方法論記事

術後認知機能障害モデル作成のための高齢C57BL/6JマウスにおけるL5腰椎椎弓切除術

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DOI:

10.3791/71733

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2026年9月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、運動機能への影響を最小限に抑えつつ、術後認知機能障害モデルを構築するための、高齢C57BL/6Jマウスにおける標準的なL5腰椎椎弓切除術について説明します。これにより、周術期神経認知障害の行動学的、組織学的、およびメカニズム的な研究を支援します。

要約

術後認知機能障害（POCD）は、手術および麻酔後に、特に高齢者において頻見される神経学的合併症であり、回復の遅延、入院期間の延長、およびクオリティ・オブ・ライフの低下に関連しています。整形外科的処置および脊椎手術はPOCDの比較的高いリスクと関連していますが、脊椎手術の周術期の特徴を密接に反映した前臨床モデルは依然として限られています。開腹術や脛骨骨折などの一般的に用いられるモデルでは、持続的な運動機能障害や長期的な末梢炎症が生じることがあり、それが認知行動結果の解釈を妨げる可能性があります。本プロトコルでは、18週齢の雄性C57BL/6Jマウスを用い、セボフルラン麻酔下でのL5腰椎椎弓切除術によるPOCDモデル作成のための、標準化された低コストな手法を記述します。この処置は日常的な手術器具を用いて行われ、持続的な運動欠損を最小限に抑えつつ、制御された外科的損傷を与えます。認知機能は、新奇物体認識テスト、新奇アームY迷路、およびバーンズ迷路を用いて評価し、海馬の神経細胞損傷および神経炎症変化は、それぞれニッスル染色およびIba1免疫蛍光染色によって評価します。代表的な結果として、手術後の運動活性の維持、認知能の低下、海馬神経細胞の完全性の低下、および海馬の神経炎症の増強が示されています。この標準化された簡便なモデルは、脊椎手術に関連する認知機能障害の基礎メカニズムの解明や、周術期の神経保護介入候補の評価のための、臨床的に意義のあるプラットフォームを提供します。

概要

術後認知機能不全（POCD）は、麻酔および手術後の学習・記憶、注意力、処理速度、および実行機能の低下と定義されており1、主に高齢患者に影響を及ぼします。また、報告されている発症率は、手術の内容や患者集団によって異なるようです2,3。POCDは、予定整形外科手術を受ける高齢者において頻繁に発生することが報告されています4。臨床的に、POCDは術後数週間から数ヶ月持続することがあり、入院期間の延長や死亡率の上昇に関連しているとされています5,6,7。世界的な人口高齢化と手術件数の増加に伴い、POCDは公衆衛生および周術期管理における重要な課題となっています。

病態生理学的に、POCDは外科的トラウマおよび麻酔への曝露によって誘発される多因子症候群と考えられており、海馬などの認知に関連する領域における神経機能不全の根底にあるメカニズムとして、神経炎症、酸化ストレス、オートファジーの調節不全、およびシナプス機能不全などが提唱されている8。これらのメカニズムを解析し、候補となる介入策を評価するために、さまざまな前臨床POCDパラダイムが開発されてきた。前臨床パラダイムには、麻酔のみのモデル、腹部手術ベースのモデル、および脛骨骨折などの整形外科的損傷モデルが含まれる9。これらのモデルは当該分野を発展させてきたが、脊椎手術に関連する周術期の特性を完全に再現できていない可能性があり、また、持続的な運動機能低下や長期的な組織炎症などの混絡要因を導入する場合があり、それが認知能の読み取りやメカニズムの解釈を困難にすることがある。

利用可能な外科的戦略の中から、標準化され、かつ脊椎に関連した外科的状況下で術後早期の認知機能障害を調査するため、L5腰椎椎弓切除術モデルを選択しました。この処置は、吸入麻酔下で制御された局所的な外科的侵襲を提供し、顕著な運動機能障害を引き起こすことなく、術後の神経炎症反応および認知機能不全の調査を可能にします。主要な手術ステップを精緻化することで、本プロトコルは、脊椎手術に関連する認知機能障害の調査および周術期の神経保護戦略を評価するための、標準化された実用的かつ費用対効果の高い手法を提供します。

