自閉症関連経路における空生振中ダンのメカニズム:ネットワーク薬理学、分子ドッキング、実験的検証に基づく研究

サマリー

本研究はネットワーク薬理学、分子ドッキング、分子動力学(MD)シミュレーションを統合し、自閉症スペクトラム障害(ASD)におけるKongsheng Zhenzhong Dan(KSZZD)のコア活性成分および治療標的を明らかにし、アラニンスキャンによる鍵結合残基の同定、バルプロ酸誘発ASDラットモデルでの効果の検証を行います。

要約

自閉症スペクトラム障害(ASD)は複雑な神経発達障害であり、その病因は慢性神経炎症と密接に関連しています。伝統的な中国医学(TCM)の古典的な処方として、孔生真中丹(KSZZD)は神経発達障害や記憶障害に神経保護効果があると報告されているため用いられていますが、ASDにおけるその具体的な分子メカニズムは不明です。本研究はネットワーク薬理学、分子ドッキング解析、MDシミュレーションを統合し、全身および原子レベルの両方でASDに対するKSZZDの主要な有効成分および治療候補標的を体系的に明らかにします。その後、アラニンフレキシブルスキャンによってキーバインディング残基を特定し、生物学的効果をバルプロ酸(VPA)誘発ASDラットモデルで評価します。ネットワーク薬理学解析では、KSZZDの主要成分であるケルセチンが、TN α F系の炎症シグナル伝達経路を調節することで部分的に作用する可能性があることが明らかになりました。分子ドッキングの結果、KSZZDのコア成分の標的への結合エネルギーはすべて-5.0 kcal/mol未満であり、その中でケルセチンはTNFへの結合親和性が最も強く(-8.52 kcal/mol)を示しました。MDシミュレーションでは、ケルセチンがTNF-αの活性ポケットに安定した結合を維持できることが示唆され、アラニンスキャンではGLU104とGLN102が複合体の構造安定性を維持する重要なアミノ酸残基であることがさらに特定されました。 in vivo 実験では、VPA誘発性ASDラットにおけるクエルセチン介入が運動行動および探索行動を有意に改善し、血清および脳組織におけるTNF-α発現レベルを効果的に低下させることが示されました。これらの発見は、ケルセチンが少なくとも部分的にTNF-αシグナル伝達経路の阻害を通じてKSZZDの予測効果に寄与している可能性を示唆しています。

概要

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的コミュニケーションの障害、興味の制限、繰り返しのステレオタイプ的な行動を特徴とする複雑な神経発達障害^です。ASDの病理的メカニズムは非常に複雑で、遺伝的変異、エピジェネティックな調節、環境要因の相互作用が関与し、最終的にシナプス可塑性の障害や神経回路の異常な結合性を引き起こす^2,3。中枢神経系(CNS)の慢性炎症はASDの発症に中心的な役割を果たしており、神経炎症を標的とした介入が有望な治療戦略として注目されています。

古典的な中医の処方である「孔生真中丹(KSZZD)」は、『緊急のための千金の必須処方箋』に初めて収録されました。この薬草は4種類の薬草、カメの甲羅、オス・ドラコニス、ポリガラエ・ラディックス、アコリ・タタリノウィイ・リゾマで構成されています。KSZZDは伝統的に心臓と腎臓のトーン、心の鎮静、精神の安定に使われます。臨床的には、知的発達遅延や記憶障害の治療に一般的に用い^{られます。}現代の薬理学的研究では、KSZZDおよびその活性成分が神経保護、抗炎症、抗酸化作用を発揮し、神経発達^{障害モデルにおける}学習、記憶、不安様行動を改善する可能性があることが示唆されています5。私たちの植物化学的解析により、ケルセチンやその他のフラボノイドがこの処方の主要な有効成分であり、血液脳関門を通過し、顕著な抗炎症活性を示すことが明らかになりました⁶。しかし、これらの活性成分がASDにおけるKSZZDの治療効果を媒介するメカニズムは、依然として十分に解明されていません。

