SMART(集霧自動再構築技術):クライオ電子顕微鏡ワークフローの効率化のための統合計算プラットフォーム

サマリー

このプロトコルは、統合ソフトウェアプラットフォーム(SMART)を用いて、データ収集、三次元再構築、原子モデル構築を単一のブラウザベースのインターフェースで接続する段階的なクライオ電子顕微鏡ワークフローを示します。代表的な例として、人間のTRPML1構造は2.38 Åの解像度で決定されます。

要約

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)は構造生物学の中心的なツールとなっていますが、現在のワークフローではデータ収集、三次元(3D)再構築、原子モデル構築のために複数の専門ソフトウェアパッケージが必要であり、そのためパイプラインの断片化や頻繁な手動介入が見られます。ここでは、SMART(Shuimu Automated Reconstruction Technology)という統合ソフトウェアプラットフォームを紹介します。これは、自動データ収集用のDataSmart、画像処理と3D再構築用のCryoSmart、深層学習ベースの原子モデル構築用のModelSmartという3つのモジュールを統合した統合されたブラウザインターフェースで実現しています。このプロトコルは、3つのモジュールすべてを操作するためのステップバイステップの指示を提供します。ワークフローには、自動試料ナビゲーションとデータ収集、モーション補正、コントラスト伝達関数(CTF)推定、粒子の採取、二次元(2D)分類、3Dの精緻化、地図の強調、原子モデル生成が含まれます。代表的な例として、私たちはヒトTRPML1(Ca²⁺透過性リソソーム陽イオンチャネル)の構造を決定するために全ワークフローを適用し、金標準のフーリエシェル相関(FSC)で0.143基準で2.38 Åの全分解能を達成しました。この研究内の3つのモジュール(DataSmart、CryoSmart、ModelSmart)は、同じTRPML1データセットに順次適用されました。このプロトコルは、さまざまなレベルのクライオEM経験を持つユーザーにもアクセス可能になるよう設計されています。

概要

『クライオ電子顕微鏡:技術進化と生物学的影響』三次元タンパク質構造の決定は分子生物学における中心的な課題であり、生物学的機能はアミノ酸残基の空間的配置と密接に結びついています。これらの構造構造を解明することは、酵素機構、リガンド相互作用、細胞シグナル伝達経路を原子分解能で解明するために不可欠です。この必須性は、クライオEMの変革的な発展を推進し、構造生物学技術として広く採用されている^1,2。

クライオEM単一粒子解析(SPA)は、孤立した錯体の高解像度構造を解明することで、多様なサンプルタイプにわたる生物学的洞察を得る強力な手法として機能^します。これにはウイルス、膜タンパク質、らせん状アセンブリ、その他の動的かつ異質な高分子複合体が含まれ、約50 kDaから数十メガダルトンまでの幅広い分子サイズに及びます。

Cryo-EM SPAは、生物的マクロ分子の三次元(3D)構造を解明する基盤技術として登場し、データ収集、3D再構築、原子モデル構築という3つの相互依存的な計算段階を包含しています(図1)。

データ収集中、ガラス化サンプルは低線量条件下で画像化され、数千の粒子投影をほぼ本来状態に捉えるマイクログラフムービーが生成されます。これらの生データセットは、その後、反復的なアライメントおよび分類アルゴリズムで処理され、体積密度マップを再構築します。最後に、原子モデルが密度に合わせて構築・洗練され、分子間の相互作用をほぼ原子レベルの分解能で明らかにします。

上記の解析は、クライオEMの出力が構造パイプラインの出発点に過ぎないことを示しています。これらの生データを解釈可能な原子モデルに変換するには、専門的な計算ソフトウェアツールの連鎖的な活用が必要です。したがって、ソフトウェアは生データを原子モデルに変換する重要な架け橋となります。

断片化されたクライオEMソフトウェアエコシステム:現在のツールと限界。現代のクライオEMワークフローは、それぞれが個別の段階に対応する専門的なソフトウェアツールのパッチワークに依存しています。

