方法論記事

術後認知機能障害モデル作成のための高齢C57BL/6JマウスにおけるL5腰椎椎弓切除術

48 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/71733

⸱

2026年9月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、運動機能への影響を最小限に抑えつつ、術後認知機能障害モデルを構築するための、高齢C57BL/6Jマウスにおける標準的なL5腰椎椎弓切除術について説明します。これにより、周術期神経認知障害の行動学的、組織学的、およびメカニズム的な研究を支援します。

要約

術後認知機能障害（POCD）は、手術および麻酔後に、特に高齢者において頻見される神経学的合併症であり、回復の遅延、入院期間の延長、およびクオリティ・オブ・ライフの低下に関連しています。整形外科的処置および脊椎手術はPOCDの比較的高いリスクと関連していますが、脊椎手術の周術期の特徴を密接に反映した前臨床モデルは依然として限られています。開腹術や脛骨骨折などの一般的に用いられるモデルでは、持続的な運動機能障害や長期的な末梢炎症が生じることがあり、それが認知行動結果の解釈を妨げる可能性があります。本プロトコルでは、18週齢の雄性C57BL/6Jマウスを用い、セボフルラン麻酔下でのL5腰椎椎弓切除術によるPOCDモデル作成のための、標準化された低コストな手法を記述します。この処置は日常的な手術器具を用いて行われ、持続的な運動欠損を最小限に抑えつつ、制御された外科的損傷を与えます。認知機能は、新奇物体認識テスト、新奇アームY迷路、およびバーンズ迷路を用いて評価し、海馬の神経細胞損傷および神経炎症変化は、それぞれニッスル染色およびIba1免疫蛍光染色によって評価します。代表的な結果として、手術後の運動活性の維持、認知能の低下、海馬神経細胞の完全性の低下、および海馬の神経炎症の増強が示されています。この標準化された簡便なモデルは、脊椎手術に関連する認知機能障害の基礎メカニズムの解明や、周術期の神経保護介入候補の評価のための、臨床的に意義のあるプラットフォームを提供します。

概要

術後認知機能不全（POCD）は、麻酔および手術後の学習・記憶、注意力、処理速度、および実行機能の低下と定義されており1、主に高齢患者に影響を及ぼします。また、報告されている発症率は、手術の内容や患者集団によって異なるようです2,3。POCDは、予定整形外科手術を受ける高齢者において頻繁に発生することが報告されています4。臨床的に、POCDは術後数週間から数ヶ月持続することがあり、入院期間の延長や死亡率の上昇に関連しているとされています5,6,7。世界的な人口高齢化と手術件数の増加に伴い、POCDは公衆衛生および周術期管理における重要な課題となっています。

病態生理学的に、POCDは外科的トラウマおよび麻酔への曝露によって誘発される多因子症候群と考えられており、海馬などの認知に関連する領域における神経機能不全の根底にあるメカニズムとして、神経炎症、酸化ストレス、オートファジーの調節不全、およびシナプス機能不全などが提唱されている8。これらのメカニズムを解析し、候補となる介入策を評価するために、さまざまな前臨床POCDパラダイムが開発されてきた。前臨床パラダイムには、麻酔のみのモデル、腹部手術ベースのモデル、および脛骨骨折などの整形外科的損傷モデルが含まれる9。これらのモデルは当該分野を発展させてきたが、脊椎手術に関連する周術期の特性を完全に再現できていない可能性があり、また、持続的な運動機能低下や長期的な組織炎症などの混絡要因を導入する場合があり、それが認知能の読み取りやメカニズムの解釈を困難にすることがある。

利用可能な外科的戦略の中から、標準化され、かつ脊椎に関連した外科的状況下で術後早期の認知機能障害を調査するため、L5腰椎椎弓切除術モデルを選択しました。この処置は、吸入麻酔下で制御された局所的な外科的侵襲を提供し、顕著な運動機能障害を引き起こすことなく、術後の神経炎症反応および認知機能不全の調査を可能にします。主要な手術ステップを精緻化することで、本プロトコルは、脊椎手術に関連する認知機能障害の調査および周術期の神経保護戦略を評価するための、標準化された実用的かつ費用対効果の高い手法を提供します。

プロトコル

すべての動物実験は、「実験動物の飼育および使用に関するガイドライン」に従って実施され、浙江大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました（倫理承認番号：ZJU20260153）。

