このプロトコルは、公開されたトランスクリプトミックデータセットと大腸上皮細胞の検証を統合し、炎症性腸疾患、大腸がん、膵腺癌に関連する共通バイオマーカーとしてS100Pを特定します。
研究記事
炎症性腸疾患、大腸がん、膵臓腺癌における共通バイオマーカーとしてのS100P:統合トランスクリプトミック解析
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
炎症性腸疾患(IBD)は大腸がん(CRC)および膵腺癌(PAAD)のリスク増加と関連していますが、これらの疾患に共通する分子的特徴はまだ完全には解明されていません。本研究は、統合トランスクリプトム解析と実験的検証を通じて、IBD、CRC、PAADに関連する共通遺伝子および生物学的経路を特定することを目的としました。IBD、CRC、PAADの遺伝子発現データセットは、がんゲノムアトラスおよび遺伝子発現オムニバスデータベースから取得されました。加重遺伝子共発現ネットワーク解析および差異発現解析を用いて、疾患関連および共通遺伝子の特定が行われました。遺伝子オントロジーおよび京都遺伝子・ゲノム百科事典(解析は、強化された生物学的機能や経路の探求に用いられました。免疫細胞浸透は、RNA転写産物の相対サブセットの推定による細胞型同定を用いて評価されました。一般的な遺伝子の診断性能を評価するために、受講者の動作特性分析が実施されました。S100Pの細胞分布を調べるために単細胞RNAシーケンス解析が行われました。さらに、S100Pダウンレギュレーションの効果は、リポ多糖(LPS)刺激された大腸上皮細胞で評価されました。合計162の疾患関連遺伝子と4つの一般的な遺伝子が同定されました。機能豊か解析では、インターロイキン17シグナル伝達経路を含む免疫および炎症関連経路の有意な濃縮が示されました。免疫浸潤解析では、IBD、CRC、PAADの複数の免疫細胞集団で同様の傾向が見られました。単細胞解析では、これら3つの疾患すべてにおいて上皮細胞におけるS100P発現の上昇が認められました。S100Pのダウンレギュレーションにより、LPS刺激された大腸上皮細胞の増殖能力が回復し、炎症性サイトカイン発現が減少しました。統合トランスクリプトミクス解析により、S100PがIBD、CRC、PAADに関連するバイオマーカーであることが特定され、これらの疾患に共通する免疫関連の特徴が浮き彫りになりました。
概要
炎症性腸疾患(IBD)は、潰瘍性大腸炎やクローン病を含む消化管に影響を与える免疫関連疾患のスペクトルを代表します。IBDの病因は非常に複雑で、粘膜免疫異常、細菌叢の乱れ、遺伝的感受性を含みます。IBDは発症率の増加と大きな経済的負担を伴う世界的な健康問題であり、その増加する有病率は大きな注目を集めています。重要なのは、IBD患者は大腸がん(CRC)3 および膵腺癌(PAAD)4の発症リスクが有意に高まることです。この関連は十分に記録されていますが、IBD、CRC、PAAD間の遺伝的なクロストークはまだ完全には解明されていません。
これまでの研究では、IBD、CRC、PAADが共通の病原性プロセスを共有していることが強く示唆されています。しかし、特異的かつ感度の高い診断バイオマーカーは依然として不足しており、共通の病原性メカニズムも完全には解明されていません。幸いにも、ハイスループットシーケンシング技術の急速な進歩と普及により、IBD、CRC、PAAD患者の多数のトランスクリプトミックデータセットが公開され、これらの疾患間の分子相互関係の体系的な調査が可能となりました。
本研究では、IBD、CRC、PAAD患者のハイスループットシーケンスデータを用いて、加重遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)および差別発現解析を用いて疾患関連および共有遺伝子を特定しました。これらの遺伝子はさらに調査され、IBD、CRC、PAAD間の共通シグナル伝達経路の可能性を特定しました。さらに、これらの共通遺伝子の診断価値も評価しました。単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)解析により、主要遺伝子S100Pが主に上皮細胞で発現していることが示されました。最後に、IBDにおけるS100Pの生物学的役割を調査しました。
結論として、本研究はIBD、CRC、PAADに関連する共通の診断バイオマーカーおよび生物学的経路を特定し、これらの疾患の共同予防と治療に関する貴重な臨床的知見を提供することを目指しました。
プロトコル