データ収集。Leginon ^4,5、SerialEM⁶、UCSFImage4⁷、TFS EPU ^8,9、Gatan Latitude、JEOL JADAS¹⁰、Auto-EMation¹¹など、多数のクライオEMデータ取得ソフトウェアパッケージが一般公開されていますが、これらのツールは主に生の映画データを出力し、取得後の処理能力は限定的です。パラメータ設定やテンプレートカスタマイズなどの重要なワークフローステップは依然として手作業を要し、データセットあたりパラメータが多すぎることが多いです。専門家の介入に依存することで、特に高スループットのシナリオでは再現性の問題やワークフローの非効率が生じます。

3D再構築。クリオEMは3D再構築ソフトウェアにおいて大きな進歩を遂げ、生物の高分子のほぼ原子レベルの分解を可能にしています。最も広く使われているツールにはRELION、cryoSPARC、EMAN2があり、それぞれ独自の利点と制約があります。RELIONはベイズ手法を用いて反復的な精緻化を行い、異種データセットの扱いや高解像度再構築の達成に優れています。¹²。しかし、計算負荷が高く学習曲線が急なため、専門家の介入が必要になることが多いです。GPUアクセラレーションとディープラーニングを活用したcryoSPARCは、処理時間を大幅に短縮し、^{ユーザーフレンドリー}です。EMAN2は粒子ピッキングや3D再構成のための包括的なスイートを提供しますが、広範な手動調整が必要でリアルタイム^{フィードバック機能が}ありません。これらのツールは3D再構築の特定の側面で優れていますが、単一の機能に限定されており、上流のデータ取得や下流の原子モデリングとの統合が欠けています。例えば、RELIONやcryoSPARCは顕微鏡制御ソフトウェアからの手動データ転送を必要とし、非効率性や潜在的な誤差が生じます。さらに、これらのツールはいずれもデータ収集時や原子モデル構築へのシームレスな移行時にリアルタイムの品質評価を提供しず、スループットや再現性を妨げる断片的なワークフローを生み出しています。

クライオEMベースの構造決定における最終的な計算段階は原子モデル構築であり、分子座標を再構築された密度マップに反復的に当てはめて原子レベルの相互作用を解明します。

従来のモデル構築手法は、静電ポテンシャル、ファンデルワール相互作用、共有結合幾何学的制約を取り入れた物理ベースのエネルギー最小化アルゴリズムを用いていますが、初期モデル配置、密度解釈、立体化学的検証においては依然として手作業に大きく依存しています 15,16,17,18.専門家によるキュレーションへの依存は、スループットを制限するだけでなく、特に低解像度(< 4 Å)で密度特徴が曖昧な場合、主観的なバイアスも生じます。

これらの制約を克服するために、ディープラーニング(DL)ベースの手法が変革的な解決策として登場し、ニューラルネットワークを活用して特徴抽出、モデル初期化、改良を自動化しています。これらのアプローチは、ノイズのある密度マップや不完全な密度マップの処理において性能が向上し、手動介入を大幅に削減することを示しています。これは、従来のパイプラインと比較してユーザー依存的なステップが40〜60%減少した最近のベンチマークによって証明されています⁽19,20,21,22)。

しかし、これらの方法は3D再構成ソフトウェアから密度マップをエクスポートし、モデルビルディングシステムにインポートする必要があります。インポート前に、密度マップを最適化するために、しばしばサードパーティ製ツールを使った追加の前処理ステップが必要になることがあります。この断片化されたワークフローは、繰り返しのデータ転送やフォーマット変換を必要とし、非効率を生み出しています。さらに、初期モデル構築の結果が満足できない場合は、再構成段階に戻って再計算を行い、その後再度モデル構築と検証を行う必要があります。このような反復サイクルは、クライオEM構造決定パイプラインのスループットと運用効率を著しく妨げます。

1.3 SMART:エンドツーエンドのクライオEM統合ソリューション

クライオEM SPAの大きな進歩にもかかわらず、完全統合された計算ソリューションの不足が高スループット構造生物学の可能性を依然として妨げています。既存のソフトウェアパッケージは、データ収集や3D再構築などの独立したワークフローコンポーネントの自動化には優れていますが、生のマイクログラフ収集、密度マップの精緻化、原子モデル構築の間の重要なギャップを埋めることに失敗しています。この断片化は手動のデータ転送、フォーマット変換、冗長なパラメータ調整を必要とし、非効率化を生み、データセットのスケールに伴う悪化を招きます。