計算生物学の急速な発展により、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、分子動力学シミュレーション、量子化学計算などの技術が、伝統中国医学の活性成分と疾患標的の原子レベルでの相互作用を解明する強力なツールを提供しました。7,8,9,10,11 .異種なデータソースを統合することで、ネットワーク薬理学はシステム生物学の観点から複雑でインタラクティブな「コンポーネント-ターゲット-経路」ネットワークを構築し、伝統中国医学の疾患介入における重要な生物学的ノードを予備的に特定することを可能にします。

この基盤に基づき、分子ドッキングは成分とターゲットタンパク質間の幾何学的マッチングやエネルギーフィットをシミュレートし、結合モードや潜在的な活性を予測するためにさらに利用可能です。その後、分子動力学(MD)シミュレーションを実施し、水性および生理学的条件下での構造変動と結合安定性を調査します。アラニンスキャンと組み合わせて、サイト指向型変異誘発シミュレーションを用いて、結合親和性を維持するコアホットスポット残基を正確に特定し、アミノ酸レベルでの薬物の寄与重量を明らかにします。最後に、よく設計された薬理学的実験に基づく検証により、伝統的な中国医学化合物が特定の疾患に及ぼす治療効果の分子メカニズムを効果的に明らかにすることができます。

したがって、本研究はまずネットワーク薬理学を通じてASD治療におけるKSZZDの中核的要素と標的をスクリーニングすることを目指します。その後、分子ドッキング、分子動力学シミュレーション、アラニンフレキシブルスキャンを組み合わせて、複雑な安定性を維持する「ホットスポット残基」を特定し、ケルセチンとTNF-αの動的相互作用パターンを評価します。最後に、VPA誘導のASDラットモデルで、動物行動、脳組織病理学、炎症因子発現レベルの評価を用いて実験的に検証されます。本研究は、KSZZD由来の成分が自閉症関連の炎症経路にどのような影響を与えるかを多尺度の視点から探求し、神経発達障害における伝統中国医学介入のさらなる研究の基盤を提供することを目指します。

プロトコル

ネットワーク薬理学解析

「Autism」はGeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)で自閉症関連のターゲットを検索するためのキーワードとして使われ^ました。データベースから取得したターゲットは、重複エントリーが削除された後に統合されました。データベース予測で捉えられなかった既知の活性成分の標的は^{文献報告に}基づき補完された。疾患標的および薬剤成分の潜在的標的はUniProtタンパク質データベース(https://www.uniprot.org/)を用いて遺伝子シンボルに統一的に標準化され、これら2つの標的セットをマッピングして自^{閉症に対する}KSZZDの治療標的を特定しました。

伝統中医システム薬理学データベースおよび分析プラットフォーム(TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)に基づき、KSZZDに含まれる潜在的な生体活性化合物および対応する標的は、経口バイオ利用能(OB ≥ 0.30)および薬剤類似指数(DL ≥ 0.18)の基準に従ってスクリーニングされました¹⁷。化合物のSMILES識別子はPubChemデータベース(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)から取得され、さらにSwiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)を用いてTCMSPプラットフォーム¹⁸に含まれていない潜在的な標的を探りました。その後、HERBデータベース(http://herb.ac.cn)はリピンスキーの五法則に従い補助スクリーニングに使用され、以下の基準で評価されました:分子量(MW ≤ 500 Da)、オクタノール-水分配係数(AlogP ≤ 5)、水素結合ドナー数(Hdon ≤ 5)、水素結合受容体数(Hacc ≤ 10)、回転可能結合数(RBN ≤ 10)。次に、BATMAN-TCMデータベース(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)を用いて、スコアカットオフ(≥0.84)、薬物適性スコア(≥0.10)、 P 値(≤0.05)を用いてターゲットスクリーニングを実施しました。最後に、UniProtデータベース(https://www.uniprot.org)を用いて選ばれた標的名を標準的な遺伝子シンボルに変換しました。