本研究では、がんゲノムアトラス(TCGA)および遺伝子発現オムニバス(GEO)からの公開された非特定データセット、ならびに確立された商業細胞株を用いました。新規募集されたヒト参加者、特定可能な患者情報、患者由来サンプルは含まれていません。すべての分析は、関連する機関ガイドラインおよび公開データベースの利用規約に従って実施されました。したがって、本研究には追加の倫理的承認やインフォームド・コンセントは必要ありませんでした。
データソース
IBDコホート(GSE179285;プラットフォーム:GPL6480およびGSE24287;プラットフォーム:GPL6480)、CRCコホート(TCGA-CRC;プラットフォーム:Illumina HiSeq 2000およびGSE87211;プラットフォーム:GPL13497)、およびPAADコホート(GSE128735;プラットフォーム:GPL20301およびGSE62452;プラットフォーム:GPL6244)のRNA-seqデータは、TCGAおよびGEOからダウンロードされました。すべてのデータセットは2025年12月5日にアクセスされました。
各データセットでは、サンプルを厳密に2つのサブグループに分け、疾患病変・腫瘍組織が症例群、対応する非病変の正常組織が対照群として割り当てられました。具体的には、IBDコホートにはIBD患者の腸粘膜サンプルが297件、健康な個人からは正常腸粘膜サンプルが56件含まれていました。CRCコホートには841の原発性大腸腫瘍組織と、211の適合する正常な大腸上皮組織が含まれていました。PAADコホートは114のPAAD腫瘍組織と106の正常膵臓実質組織で構成されていました。
同じ疾患カテゴリー内のすべてのデータセットは一様に統合されました。limmaパッケージの正規化BetweenArrays関数を適用し、クロスサンプル分位数正規化を行い、プラットフォーム間バッチ効果を効果的に排除し、異なるデータセット間で遺伝子発現値を標準化し、その後の差分発現解析に備えました。
IBD、CRC、PAAD関連遺伝子および一般的な遺伝子のスクリーニング
まず、IBD、CRC、PAADのコホートからLIMMAパッケージを用いて差分発現遺伝子(DEGs)をスクリーニングし、元の P 値はBenjamini-Hochberg偽発見率(FDR)法で補正しました。IBD、CRC、PAADのコホートでは、スクリーニング基準は|logFC|> 0.4、 P < 0.05。さらに、WGCNAはすべての遺伝子に対して実施され、最小モジュール遺伝子閾値100(ソフト閾値パワー=0.90;ネットワークタイプ=符号付き)でした。その結果、3つのコホートで共通のDEGおよびモジュール遺伝子が同定されました。両方の方法で一貫して同定された遺伝子は共通遺伝子として定義され、残りの遺伝子は関連遺伝子として分類されました。
PPIと機能豊化分析
これらの解析は疾患関連遺伝子に対して行われました。タンパク質間相互作用(PPI)解析はSTRINGデータベースを用いて行われました(相互作用スコア>0.40)。機能豊か解析には、clusterProfiler、enrichplot、orgを用いて行われたGene Ontology(GO)および京都Genes and Genomes百科事典(KEGG)解析が含まれます。Hs.eg.dbパッケージ(P < 0.05およびFDR調整後の q 値[ベンジャミニ–ホッホバーグ法]<0.05)。
免疫マイクロ環境プロファイリング
CIBERSORTは、デフォルトのLM22シグネチャマトリックス7を用いて遺伝子発現データから免疫細胞浸透レベルを推定する信頼性の高いアルゴリズムです。本研究では、CIBERSORTアルゴリズムを用いてIBD、CRC、PAADの各コホートサンプルにおける免疫細胞浸透の程度を推定し、これら3つの疾患における免疫微小環境の共通特性を探りました。分析は1,000回の置換で各サンプルの P 値を算出し、混合表現ファイルには分位数正規化(QN = TRUE)を適用しました。CIBERSORT P 値<0.05のサンプルのみが後続解析のために保持され、デコンボリューション結果の信頼性が保証されました。
共通遺伝子の診断価値の評価
IBD、CRC、PAADコホートにおける共通遺伝子の診断価値は、rのpROCパッケージを用いた受講者動作特性(ROC)解析を用いて評価されました。感度と特異度の最適なトレードオフはROC曲線を用いて可視化されました。
qRT-PCR、細胞トランスフェクション、コロニー形成アッセイ
qRT-PCRおよび細胞トランスフェクションは、先行研究8,9,10に基づいて実施されました。一時的トランスフェクションは、メーカーの指示に従いjetPRIMEトランスフェクション試薬(ポリプラス、中国)を用いて行われました。細胞はトランスフェクション混合物と6時間インキュベートされ、その後培地は完全なDMEMに置き換えられました。その後の実験はトランスフェクションから48時間後に行われました。