これらの制約に対処するため、統合型冷凍EMワークフロープラットフォームを紹介します。これは、凍結EM SPA全体のパイプラインを統合したAI駆動の統合計算プラットフォームです。統合プラットフォームは、DataSmart(自動データ取得)、CryoSmart(ハイブリッドニューラルネットワーク対応3D再構築)、ModelSmart(深層学習に基づく原子モデリング)の3つのコアモジュールを統合しています。

プラットフォームの3つの計算モジュールは標準化されたデータストリームで相互接続されており、1つのモジュールからの出力が後の処理ステップでのパラメータ調整に反映される効率的なデータフローを実現しています。この統合は、従来のクライオEMワークフローで必要となる手動ステップやデータ転送の件数を減らし、構造生物学の実験室におけるアクセス性と効率の向上を目指しています。

プロトコル

ヒトTRPML1タンパク質のタンパク質発現に用いられたExpi293F細胞株は、湖南豊輝バイオテクノロジー有限公司(カタログ番号:SC0236058)から購入されました。細胞株の同様は、ショートタンデムリピート(STR)プロファイリングによって適切に認証されました(補足ファイル1)。

倫理的声明
この研究には、人間の参加者、動物、または直接取得されたサンプルは含まれていません。ヒトのTRPML1タンパク質は組換え発現によって作製され、 in vitroで精製されました。組換えタンパク質発現に用いられるExpi293F細胞株は、商業的に入手可能な確立された不死化細胞株です。したがって、機関の倫理的承認や書面によるインフォームドコンセントは必要ありませんでした。

注:統合クライオEMワークフロープラットフォームは、自動データ取得モジュール、ハイブリッドニューラルネットワーク対応3D再構築モジュール、深層学習ベースの原子モデリングモジュールの3つのコアモジュールに構成されており、データがこれらのソフトウェアコンポーネント間の通信インターフェースとして機能します(図2参照).統合クライオEMワークフロープラットフォームシステムはブラウザ・サーバー(B/S)アーキテクチャを採用しており、ユーザーがすべての操作をウェブインターフェースを通じて行えるため、使いやすさと運用のアクセシビリティを確保しています。

1. 自動データ取得

注:統合クライオEMワークフロープラットフォームは、自動データ取得モジュール、ハイブリッドニューラルネットワーク対応3D再構築モジュール、そして深層学習ベースの原子モデリングモジュールの3つのコアモジュールで構成されています。データはこれらのソフトウェアコンポーネント間の通信インターフェースとして機能します(図2)。このシステムはブラウザ・サーバー(B/S)アーキテクチャを採用しており、すべての操作をウェブインターフェースを通じて行えます。