薬物標的と自閉症標的の重複標的は、オンラインのDraw Venn Diagramツール(http://bioinformatics.psb.ugent.be)を用いて特定されました。これらの重複標的はSTRINGデータベース(https://string-db.org/)にインポートされ、タンパク質間相互作用(PPI^{)ネットワークを構築し}ました。種はホモ・サピエンスに設定され、信頼度スコアが0.40未満のタンパク質間相互作用は除外されました。得られたネットワークはCytoscape 3.10.0ソフトウェアにインポートされ、視覚解析¹⁶で薬剤、化合物、標的がそれぞれ赤いダイヤモンド、青い円、緑の三角形で表され、エッジの重みはノードの度中心性を反映していました。その後、CytoNCAプラグインを使って度中心性の値を計算し、コア化合物のランク付けを行い、主要なコア化合物を特定しました。ターゲット遺伝子のバイオインフォマティクス濃縮解析はMetascapeプラットフォーム²⁰を用いて行われ、GO解析(生物学的プロセスBP;分子機能MF;細胞成分CC)およびKEGG経路解析が含まれていました。

分子ドッキング

上記の自閉症関連受容体タンパク質は、ドッキング前に欠損残基の修復、プロトン化状態の最適化、受容体の構造的完全性を維持するための結晶水分子の除去によって前処理されました。その後、CDOCKERモジュール²¹ で半柔軟性ドッキング方式が採用されました。共結晶リガンドから10 Å以内の残基が活性ポケットとして定義され、この領域内で配位子-受容体結合がシミュレートされました。

ドッキング結果はCDOCKER相互作用エネルギーを主要指標として評価し、エネルギー値が低いほどリガンドと受容体間の結合予測が安定していることを示しました。ドッキングモードの信頼性は、コア成分の空間的結合構造とアクティブポケット内の共結晶リガンドの構造を比較することで評価されました。最適な結合エネルギーと最も強い相互作用を持つ錯体が、その後の分子動力学シミュレーションの初期立体構造として選ばれました。

分子動力学シミュレーション

分子ドッキングの発見に基づき、ケルセチン複合体とTNF-αの結合メカニズムを探る分子動力学シミュレーションが実施されました。この手法は原子レベルでの分子運動や相互作用をシミュレートし、タンパク質、配位子、周囲環境の動的変化を解析することで、分子立体構造変化、結合安定性、タンパク質-リガンドダイナミクスに関する情報を提供します。受容体-配位体はTIP3P水モデルを用いてソルベーションされ、完全な溶媒化と境界効果の低減のために、複合体と系境界の間に少なくとも12 Åのバッファー距離を設けました。イオン濃度は0.154 Mに設定され、系電荷を中和するためにナッセンイオンとクリンイオンが加えられました。シミュレーション精度向上のため、Amber14SBタンパク質フォースフィールド²² が採用されました。これは非結合分子間相互作用や結合モードを効果的に記述し、特にタンパク質-リガン^{ド複合体の}研究に適しています。

初期エネルギー最小化のために、最も急な降下法が5000ステップで実行され、不合理な接触や高エネルギー構造を除去し、収束閾値を10 kJ/mol/nmに定めて力場パラメータの緩和を確保しました。その後、熱力学状態のさらなる最適化とシステムの安定性を確保するために共役勾配法を2,000ステップ実行^{しました。}

平衡時には、NVTアンサンブルシミュレーションが100psで2 fsのタイムステップで初めて実施されました。システムは初期構造の影響を減らし熱力学的平衡に達するために徐々に300Kまで加熱されました。その後、アンサンブルはNPTに切り替わり、密度と圧力を安定させるために1バールの定圧でさらに100 psの平衡が行われました。この段階は生産シミュレーション²⁵の前にシステムを安定した熱力学状態にするために用いられました。正式な分子動力学シミュレーションは20 nsで行われ、温度は300 K、圧力は1バール、時間ステップは2 fsで維持されました。軌道は10 psごとに保存されました。シミュレーションの安定性と精度を確保するため、温度、圧力、体積などの物理パラメータが定期的に監視され、期待範囲内に収まっていることを確認します。

