本プロトコルでは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）/受容体活性修飾タンパク質1（RAMP1）経路を介して肺の第2群自然リンパ球（ILC2s）を調節することにより、Kechuanting 穴貼療法（KAST）がタイプ2気道炎症に及ぼす治療メカニズムを評価するための、オバムチン（OVA）誘発アレルギー性喘息（AA）マウスモデルの作製について記述します。
研究記事
刻泉穴への貼付療法は、ILC2数の調節を介して、アレルギー性喘息マウスにおける2型気道炎症を軽減する
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
穴位贴敷疗法（KAST）は、アレルギー性喘息（AA）患者における気道炎症を効果的に改善することが示されていますが、その詳細なメカニズムはまだ明らかになっていません。本研究では、神経免疫学的視点から、AAマウスモデルにおけるKASTの治療メカニズムを調査することを目的としました。オバルブミン（OVA）誘発アレルギー性喘息マウスモデルを作製し、マウスにKASTを施しました。KASTが肺の第2群自然リンパ球（ILC2s）および2型気道炎症に及ぼす影響を、フローサイトメトリー、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色、および免疫組織化学を用いて評価しました。肺組織におけるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）タンパク質レベルの評価には、ウェスタンブロッティング（WB）およびELISAを用いました。CGRP/受容体活性修飾タンパク質1（RAMP1）経路がILC2sおよび2型気道炎症に及ぼす調節的役割を調べるため、アレルギー性喘息マウスにCGRPまたはCGRP受容体阻害剤であるBIBN-4096を鼻腔内投与しました。KASTはILC2sの数を減少させ、2型気道炎症を緩和し、それに伴い肺組織におけるCGRPの発現が低下しました。CGRPの鼻腔内投与は、肺におけるRAMP1+ILC2sおよび総ILC2sを増加させ、2型気道炎症を悪化させました。逆に、BIBN-4096の鼻腔内投与は肺のILC2sを減少させ、2型気道炎症を軽減しました。薬理学的阻害による裏付けから、KASTはCGRP/RAMP1経路のダウンレギュレーションと、それに続く肺ILC2sの抑制に密接に関連して、アレルギー性喘息における気道炎症を軽減することが示唆されました。
概要
アレルギー性喘息（AA）は喘息の中で最も一般的な表現型であり、中国における全喘息症例の60～80%を占めています1。AAは有病率が高く、疾患コントロールが不十分であるため、患者のクオリティ・オブ・ライフ（QOL）を著しく損ない、多大な経済的負担をもたらすことが特徴です2,3,4,5。吸入ステロイド薬（ICS）が依然として臨床治療の主軸となっていますが6、一部の患者では反応が限定的であり、長期使用はしばしば副作用や疾患進行を停止できないことに関連しています7。したがって、安全で効果的な新規治療戦略の開発は、臨床および研究の両面において優先事項となっています。中医学の外用療法である克川亭穴貼療法（KAST）は、有効成分を経皮的に届けるため、潜在的に肝初回通過効果を回避し、全身的な副作用を最小限に抑えることができます8,9。臨床研究により、KASTが喘息症状を緩和し、肺機能を部分的に回復させ、患者のQOLを向上させることが示されています10,11,12。同時に、血清メタボロミクス、ネットワーク薬理学、および喘息モデルを用いた動物実験により、KASTはIgE、IL-4、IL-13の発現を抑制することを含む、血清および気管支肺胞洗浄液（BALF）中の炎症性メディエーターレベルを低下させることで、気道炎症を減弱させることが示唆されています9,13,14。総合すると、これらの知見は喘息におけるKASTの治療効果を支持する根拠となります。しかし、その詳細な作用機序は依然として不明です。
AA再発を促進する核心的な病理学的メカニズムの一つにタイプ2気道炎症があり、そこでは第2群自然リンパ球（ILC2s）が重要な役割を果たしている15。アレルゲン刺激を受けると、ILC2sはIL-5やIL-13などのサイトカインを分泌し、それによって気道炎症を誘導する16,17。ILC2sを枯渇させると喘息マウスの気道炎症が著しく軽減されることが研究で示されており、疾患の進行におけるILC2sの中心的な役割が強調されている18。特に、ILC2sの活性化と機能は複数のメカニズムによって厳密に調節されており、近年では神経免疫相互作用が注目を集めている。新たな知見により、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）がILC2s表面の受容体活性修飾タンパク質1（RAMP1）に結合し、ILC2sの活性化とその後のタイプ2サイトカインの放出を誘導することで、AAにおける気道炎症を悪化させることが示唆されている19,20,21。本研究では、ハイスループットRNAシーケンシング（RNA-seq）スクリーニングにより、KAST介入によって強く調節される極めて反応性の高いニューロペプチドとしてCGRPを同定した。したがって、CGRP/RAMP1経路に着目し、AAマウスにKAST介入を行い、ILC2活性の調節およびタイプ2気道炎症の軽減における潜在的なメカニズムを調査した。