1. プロジェクトの初期化
   1. 自動化されたデータ取得モジュールのソフトウェアプラットフォームで新しいプロジェクトを作成します。
   2. 希望すれば、最近のプロジェクトから設定設定を継承するオプションを選択してください。新しい構成を作成するのではなく、継承したパラメータを電子顕微鏡のセットアップに再利用します。
2. ビームシフト検査
   注意:透過電子顕微鏡(TEM)制御ソフトウェア内でビームシフト調整を行います。
   1. 低倍率チェック(AtlasおよびGridSquare)
      1. スクリーニングモジュールを開けろ。アトラスおよびグリッドスクエアの倍率で画像を取得します。
      2. 画像が適切に照らされ、ビームシフトがないか確認してください。画像センターがグリッドバーの上に位置しないようにしてください。
   2. データ取得拡大検査
      1. データ取得倍率(例:60Kまたは100K)で画像を取得します。梁の整列を評価してください。
      2. 画像取得に失敗したり、大きなビームシフトが観測された場合は、進行前にビームシフトを補正してください。
   3. 穴のユーセントリック拡大率チェック
      1. 穴/ユーセントリック倍率(通常8K)で画像を取得します。ビームが中心でない場合は、照明スポットが中心になるまでビームシフトを調整します。
      2. 絞りの位置を変えないでください。開口サイズがデータ取得時に使用された開口径と一致しているか確認してください。
3. Z高度調整
   1. オートユーセントリック 調整
      1. スクリーニングページに移動します。段を穴/ユーセントリックの高さの拡大倍率できれいなカーボンフィルムエリアに移動させます。AutoFunctionページのAuto-Eucentricモジュールを開きます。
      2. スタートをクリックして ください。 ログパネルのフィードバックを監視してください。手術が失敗したら別のエリアに移動し、同じ手順を繰り返してください。
   2. オートフォーカス調整
      1. AutoFunctionページでAutoFocusモジュールを開きます。スタートをクリックしてください。
      2. ログメッセージを確認してください。指示通りのパラメータを調整するか、オートフォーカスが失敗した場合はセクション1.3.1を繰り返してください。
4. 拡大調整の調整
   1. アライメント検査
      1. データ倍率で識別可能な特徴を特定し、画像を取得します。穴/ユーセントリックハイトの倍率で画像を取得してください。
      2. 両方の画像の中心領域を比較してください。データ倍率と穴の倍率間でずれが観察された場合はキャリブレーションに進みます。
      3. データ倍率と穴の倍率が揃っている場合、穴とグリッドスクエア倍率の整合性を点検してください。すべての倍率レベルが揃っていればキャリブレーションなしで作業を進めてください。
   2. 倍率シフトキャリブレーション
      1. キャリブレーションページに移動します。拡大シフトモジュールを開け。まずはデータ倍率、または最も低いずれ倍率から始めましょう。
      2. 特徴的な特徴を含む高倍率画像を取得します。対応する低倍率画像を取得してください。2つの画像間の変位を評価してください。
      3. 低倍率画像の特徴中心に対応する位置を右クリックします。「 ここから移動」を選択してください。高倍率画像を再取得し、アライメントを確認します。
      4. 必要に応じて調整を繰り返してください。アライメントが達成された後、次の倍率ペアに進むには「 次へ 」をクリックしてください。残りのずれている倍率ペアすべてについてキャリブレーション手順を繰り返します。
5. データ収集の準備
   1. アトラス取得、正方形選択、正方形イメージング、穴選択の実施
      1. アトラスモジュールを開けてください。タイルフィールドを空欄にして81枚すべてのタイルを入手するか、希望するタイル数を入力してください。
      2. □選択インターフェースに進みましょう。右クリックして適切な四角を選択します。
      3. ホールセレクションページに移動します。「すべて準備」をクリックします。画像取得が完了するまでログウィンドウを監視してください。
      4. 画像リストからキャプチャされた正方形画像を選択します。穴がはっきり見える場合は「 穴を探す 」機能を使って自動で穴選択を行います。
         注意:厚い氷や表面汚染のあるグリッドでは、自動穴検出が失敗する可能性があります。取得前に検出された穴を目視で確認し、自動検出が信頼できない場合は半自動穴選択法を用いてください。
      5. 厚い氷や汚染が信頼できる自動選抜を妨げる場合は、 種子ベース選択 機能を使用してください(図3)。
         1. 中央の穴を選びます。直角を形成する隣接する2つの穴を選びます。
         2. 2番目と3番目の穴で定められた方向に沿って、2つの遠い穴を選びます。
         3. 「送信」をクリックします。別のマスを処理する際に「Move All」を有効にしてください。5つの種穴のうち1つを透明な穴に引きずり出します。「送信」をクリックします。
   2. テンプレート定義
      1. テンプレート定義ページに移動します。画像を取得するには「取得」をクリックしてください。画像に完全な穴があるかどうかを確認してください。
      2. ターゲットエリアを右クリックし、完全な穴が見えない場合は MoveStageTo を選択します。テンプレートイメージを再取得してください。画像の位置とオートフォーカスの位置は、対応するマーカーをドラッグして指定します。
      3. ここで穴あたりのフレーム数を入力します。目的のデフォーカス値(例:−1.5 μm)を入力します。すべての取得パラメータを検証してください(図4)。
6. ビームシフト再チェック
   1. すべての準備手順を完了した後、セクション1.2を繰り返します。
7. 乱視と昏睡の矯正
   1. 乱視補正
      1. ステージをきれいなカーボンフィルムのエリアに移動させてください。オートフォーカスを使って高さを望むデフォーカス値(例:−1.5μm)に調整します。AutoFunctionページでAutostigmateモジュールを開きます。
      2. スタートをクリックしてください。ログパネルでCtffindの出力を監視してください。乱視と解像度適合度の値を見直してください。乱視が高ければ、別の部位で同じ手順を繰り返してください。
   2. 昏睡矯正
      1. オートスティグメイトの結果が複数回試行しても最適でない場合は、オートコマモジュールを開けてください。スタートをクリックしてください。
8. 自動データ収集
   1. AutoCollectページに移動します。スタートをクリックしてください。 システムが自動でAutoEmissionおよびAutoZLPのキャリブレーションを行えるようにします。
   2. スクリーニング、データ取得、準備設定で定義されたパラメータを使ってデータを取得します。自動回収プロセスを監視してください(図5)。
      一時停止点:データ収集が完了した後、取得した映画スタックを保存し、後日の画像処理段階でプロトコルを再開しても、下流の結果に影響を与えません。
9. 即時のリモートモニタリング
   1. リモートモニタリングモジュールを使って収集進捗を監視してください。MotionCor2²³を使って生成されたリアルタイムのモーションコレクション結果をレビューしてください。リアルタイムの乱視とピントの合いの低下測定を見直してください。
   2. 監視URLを認可ユーザーと共有してください。コンピュータやモバイル端末から収集状況やデータ品質情報にアクセスできます。 図6のリモート監視機能の例を振り返ります。