プロトコル

すべての動物実験は、「実験動物の飼育および使用に関するガイドライン」に従って実施され、浙江大学の動物実験委員会によって承認されました（倫理承認番号：ZJU20260153）。

1. 術前準備

  1. 実験動物、群分け、鎮痛および盲検化
    1. 体重 30–34 g の 18 ヶ月齢 C57BL/6J オスマウスを使用する。マウスは、食物と水を自由に摂取させ、12 時間明暗周期の下で飼育する。
    2. 手術前に、少なくとも 7 日間、飼育環境に順化させる。順化後、マウスを L5 椎弓切除群または対照群にランダムに割り当てる。
    3. 実験手順の前に、各マウスにコード化された識別番号を割り当てる。行動評価を処置に対して盲検化して実施できるよう、群分けコードを保持する。
    4. L5 椎弓切除群のマウスにセボフルラン麻酔を施し、続いて L5 腰椎椎弓切除術を行う。対照群のマウスには、セボフルラン麻酔、手術部位の準備、および外科的介入を行わない。
    5. 両群のマウスに、メロキシカムを 2 mg/kg 皮下投与する。L5 椎弓切除群では麻酔導入後に初回投与を行い、対照群では手術終了時に相当する時点で投与する。
    6. その後、両群のマウスにメロキシカム 2 mg/kg を 24 h ごとに 48 h 間、皮下投与する。実験期間を通じて、両群を同じ条件下で飼育、ハンドリングし、モニタリングする。
    7. すべての行動評価を、両群で同一の実験スケジュールに従って実施する。行動評価を行う研究者が、群分けについて盲検化されたままであることを確認する。
  2. すべての手術器具を滅菌し、手術ワークスペースを消毒する。麻酔中の体温を維持するため、ホットパッドを予熱しておく。周術期投与用のメロキシカムを準備する。
  3. ガス麻酔機を起動し、マウスを導入チャンバーに入れる。酸素流量 1 L/min を維持しながら、3–5% セボフルランで 3–5 min 間、全身麻酔を導入する。
  4. 麻酔したマウスを手術台に移す。酸素流量 0.5–0.8 L/min で麻酔マスクを通じて 1.5–3% セボフルランを投与し、麻酔を維持する。メロキシカムを 2 mg/kg 皮下投与する。セボフルラン導入開始から測定した総麻酔時間は約 4 h である。安定した手術麻酔深度を維持するために、必要に応じてセボフルラン濃度を調整する。
  5. マウスを腰椎が上を向くように腹臥位に配置する。動物を固定し、L5 手術野へのアクセスを妨げないように、前肢をテープで優しく固定する。
  6. 足底反射の消失を確認し、十分な麻酔深度であることを確認する。角膜の乾燥を防ぐため、眼軟膏を塗布する。
  7. 小型動物用バリカンを使用して、腰部正中線付近（約 L3–S1）の除毛を行う。露出した皮膚を 75% エタノール、次いでポビドンヨードで消毒し、無菌状態を確保するためにこの手順を 2–3 回繰り返す。