アラニンフレキシブルスキャン

分子動力学シミュレーションから得られた安定した立体構造に基づき、配位結合界面から半径3Å以内のすべてのアミノ酸残基に対してアラニンスキャンが実施されました。この手法では、標的残基を体系的にアラニンに置き換え、側鎖を切断しつつ主鎖の立体構造を維持し、側鎖媒介の特異的相互作用を除去します。各残基の結合親和性への寄与重量は、野生型と変異体間で結合自由エネルギーの変化を計算することで定量化しました。従来の静的モデルとは異なり、本研究では側鎖柔軟な緩和機構を導入し、突然変異部位周辺の環境が構造的緩和を行い、結合界面の動的応答をより現実的にシミュレートできるようにしました。この解析は、複雑な安定性を維持する候補ホットスポット残基を特定し、自閉症関連タンパク質を標的としたリード化合物最適化のためのエネルギー的な指紋を提供することを目指しました。

動物実験

実験動物

健康なSPFグレードのSprague-Dawley(SD)ラット(オス3頭、メス3頭、生後3か月)を同一の条件下で生まれ育てたものを選定しました。室温は18〜22°Cに制御され、相対湿度は60%〜70%に保たれ、光のサイクルは12時間(明暗)でした。すべての動物実験手術は、準義第一人民病院の実験動物倫理委員会(承認番号:LunShen (2025)-2-362)によって承認されました。

動物の交尾、妊娠識別、そしてグループ化

購入後1週間、すべてのラットはSPF環境で適応的に給餌されました。毎日午後18時にメスのラット1匹とオス用のラットが一緒にケージに入れられていました。膣プラグ検査は翌朝8時(ケージ入りから12時間後)に行われました。膣プラグの存在は成功した交尾とみなされ、同日は妊娠0.5日目(GD0.5)と指定されました。妊娠したラットは個別にケージに入れられていました。妊娠中のラットの体重は毎日測定・記録されました。妊娠中のラットの体重は継続的に増加し、平均1日あたり2〜5gの増量があり、出産前には総体重が約30%増加することができました。妊娠約10日後には、典型的な洋梨形の非対称腹部膨らみが見え、触診で胎児の硬い塊を感じることができ、肥満による均一で柔らかい腹部の周囲とは区別されました。

モデルの確立と対照群の設定:

モデル群では、妊娠中の2隻のラットを無作為に選び、妊娠12.5日目(GD12.5)に1回腹腔内VPA溶液(600 mg/kg)を注射しました。VPAは妊娠12.5日目に600 mg/kgの単回腹膜内注射で投与されました。このレジメンは、SchneiderとPrzewłocki(²⁶)による画期的な研究に基づいて選ばれました。彼らは、この特定の妊娠時点におけるVPA曝露が、人間のASDの神経解剖学的および行動的特徴の両方を再現することを確立しました。このプロトコルはその後標準モデルとなり、同一パラメータ²⁷を用いた最近の薬理学的研究で一貫して検証されています。ブランク対照群では、妊娠中のラット1匹を選び、同時点に0.9%の正常生理食塩水を腹腔内に注射しました。妊娠中のラットは自然分娩し、子孫の誕生日は出生後0日目(PND0)として記録されました。すべての子ラットは離乳され、PND21上で性別別に飼育されました。

子孫のグループ化と介入

PND28では、VPA曝露妊娠ラットの子孫から12頭の雄子(モデル群6匹、クエルセチン介入群6匹)を無作為に選び、正常な生理食塩水曝露妊娠ラットの子孫から6匹の雄子を無作為に選びました(空白群に6匹)。各グループの子犬間で体重に有意な差がないことが確認されました。正常生理食塩水投与の妊娠ラットから生まれた子はブランク群に、VPA治療を受けた妊娠ラットから生まれた子はモデル群に、VPA投与を受けた妊娠ラットから生まれた子はクエルセチン介入群に割り当てられました。