簡単に、TRIzol試薬を用いて全細胞RNAを抽出しました。RNAはPrimeScript RT Master Mixを用いて逆転写されcDNAに変換されました。定量PCRはTB Green qPCRを用いて実施されました。βアクチンは発現正規化の内部参照遺伝子として用いられました。生物学的実験は三つに分けて行われました。プライマー配列とsiS100P配列は、 以前の研究で確認できます。
NCM460、FHC、HCT116、SW116、PANC1、BXPC2細胞は 材料表に記載されているように得られました。すべての細胞株は細胞同定とマイコプラズマ検査を受けました。
実験中、すべての細胞は3〜5世代にわたって伝達されました。すべての細胞は胎児用牛血清10%とペニシリン・ストレプトマイシン1%を含む完全なDMEMで培養されました。
コロニー形成アッセイは、以前の研究で説明された通りに実施されました。簡単に言えば、6ウェルプレートの各ウェルに 1,000 個の細胞がシードされ、10日間培養された後、実験は終了しました。細胞は4%のパラホルムアルデヒドで固定され、0.1%の結晶バイオレットで染色され、ImageJを用いてコロニー数えました。
scRNA-seqデータに基づく共通遺伝子の解析
IBDデータセット(GSE214695)、CRCデータセット(GSE166555)、PAADデータセット(GSE154778)からのscRNA-seqデータは、前回の研究で記述された通りに前処理されました8,13。生カウント行列は、limma::averepsを用いた重複遺伝子記号の平均発現で折りたたみました。初期のフィルタリングにより、少なくとも3つの細胞および少なくとも50個の固有の転写産物を含む細胞で検出された遺伝子が保持されました。ミトコンドリア転写物の割合が50個未満>検出された遺伝子を除去した。ログ正規化はスケールファクター10,000で行われ、その後分散安定化変換を用いて、主成分解析(PCA)前にZスコア標準化された上位1,500の高変動遺伝子を特定しました。クラスター定義マーカー遺伝子は、log2(fold変化)>0.5、検出分数≥ターゲットクラスターでの検出分数0.25、調整済みP値<0.05を用いてフィルタリングしました。
簡単に言うと、データの前処理はSeuratパッケージを使い、セルタイプの注釈はSingleRパッケージ(バージョン2.6.0)を使って行われました。セルクラスタリングは、PCA次元1–20に基づくk近傍グラフ構築とt-SNE埋め込みを用いてSeuratで実施されました。次に、共通遺伝子の異なる細胞型における分布と発現レベルを調べました。
IBDモデルの構築
先行研究14によると、リポ多糖(LPS)は正常なヒト大腸上皮細胞(FHCおよびNCM460)で炎症を誘導するために用いられ、炎症を模倣するIBDモデルを生成しました。生物学的実験は三つに分けて行われました。細胞は通常、37°Cの加湿インキュベーターで5%のCO2で培養しました。細胞コンフルンが約50%〜70%に達した時点で、培養培地を新鮮な完全培地に交換し、細胞は12時間の10 ng/mL LPSで処理されました。車両対照として、同量の無菌リン酸塩緩衝生食塩水(PBS)が使用されました。培養体積は6ウェルプレートで1ウェルあたり2 mLでした。処理後、培地を除去し、細胞を予備冷却した無菌PBSで2回洗浄し、その後の解析のために細胞を収集しました。
統計解析
すべてのバイオインフォマティクス解析はRソフトウェア(バージョン4.1.2)を使用して実施されました。2つのグループ間の比較は学生の t検定を用い、複数グループ間の比較は一方分散分析(ANOVA)を用いて行われました。相関解析はスピアマン法を用いて行われました。すべての細胞実験は少なくとも3回繰り返し行われ、データは平均±標準偏差(SD)として提示されています。 P 値またはFDR<0.05は統計的に有意とみなされました。NS(新星)は重要ではありません。 P < 0.05(*)、 P < 0.01(**)、 P < 0.001(***)です。
結果
IBD、CRC、PAADにおけるDEGs
まず、IBDコホート(GSE179285およびGSE24287)、CRCコホート(TCGA-CRCおよびGSE87211)、およびPAADコホート(GSE128735およびGSE62452)を統合し、PCAおよび遺伝子発現密度プロットを用いて統合評価しました。結果は、異なるデータセット間のバッチ効果が統合後に効果的に除去されることを示しました(図1A–F)。