1. 術前準備

  1. 実験動物、群分け、鎮痛処置および盲検化
    1. 体重 30–34 g の 18 ヶ月齢雄性 C57BL/6J マウスを使用する。マウスは、食物と水に自由的にアクセスできる環境で、12 時間明暗サイクル下で飼育する。
    2. 手術前に、少なくとも 7 日間マウスを飼育環境に慣らす。順化後、マウスを L5 椎弓切除群または対照群にランダムに割り付ける。
    3. 実験手順の前に、各マウスにコード化された識別番号を割り当てる。治療内容を盲検化した状態で行動評価が行えるよう、群分けコードを保持する。
    4. L5 椎弓切除群のマウスにセボフルラン麻酔を施し、続いて L5 腰椎椎弓切除術を行う。対照群のマウスには、セボフルラン麻酔、手術部位の準備、および外科的介入を行わない。
    5. 両群のマウスにメロキシカムを 2 mg/kg で皮下投与する。L5 椎弓切除群では麻酔導入後に初回投与を行い、対照群では手術終了時に相当するタイミングで投与する。
    6. 両群のマウスに、その後 48 時間にわたり 24 時間ごとにメロキシカム 2 mg/kg を皮下投与する。実験期間中、両群を同一の条件下で飼育、取り扱い、およびモニタリングを行う。
    7. すべての行動評価を、両群で同一の実験スケジュールに従って実施する。行動評価を行う研究者が、群分けについて盲検化された状態を維持するようにする。
  2. すべての手術器具を滅菌し、手術ワークスペースを消毒する。麻酔中の体温を維持するため、ヒートパッドを予熱しておく。周術期投与用のメロキシカムを準備する。
  3. ガス麻酔装置を起動し、マウスを導入チャンバーに入れる。酸素流量 1 L/min を維持しながら、3–5% のセボフルランで 3–5 分間、全身麻酔を導入する。
  4. 麻酔したマウスを手術台に移す。酸素流量 0.5–0.8 L/min で、麻酔マスクを通じて 1.5–3% のセボフルランを投与し、麻酔を維持する。メロキシカム 2 mg/kg を皮下投与する。セボフルラン導入開始から測定した総麻酔時間は約 4 時間である。安定した手術麻酔深度を維持するため、必要に応じてセボフルラン濃度を調整する。
  5. マウスを、腰椎が上を向くように腹臥位に配置する。動物を安定させ、L5 手術野へのアクセスを妨げないよう、前肢をテープで軽く固定する。
  6. 足底反射の消失を確認し、十分な麻酔深度であることを確認する。角膜の乾燥を防ぐため、眼軟膏を塗布する。
  7. 小動物用トリマーを用いて、腰部正中線領域（おおよそ L3–S1）の除毛を行う。露出した皮膚を 75% エタノール、次いでポビドンヨードで消毒し、無菌状態を確保するためにこの手順を 2–3 回繰り返す。

2. L5腰椎椎弓切除術

注：本プロトコルにおいて、すべての手術工程は、実体顕微鏡や拡大ルーペを使用せず、直接視認下で実施した。

  1. 麻酔したマウスを、あらかじめ温めておいた手術台の上に腹臥位で配置する。体を安定させ、腰部を完全に露出させるため、前肢をテープで固定する（Figure 1）。
  2. 体表の指標を用いてL5椎体レベルを特定する。両側の腸骨稜を触診し、その最高点を結ぶ仮想的な横線を引く。
  3. この横線をL5–L6椎間腔の概略的な指標とする。L5椎弓板を標的とするため、この線よりわずかに頭側に皮膚切開の中心を定める。
  4. 手術部位を消毒する。あらかじめ定めたL5レベル上で、L4–L6領域を露出させるため、正中線に沿って約1.5–2.0 cmの縦方向の皮膚切開を行う。
  5. 滅菌鉗子で皮膚の端を牽引する。背側筋膜を露出し、正中筋膜縫合線を特定する。
  6. 脊髄を露出させた後、椎体レベルを確認する。腰仙移行部と最も尾側の腰椎を特定する。
  7. C57BL/6マウスは通常6個の腰椎を持つため、L6の直ちに頭側にある椎体をL5として特定する。腰仙移行部から頭側に向かって2つの椎体を数えることでレベルを確認する。
  8. 正中筋膜縫合線に沿って小さな開口部を作る。直接視認しながら、脊柱起立筋を両側に牽引する。
  9. L5棘突起に隣接する筋肉を分離し、下にある椎弓板を露出させる。L4棘突起からL6棘突起まで、3つの棘突起がすべて明確に見えるまで頭側および尾側に露出範囲を広げる。
  10. 綿棒または微細鉗子を用い、主に鈍的で骨に沿った剥離を行う。筋膜の癒着を剥離する場合にのみ鋭的な剥離を行い、出血を最小限に抑える。
  11. 綿棒で側方への牽引を維持し、L5椎弓板およびL5–L6椎間腔を完全に露出させる。次へ進む前に、再度椎体レベルを確認する。
  12. 鉗子でL5棘突起をそっと掴み、棘突起と隣接する腰椎を手術台に対して約30°の角度まで持ち上げ、L5–L6椎間腔を広げる。
  13. 直接視認しながら、閉じた状態の眼科用鋏の先端をL5–L6椎間腔に挿入する。L5椎弓板の尾側縁の直下にある浅い平面に沿って鋏を進める。
  14. 鋏をわずかに開き、最初の骨開口部を作る。椎弓板の縁に沿って小さな骨片を順次除去し、椎弓切除のウィンドウを拡大する。骨の除去はL5椎弓板の背側に限定し、ウィンドウが側方の両側 facets joints（facet joints）まで広がらないようにする。
  15. 硬膜損傷を防ぐため、過剰な挿入深さと過度な切削力を避ける。
  16. 骨ウィンドウを通して硬膜が明確に見えるまで、段階的に椎弓板の除去を続ける。
  17. 術野を注意深く検査する。活動性の出血がないことを確認し、硬膜が損傷せず無傷であることを検証する。
  18. 温めた滅菌生理食塩水で手術部位を洗浄する。穏やかな圧迫により止血を行う。
  19. 創傷を層別に閉鎖する。6-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉鎖し、切開部位を消毒する。
  20. 創閉鎖後、総麻酔時間が約4 hに達するまでセボフルラン麻酔を継続する。その後、セボフルランの投与を中止し、術後ケアに移行する。

