合があります。したがって、PDMSの厚さの最適化は、イメージングのアクセシビリティとデバイス作製時の実用的なハンドリングとの間での重要なバランス調整となります。さらに、本研究では、細胞上のPDMS層の厚さが0.4 mmであり、使用可能な共焦点顕微鏡の浸透深さ（0.2 mm）を超えていたため、デバイスをそのままの状態での共焦点顕微鏡観察は不可能でした。その結果、共焦点イメージングはデバイスを分解し、象牙質表面を直接的に露出させた後に行われました。加えて、象牙質固有の不透明性により、その表面に付着した細胞の直接的な光学的可視化が妨げられたため、本デバイスでは蛍光顕微鏡観察は適用できませんでした。

この制限は、細胞を含むマイクロチャネルが象牙質ディスクの下方に配置される垂直積層型のOoC構成において特に顕著であり、上層のPDMS層と象牙質自体の不透明性の両方によって光学的アクセスが妨げられます。この制限は、マイクロチャネルが象牙質の下ではなく側面に沿って横方向に走る水平積層型のチップ設計では生じません。そのため、象牙質の不透明度やPDMSの厚さに干渉されることなく、細胞が播種された表面への直接的な光学的アクセスが可能になります。したがって、垂直積層と水平積層の構成の選択にあたっては、流体的な要求事項や生物学的な要求事項だけでなく、研究室で利用可能なイメージング手法も考慮する必要があります。OoCシステムにおいてデバイス設計は重要な役割を果たし、微小環境は可能な限りin vivoの条件に近づけて維持されなければなりません。多くの組織と同様に、歯は機械的刺激を受け、異方性挙動³⁵を示します。つまり、その特性は適用される刺激の方向に依存して変化します。さらに、象牙質と象牙芽細胞が垂直に配置されている象牙質–歯髄複合体の冠部と、象牙芽細胞が象牙質に隣接して存在する側面との間には組織学的な差異があり、細胞数、組織構成、および象牙細管の配向に顕著な違いが見られます。したがって、垂直積層型のチップ設計は、象牙質–歯髄複合体の冠部に影響を及ぼすう蝕病変や修復材料の、より忠実な解剖学的再現を可能にします。

精密なプラズマ表面処理はデバイスの組み立てを成功させるために不可欠であり、チップ製造における主要な課題の一つであり続けています³⁶。本研究では、作製したデバイスの20%で剥離が発生しました。この結果は想定内と言えます。なぜなら、本研究で使用したハンドヘルドプラズマペンによるPDMS–PDMS接合は、真空ベースのプラズマチャンバーシステムよりも反応性酸素種の生成濃度が低いためです。真空システムでは大気圧以上の酸素濃度が可能であり、その結果、接合に利用可能な共有結合性表面基をより多く生成できます³⁶。したがって、プラズマペンを用いて得られる接合強度は、専用のプラズマチャンバーで得られるものよりも本質的に低く、再現性も低いため、これが観察された剥離率に寄与したと考えられます。また、象牙質統合戦略の最適化においても、漏出を最小限に抑えつつ、象牙質ディスクと中間PDMS層との密着性を確保するために、複数回の作製反復が必要となりました。初期のアプローチでは、象牙質を配置するために中間層に定義済みのリセス（凹部）を作製しましたが、リセスの手動切断により象牙質ディスクとPDMSマージン間の整合性が不十分となり、培地注入時に漏出が発生し、全体的な作製成功率は約50%にとどまりました。

その後、象牙質–PDMS界面の封止性を向上させるために義歯用接着剤の検討を行ったが、走査電子顕微鏡による観察の結果、細胞接着への干渉と象牙質表面における細胞の視認性の低下が認められた。そのため、最終的なプロトコルでは、金型の中に象牙質ディスクを直接配置してから、試料の周囲に慎重にPDMSをキャストするように最適化した。これにより、デバイス内への象牙質ディスクの組み込みが改善され、追加の封止材の必要性が軽減された。この手法は、象牙質ディスクの縁と周囲のPDMSとの間で密接かつ適合的な接触を確保することで、象牙質表面への細胞接着を妨げる可能性のある二次的な封止剤に頼ることなく、象牙質–PDMS界面における漏出を効果的に排除した。また、本手法のいくつかの限界についても考慮する必要がある。マイクロ流体デバイスの作製は、依然として一部の手作業による操作に依存しており、デバイス間や操作者間でばらつきが生じる可能性がある。フォトリソグラフィーは、マイクロチャネル形状の作製において高い精度と再現性を提供するが、このプロセスには専用の設備と技術的な専門知識が必要となる場合がある。3Dプリンティング技術を含む代替的な作製アプローチは、一部の研究室においてデバイスのプロトタイピングやアクセシビリティを向上させる可能性があるが、印刷解像度、残留モノマー、材料の生体適合性などの要因について、慎重な最適化が必要である³⁷。