図1。炎症性腸疾患(IBD)、大腸がん(CRC)、膵腺癌(PAAD)コホートの正常化。 (A) IBDコホート(GSE179285およびGSE24287)の正規化前後の主成分解析(PCA)プロット。(B) IBDコホートの正規化前後の遺伝子発現分布図。(C) CRCコホート(TCGA-CRCおよびGSE87211)の正規化前後のPCAプロット。(D) CRCコホートの正規化前後の遺伝子発現分布をプロットします。(E) PAADコホート(GSE62452およびGSE128735)の正規化前後のPCAプロット。(F) PAADコホートの正規化前後の遺伝子発現分布図。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
データセット統合およびバッチ効果補正の後、IBD、CRC、PAADコホートに対して差異発現解析が実施されました。各コホート内で、疾患病変や腫瘍組織を適合した正常組織と比較し、DEGを特定しました。IBDコホートでは183のDEGが同定され、そのうち64はダウンレギュレーション遺伝子、119はアップレギュレーション遺伝子でした(図2A)。CRCコホートでは5,064のDEGが同定され、そのうち2,477個がダウンレギュレーションされた遺伝子と2,587個がアップレギュレーションされた遺伝子でした(図2B)。PAADコホートでは2,293のDEGが同定され、そのうち901個がダウンレギュレーション遺伝子、1,392個がアップレギュレーションされた遺伝子が含まれていました(図2C)。最終的に、IBD、CRC、PAADのコホート間で40の重複DEGが特定されました(図2D)。
図2。IBD、CRC、PAADコホートの差別発現解析。 (A) IBDコホートにおける差異発現遺伝子(DEGs)のヒートマップおよび火山プロット。(B) CRCコホートにおけるDEGsのヒートマップおよび火山プロット。(C) PAADコホートにおけるDEGのヒートマップおよび火山プロット。(D) IBD、CRC、PAADコホート間の重複するDEGを示すベン図。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
IBD、CRC、PAADにおけるWGCNA
WGCNAはIBD、CRC、PAADのコホートで実施されました。IBDコホートでは、臨床特性と密接に関連する3つのモジュールが特定され、MEブラウンおよびMEturquoiseモジュールが最も強い相関を示しました(図3A)。同様に、CRCコホートでは8つのモジュールが臨床特性と密接に関連しており、MEbrownおよびMEturquoiseモジュールが最も強い相関を示しました(図3B)。PAADコホートでは、1つのモジュールが臨床的特徴と密接に関連しており、MEblackおよびMEbrownモジュールが最も強い相関を示しました(図3C)。
図3。IBD、CRC、PAADコホートの加重遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)。 (A) IBDコホートにおける遺伝子共発現モジュールと臨床形質の相関を示すヒートマップ。(B) CRCコホートにおける遺伝子共発現モジュールと臨床形質との相関を示すヒートマップ。(C) PAADコホートにおける遺伝子共発現モジュールと臨床形質の相関を示すヒートマップ。(D) IBD、CRC、PAADの各コホートにおける主要な共発現モジュールから同定された重複遺伝子を示すベン図。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
臨床形質と有意に関連するモジュール遺伝子に基づき、IBD、CRC、PAADに関与する可能性のあるモジュール関連遺伝子434が同定されました(図3D)。
IBD、CRC、PAADにおける共通遺伝子の機能豊か解析
差異発現解析とWGCNAの結果を組み合わせることで、40の共通DEGと122の共通モジュール関連遺伝子が同定されました。IBD、CRC、PAADの共通分子特性を調査するために、これらの遺伝子を統合してさらなる解析を行い、158の疾患関連遺伝子が得られました。
まず、158の遺伝子をSTRINGデータベースを用いて解析し、PPIネットワークを構築しました(図4A)。その後、GOおよびKEGG濃縮解析が実施されました。GO解析ではホルモン代謝過程を含む生物学的プロセスの有意な濃縮が示され(図4B,C)、一方でKEGG解析では白血間白イキン17(IL-17)シグナル伝達経路およびペルオキシソーム増殖物質活性化受容体(PPAR)シグナル伝達経路の濃縮が示されました(図4D,E)。