3. 術後ケア

  1. 椎弓切除術群の手術終了時に相当するタイミングで、対照群のマウスにメロキシカムを 2 mg/kg 皮下投与する。椎弓切除術群の各マウスを温度制御されたヒーティングパッドの上に置き、マウスが意識を回復し、安定した自発呼吸と運動能を示すまで体温を維持する。
  2. 麻酔から完全に回復した後、椎弓切除術群の各マウスをホームケージに戻す。その後、正常な歩行が観察されるまで動物をモニタリングする。両群のマウスに、その後 48 時間にわたり 24 時間ごとにメロキシカム 2 mg/kg を皮下投与する。
  3. 術後 3 日目まで、手術切開部位と縫合の状態を毎日点検する。必要に応じてマウスを再度麻酔し、緩んだり切れたりした縫合糸を replacement する。
  4. 切開部位に腫脹、出血、浸出液、または局所炎症の兆候がないか毎日確認する。
  5. 術後期間を通じて、体重、グルーミング行動、自発活動、および餌と水の摂取量をモニタリングする。
  6. 以下の定義済みの人道的エンドポイント基準のいずれかに該当した場合、予定されていた実験終了前にマウスを人道的に安楽死させる：術前体重の 20% 以上の減少、24 時間にわたる完全な拒食または 3 日連続で餌の摂取量が正常量の 50% 未満であること、麻酔回復後 24 時間経過しても起立不能または餌や水へのアクセスに対する顕著な忌避が持続すること、あるいは 37 °C 以下の体温を伴う顕著な衰弱を特徴とする瀕死状態であること。