2. L5腰椎椎弓切除術

注意：本プロトコルにおけるすべての手術ステップは、実体顕微鏡や拡大ルーペを使用せず、直接視認下で実施されました。

  1. 麻酔をかけたマウスを、あらかじめ温めておいた手術台の上に腹臥位で配置する。前肢をテープで固定して体を安定させ、腰部を完全に露出させる（図1）。
  2. 体表の指標を用いてL5椎体レベルを特定する。両側の腸骨稜を触診し、その最高点を結ぶ仮想的な横線を引く。
  3. この横線をL5–L6椎間腔の概略的な指標とする。L5椎弓板を標的とするため、この線よりわずかに頭側に皮膚切開予定位置を中心にとる。
  4. 手術部位を消毒する。あらかじめ決定したL5レベル上で、L4–L6領域を露出させるため、約1.5–2.0 cmの正中縦切開を行う。
  5. 滅菌ピンセットで皮膚の端を牽引する。背側の筋膜を露出し、正中の筋膜縫合線を特定する。
  6. 脊髄を露出させた後、椎体レベルを確認する。腰仙関節および最も尾側の腰椎を特定する。
  7. C57BL/6マウスは通常6個の腰椎を持つため、L6の直頭側に位置する椎体をL5として特定する。腰仙関節から頭側に向かって2個目の椎体を数えることで、レベルを確認する。
  8. 正中の筋膜縫合線に沿って小さな開口部を作る。直視下で脊柱傍筋を両側に牽引する。
  9. L5棘突起に隣接する筋肉を分離し 、下層の椎弓板を露出させる。 露出範囲を頭側のL4棘突起および尾側のL6棘突起まで広げ、3つの棘突起がすべて明確に見えるようにする。
  10. 綿棒または微細ピンセットを用いて、主に鈍的な骨隣接剥離を行う。筋膜の癒着を解除し、出血を最小限に抑えるために必要な場合にのみ、鋭的な剥離を行う。
  11. 綿棒で 外側へ牽引し続け、L5椎弓板およびL5–L6椎弓間腔を完全に露出させる。操作を進める前に、椎体レベルを再確認する。
  12. ピンセットでL5棘突起をそっと掴み、棘突起と隣接する腰椎を手術台に対して約30°の角度に持ち上げ、L5–L6椎弓間腔を広げる。
  13. 直視下で、閉じた状態の眼科用剪刀の先端をL5–L6椎弓間腔に挿入する。L5椎弓板の尾側縁の直下の浅い平面に沿って剪刀を進める。
  14. 剪刀をわずかに開き、最初の骨開口部を作る。椎弓板の縁に沿って小さな骨片を順次除去し、椎弓切除窓を拡大する。骨の除去はL5椎弓板の背側に限定し、骨窓を外側の両側椎間関節まで広げないように注意する。
  15. 硬膜損傷を防ぐため、挿入深さと切断力を過剰にしない。
  16. 骨窓を通して硬膜が明確に見えるまで、段階的に椎弓板の除去を続ける。
  17. 術野を注意深く観察する。活動性の出血がないことを確認し、硬膜が損傷なく維持されていることを検証する。
  18. 温めた滅菌生理食塩水で手術部位を洗浄する。緩やかな圧迫止血を行う。
  19. 創傷を層状に閉鎖する。皮膚を6-0ナイロン縫合糸で縫合し、切開部位を消毒する。
  20. 創閉鎖後、総麻酔時間が約4時間に達するまでセボフルラン麻酔を継続する。その後、セボフルランの投与を中止し、術後ケアに移行する。

3. 術後ケア

  1. 椎弓切除群の手術終了時のタイミングで、対照群のマウスにメロキシカムを2 mg/kgで皮下投与する。椎弓切除群の各マウスを温度制御されたヒーティングパッドの上に置き、マウスが意識を取り戻し、安定した自発呼吸および運動活動を示すまで体温を維持する。
  2. 麻酔から完全に回復した後、椎弓切除群の各マウスをホームケージに戻す。その後、通常の歩行が観察されるまで動物をモニタリングする。両群のマウスに対し、その後48時間、24時間ごとにメロキシカムを2 mg/kgで皮下投与する。
  3. 術後3日目まで、手術切開部位と縫合の状態を毎日検査する。必要に応じて、マウスを再度麻酔し、緩みや断裂がある縫合糸を replacement する。
  4. 切開部位に腫れ、出血、浸出液、または局所炎症の兆候がないか毎日確認する。
  5. 術後期間を通じて、体重、グルーミング行動、自発活動、および食物・水摂取量をモニタリングする。
  6. 以下の事前定義された人道的なエンドポイント基準のいずれかを満たした場合は、予定された実験終了前に、当該マウスを人道的に安楽死させる：術前体重の20%以上の減少、24時間の完全な食欲不振または3日間連続で食物摂取量が通常の50%未満、麻酔回復後24時間が経過しても起立不能または食物・水へのアクセスが著しく困難な状態、あるいは37 °C未満の体温を伴う著しい衰弱を特徴とする瀕死状態。