PND28から4週間にわたる継続的な介入が行われました。ケルセチン介入群では、ケルセチン懸濁液を毎日一定時間に胃内投与し、用量は100 mg/kg/1日でした。この用量は以下の統合的証拠に基づいて選択されました。(i) 以前の用量範囲研究で、LPS誘発神経炎症ラットモデルにおける不安様行動の緩和および炎症促進サイトカイン減少に最適な用量として100 mg/kgが特定されました²⁸;(ii) 50 mg/kgのケルセチンは、出生前VPA誘発自閉症ラットモデル²⁹において社会的相互作用の欠如や酸化性脳損傷を予防することが示されています。(iii)経口ケルセチンは最近、プロピオン酸誘発自閉症ラットモデルにおいて脳内のTNF-αレベルを低下させ、自閉症様行動を改善することが示されました。³⁰。これらの独立した検証は、現在の出生後VPA誘発ASDモデルにおいてTNF-α媒介炎症経路の強固な関与を確保するために100 mg/kgの選択を支持しています。ブランク群とモデル群では、0.5%のCMC-Na自然生理食塩水を同じ体積で毎日胃内投与しました。介入期間中、すべての動物は自由に食事と水にアクセスでき、体重は毎週測定され、投与量は体重に応じて調整されました。

野外試験

4週間の介入(約PND56)後、自発活動と不安レベルを評価するためにオープンフィールドテストが実施されました。オープンフィールドテスト(OFT)は、実験動物の不安に関連する行動を評価するための古典的な行動実験です。測定された指標は、開けた環境でのラットの自発的な移動能力と、その開けた野原の中央で過ごす時間でした。ラット用のOFT装置は高さ30cm、長さ50cm、幅50cmで、内壁は白く、人工的に16の小さなグリッドに分割されていました。内側に4格、外側に12格子で構成されていました。実験現場は音響刺激を避けるため静かに保たれました。各ラットは箱の底の中央に配置され、ビデオ撮影とタイミングを同時に測定しました。カメラの視野は開けたフィールド全体をカバーし、ネズミの自発的な動きやグリッド間の交差回数を記録しました。各検査は5分間続き、その後ビデオ録画は中断されました。開いた箱の内壁と底は75%アルコールで拭き取られ、1匹の糞便や体臭が次の動物の検査結果に影響しないようにしました。この手術は、すべてのラットがテストを完了するまでラットを入れ替えた後も繰り返しました。

病理的検出方法

4%パラホルマルデヒドで固定した後、脳組織は完全自動脱水機を用いて勾配脱水を行いました:75%エタノールを2時間、85%エタノールを1時間、95%エタノールを1時間、絶対エタノールI-IVをそれぞれ20分間投与しました。その後、組織はクリアリングエージェントIで25分、クリアリングエージェントIIで30分間クリアリングされ、その後パラフィン埋め込みが行われました。厚さ5μmの断片は、脱ワックス溶液IおよびIIでそれぞれ30分間脱ワックスされ、勾配エタノールで再水和されました。切片はヘマトキシリンで5〜10分間染色され、塩酸アルコールで3秒分化され、アルカリ水で対比染色されて青色にしました。その後、アルコール溶性のエオシンで3分間カウンターステインされ、勾配エタノールで脱水され、透明化され、中性の装着液でカバースリップし、顕微鏡で観察されました。

血清および脳組織におけるTNF-αレベルの検出

最後の投与後、ラットから腹部大動脈血を採取し、3,000 r/min、4°Cで15分間遠心分離し、血清上清液を採取しました。一方、海馬および皮質組織を解離し、予冷PBSを1:9の比率で機械的均質化のために添加しました。ホモジネートは4°Cで12,000 r/minで20分間遠心分離し、上清液を採取しました。組織タンパク質の定量にはBCA法が用いられました。ELISAキットの指示に従い、検査対象のサンプルとビオチニル化抗体が順次マイクロプレートに追加されました。培養および洗浄後、アビディン-ペルオキシダーゼ複合体が添加され、培養されました。再度洗浄後、色相用に基質溶液を加え、反応を停止液で終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸収を測定しました。血清中のTNF-α濃度(pg/mL)および脳組織中のpg/mgプロトは標準曲線を用いて算出しました。