4. POCDの行動評価

  1. オープンフィールド試験（自発的活動の制御；術後3日目）
    1. 照度 20 lux の下、壁高 40 cm の 45 cm × 45 cm アリーナでオープンフィールド試験を実施する。ビデオカメラをアリーナの中心真上に配置し、試験エリア全体が視野に入るようにする。
    2. マウスをアリーナの中心に置き、配置後直ちにビデオトラッキングを開始する。マウスに 5分間自由に探索させる。ビデオトラッキングシステムを用いて、5分間のセッション全体を解析し、総移動距離と平均移動速度を算出する。
  2. 歩容解析
    1. 術後3日目に、自動歩容解析システムを用いて歩容解析を行う。
    2. 各マウスをウォークウェイの一端に置き、自由に歩行させる。歩行中の足跡を、歩容解析システムに内蔵された高速カメラで記録する。
    3. 各マウスの歩容試行を記録し、その後の解析のために、ウォークウェイを継続的に前進して通過した有効な走行データを3回分収集する。
    4. 歩容解析ソフトウェアを用いて、記録された足跡データを解析する。自動識別された足跡を確認し、必要に応じて、歩容パラメータを抽出する前に右前肢、左前肢、右後肢、左後肢の分類を手動で修正する。
    5. ストライド長、立脚時間、遊脚速度、および接地面積を定量化し、統計解析のために、各マウスの3回の有効な走行からの平均値を算出する。
  3. バーンズ迷路（空間学習と記憶；術後4～6日目）
    ​注：術後4日目から3日間連続で、1日1回バーンズ迷路試験を行う。概日変動を最小限に抑えるため、毎日同じ時間帯に試験を実施する。
    1. 指定したターゲットホールの下にエスケープボックスを配置する。実験を通じてターゲットの位置は同一に保持する。
    2. 各試行の開始時に、マウスを迷路の中心に置く。マウスがエスケープボックスを探索する時間を最大 3分間までとする。マウスがエスケープボックスに入った時点で試行を終了する。
    3. 3分以内にエスケープボックスを発見できなかった場合は、マウスをターゲットホールまで緩やかに誘導する。タスク学習を強化するため、マウスを短時間エスケープボックスに留まらせる。
    4. ビデオトラッキングシステムを用いて、脱出潜時と移動距離を記録する。3分以内にエスケープボックスに入れなかった試行については、脱出潜時を 180 s とする。統計解析には、3日目の最終セッションで記録された脱出潜時と移動距離のみを含める。
  4. 新規物体認識（認識記憶；術後3～4日目）
    ​注：オープンフィールド試験で使用したものと同じアリーナとビデオトラッキングシステムを使用する。新規物体認識トレーニングの前に、術後3日目のオープンフィールドセッションを用いて、マウスを試験アリーナに慣れさせる。
    1. トレーニングセッションでは、同一の円筒形物体2つをアリーナ内の対称な位置に配置する。マウスに 5分間自由に探索させる。
    2. 1時間の保持期間の後、既知の円筒形物体1つを新規の立方体状物体に置き換える。潜在的な側好性を最小限にするため、マウス間で新規物体の配置をカウンターバランスさせる。マウスに 5分間探索させる。
    3. ビデオトラッキングシステムを用いて、既知物体と新規物体の探索時間を記録する。解析には、総物体探索時間が少なくとも 3 s 以上であるマウスのみを含める。
    4. 嗜好指数（PI）を次のように算出する：
      嗜好指数の公式：PI = T_novel / (T_novel + T_familiar) × 100%.
      Tnovel および Tfamiliar を、テストセッション中にそれぞれ新規物体および既知物体の探索に費やした時間とする。
  5. 新規アームY迷路（空間認識記憶；術後5日目）
    1. 120°の間隔で配置された3つの同一アームからなるY字型迷路で試験を行う。アームの1つを不透明な扉でランダムに遮断し、このアームを新規アームとして指定する。
    2. 開放されている2つのアームのうち、1つをランダムにスタートアームとして選択する。残りの開放アームを既知アームとする。マウスをスタートアームの端に置き、アクセス可能な2つのアームを 5分間自由に探索させる。
    3. 1時間の試行間隔の後、不透明な扉を取り除き、マウスを同じスタートアームの端に戻す。
    4. マウスに 3つのアームすべてを 5分間自由に探索させる。
    5. 追跡された体の中心が、中心領域から定義されたアーム領域に入ったことをアーム進入と定義する。ビデオトラッキングシステムを用いて、各アームへの進入回数と滞在時間を記録する。
    6. 時間に基づく新規アーム嗜好指数を次のように算出する：
      行動研究の時間計算公式；新規アーム滞在時間の割合を示す式。
      Tnovel、Tstart、Tfamiliar を、それぞれ新規アーム、スタートアーム、および既知アームで費やした時間とする。
    7. 進入回数に基づく嗜好指数を次のように算出する：
      新規アーム進入回数の公式、E_novel/E_total、行動実験解析式。
      Enovel を新規アームへの進入回数、Etotal をテスト試行中の3つのアームすべてへの総進入回数とする。