4. POCDの行動評価

  1. オープンフィールド試験（運動制御；術後3日目）
    1. 照度20 luxの下で、壁の高さが40 cmの45 cm × 45 cmのアリーナを用いてオープンフィールド試験を行う。ビデオカメラをアリーナの中央真上に配置し、テストエリア全体が視野に入るようにする。
    2. マウスをアリーナの中央に置き、配置後すぐにビデオトラッキングを開始する。マウスに5分間自由に探索させる。5分間のセッション全体を分析し、ビデオトラッキングシステムを用いて総移動距離と平均移動速度を算出する。
  2. 歩行解析
    1. 術後3日目に、自動歩行解析システムを用いて歩行解析を行う。
    2. 各マウスをウォークウェイの一端に置き、自由にウォークウェイを横切らせる。歩行解析システムに統合された高速カメラを用いて、歩行中の足跡を記録する。
    3. 各マウスの歩行トライアルを記録し、その後の分析のために、ウォークウェイを連続して前進して横切った有効なランを3回収集する。
    4. 歩行解析ソフトウェアを用いて、記録された足跡データを分析する。自動的に識別された足跡を確認し、必要に応じて、歩行パラメータを抽出する前に右前肢、左前肢、右後肢、左後肢の分類を手動で修正する。
    5. ストライド長、立脚時間、遊脚速度、および接地面積を定量化し、統計解析のために各マウスの有効な3回のランから平均値を算出する。
  3. バーンズ迷路（空間学習および記憶；術後4～6日目）
    ​注：術後4日目から3日間連続で、1日1回バーンズ迷路試験を行う。概日変動を最小限に抑えるため、毎日同じ時間帯に試験を実施する。
    1. 指定したターゲットホールの下にエスケープボックスを配置する。実験期間を通じてターゲットの位置は同一に維持する。
    2. 各トライアルの開始時に、マウスを迷路の中央に置く。マウスがエスケープボックスを探す時間を最大3分間設ける。マウスがエスケープボックスに入った時点でトライアルを終了する。
    3. 3分以内にエスケープボックスを見つけられなかった場合は、マウスをターゲットホールまで優しく誘導する。タスク学習を強化するため、マウスを短時間エスケープボックスに留まらせる。
    4. ビデオトラッキングシステムを用いて、脱出潜時と移動距離を記録する。3分以内にエスケープボックスに入らなかったトライアルについては、脱出潜時を180 sとする。統計解析には、3日目の最終セッションで記録された脱出潜時と移動距離のみを含める。
  4. 新奇物体認識試験（認識記憶；術後3～4日目）
    ​注：オープンフィールド試験で説明したものと同じアリーナとビデオトラッキングシステムを使用する。新奇物体認識トレーニングの前に、術後3日目のオープンフィールドセッションを用いてマウスをテストアリーナに慣れさせる。
    1. トレーニングセッション中、アリーナ内の対称な位置に2つの同一な円柱状の物体を配置する。マウスに5分間自由に探索させる。
    2. 1時間の保持間隔の後、使い慣れた円柱状の物体の1つを、新奇な立方体状の物体に置き換える。側方嗜好性の影響を最小限にするため、マウス間で新奇物体の位置をカウンターバランスさせる。マウスに5分間探索させる。
    3. ビデオトラッキングシステムを用いて、使い慣れた物体と新奇な物体の探索時間を記録する。合計物体探索時間が3 s以上のマウスのみを分析に含める。
    4. 嗜好指数（PI）を以下のように算出する：
      figure-protocol-1
      TnovelおよびTfamiliarは、それぞれテストセッション中に新奇物体および使い慣れた物体を探索して過ごした時間と定義する。
  5. 新奇アームY迷路（空間認識記憶；術後5日目）
    1. 120°の間隔で配置された3つの同一なアームからなるY字型迷路で試験を行う。不透明なドアで1つのアームをランダムに塞ぎ、このアームを新奇アームとして指定する。
    2. 開いている2つのアームのうち1つをランダムにスタートアームとして選択する。残りの開いているアームを使い慣れたアームとして指定する。マウスをスタートアームの端に置き、アクセス可能な2つのアームを5分間自由に探索させる。
    3. 1時間のインタートライアル間隔の後、不透明なドアを取り除き、マウスを同じスタートアームの端に戻す。
    4. マウスに3つのアームすべてを5分間自由に探索させる。
    5. アームへの進入は、追跡された身体中心が中央ゾーンからあらかじめ定義されたアームゾーンに入ったときと定義する。ビデオトラッキングシステムを用いて、各アームへの進入回数と滞在時間を記録する。
    6. 時間ベースの新奇アーム嗜好指数を以下のように算出する：
      figure-protocol-2
      Tnovel、Tstart、Tfamiliarは、それぞれ新奇アーム、スタートアーム、使い慣れたアームで過ごした時間と定義する。
    7. 進入回数ベースの嗜好指数を以下のように算出する：
      figure-protocol-3
      Enovelを新奇アームへの進入回数とし、Etotalをテストトライアル中の3つのアームすべてへの総進入回数と定義する。