2. 三次元再構成

注意:3D再構築モジュールを使用して、以前に取得した画像データセットから三次元再構成を行います。ワークフローには、プロジェクト作成、マイクログラフインポート、コントラスト伝達関数(CTF)推定、パーティクルピック、パーティクル抽出、2D分類、初期モデル生成、3D精査が含まれます(図7)。

1. プロジェクト創設
   1. 3D再構築モジュールのホームページに移動します。プロジェクト管理ページを開くには 「プロジェクト」 をクリックしてください。 「新しいプロジェクト」をクリックします。
   2. プロジェクト名を入力し、保管場所を指定します。プロジェクト 作成をクリックします。 新しく作成されたプロジェクトの 横を「開く」 をクリックしてください。新しい実験を作成するには「 新しい実験 」をクリックしてください。
      注:プロジェクトは全体のデータ処理セッションを表し、実験はプロジェクト内の個々の処理ワークフローを表します。1つのプロジェクト内で複数の実験を作成することができます。
2. インポートファイル
   1. 「新しい仕事」をクリックします。インポートを選択して「作成」をクリックします。適切なファイル形式を選択してください。データ取得時に生成された.mrcファイルをインポートしてください。ここでピクセルサイズ、加速電圧、CPU数を入力します。キュージョブをクリックします。
      注意:実行中のジョブを終了するには、 Killをクリックし、その後 Clear をクリックしてジョブを建設状態に戻してください。完了または待機中のジョブについては、ジョブステータスをリセットするために 「クリア 」をクリックしてください。
3. CTF推定
   1. 「新しい仕事」をクリックします。CTF見積もりを選択し、「作成」をクリックします。
      注:3D再構築モジュールは複数のCTF推定アルゴリズムをサポートしています。このプロトコルはCTFFIND4を使用します。
   2. 「 Connect 」ボタンをクリックして露出を選びます。インポートした顕微鏡写真を選択してください。振幅コントラストを0.1に設定し、最小フィッティング分解能を30 Åにします。最大フィッティング分解能は4 Å、最小のデフォーカス探索値は5,000 Å、最大デフォーカス探索値は50,000 Å、探索ステップサイズは500 Åにします。
   3. キュージョブをクリックします。
4. 手動粒子ピッキング
   1. 「新しい仕事」をクリックします。「パーティクルピッキング」を選択し、その後「ブロブピッカー」を選択します。「作成」をクリックします。マイクログラフ(露光)は「接続」ボタンをクリックしてください。
   2. インポートした顕微鏡写真を選択してください。必要なパラメータを入力してください。キュー ジョブをクリックします。代表的な顕微鏡写真を3〜4枚検査してください。左クリックでパーティクルを選択します。
   3. 右クリックでパーティクルの選択を解除してください。選択した粒子から粒子径の範囲を決定します。「 ピッキング完了」をクリックします!粒子を抽出する。
      注意:少なくとも3枚のマイクログラフから粒子を測定してください。
5. ブロブ・ピッカー
   1. 「新しい仕事」をクリックします。「パーティクルピッキング」を選択し、その後「ブロブピッカー」を選択します。「作成」をクリックします。 マイクログラフ(露出)入力を接続します。
   2. インポートした顕微鏡写真を選択してください。必要なパラメータを入力してください。キュージョブをクリックします。
6. 粒子ピックを検査する
   1. 「新しい仕事」をクリックします。「粒子ピックを検査する」を選択します。「作成」をクリックします。マイクログラフ(露出)入力を接続します。Particlesの入力を接続してください。
   2. 対応するファイルを選択します。必要なパラメータを入力してください。キュー ジョブをクリックします。作業完了後に代表的な画像を3〜4枚確認してください。