図4。IBD、CRC、PAADで同定された疾患関連遺伝子の機能豊か解析。 (A) 疾患関連遺伝子のタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク。(B) 遺伝子オントロジー(GO)濃縮解析は、濃縮された生物学的プロセス、細胞成分、分子機能項のドットプロットとして提示されました。(C) 強化されたGO用語と関連遺伝子の関係を示すGO遺伝子–概念ネットワーク。(D) 京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路富集解析をドットプロット形式で提示。(E) 濃縮経路と関連遺伝子間の関係を示すKEGG遺伝子経路ネットワーク。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
IBD、CRC、PAADにおける免疫細胞浸潤と共通遺伝子の相関解析
CIBERSORTはIBD、CRC、PAADコホートにおける免疫細胞浸潤レベルを推定するために用いられました。IBDコホートでは、正常サンプルとIBDサンプル間で免疫細胞浸潤レベルの違いが観察され(図5A)、共通遺伝子と免疫細胞集団との相関が評価されました(図5B)。同様に、CRCコホートにおける正常サンプルとCRCサンプル間で免疫細胞浸潤レベルの違いが観察され(図5C)、共通遺伝子と免疫細胞集団との相関が評価されました(図5D)。PAADコホートでは、正常サンプルとPAADサンプル間で免疫細胞浸潤レベルの違いも観察され(図5E)、共通遺伝子と免疫細胞集団の相関も評価されました(図5F)。
図5。IBD、CRC、PAADコホートにおける免疫細胞浸潤解析。 (A) IBDコホートにおける免疫細胞集団の推定割合を示すバイオリンプロット。(B) IBDコホートにおける共通遺伝子と免疫細胞集団間の相関解析、免疫細胞相関ヒートマップおよび遺伝子–免疫細胞関連ネットワークを含む。(C) CRCコホートにおける免疫細胞集団の推定割合を示すバイオリンプロット。(D) CRCコホートにおける共通遺伝子と免疫細胞集団間の相関解析、免疫細胞相関ヒートマップおよび遺伝子–免疫細胞関連ネットワークを含む。(E) PAADコホートにおける免疫細胞集団の推定割合を示すバイオリンプロット。(F) PAADコホートにおける共通遺伝子と免疫細胞集団間の相関解析、免疫細胞相関ヒートマップおよび遺伝子–免疫細胞関連ネットワークを含む。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
IBD、CRC、PAADにおける共通遺伝子の潜在的価値評価
共通遺伝子の発現パターンは、IBD、CRC、PAADコホートでさらに評価されました。S100Pは3つのコホートすべてで一貫して過剰発現していました(図6A、D、G)。さらに、共通遺伝子の診断性能はROC解析を用いて評価されました。
図6。IBD、CRC、PAADコホートにおける共通遺伝子の診断性能。 (A) IBDコホートにおけるFXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1の発現レベル。(B) IBDコホートにおける個々の共通遺伝子の診断性能を示す受講者動作特性(ROC)曲線。(C) IBDコホートにおける統合診断モデルの診断性能を示すROC曲線。(D) CRCコホートにおけるFXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1の発現レベル。(E) CRCコホートにおける個々の共通遺伝子の診断性能を示すROC曲線。(F) CRCコホートにおける統合診断モデルの診断性能を示すROC曲線。(G) PAADコホートにおけるFXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1の発現レベル。(H) PAADコホートにおける個々の共通遺伝子の診断性能を示すROC曲線。(I) PAADコホートにおける統合診断モデルの診断性能を示すROC曲線。該当する場合は、曲線下面積(AUC)および対応する95%信頼区間を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
IBDコホートでは、FXYD3で曲線下面積(AUC)が0.626、S100Pが0.597、PLA2G2Aが0.670、MUC1が0.697でしたが、統合診断モデルではAUCが0.815となりました(図6B、C)。同様に、CRCコホートでは、FXYD3のAUC値が0.839、S100Pが0.738、PLA2G2Aが0.716、MUC1が0.672でしたが、統合診断モデルではAUCが0.925でした(図6E、F)。PAADコホートでは、FXYD3のAUC値は0.852、S100Pの0.896、PLA2G2Aの0.637、MUC1の0.733であり、統合診断モデルではAUCは0.901でした(図6H,I)。
共通遺伝子に基づくscRNA-seq解析