プロトコル
すべての動物実験は、全米科学アカデミーが発行した「実験動物の飼育および使用に関するガイド」に従って実施されました。本プロトコルは、南京中医学大学附属病院の動物倫理委員会によって承認されました（承認番号：2023DW-059-01）。本研究で使用したすべての材料、試薬、ツール、およびソフトウェアの包括的なリストは、材料表に詳しく記載されています。
実験動物および群分け
健康な雌性のBALB/cマウス（SPFグレード、8～10週齢）を、南京中医学大学実験動物センター（ライセンス番号：SYXK (Su) 2018-0049）より入手した。動物は、24～26 °C、12時間の明暗サイクルという標準条件下で飼育した。滅菌した飼料と水は自由摂取させ、床材は定期的に交換し、ケージは日常的に清掃した。7日間の馴化期間後、マウスをランダムに6群（各群 n = 7）に分けた：正常群、モデル群、CGRP群、BIBN-4096群、KAST群、およびKAST + CGRP群。動物の群分けには、コンピュータで生成した乱数表を用いてランダムに割り当てた。介入が割り当てられるまで、群の割り当ては研究者に秘匿した。組織の利用を最適化するため、ランダム化されたコホート（各群 n = 7）から得られた肺サンプルを、異なる処理経路に体系的に割り当てた。特定の組織学的および分子生物学的アッセイにおける正確な解析サンプル数（n = 5、4、または3）については、それぞれの図の説明文に明記した。解析から除外されたデータはなかった。
KAST製剤の調製
本製剤は、南京中医药大学附属医院の薬剤部によって調製された22。使用された9種類の伝統的な中薬生薬は、白芥子子（2部）、延胡索（2部）、酢制甘遂（1部）、細辛（1部）、麻黄（1部）、萊菔子（1部）、丁香（1部）、肉桂（1部）、および皂莢（1部）である。各生薬を微粉末に研磨し、80メッシュのふるいにかけた。混合粉末100 gに対し、新鮮な生姜汁70 mLと液体パラフィン30 mLを添加し、十分に混合した後、直径0.5 cm、重量0.3 g ± 5%のパッチに加工した。具体的に、すべての生薬成分および新鮮な生姜は、主任薬剤師のLin-gang Zhaoによって鑑定され、使用前に暗所で乾燥した4 °Cの環境で保存された9。介入の再現性とバッチ間の安定性を保証するため、当チームで確立したUPLC-Q-TOF-MSおよびHPLC法に基づいた厳格な品質管理基準を適用し、sinapine thiocyanateなどの主要な活性マーカーが一定に存在することを確認した23。実際の手順では、経皮吸収を最適化するため、0.5 cmのパッチを2.5 cm × 5.5 cmの医療用低刺激性通気性粘着テープで固定した。
AAマウスモデルの作製
AAモデルは、OVA感作および鼻腔内投与による既存の文献プロトコルに従って作製した24。Normal群を除き、すべてのマウスに、100 µg OVAおよび2 mg 水酸化アルミニウムを含む生理食塩水 200 µL を、0日目と12日目に腹腔内投与して感作させた。18日目から23日目まで、50 µL の生理食塩水に溶解した 50 µg OVA を1日1回、鼻腔内に投与した。24日目から53日目まで、OVAを1日おきに鼻腔内投与した。54日目にマウスの体重を測定した後、頚脱臼により安楽死させ、組織を採取した。その後、総肺重量を体重で除して肺係数を算出した。
介入
40日目から53日目まで、KAST群およびKAST + CGRP群のマウスの背部3 cm × 6 cmの範囲を除毛した。左右の肺俞（BL13）、膈俞（BL17）、脾俞（BL20）、および腎俞（BL23）のツボにパッチを貼付し、粘着テープで固定して、1日1回1.5時間、14日間連続で処置を行った。CGRP群およびKAST + CGRP群のマウスには、40日目から53日目まで、10 µLのCalcitonin/CALCA溶液（1 pg/µL）を隔日で経鼻投与した。BIBN-4096群のマウスには、10 µLのBIBN-4096溶液（0.3 mg/mL、CGRP受容体拮抗薬）を隔日で経鼻投与した。正常群およびモデル群には、介入を行わず標準的な飼育を行った。KASTは、アレルギー性気道炎症の確立後（18日目の初回OVA感作から22日後の40日目より開始）、40日目から53日目まで投与した。したがって、本研究におけるKASTは予防的介入ではなく、治療的介入として作用した。