   3. 正しい粒子選択を確認してください。「 ピッキング完了」をクリックします!出力場所。
7. 顕微鏡写真から抽出粒子
   1. 「新しい仕事」をクリックします。顕微鏡写真から抽出抽出物を選択してください。「作成」をクリックします。マイクログラフ(露出)入力を接続します。Particlesの入力を接続してください。対応するファイルを選択します。
   2. 抽出ボックスのサイズを粒子径の2〜3倍に設定します。TRPML1には400ピクセルの抽出ボックスサイズを使いましょう。フーリエのクロップサイズを抽出ボックスのサイズの4分の1から1/2に設定します。
   3. TRPML1にはフーリエクロップサイズを100ピクセルにしてください。キュージョブをクリックします。
      注:フーリエクロップサイズを縮小するとGPUの計算負荷が減少します。
8. 二次元分類
   1. 「新しい仕事」をクリックします。「2D分類」を選択してください。「作成」をクリックします。Particlesの入力を接続してください。
   2. パーティクルスタックをインポートします。必要なパラメータを入力してください。キュージョブをクリックします。
      注意:50〜200クラスを選択してください。小さなデータセットにはクラス数を減らし、大きなデータセットにはクラスを多く使いましょう。
9. 選択された二次元クラス
   1. 「新しい仕事」をクリックします。「選択2Dクラス」を選択します。「作成」をクリックします。Particlesの入力を接続してください。テンプレート入力を接続します。
   2. 必要なファイルをインポートしてください。キュー ジョブをクリックします。仕事が「待機中」状態に入るまで待ちましょう。「 待機」をクリックします。
   3. 明確で明確に定義された2Dクラスを選択してください。 「完了」をクリックします。
10. 初期モデル生成
    1. 「新しい仕事」をクリックします。アビット再建を選択してください。Particlesの入力を接続してください。選択した粒子をインポートします。
    2. ここで最初のクラス数が登場します。ここで対称性パラメータが登場します。キュージョブをクリックします。
11. 異種的精錬
    注意:異種サンプルには異質精錬を、均質試料には均質精錬を用いてください。
    1. 「新しい仕事」をクリックします。異種的精錬ジョブを作成しましょう。Particlesの入力を接続してください。ボリューム入力を接続してください。
    2. 対応するファイルを選択します。ここでリファインメントパラメータが登場します。適切な対称性(例:C1)を指定します。キュージョブをクリックします。
12. 均質精錬
    1. 「新しい仕事」をクリックします。均質な精錬ジョブを作成しましょう。Particlesの入力を接続してください。ボリューム入力を接続してください。
    2. オプションでマスク入力を接続することもできます。前回の精錬ステップでパーティクルスタックと最も性能の良い体積クラスをインポートします。必要なパラメータを入力してください。
    3. 適切な対称性(例:OまたはC1)を指定します。キュージョブをクリックします。ジョブ完了後に「出力」をクリックします。ブラウザインターフェースで再構成された密度マップ(図8)を検査してください。
13. 地図の強化
    注: Map Enhancer はDeepEMhancer²⁴を使用しています。可能な限りハーフマップを使いましょう。翻訳後修飾やリガンド分子はDeepEMhancerのトレーニングセットに含まれておらず、正確に強化されない可能性があります。 Map Enhancer は局所的なシャープニング、自動マスキング、ノイズ除去を行います。
    1. 「新しい仕事」をクリックします。マップエンハンサージョブを作成しましょう。均質精錬中に生成されたボリュームをインポートします。
    2. 対応するマスクをインポートします。必要に応じてMap Data Pathオプションから地図ファイルをインポートしてください。仕事を遂行してください。