5. 組織処理、ニッスル染色および免疫蛍光染色

  1. 組織処理
    1. 指定の実験終了時点で、酸素流量 2 L/min で 3% セボフルランを投与し、マウスを深く麻酔させる。
    2. 後肢の逃避反射が消失していることを確認し、十分な麻酔深度であることを検証する。深い麻酔を維持したまま、心停止前に 20 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で経心腔灌流を行い、血管内の血液を除去する。
    3. 直ちに 20 mL の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) でマウスを灌流する。
    4. 全脳を慎重に摘出する。脳を 4% PFA に浸し、4 °C で 24 時間後固定を行う。
    5. 組織が完全に沈むまで、脳を 30% ショ糖溶液に移す。
    6. 脳を最適切断温度 (OCT) コンパウンドに包埋する。
    7. 包埋した組織を急速凍結し、クライオセクショニングまで −80 °C で保存する。
  2. ニッスル染色
    1. 16 µm の凍結切片を室温に戻す。スライドを 20 分間風乾させる。
    2. スライドを PBS で 2 分間洗浄する。
      注：染色前に、組織切片がスライドにしっかりと付着していることを確認すること。
    3. 切片全体をトルイジンブルー染色液で覆う。55 °C で 30 分間インキュベートする。
      注：過染色を防ぐため、16 µm 切片に対して染色時間を経験的に最適化すること。
    4. 蒸留水で 10–30 秒間、短時間洗浄する。
    5. 95%、85%、75% のエタノールで、それぞれ 2 分間ずつ順次分染を行う。
      注：染色の強度を最適化するため、必要に応じて分染時間を調整すること。
    6. 新鮮なキシレンで 5 分間ずつ 2 回、透明化を行う。
      注：キシレンを使用するすべての工程は、化学用ドラフトチャンバー内で行うこと。
    7. 中性バルサムを用いて切片を封入する。各切片の上にカバーガラスを静かに載せる。
    8. 20× 対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、染色切片を撮影する。冠状断の海馬切片において、特徴的な緻密な錐体細胞層に基づき CA1 領域を同定する。マウスごとに 1 枚の冠状断切片を分析し、各海馬半球の CA1 領域から重複しない 2 つの視野を撮影する。
    9. 画像解析ソフトウェアの細胞カウントプラグインを使用し、形態的に完全なニッスル陽性ニューロンおよびニッスル体を的に手動でカウントする。完全なニューロンは、完全な細胞体、核小体が視認できる円形の核、および豊富な細胞質ニッスル物質によって同定し、ニッスル体はニューロン細胞質内の強塩基性の顆粒状または凝集構造として同定する。
    10. 分析したすべての視野から得られた値を平均し、動物 1 匹あたりの単一値を算出する。カウントを行う観察者が、グループ割り付けについて盲検化されていることを確認する。
  3. Iba1 免疫蛍光染色
    1. 染色前に、脳切片を室温に馴染ませる。
    2. スライドをクエン酸ナトリウム抗原賦活化溶液に浸し、80 °C のウォーターバスで 25 分間抗原賦活化を行う。賦活化後、スライドと賦活化溶液を自然に室温まで冷却させる。
    3. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    4. PBS 中 0.2% Triton X-100 で室温にて 30 分間透過処理を行い、続いて PBS で 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    5. 加湿チャンバー内で、PBS 中 3% 牛血清アルブミン (BSA) を用いて室温で 1 時間インキュベートし、非特異的結合をブロックする。
    6. PBS で 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    7. イオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (Iba1) に対する一次抗体を、ブロッキング溶液 (PBS 中 3% BSA) で 1:100 に希釈し、希釈した一次抗体とともに加湿チャンバー内 4 °C で一晩インキュベートする。
    8. PBS で 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    9. 488 標識ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) (1:1000) を用い、暗所で室温にて 90 分間インキュベートする。
    10. 暗所で PBS を用い 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    11. DAPI (1:8000) を用い、暗所で 5 分間核を対比染色する。
    12. 暗所で PBS を用い 3 分間ずつ 3 回洗浄する。
    13. 退色防止封入剤を用いて切片を封入し、カバーガラスを適用し、撮像まで切片を遮光して保存する。
    14. 20× 対物レンズを備えた共焦点蛍光顕微鏡を用いて、海馬 CA1 領域の蛍光画像を撮影する。定量比較に含まれるすべての切片に対して、同一の画像取得設定を使用する。マウスごとに 1 枚の冠状断切片を分析し、各海馬半球の CA1 領域から重複しない 2 つの視野を撮影する。
    15. すべての画像で同一の閾値設定を用いて、海馬 CA1 領域における Iba1 の平均蛍光強度を定量する。すべての視野の値を平均し、動物 1 匹あたりの単一値を算出する。

6. 統計解析

  1. 統計解析ソフトを用いてすべての統計解析を行う。データは平均値 ± 標準偏差 (SD) として提示する。
  2. Shapiro–Wilk検定を用いてデータの正規性を評価する。F検定を用いて分散の等分散性を評価する。
  3. 等分散性の仮定が満たされる場合は、非対応の二方向Studentのt検定を用いて、コントロール群とL5椎弓切除群を比較する。等分散性の仮定が満たされない場合は、Welchのt検定を用いる。
  4. nを各解析に含まれる動物数と定義する。P値 < 0.05 を統計的に有意とみなす。