皮膚の準備として、電動バリカンを用いて指定された背部領域の除毛を行った。ツボの定位は、中国針灸学会が発行した「実験動物のツボの名称および部位－第3部：マウス (T/CAAM 0002-2020)」の標準に厳密に従った。左右対称な4組の背部部位を正確にマークし、次のように定義した：肺俞（BL13：第3胸椎棘突起下の肋骨間、正中線から外側に 3 mm）、膈俞（BL17：第7胸椎棘突起下、正中線から外側に 3 mm）、脾俞（BL20：第12胸椎棘突起下、正中線から外側に 3 mm）、および腎俞（BL23：第2腰椎棘突起下、正中線から外側に 3 mm）。3Mテープをきつく巻き付けて安定した密着性を確保し、1.5 h の貼付期間中にパッチのずれや二次的な皮膚浸食が起こらないようにした。
CGRP/CALCA（1 pg/µL、マウス1匹あたり10 µL）およびBIBN-4096（0.3 mg/mL、マウス1匹あたり10 µL）の投与量は、既報の研究25に基づいて選択した。具体的に、CGRP介入においては、1 mgのBSAを1 mLのddH2Oに溶解し、ボルテックスを用いて最終濃度1 mg/mLの0.1% BSA溶液を調製した。再構成させる前に、凍結乾燥されたCalcitonin/CALCAタンパク質粉末を4 °Cで12,000 × gにて30秒間遠心分離した。その後、調製した0.1% BSA溶液を20 µL加え、1 µg/µLのストック溶液とした。バイアルを数回ゆっくりと転倒混和し（ボルテックスは使用しない）、数秒間スピンダウンした後、タンパク質を完全に再構成させるため室温で数分間放置した。扱い不可能なほど大量の溶液を一段階で調製することを避けるため、標準的な2段階の連続希釈により1 pg/µLのワーキングソリューションを調製した。まず、1 µg/µLのストック溶液1 µLを滅菌生理食塩水999 µLで希釈して1 ng/µLの中間溶液を作成し、次に、この中間溶液1 µLをさらに滅菌生理食塩水999 µLと混合して、最終的な1 pg/µLのワーキングソリューションとした。ワーキングソリューションは4 °Cで保持し、残りの分注分は-20 °Cで最大2～3ヶ月間保存した。BIBN-4096群では、1 mgのBIBN-4096粉末を333 µLのddH2Oに溶解して3 mg/mLのストック溶液を得て、1バイアルあたり50 µLずつ分注し、-80 °Cで保存した。0.3 mg/mLのワーキングソリューションを調製するため、ストック溶液の50 µLの分注分をそれぞれ450 µLの滅菌生理食塩水で十分に混合した。40日目から53日目まで、1 pg/µLのCGRP溶液または0.3 mg/mLのBIBN-4096溶液を10 µLずつ、麻酔なしで軽く保定した状態で、1日おきに各マウスに経鼻投与した。
アウトカム評価指標および検出方法
行動試験
53日目の最終的な経鼻感作後、デジタルビデオシステムを用いて、鼻擦りおよびくしゃみの回数を10分間モニタリングし、記録した。ビデオ内の行動回数は、2名の研究者が二重盲検法を用いて独立してカウントした。カウント数に大きな相違があった場合は、3人目の研究者がビデオを再評価し、最終的に最も整合性の高いデータを統計解析に採用した。
気管支挑発試験
最終的な誘発から24時間以内に、0、5、10、20、および40 mg/mLの濃度のネブライズ化アセチルコリン（ACh）を用いて気道反応性を評価した（各濃度300 µLを1分間ネブライズした）。気道収縮を経験的に示し、気道過敏性（AHR）を評価するために用いられる無次元指数である強化ポーズ（Penh）値を、非侵襲的全身プレチスモグラフィーを用いて、各ネブライズ後に5分間記録した。記録に先立ち、マウスをチャンバー内で10分間順応させた。Penhは、呼気/吸気時間とピークフローのバランスをとる経験式に基づき、統合された手動保存/ストリーミングシステムソフトウェアを用いて自動的に算出した。
組織病理学的検査（HE染色）
4%パラホルムアルデヒドで固定した肺組織を、段階的なアルコール系列で脱水し、キシレンで透徹した後、自動処理装置を用いてパラフィンブロックに包埋した。ブロックを厚さ4 µmで薄切し、42 °Cの水槽で展張させ、ガラススライドに貼付した。スライドを80 °Cで2時間焼付けし、室温まで冷却する前に一晩乾燥させた。染色のために、切片をキシレン（IおよびII、各20分）で脱パラフィンし、段階的なエタノール系列（100% I/IIおよび75%、各5分）で再水和させ、水道水で洗浄した。スライドをヘマトキシリンで3～5分間染色し、1%酸アルコールで分化させ、青染液で青染した。洗浄後、切片を85%および95%エタノール（各5分）で脱水し、エオジンで5分間対比染色した。