IBDデータセットのscRNA-seqデータの前処理を経て、17の細胞クラスターと8の細胞タイプが特定されました。共通遺伝子の異なる細胞集団間の分布を評価したところ、共通遺伝子は主に上皮細胞で発現していることが判明しました(図7A)。同様に、CRCデータセットの前処理では20の細胞クラスターと8の細胞タイプが特定され、共通遺伝子も主に上皮細胞で発現しています(図7B)。最後に、PAADデータセットの前処理により19の細胞クラスターと7の細胞型が特定され、共通遺伝子も同様に主に上皮細胞で発現しました(図7C)。
図7。IBD、CRC、PAAD組織における一般的な遺伝子の単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)解析。 (A) IBDデータセットにおけるセルクラスターの一様多様近似および投影(UMAP)可視化(GSE214695)、対応するセルタイプ注釈、および細胞集団におけるFXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1の表現を示す特徴プロット。(B) CRCデータセット内の細胞クラスターのUMAP可視化(GSE166555)、対応する細胞タイプ注釈、および細胞集団におけるFXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1の発現を示す特徴図。(C) PAADデータセット内の細胞クラスタのUMAP可視化(GSE154778)、対応するセルタイプ注釈、および細胞集団におけるFXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1の発現を示す特徴プロット。色のスケールは相対的な遺伝子発現レベルを示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
IBDにおけるS100Pの生物学的機能
IBD、CRC、PAADの各コホートでS100Pの一貫した過剰発現と、CRCおよびPAADにおけるS100Pの役割を記述した過去の報告を踏まえ、本研究はIBDにおけるS100Pの生物学的機能をさらに調査しました。
まず、LPS誘導IBDモデルでS100P発現が有意に増加し、siS100Pのノックダウン効率が確認されました(図8A,B)。さらに、LPS処理は細胞増殖を抑制し、S100P発現の阻害は細胞増殖を部分的に回復させました(図8C)。さらに、S100PノックダウンはIBDモデル細胞株FHCおよびNCM460におけるIL-1β、IL-6、TNF-αの発現を有意に減少させました(図8D,E)。最後に、S100Pのダウンレギュレーションにより、大腸上皮細胞、CRC細胞、PAAD細胞におけるIL17RA発現が減少しました(図8F)。
図8。S100Pのダウンレギュレーションは、大腸上皮細胞におけるリポ多糖(LPS)誘発性炎症反応を弱めます。 (A) LPS刺激およびS100Pノックダウン後のFHC細胞における相対的なS100P mRNA発現。(B) LPS刺激およびS100Pノックダウン後のNCM460細胞における相対的なS100P mRNA発現。(C) LPS刺激およびS100Pノックダウン後のFHCおよびNCM460細胞における細胞増殖の代表的なコロニー形成画像および定量化。(D) LPS刺激およびS100Pノックダウン後のFHC細胞におけるIL-1β、IL-6、TNF-αレベルのELISA測定。(E) LPS刺激およびS100Pノックダウン後のNCM460細胞におけるIL-1β、IL-6、TNF-αレベルのELISA測定。(F) FHC、NCM460、HCT116、SW1116、PANC-1、BxPC-3細胞におけるS100Pノックダウン後のIL-17RA mRNA発現の相対。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
データの利用可能性
本研究で分析されたデータセットは、TCGAおよびGEOリポジトリでTCGA-CRC、GSE179285、GSE24287、GSE87211、GSE128735、GSE62452、GSE214695、GSE166555、GSE154778の登録番号で公開されています。本研究では新たなシーケンシングデータセットは生成されませんでした。
ディスカッション
これまでの研究では、免疫関連の消化器疾患であるIBDが、神経変性疾患17、多発性硬化症18、筋萎縮性側索硬化症19、子宮内膜症20、関節リウマチ2、ホジキンリンパ腫21、CRC22、PAAD23など、いくつかの疾患と関連していることが強調されています。IBDは一般的にCRC24 およびPAAD23の発症リスクを高めると考えられています。これらの疾患間の疫学的関連は報告されていますが、共通する分子特性はまだ完全には解明されていません。本研究では、バルクトランスクリプトミクスデータセット、scRNA-seqデータ、細胞機能実験を統合し、IBD、CRC、PAAD間の共通分子特徴を調査しました。本研究結果は、これらの疾患環境で共有される分子および免疫関連の特性についてさらに洞察を提供します。