結果

すべてのマウスが予定されていた実験終了時まで生存し、事前に定義された人道的エンドポイント基準に達した個体はなく、すべての個体が最終解析に含まれた。術後3日目に、オープンフィールド試験および歩行解析を用いて運動機能を評価した。オープンフィールド試験における総移動距離および平均速度のいずれにおいても群間に差はなく、自発的な運動能は同等であることが示された(Figure 2A)。同様に、歩行解析においても、歩幅、支持期時間、遊脚速度、または足跡面積に群間の有意な差は見られなかった(Figure 2B)。以上の結果から、L5椎弓切除術は、その後の認知行動パフォーマンスの差を説明するのに十分な顕著な運動機能障害を引き起こさなかったことが示唆される。

認知機能は、新奇物体認識（NOR）テスト、新奇アームY迷路、およびバーンズ迷路を用いて評価した。NORテストにおいて、L5椎弓切除術群は対照群よりも新奇物体嗜好指数（PI）が有意に低かった（図3A）。新奇アームY迷路では、L5椎弓切除術群は新奇アームでの滞在時間および進入回数の両方において、PIが有意に低かった（図3B）。バーンズ迷路では、テスト3日目にL5椎弓切除術群で脱出潜時が延長し、移動距離が増大した（図3C）。以上の行動学的所見は、L5椎弓切除術後の術後認知機能が低下していることを示している。

海馬CA1領域において、L5椎弓切除術群では対照群と比較してNissl陽性ニューロンおよびNissl体が有意に少なく、ニューロンの構造的損傷が示された（Figure 4A, B）。さらに、L5椎弓切除術群ではIba1の平均蛍光強度が有意に上昇しており、これはミクログリアの活性化亢進と一致していた（Figure 4C, D）。

マウス腰椎解剖図およびL4、L5、L6椎骨の同定プロセス。
図1マウスにおける術後認知機能障害（POCD）モデル作製のためのL5腰椎椎弓切除術。 (AL5椎弓における手術標的および、隣接する椎骨レベル（L4–L6）にわたる術野の範囲の図解。B) L5腰椎椎弓切除術の主要な手順を示す術中写真。(a) 除毛後の腰部。脊椎正中線を確認し、矢印は予定している皮膚切開の方向を示す。(b) 腰椎上の正中皮膚切開。(c) 筋膜を切開し、傍脊柱筋を段階的に剥離して棘突起を露出させ、さらにL5棘突起および椎弓周囲の組織を清掃してL5椎弓を完全に露出させる。(d) L5椎弓の除去後のL5椎弓切除の状態。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

椎弓切除術対コントロール研究：移動経路、棒グラフ、歩行データの比較、実験結果。
図2: L5腰椎椎弓切除術後の運動能および歩行の評価。(A) 総移動距離と平均速度を示すオープンフィールドテスト (n = 10)。(B) ストライド長、立脚時間、遊脚速度、および足摺面積を示す歩行分析 (n = 6)。データは平均 ± SD で示す。統計的有意性は ns (有意差なし) として表示。略語：Control = コントロール群、Laminectomy = L5 椎弓切除群。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

迷路図と棒グラフを用いて、認知タスクのパフォーマンスにおける対照群と椎弓切除術の効果を分析します。
図3L5腰椎椎弓切除術後の認知行動アセスメント。 (A) 新規物体認識試験 (n = 10)。 (B新規アームY迷路試験（n = 10）。C) バーンズ迷路試験（n = 10）。データは平均値 ± 標準偏差（SD）を示す。統計的有意性は * で示す。P < 0.05, **P < 0.01、および***P < 0.001. 略語：Control = 対照群；Laminectomy = L5椎弓切除術群。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

椎弓切除術の結果；対照群および椎弓切除群におけるIBA1強度の組織像および棒グラフ。
図4L5腰椎椎弓切除術後における海馬CA1領域の組織学的評価。 (A) 海馬CA1領域におけるニッスル染色の代表的な画像。 (B) ニッスル陽性ニューロン（左）およびニッスル小体（右）の定量化（n = 5）。(C海馬CA1領域におけるIba1免疫蛍光染色の代表画像。スケールバー = 100 µm. (D) Iba1平均蛍光強度の定量化（n = 6）。データは平均値 ± 標準偏差（SD）で示す。統計的有意性は**で示す。P < 0.01、および***P < 0.001. 略語：Control = 対照群、Laminectomy = L5椎弓切除術群。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