5. 組織処理、ニッスル染色、および免疫蛍光染色

  1. 組織処理
    1. 規定の実験エンドポイントにおいて、酸素流量 2 L/min で 3% セボフルランを投与し、マウスを深く麻酔する。
    2. 後肢の逃避反射の消失により、十分な麻酔深度であることを確認する。深い麻酔を維持したまま、心停止前に 20 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で経心腔灌流を行い、血管内血液を除去する。
    3. 直ちに 20 mL の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) でマウスを灌流する。
    4. 全脳を慎重に摘出する。脳を 4% PFA に浸し、4 °C で 24 時間後固定を行う。
    5. 組織が完全に沈むまで、脳を 30% ショ糖溶液に移す。
    6. 脳を最適切断温度 (OCT) コンパウンドに包埋する。
    7. 包埋した組織を急速凍結し、クライオセクショニングまで −80 °C で保存する。
  2. ニッスル染色
    1. 16 µm の凍結切片を室温に戻す。スライドを 20 分間風乾させる。
    2. スライドを PBS で 2 分間洗浄する。
      注：染色前に組織切片がスライドにしっかりと付着していることを確認すること。
    3. 切片全体をトルイジンブルー染色液で覆う。55 °C で 30 分間インキュベートする。
      注：過染色の防止のため、16 µm の切片における染色時間は経験的に最適化すること。
    4. 蒸留水で 10–30 秒間短時間洗浄する。
    5. 95%、85%、75% のエタノールを用いて、それぞれ 2 分ずつ順次脱色を行う。
      注：染色強度を最適化するために、必要に応じて脱色時間を調整すること。
    6. 新鮮なキシレンで 5 分ずつ 2 回、透明化を行う。
      注：キシレンを用いるすべての工程は、化学薬品用ドラフトチャンバー内で行うこと。
    7. 中性バルサムで切片を封入する。各切片の上にカバーガラスを静かにのせる。
    8. 20× 対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、染色された切片を撮影する。海馬の冠状切断像において、特徴的な緻密な錐体細胞層に基づいて CA1 領域を特定する。マウスあたり 1 枚の冠状切片を解析し、各海馬半球の CA1 領域から重複しない 2 つの視野を取得する。
    9. 画像解析ソフトウェアの細胞計数プラグインを用いて、形態学的に完全なニッスル陽性ニューロンおよびニッスル体を手動でカウントする。完全なニューロンは、完全な細胞体、核小体が視認できる円形の核、および豊富な細胞質ニッスル物質によって特定し、ニッスル体はニューロン細胞質内の強塩基性の顆粒状または凝集構造として特定する。
    10. 解析したすべての視野から得られた値を平均し、動物 1 頭あたり 1 つの値を算出する。カウントを行う観察者は、グループ割り付けについて盲検化されていることを確認する。
  3. Iba1 免疫蛍光染色
    1. 染色の前に、脳切片を室温に馴化させる。
    2. スライドをクエン酸ナトリウム抗原賦活化溶液に浸し、80 °C のウォーターバスで 25 分間抗原賦活化を行う。抗原賦活化後、スライドと賦活化溶液を室温まで自然冷却させる。
    3. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    4. 0.2% Triton X-100 含有 PBS で室温にて 30 分間透過処理を行い、続いて PBS で 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    5. 加湿チャンバー内にて、3% 牛血清アルブミン (BSA) 含有 PBS で室温で 1 時間インキュベートし、非特異的結合をブロックする。
    6. PBS で 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    7. 電離カルシウム結合適応分子 1 (Iba1) に対する一次抗体 (1:100) をブロッキング溶液 (3% BSA 含有 PBS) で希釈し、加湿チャンバー内にて 4 °C で一晩インキュベートする。
    8. PBS で 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    9. 488-標識ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) (1:1000) を用いて、暗所で室温にて 90 分間インキュベートする。
    10. 暗所で PBS を用い、3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    11. DAPI (1:8000) を用いて、暗所で 5 分間核を対比染色する。
    12. 暗所で PBS を用い、3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    13. 退色防止封入剤で切片を封入し、カバーガラスを被せ、イメージングまで遮光保存する。
    14. 20× 対物レンズを備えた共焦点蛍光顕微鏡を用いて、海馬 CA1 領域の蛍光画像を取得する。定量比較に含まれるすべての切片において、同一の画像取得設定を用いる。マウスあたり 1 枚の冠状切片を解析し、各海馬半球の CA1 領域から重複しない 2 つの視野を取得する。
    15. すべての画像で同一の閾値設定を用い、海馬 CA1 領域における Iba1 の平均蛍光強度を定量化する。すべての視野の値を平均して、動物 1 頭あたり 1 つの値を得る。