本研究では、差異発現解析とWGCNAを通じて158の疾患関連遺伝子を特定し、40の共通DEGsと122の共通モジュール関連遺伝子を含みます。機能豊化解析により、IL-17シグナル伝達経路を含む経路の有意な濃縮が示されました。過去の研究では、IL-17シグナル伝達がIBD、CRC、PAADの進行に重要な役割を果たすことが報告されています。これらの観察は、IL-17に関連するプロセスがこれらの疾患に共通する生物学的特徴である可能性を示唆しています。しかし、本研究ではS100PとIL-17シグナル伝達の機構的関係を直接調査しておらず、この関連を明らかにするためには追加の機能的研究が必要です。分析されたデータセット全体で4つの共通遺伝子(FXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1)が同定されました。過去の研究では、FXYD3がPAAD細胞の増殖を調節することが示されています。28、S100PはCRCおよびPAADの進行に関与していることが示されています。15,16、MUC1はIBD、CRC、PAADの進行に関与しています。対照的に、3つの疾患すべてでPLA2G2Aはあまり広範に調査されていません。ROC解析により、4つの遺伝子それぞれが測定可能な診断性能を示し、統合診断モデルは個々の遺伝子よりも高い診断性能を示していることが示されました。したがって、我々の発見は、IBD、CRC、PAAD全体で共通の分子特徴としてこれらの遺伝子を特定することで、これまでの観察を拡張しています。
免疫細胞浸潤解析では、未熟B細胞、安静自然キラー(NK)細胞、M0マクロファージにおいて、IBD、CRC、PAADの各コホートで同様の浸潤パターンが示されました。さらに、scRNA-seq解析ではFXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1が主に上皮細胞で発現していることが示されました。これらの発見は、同定された遺伝子の細胞分布および免疫関連特性との潜在的な関連について追加情報を提供します。しかし、本解析では上皮細胞と免疫微小環境との直接的な相互作用を確立できておらず、さらなる機構的研究が必要です。
最後に、LPS誘発炎症模倣IBDモデルにおけるS100Pの生物学的役割を調査しました。LPS刺激後、S100Pの発現は有意に増加し、siRNA介在のノックダウンによって発現が効果的に減少しました。実験条件下で、S100Pノックダウンは細胞増殖を部分的に回復させ、炎症性サイトカインであるIL-1β、IL-6、TNF-αの発現を低減させました。さらに、S100PのダウンレギュレーションはIL17RA発現の減少と関連していました。これらの発見は、炎症関連細胞応答におけるS100Pのさらなる研究を支持しています。
この研究にはいくつかの制限があります。まず、機能喪失実験のみが行われ、過剰発現や救済実験は行われませんでした。したがって、S100Pの直接的な因果関係は確立できません。次に、S100Pの発現は主にmRNAレベルで評価され、タンパク質レベルの検証は行われませんでした。第三に、機能的実験は炎症模倣細胞モデルに限定され、CRCおよびPAADモデルは実験的に調査されませんでした。最後に、マルチオミクス解析により共通の分子特徴の同定が強化されましたが、S100Pおよび他の共有遺伝子の生物学的役割をさらに明確にするためには、さらなる機構研究と生体内での検証が必要です。
結論として、本研究はIBD、CRC、PAADにおける共通分子特徴、生物学的経路、免疫関連特性を特定しました。4つの共通遺伝子(FXYD3、S100P、PLA2G2A、MUC1)は解析データセット全体で診断の可能性を示し、S100Pは炎症模倣IBDモデルでさらに調査されました。これらの発見は、IBD、CRC、PAADを結びつける共通の分子メカニズムを調査する今後の研究の基盤を提供します。
開示事項
利益相反:
著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。
謝辞
著者らは中国国家重点研究開発計画(助成金番号2023YFB3210400)からの財政支援を感謝します。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
参考文献
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