統計解析

Microsoft Excelの RANDBETENT 関数を使ってラットをランダム化し、割り当てのための乱数を生成しました。本研究のすべての実験データは平均±標準偏差(SD)として表されました。統計解析の前に、各グループのデータに対してまず正規性検定(シャピロ・ウィルク検定)および分散均一性検定(レヴェーン検定)が実施されました。正規分布および分散の均質性に準拠するデータについては、一方向分散分析(一方方向ANOVA)が用いられました。差異が統計的に有意であれば、LSD法を複数比較に用い続けました。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 の値は統計的に有意とされました。

結果

自閉症治療におけるKSZZDに関するネットワーク薬理学研究の結果の分析

GeneCardsデータベースから合計15,770件の自閉症関連ターゲットが取得されました。関連スコア4.21≥のターゲットが自閉症の潜在的なターゲットとして選ばれ、1014の疾患ターゲットが得られました。KSZZDの827のターゲットは1,014の自閉症ターゲットと交差し、125の共通ターゲットが取得されました。SRplotプラットフォーム³¹ (https://www.bioinformatics.com.cn/)を用いて可視化を行い、 図1Aに示されるベン図が作成されました。これら125のターゲットは、KSZZDが自閉症に関連する影響を及ぼす可能性のある場所と考えられていました。

KSZZD Pillのアクティブコンポーネントとターゲットは参照...

ディスカッション

重要な疑問は、なぜケルセチンが他のコア成分ではなく実験的検証に選ばれたのか、そしてそれがKSZZDの全体的な効果を代表できるのかという点です。この選択は以下の収束する証拠に基づいています。(i) 出生前VPA誘発ラットモデルにおいて、ケルセチンは社会的相互作用の欠如および酸化性脳損傷を有意に予防した²⁹;(ii) プロピオン酸誘発自閉症モデルにおいて、経口ケルセチンは脳内のTNF-αレベルを低下させ、自閉症様行動を改善した³⁰;(iii) LPS誘導神経炎症モデルにおいて、ケルセチンは不安様行動を緩和し、炎症性サイトカインを用量依存的に減少させました²⁸。これらの発見は、ASD関連モデルにおけるケルセチンの神経保護および抗炎症薬としての支持を支持しています。次に、ケルセチンは血脳関門³²に浸透することが示されており、これは中枢TNF α媒介神経炎症を標的とする前提条件です。第三に、...