6. 統計解析

  1. すべての統計解析は統計解析ソフトウェアを用いて行う。データは平均値として提示する。 ± 標準偏差 (SD)
  2. Shapiro–Wilk検定を用いてデータの正規性を評価する。F検定を用いて分散の等質性を評価する。
  3. 等分散性の仮定が満たされている場合は、対応のない両側Student's t検定を用いて対照群とL5椎弓切除術群を比較する。等分散性の仮定が満たされていない場合は、Welch's t検定を用いる。
  4. nを各解析に含まれる動物数として定義する。aを検討する P 値 < 0.05で統計的に有意。

結果

すべてのマウスが予定されていた実験終了時まで生存し、あらかじめ定義された人道的エンドポイント基準に達した個体はなく、全個体が最終解析に含まれた。術後3日目に、オープンフィールド試験および歩容解析を用いて運動機能を評価した。オープンフィールド試験における総移動距離および平均速度のいずれにおいても群間に差はなく、自発的な運動活性は同等であることが示された (Figure 2A)。同様に、歩容解析においても、歩幅、立脚時間、遊脚速度、または接地面積において群間に有意な差は認められなかった (Figure 2B)。以上の結果から、L5椎弓切除術は、その後の認知行動パフォーマンスの差を説明するに十分な顕著な運動機能障害を引き起こさなかったことが示唆される。

認知機能は、新奇物体認識（NOR）テスト、新奇アームY迷路、およびバーンズ迷路を用いて評価した。NORテストにおいて、L5椎弓切除術群は対照群よりも有意に低い新奇物体嗜好指数（PI）を示した（図 3A）。新奇アームY迷路では、L5椎弓切除術群は、新奇アームでの滞在時間と進入回数の両方において有意に低いPIを示した（図 3B）。バーンズ迷路では、L5椎弓切除術群は、テスト3日目に、より長い脱出潜時とより長い移動距離を示した（図 3C）。以上の行動学的所見から、L5椎弓切除術後の術後認知機能が低下していることが示された。

海馬CA1領域において、L5椎弓切除術群は対照群と比較してNissl陽性ニューロンおよびNissl小体が有意に少なく、ニューロンの構造的損傷が示された（Figure 4A, B）。さらに、L5椎弓切除術群ではIba1の平均蛍光強度が高く、これはミクログリアの活性化亢進と一致していた（Figure 4C, D）。