培地の継続的な供給により、細胞に安定した環境が提供され、老廃物の蓄積やカルシウム／リン酸の不均衡から細胞が保護されます¹⁶。いくつかの研究により、定常流によって誘発されるせん断応力が、細胞挙動の重要な決定要因であるin vivoのシグナリングと同様のメカノトランスダクションプロセスを模倣できることが示されており^38,39、それが細胞の分化と成熟に寄与し、細胞形態、遺伝子発現、および機能に顕著な変化をもたらします³⁹。本研究では、デバイスの作製と初期検証について報告し、静的培養条件下での24時間後の細胞接着性と生存率を実証しています。したがって、動的な流れの影響については評価していません。動的な流れの条件の導入は、今後の研究における重要な方向性であり、後続の調査で取り組む予定です。本プロトコルでは、3層構造のPDMSマイクロ流体プラットフォーム内に象牙質を組み込んだ、垂直積層型の象牙質-歯髄複合体OoCデバイス作製のための再現可能なワークフローを提供します。本モデルの潜在的な応用としては、象牙質とバイオマテリアルの相互作用の調査、歯科材料に対する細胞応答の解析、および制御された実験条件下での象牙質-歯髄界面のin vitro評価などが挙げられます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
生物学的および化学的材料
アセトン	ExpertQ	SOLV 8	シリコンウェーバーの洗浄
Alpha MEM 培地	Cytiva	SH30265.02	歯髄幹細胞培養培地
クロラミン (0.5%)	Merck	7080-50-4	象牙質ディスク用保存液
歯髄幹細胞	該当なし	該当なし	初代細胞培養。ステップ 3.2.1 および 3.2.2 を参照
EDTA (10%)	Winkler	N2222158E	スメア層の除去
エポキシ系ネガフォトレジスト	Gersteltec	GM1060	フォトリソグラフィー用モールド作製
0.1 M Sorensen’s リン酸緩衝液含有グルタルアルデヒド (2.5%)	Sigma-Aldrich	210908-06	SEM固定
健康なヒトの歯（大臼歯または小臼歯）	該当なし	該当なし	ヒトサンプル
イソプロパノール	ExpertQ	SOLV 16	ウェーバー洗浄、現像停止、およびPDMS洗浄
LIVE/DEAD 生細胞・死細胞染色キット	Sigma-Aldrich	451	蛍光生存率染色
PBS (リン酸緩衝生理食塩水)	Corning	46-013-CM	洗浄およびリークテスト
PDMSベースおよび硬化剤 (ポリジメチルシロキサン)	Dow	Sylgard 184	デバイス作製
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	フォトレジスト現像
トリパンブルー	Sigma Aldrich	T8154-100ml	細胞生存率評価
トリプシン	Corning	25-053-CI	細胞剥離
超純水	Cytiva	SH30529.01	洗浄液
消耗品およびラボウェア
19G 注射針	Vmatic	VCB19050	デバイスとマイクロポンプまたはシリンジの接続
バイオプシーパンチ (直径: 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	入口および出口ポートの作製
カッティングマット	Nicecool	該当なし	パンチング時の表面保護
歯科用仕上げディスク (例: Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	象牙質の研磨
メスルーバー-バーブアダプター (雌)	Runze Fluidics	RH-M016	チューブ接続
ガラス製またはプラスチック製撹拌棒	Duran	該当なし	PDMSの混合
皮下注射用シリンジ	Cranberry	pc-12246	細胞播種およびリークテスト
糸くずの出ない滅菌ガーゼ	Linderson	該当なし	パンチング後の残渣除去
メスルルーバーアダプター (雄)	Runze Fluidics	RH-G016	チューブ接続
混合容器	Duran	該当なし	PDMSの調製
ペトリ皿 (140 mm × 20 mm)	Deltalab	2000219	細胞培養/インキュベーション
ポリテトラフルオロエチレンベース	CCTVal	該当なし	中間象牙質層の作製
シリコンウェーバー	Jiaozuo Commercial FineWin	該当なし	モールド作製
シリコーンチューブ	Runze Fluidics	96421	流体接続
T75 フラスコ	Corning	353136	歯髄幹細胞の拡大培養
ウェルプレート	SPL Life Sciences	30006	共焦点染色およびイメージング準備
装置および器具
エアドライヤー	METALPLAN	TITAN-040	圧縮空気の乾燥
圧縮空気源	SCHULZ	CSD-18.1	モールドおよび表面の洗浄
共焦点顕微鏡	Olympus	該当なし	モデル: FV1000
直接描画リソグラフィーシステム	Heidelberg	uPG 101	フォトレジスト露光
環境走査型電子顕微鏡	Hitachi	該当なし	モデル: Quanta 400
高速ハンドピース	Nakanishi	該当なし	モデル: Pana-max2
ホットプレート	LabTech	EH20A Plus	ウェーバーおよびフォトレジストのベイク
層流キャビネット	BioBase	BBS8V1708313D	デバイスの滅菌
マイクロ流体ポンプ	New Era	該当なし	モデル: 1002X-ES。10 µL/min でのリークテスト
微細構造モールド (フォトリソグラフィーにより作製)	CCTVal	該当なし	モールド作製の仕様についてはステップ 2.2 を参照
オーブンまたはインキュベーター	Memmert	UN110	50°C でのPDMS硬化および 75°C での接合強化
真空プラズマ洗浄チャンバー	Fari Plasma	GD-5	ウェーバーのプラズマ活性化
ハンドヘルドコロナプラズマ	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	PDMSのプラズマ活性化
超音波洗浄機	Elma Sonic	S 10 (H)	ウェーバー洗浄
真空チャンバーまたはデシケーター (250 mm)	Winglass	該当なし	PDMSの脱泡
真空ポンプ	ROCKER	300	PDMSの脱泡