3. 深層学習に基づく原子モデリング

注:深層学習ベースの原子モデリングモジュールは、以前に開発されたSMARTFoldフレームワーク²⁵ に基づいており、クライオEM密度マップからタンパク質および核酸(RNA/DNA)の原子モデル構築をサポートします。

1. 深層学習ベースの原子モデリングモジュールを立ち上げる
   1. ディープラーニングベースの原子モデリングモジュールシステムにログインしてください。タスク提出のインターフェースを開きます。左側パネルにクライオEM密度マップをアップロードしてください。
   2. 必要な入力パラメータを入力します。モデリングタスクを提出してください。
2. クライオEM密度マップをアップロード
   1. 密度マップを.mrc、.ccp4、または.map形式でアップロードしてください。ファイルサイズが100MB未満であることを確認しましょう。
      注意:密度マップが100MBを超える場合は、アップロード前にファイルサイズを減らしてください。
      1. UCSF ChimeraX²⁶ を使って、コマンド:volume zoneを使って密度マップを対象領域にクロップします。マップをより大きなピクセルサイズにリサンプリングします。
      2. 溶媒部分を除去するためにソフトマスクを貼ります。
         注意:アップロード前に密度マップを確認し、最適なモデル性能を確保し、処理ミスのリスクを減らすために必ず確認してください。
3. 密度マップを点検し準備する
   1. 密度マップのトリミングを実行してください。 このトリミングでは、密度マップで不要な領域を除去します。トリミングされた地図にモデル作成に必要な地域のみが含まれていることを確認してください。
      注意:トリミングはファイルサイズを削減し、モデル生成時のメモリオーバーフローを防ぐのに役立ちます。
   2. 次にミラーインバージョンを確認してください。密度マップでミラー反転の可能性を調べてください。マップ内のαらせん領域を調べてください。αらせんが右手型の配置を示し、反時計回りに螺旋状に上向きに進んでいるかを確認しましょう。鏡像構造が検出された場合は密度マップを反転させます。
4. シーケンスファイルをアップロードする
   1. 対応するシーケンスファイルをアップロードしてください。あるいは、手動でシーケンスを入力してください。再構築に含まれるすべてのタンパク質または核酸配列を提供してください。
   2. 該当する場合はヘテロメトリックまたはホモマー配列の情報を指定してください。必要に応じてタンパク質名を入力してください(オプションステップ)。
5. マップ解像度を指定してください。ここで、報告されたクライオEM密度マップの解像度が登場します。コンピューティングパーティションを選択します。モデル生成に使用するGPU計算ノードを選択します。
6. CPUリソースを指定するには、割り当てるCPU数を入力します。CPUは8台を超えないでください。アップロードしたすべてのファイルとパラメータを確認しましょう。「 提出 」をクリックしてモデル生成を開始します。
7. 予測された原子モデルを検証する
   1. ジョブ完了後にインタラクティブビジュアライゼーションウィンドウを開きます。モデルを回転させて構造的特徴を確認してください。ズームイン・アウトで局所的およびグローバルな構造の詳細を検証できます。
   2. モデルを複数の角度から検査してください。モデルの品質、空間的構造、原子レベルの特徴を評価します。生成されたモデルを下流の分析と検証に活用してください。
   3. 可視化インターフェースの例として図9を参照してください。

結果

TRPML1はムコリピン-1(MCOLN1)とも呼ばれ、イオン恒常性の維持、小胞輸送の調節、哺乳類細胞におけるオートファジーの支援に不可欠なリソソームカチオンチャネルです(^27,28)。遺伝子変異によるTRPML1の機能障害は、神経異常、網膜変性、鉄欠乏性貧血を特徴とする重度の神経変性リソソーム貯蔵障害である粘脂質症IV型と直接関連^{しています。}したがって、TRPML1機能の構造的基盤を理解することは、その生理学的および病理学的役割を解明するために極めて重要です。