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図1: マウスにおける術後認知機能障害（POCD）モデル作成のためのL5腰椎椎弓切除術。 (A) L5椎弓の手術標的および隣接する椎体レベル（L4–L6）にわたる露出範囲の模式図。(B) L5腰椎椎弓切除術の主要な手順を示す術中写真。(a) 除毛後の腰部。脊柱正中線を確認し、矢印は予定している皮膚切開の方向を示す。(b) 腰椎上の正中皮膚切開。(c) 筋膜を切開し、傍脊柱筋を段階的に分離して棘突起を露出させ、さらにL5棘突起と椎弓周囲の組織を清掃してL5椎弓を完全に露出させる。(d) L5椎弓を除去した後のL5椎弓切除。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 2: L5腰椎椎弓切除術後の自発運動能および歩行の評価。(A>) 総移動距離および平均速度を示すオープンフィールド試験 (n = 10)。(B>) 歩幅、立脚時間、遊脚速度、および足跡面積を示す歩行解析 (n = 6)。データは平均 ± SD で示す。統計的有意差は ns（有意差なし）として表記。略語：Control = 対照群、Laminectomy = L5椎弓切除群。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 3: L5腰椎椎弓切除術後の認知行動評価。 (A) 新規物体認識テスト (n = 10)。 (B) Y迷路新規アームテスト (n = 10)。 (C) バーンズ迷路テスト (n = 10)。データは平均値 ± SD を示す。統計的有意性は *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 として示される。略語：Control = 対照群、Laminectomy = L5椎弓切除群。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 4: L5腰椎椎弓切除術後の海馬CA1領域の組織学的評価。 (A>) 海馬CA1領域におけるニッスル染色の代表画像。 (B>) ニッスル陽性ニューロン（左）およびニッスル体（右）の定量化 (n = 5)。 (C>) 海馬CA1領域におけるIba1免疫蛍光染色の代表画像。スケールバー = 100 µm。 (D>) Iba1の平均蛍光強度の定量化 (n = 6)。データは平均 ± SDで示す。統計的有意性は **P < 0.01、および ***P < 0.001 として示す。略語：Control = コントロール群；Laminectomy = L5椎弓切除群。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

脊椎手術を受けた高齢者において、術後認知機能障害が報告されています10。さらに、実験的な証拠により、加齢が手術に伴う認知機能低下および神経炎症反応への感受性を高めることが示されています11,12。本プロトコルでは、高齢マウスに約4時間のセボフルラン麻酔とL5椎弓切除術を組み合わせることで、早期術後認知機能障害をモデル化します。本手法の主な有用性は、脊椎手術後の行動学的および海馬組織学的変化を調査するための、実用的かつ簡便な手順を提供することにあります。

前臨床のPOCDモデルには、麻酔のみへの曝露、腹部手術、および整形外科的損傷のパラダイムが含まれます13。麻酔のみのパラダイムでは、外科的外傷のない状態での麻酔の効果を評価できますが14、麻酔と組織損傷への複合的な曝露を再現することはできません。腹部手術および脛骨骨折モデルは外科的損傷を伴い、手術関連認知機能障害の研究に使用されてきました15,16。しかし、これらの手術部位および組織損傷パターンは、脊椎手術のものとは異なります。外科的外傷の種類と強度は、術後の認知機能の結果および中枢性炎症反応に影響を及ぼす可能性があるため9、前臨床モデルを選択する際は手術の背景を考慮すべきです。したがって、本L5椎弓切除術プロトコルは、高齢マウスにおける術後早期の認知機能障害を調べるための、脊椎手術に関連した実験的パラダイムを提供します。