脊椎手術を受けた高齢者において、術後認知機能障害が報告されています10。さらに、実験的な証拠により、加齢が手術に伴う認知機能低下および神経炎症反応への感受性を高めることが示されています11,12。本プロトコルでは、高齢マウスに約4時間のセボフルラン麻酔とL5椎弓切除術を組み合わせることで、早期術後認知機能障害をモデル化します。本手法の主な有用性は、脊椎手術後の行動学的および海馬組織学的変化を調査するための、実用的かつ簡便な手順を提供することにあります。

前臨床のPOCDモデルには、麻酔のみへの曝露、腹部手術、および整形外科的損傷のパラダイムが含まれます13。麻酔のみのパラダイムでは、外科的外傷のない状態での麻酔の効果を評価できますが14、麻酔と組織損傷への複合的な曝露を再現することはできません。腹部手術および脛骨骨折モデルは外科的損傷を伴い、手術関連認知機能障害の研究に使用されてきました15,16。しかし、これらの手術部位および組織損傷パターンは、脊椎手術のものとは異なります。外科的外傷の種類と強度は、術後の認知機能の結果および中枢性炎症反応に影響を及ぼす可能性があるため9、前臨床モデルを選択する際は手術の背景を考慮すべきです。したがって、本L5椎弓切除術プロトコルは、高齢マウスにおける術後早期の認知機能障害を調べるための、脊椎手術に関連した実験的パラダイムを提供します。

本プロトコルにおける主要な技術的課題は、硬膜への損傷を避けつつ、硬膜を明確に露出させるためにL5椎弓板から十分な骨を除去することです。直接視認下での椎弓切除術では、器具の到達深度、切削力、および眼科用剪刀の挿入角度を慎重に制御する必要があります。骨の除去は、椎弓の縁に沿って小さく制御された切開を段階的に繰り返して行う必要があります。ピンセットでL5棘突起を把持し、術野となる腰椎セグメントを手術台に対して約30°の角度に持ち上げることで、L5–L6の椎弓間腔を広げることができます。この操作により、剪刀の先端を骨縁の下に浅く挿入することが可能になり、硬膜に接触するリスクを低減できます。骨の除去が不十分な場合は術野の露出が制限され、一方で過剰に侵襲的な切削や過度な挿入深度は硬膜損傷を引き起こす可能性があります。制御不能な出血は術野を不鮮明にし、術後の回復を妨げ、行動結果のばらつきを増大させる恐れがあります。剪刀の先端を安全に挿入するための椎弓間腔が不十分な場合は、挿入深度を深くするのではなく、腰椎セグメントの位置と挙上角度を再調整してください。出血によって術野が不鮮明になった場合は、十分な視認性が回復するまで骨の除去を一時中断し、その後、残っている骨を漸増的に除去してください。

傍脊柱筋の剥離および L5 椎弓切除術は、術後の 一過性の疼痛の原因となる可能性があり、マウスを用いた実験的な椎弓切除術後に機械的過敏症が認められたことが報告されている17。メロキシカムは、あらかじめ定義された鎮痛レジメンに従って投与された。マウスにおける術後の疼痛に関連する顔面表情は、約 36–48 h 持続することが報告されている18。48 h の鎮痛レジメンは、この術後早期の期間をカバーすることを目的としており、術直後の疼痛による潜在的な影響を軽減するため、鎮痛レジメン完了後の術後 3 日目に認知行動テストを開始した。オープンフィールドテストは、実験的な POCD 研究において、自発的な運動能力を評価し、運動能力の低下が認知行動パフォーマンスに影響を及ぼしているかどうかを判断するために用いられてきた19,20。それに伴い、認知評価に先立ち、術後 3 日目にオープンフィールドテストと歩行分析を実施した。オープンフィールドでの運動能力または歩行パラメータにおいて、群間に有意な差は認められず、その後の認知行動上の差が主に顕著な運動障害によって説明される可能性は低いことが示唆された。しかし、術後の自発的な疼痛および創傷部位の不快感は直接評価されていないため、行動パフォーマンスへの残存影響を完全に排除することはできない。今後の研究では、術後の自発的な疼痛の直接的な評価を組み込むことが考えられる。

全体として、本プロトコルは、L5椎弓切除術後の高齢マウスにおける術後早期認知機能障害を調査するための実用的な実験的アプローチを提供するものである。本手法は、脊椎手術に関連する認知機能障害の行動学的結果および潜在的なメカニズムの解明に利用できるほか、術後認知機能障害の予防または軽減を目的とした介入策の評価にも活用できる。より大規模なコホートおよび独立した研究室での検証を行うことで、本モデルの安定性と再現性がさらに確立されると考えられる。