合計1,034本の映画スタックが、名目上の96,000×倍率で収集され、超解像度ピクセルサイズは0.808 Åに相当します(

ディスカッション

クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)による生体高分子の構造決定は、計算ツールの密接な統合と専門家の介入を必要とする長期にわたる多段階のワークフローを本質的に含みます。統合プラットフォームは、データ収集、3D再構築、原子モデリングを単一の垂直統合フレームワークに統合することで、より効率的なクライオEMワークフローへの一歩を踏み出します。パイプライン全体にAI駆動のアルゴリズム(例:密度誘導モデル構築のための幾何学的ディープラーニング)を埋め込むことで、各処理段階ごとに別々のソフトウェアパッケージに依存するワークフローに比べて、手動のデータ転送やフォーマット変換の回数を減らすことを目指しています。学術研究所から製薬パイプラインまで、クライオEMのスループット需要が急速に増加している現在の状況^{において、統合} ソフトウェア環境は実用的な利点をもたらす可能性があります。

このプラットフォームのサーバーベースの展開により、外部ネットワークへの依存を排除し、機密性の高い生物医学デー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMARTプラットフォームの3D再構成モジュール;ハイブリッドニューラルネットワーク対応
クライオ電子顕微鏡	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	データ取得用;エネルギーフィルター搭載
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMARTプラットフォームの自動データ取得モジュール
DeepEMhancer	オープンソース	V0.17	Cryo-EM体積のディープラーニングベースの事後処理;CryoSmart Map Enhancerに統合
直接電子検出器	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	ムービー録画用カメラ
グリッド	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Cryo-EM標本グリッド
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMARTプラットフォームのディープラーニングベースの原子モデリングモジュール;SMARTFoldフレームワークを拡張
SMARTプラットフォーム	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	統合されたCryo-EMプラットフォーム;ブラウザ-サーバー(B/S)アーキテクチャ;DataSmart, CryoSmart, ModelSmartモジュールを含む
TEM制御ソフトウェア	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	ビームシフト調整用の電子顕微鏡制御ソフトウェア
Topaz	オープンソース	V 2.5	ディープラーニングベースの粒子ピッキングツール;CryoSmartにプラグインとして統合
TRPML1タンパク質サンプル	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	ヒトTRPML1 (mucolipin-1);タンパク質および結晶学部門で自社調製
ガラス化装置	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Cryo-EMサンプル調製用
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	一般目的の表示、分析などのソフトウェア
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	統合されたCryo-EMワークフロープラットフォーム
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	ModelSmartの基盤となるディープラーニングフレームワーク
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	自動Cryo-EMデータ取得ソフトウェア
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	自動TEM/cryo-EM取得ソフトウェア
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	自動Cryo-EMデータ収集ソフトウェア
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	マルチグリッド自動Cryo-EM取得
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	電子顕微鏡取得ソフトウェア
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	自動Cryo-EM取得システム
Auto-EMation	清華大学	N/A	自動Cryo-EM取得ソフトウェア
RELION	MRC分子生物学研究所	RRID:SCR_016274	ベイジアンCryo-EM再構成ソフトウェア
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Cryo-EM画像処理と再構成
EMAN2	ベイラー医科大学	RRID:SCR_017270	Cryo-EM画像処理スイート
CTFFIND4	MRC分子生物学研究所	RRID:SCR_016732	CTF推定ソフトウェア
Gctf	MRC分子生物学研究所	RRID:SCR_016500	GPU加速CTF推定
MotionCor2	ハワード・ヒューズ医学研究所 / UCSF	RRID:SCR_016499	モーション補正ソフトウェア
DeepEMhancer	スペイン国立生物技術センター(CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	ディープラーニングCryo-EMマップ強化
Topaz	カリフォルニア大学バークレー校	RRID:SCR_018037	ディープラーニング粒子ピッキング
UCSF ChimeraX	カリフォルニア大学サンフランシスコ校	RRID:SCR_015872	分子可視化ソフトウェア
CTFFIND4	Grigorieffラボ	RRID:SCR_016732	CryoSmartワークフローで使用されるCTFフィッティング
EMDB-8840	電子顕微鏡データバンク	アクセス: EMD-8840	ヒトTRPML1参照マップ
EMPIAR-10204	電子顕微鏡公共イメージアーカイブ	アクセス: EMPIAR-10204	β-ガラクトシダーゼベンチマークデータセット
透過型電子顕微鏡(TEM)	未指定	N/A	Cryo-EMデータ取得用
FEI Tecnai電子顕微鏡	FEI (現在はThermo Fisher Scientific)	未指定	引用されたワークフローで言及
エネルギーフィルター	未指定	N/A	自動収集時に使用
GPUコンピューティングノード	未指定	N/A	ModelSmart計算用