本プロトコルにおける主要な技術的課題は、硬膜への損傷を避けつつ、硬膜を明確に露出させるためにL5椎弓板から十分な骨を除去することです。直接視認下での椎弓切除術では、器具の到達深度、切削力、および眼科用剪刀の挿入角度を慎重に制御する必要があります。骨の除去は、椎弓の縁に沿って小さく制御された切開を段階的に繰り返して行う必要があります。ピンセットでL5棘突起を把持し、術野となる腰椎セグメントを手術台に対して約30°の角度に持ち上げることで、L5–L6の椎弓間腔を広げることができます。この操作により、剪刀の先端を骨縁の下に浅く挿入することが可能になり、硬膜に接触するリスクを低減できます。骨の除去が不十分な場合は術野の露出が制限され、一方で過剰に侵襲的な切削や過度な挿入深度は硬膜損傷を引き起こす可能性があります。制御不能な出血は術野を不鮮明にし、術後の回復を妨げ、行動結果のばらつきを増大させる恐れがあります。剪刀の先端を安全に挿入するための椎弓間腔が不十分な場合は、挿入深度を深くするのではなく、腰椎セグメントの位置と挙上角度を再調整してください。出血によって術野が不鮮明になった場合は、十分な視認性が回復するまで骨の除去を一時中断し、その後、残っている骨を漸増的に除去してください。

傍脊柱筋の剥離および L5 椎弓切除術は、術後の 一過性の疼痛の原因となる可能性があり、マウスを用いた実験的な椎弓切除術後に機械的過敏症が認められたことが報告されている17。メロキシカムは、あらかじめ定義された鎮痛レジメンに従って投与された。マウスにおける術後の疼痛に関連する顔面表情は、約 36–48 h 持続することが報告されている18。48 h の鎮痛レジメンは、この術後早期の期間をカバーすることを目的としており、術直後の疼痛による潜在的な影響を軽減するため、鎮痛レジメン完了後の術後 3 日目に認知行動テストを開始した。オープンフィールドテストは、実験的な POCD 研究において、自発的な運動能力を評価し、運動能力の低下が認知行動パフォーマンスに影響を及ぼしているかどうかを判断するために用いられてきた19,20。それに伴い、認知評価に先立ち、術後 3 日目にオープンフィールドテストと歩行分析を実施した。オープンフィールドでの運動能力または歩行パラメータにおいて、群間に有意な差は認められず、その後の認知行動上の差が主に顕著な運動障害によって説明される可能性は低いことが示唆された。しかし、術後の自発的な疼痛および創傷部位の不快感は直接評価されていないため、行動パフォーマンスへの残存影響を完全に排除することはできない。今後の研究では、術後の自発的な疼痛の直接的な評価を組み込むことが考えられる。

全体として、本プロトコルは、L5椎弓切除術後の高齢マウスにおける術後早期認知機能障害を調査するための実用的な実験的アプローチを提供するものである。本手法は、脊椎手術に関連する認知機能障害の行動学的結果および潜在的なメカニズムの解明に利用できるほか、術後認知機能障害の予防または軽減を目的とした介入策の評価にも活用できる。より大規模なコホートおよび独立した研究室での検証を行うことで、本モデルの安定性と再現性がさらに確立されると考えられる。

開示事項

著者は競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

浙江大学医学院コアファシリティプラットフォームのSanhua Fang氏、および浙江大学動物センターのYanhong Chen氏とXuliang Zhang氏による技術的支援に感謝いたします。本研究は、以下の基金より助成を受けて実施されました：中国国家自然科学基金（Nos. 82575196, 82074535, U23A20508）。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C57BL/6J オスマウスSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-0005動物モデル
ANY-maze Video Tracking SoftwareStoelting Co., USA6000行動ビデオトラッキングおよび解析
エリスロマイシン眼軟膏Beijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H11021270眼球乾燥の防止
精密ピンセットNANA皮膚の固定
ヒーティングパッドNANA温度制御
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology17198Iba1 免疫蛍光染色
吸入麻酔装置RWD Life Science Co., Ltd.R581S麻酔
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY2025112704歩容解析
眼科用マイクロ剪刀NANA骨の除去
ニッスル染色液Haoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033ニッスル染色
剪刀Shang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY00030皮膚切開
セボフルランShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.25062331麻酔
使い捨て手術用ドレープJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.20212140221手術操作用プラットフォーム
小動物用バリカンYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-03310除毛
手術用縫合糸・針Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603皮膚の縫合
Veet 除毛クリームRECKITT BENCKISER (India) LtdNA除毛

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