開示事項

著者は競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

浙江大学医学院コアファシリティプラットフォームのSanhua Fang氏、および浙江大学動物センターのYanhong Chen氏とXuliang Zhang氏による技術的支援に感謝いたします。本研究は、以下の基金より助成を受けて実施されました：中国国家自然科学基金（Nos. 82575196, 82074535, U23A20508）。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C57BL/6J オスマウスSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-0005動物モデル
ANY-maze Video Tracking SoftwareStoelting Co., USA6000行動ビデオトラッキングおよび解析
エリスロマイシン眼軟膏Beijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H11021270眼球乾燥の防止
精密ピンセットNANA皮膚の固定
ヒーティングパッドNANA温度制御
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology17198Iba1 免疫蛍光染色
吸入麻酔装置RWD Life Science Co., Ltd.R581S麻酔
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY2025112704歩容解析
眼科用マイクロ剪刀NANA骨の除去
ニッスル染色液Haoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033ニッスル染色
剪刀Shang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY00030皮膚切開
セボフルランShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.25062331麻酔
使い捨て手術用ドレープJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.20212140221手術操作用プラットフォーム
小動物用バリカンYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-03310除毛
手術用縫合糸・針Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603皮膚の縫合
Veet 除毛クリームRECKITT BENCKISER (India) LtdNA除毛

参考文献

  1. Zhao Q, Wan H, Pan H, Xu Y. Postoperative cognitive dysfunction-current research progress. Front Behav Neurosci. 2024;18:1328790.
  2. Kong H, Xu LM, Wang DX. Perioperative neurocognitive disorders: A narrative review focusing on diagnosis, prevention, and treatment. CNS Neurosci Ther. 2022;28(8):1147-1167.
  3. Monk TG, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery. Anesthesiology. 2008;108(1):18-30.
  4. Li X, et al. Risk factors for postoperative cognitive decline after orthopedic surgery in elderly Chinese patients: A retrospective cohort study. Clin Interv Aging. 2024;19:491-502.
  5. Krenk L, et al. Cognitive dysfunction after fast-track hip and knee replacement. Anesth Analg. 2014;118(5):1034-1040.
  6. Yang X, et al. Identification of individuals at risk for postoperative cognitive dysfunction (POCD). Ther Adv Neurol Disord. 2022;15:17562864221114356.
  7. Suraarunsumrit P, et al. Outcomes associated with postoperative cognitive dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Age Ageing. 2024;53(7):afae160.
  8. Lin X, et al. The potential mechanism of postoperative cognitive dysfunction in older people. Exp Gerontol. 2020;130:110791.
  9. Lu B, et al. Effects of different types of non-cardiac surgical trauma on hippocampus-dependent memory and neuroinflammation. Front Behav Neurosci. 2022;16:950093.
  10. Park S, et al. Preoperative mild cognitive impairment as a risk factor of postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing spine surgery. Front Aging Neurosci. 2024;16:1292942.
  11. Xu Z, et al. Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice. Sci Rep. 2014;4:3766.
  12. Zhang ZJ, et al. Aging alters Hv1-mediated microglial polarization and enhances neuroinflammation after peripheral surgery. CNS Neurosci Ther. 2020;26(3):374-384.
  13. Eckenhoff RG, et al. Perioperative neurocognitive disorder: State of the preclinical science. Anesthesiology. 2020;132(1):55-68.
  14. Guo LY, et al. Cognitive deficits after general anaesthesia in animal models: A scoping review. Br J Anaesth. 2023;130(2):e351-e360.
  15. Qiu LL, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species in the hippocampus might contribute to microglial activation in postoperative cognitive dysfunction in aged mice. Brain Behav Immun. 2016;51:109-118.
  16. Cibelli M, et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 2010;68(3):360-368.
  17. Yamamoto S, et al. Intraoperative spinal cord stimulation mitigates central sensitization after spine surgery in mice. Spine (Phila Pa 1976). 2023;48(11):E169-E176.
  18. Matsumiya LC, et al. Using the mouse grimace scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012;51(1):42-49.
  19. Sun L, et al. Activation of cannabinoid receptor type 2 attenuates surgery-induced cognitive impairment in mice through anti-inflammatory activity. J Neuroinflammation. 2017;14(1):138.
  20. Zhan G, et al. Anesthesia and surgery induce cognitive dysfunction in elderly male mice: The role of gut microbiota. Aging (Albany NY). 2019;11(6):1778-1790.

再版と許可

さらに記事を探す

脊椎手術モデルセボフルラン麻酔認知機能テスト海馬ニューロン損傷神経炎症性変化ニッスル染色Iba1免疫蛍光染色

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。