材料

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この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5% CMC-Na normal saline solution	原稿に記載なし	未指定	ブランク/モデルグループとケルセチン懸濁液に使用される媒体。
0.9% normal saline	原稿に記載なし	未指定	ブランクコントロール母体注射用媒体。
PBS中の4%パラホルムアルデヒド	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK	脳組織の固定に使用。
75%アルコール	原稿に記載なし	未指定	動物間のオープンフィールド装置の清掃に使用。
絶対エタノール	原稿に記載なし	未指定	埋め込み前の組織脱水に使用。
アルカリ水	原稿に記載なし	未指定	ヘマトキシリン染色切片を青くするために使用。
Amber14SBタンパク質フォースフィールド	原稿に記載なし	該当なし	分子動力学シミュレーションに使用するタンパク質フォースフィールド。
BATMAN-TCMデータベース	原稿に記載なし	該当なし	オンラインターゲットスクリーニングデータベース: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/
BCAタンパク質アッセイキット	Thermo Scientific	23225	組織ホモジネートのタンパク質定量に使用。
青色化試薬	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7301	ヘマトキシリン染色後に核を青くするために使用。
CDOCKERモジュール	原稿に記載なし	該当なし	分子ドッキングに使用する半柔軟ドッキングモジュール。
クリアリング/脱蝋剤	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	Clear-Rite 3, 6901	組織学ワークフローのクリアリングと脱パラフィン化に使用可能。
CytoNCAプラグイン	原稿に記載なし	該当なし	Cytoscapeプラグインで度中心性分析に使用。
Cytoscapeソフトウェア	原稿に記載なし	バージョン3.10.0	ネットワーク可視化とタンパク質-タンパク質相互作用分析に使用。
Discovery Studioソフトウェア	原稿に記載なし	2019年版と2021年版	受容体前処理、ドッキング、アラニンスキャンに使用。
Draw Venn Diagramオンラインツール	原稿に記載なし	該当なし	ヴェン図のオンラインツール: http://bioinformatics.psb.ugent.be
エオシン-Y（アルコール性）	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7111	H&E染色における細胞質の対染色に使用。
全自動脱水器	原稿に記載なし	未指定	固定された脳組織の段階的脱水に使用。
GeneCardsデータベース	原稿に記載なし	該当なし	自閉症関連ターゲットの取得に使用するオンラインデータベース: https://www.genecards.org/
GraphPad Prismソフトウェア	原稿に記載なし	バージョン9.5	統計分析とグラフ作成に使用。
ヘマトキシリン染色溶液	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7211	H&E染色における核染色に使用。
HERBデータベース	原稿に記載なし	該当なし	補足的な化合物スクリーニングに使用するオンラインデータベース: http://herb.ac.cn
塩酸アルコール	原稿に記載なし	未指定	H&E染色中の差別化に使用。
Metascapeプラットフォーム	原稿に記載なし	該当なし	GOとKEGGの富集分析に使用するオンラインプラットフォーム。
マイクロプレートリーダー	Thermo Scientific	Multiskan FC, 51119000	450 nmでの吸光度測定に使用。
顕微鏡	原稿に記載なし	未指定	H&E染色した脳切片の観察に使用。
Microsoft Excelソフトウェア	Microsoft	未指定	RANDBETWEEN関数を使用してラットをランダム化するために使用。
マウンティング媒体	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	4111	カバースリップと染色切片の永久マウンティングに使用。
オープンフィールドテスト装置	原稿に記載なし	未指定	行動テストに使用する50 cm × 50 cm × 30 cmのボックス。
パラフィン	原稿に記載なし	未指定	脳組織のパラフィン埋め込みに使用。
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4	Gibco	10010023	組織ホモジネーションの予冷バッファーとして使用。
PLIP相互作用フィンガープリンティング	原稿に記載なし	該当なし	タンパク質-リガンド相互作用フィンガープリント分析に使用。
PubChemデータベース	原稿に記載なし	該当なし	SMILES識別子を取得するために使用するオンラインデータベース: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
ケルセチン	原稿に記載なし	未指定	経口投与で1日あたり100 mg/kg投与。
ラットTNF-αELISAキット	Invitrogen	ERA56RB	血清および組織ホモジネートのTNF-α検出に適しています。
冷蔵遠心機	Thermo Scientific	Sorvall ST 16R, 75004383	血清および組織ホモジネートの遠心分離に使用。
Schrödinger Suiteソフトウェア	Schrödinger, LLC	2024年版	分子動力学シミュレーションシステムの構築に使用。
SPFグレードのスプラーグ・ドーリーラット	原稿に記載なし	未指定	動物モデルの確立に使用するオス3匹とメス3匹のラット。
SPSSソフトウェア	原稿に記載なし	バージョン25.0	統計分析に使用。
SRplotプラットフォーム	原稿に記載なし	該当なし	視覚化に使用するオンラインプラットフォーム: https://www.bioinformatics.com.cn/
STRINGデータベース	原稿に記載なし	バージョン12.0	タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークの構築に使用: https://string-db.org/
SwissTargetPredictionプラットフォーム	原稿に記載なし	該当なし	ターゲット予測に使用するオンラインプラットフォーム: http://swisstargetprediction.ch/
TCMSPデータベース	原稿に記載なし	該当なし	生物活性化合物スクリーニングに使用するオンラインプラットフォーム: http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
TIP3P水モデル	原稿に記載なし	該当なし	分子動力学シミュレーションに使用する水モデル。
UniProtタンパク質データベース	原稿に記載なし	該当なし	ターゲット名をGene Symbolに標準化するために使用: https://www.uniprot.org/
バルプロ酸（VPA）溶液	原稿に記載なし	未指定	妊娠12.5日に腹