最後に、スライドを絶対エタノール（I、II、およびIII、各5分）で脱水し、キシレン（IおよびII、各5分）で透徹し、中性バルサムで封入して自然乾燥させた。光学顕微鏡とCaseViewerシステムを用い、200×倍率でランダムな視野から画像をキャプチャした。肺の炎症および上皮の肥厚を、0～4のスケールで盲検的にグレード化した：0は炎症なし、1は散在的な炎症細胞、2は少数の（<3）炎症 foci、3は複数の（≥3）炎症 foci、4は肺全体にわたるびまん性浸潤とした。上皮の肥厚は次のようにスコア化した：0は正常、1は明らかな肥厚、2は部分的な気道肥厚、3はほぼ完全な閉塞、4は正常構造の消失とした。各実験群について、合計20箇所のランダムな顕微鏡視野を撮影・評価し、組織病理学的スコアの生データを取得した。4視野ごとのデータの平均値を1つの独立したデータポイントとし、統計解析のために1群あたりn = 5リプリケートの最終サンプルサイズとした。スコアリングは盲検的に実施した。
RNA-seq（RNAシーケンシング）
マウス肺組織から、製造元のプロトコルに従いTRIzol試薬を用いて全RNAを抽出した。RNAの純度、濃度および完全性は、分光光度計およびマイクロ流体ベースのプラットフォームを用いて評価した。市販のライブラリー調製キットを用いてトランスクリプトームライブラリーを構築し、ハイスループットシーケンシングプラットフォームでシーケンシングを行い、150 bpのペアエンドリードを生成した。適切なフィルタリングソフトウェアを用いて生データのクオリティコントロールを行いクリーンリードを取得し、スプライス認識アライメントツールを用いてリファレンスゲノムにマッピングした。遺伝子発現レベルはFPKMとして算出し、リードカウントはリードカウントユーティリティにより集計した。特化した統計パッケージを用いて差分的発現解析を行い、閾値は|log2 Fold Change| ≥ 1および補正後p < 0.05に設定した。
ELISA（酵素結合免疫吸着法）
新鮮なマウス肺組織を精密に計量し、組織 20 mg に対して PBS バッファー 200 µL の厳密な比率でホモジナイズした。ホモジネートを 4 °C で約 13,400 × g、10 分間遠心分離し、タンパク質含有上清を回収した。標準化のため、BCA 法を用いて上清中の総タンパク質量を定量した。ELISA 手順は、市販のキットを用い、製造元のプロトコルに従ってテクニカルトリプリケートで実施した。簡潔に述べると、標準希釈液 50 µL、または希釈済みサンプル 50 µL（タンパク質サンプル 10 µL をサンプル希釈液 40 µL と混合し、最終的に 5 倍希釈したもの）を、抗体コート済み 96 ウェルプレートに添加した。プレートを密封し、37 °C で 30 分間インキュベートした。1:30 に希釈した洗浄バッファーで 5 回洗浄した後、酵素結合コンジュゲート試薬 50 µL を各ウェル（ブランクウェルを除く）に添加し、混合物を 37 °C で 30 分間インキュベートした。さらに 5 回洗浄した後、発色剤 A 液 50 µL と発色剤 B 液 50 µL を各ウェルに添加し、プレートを 37 °C の暗所で 10 分間インキュベートした。停止液 50 µL を添加して反応を停止させると、色が青から黄色に変化した。各ウェルの吸光度（OD 値）を、マイクロプレートリーダーを用いて 15 分以内に 450 nm で測定した。4 パラメーターロジスティックモデルまたは線形回帰モデル（R2 > 0.99 を確認）を用いて標準曲線をプロットし、それに基づき肺組織ホモジネート中の標的タンパク質濃度を算出した。
フローサイトメトリー
肺組織を摘出し、細切した後、10% FBS、50 µL Liberase TM、および 5 µL DNase I を含む 5 mL の RPMI-1640 中で、37 °C、80 rpm の振盪条件下で 45 分間消化した。消化後の懸濁液を 400メッシュのセルストレーナーに通し、4 °C で 300 × g、10 分間遠心分離した。沈殿物を 2 mL の赤血球溶血バッファーに再懸濁し、室温・暗所で 10 分間静置した。洗浄後、死細胞を除去するため、Ghost Dye Red 780（1サンプルあたり 1.25 µL）を用いて 4 °C・暗所で 20 分間染色した。洗浄後、10 µL の FcR Blocking Reagent を用いて 4 °C で 10 分間ブロッキングを行った。その後、以下の蛍光色素標識抗体を用いて 4 °C で 30 分間表面染色を行った：FITC anti-mouse CD45 (0.5 µL)、PE anti-mouse/human KLRG1 (1.25 µL)、BB700 rat anti-mouse CD90.2 (0.5 µL)、および anti-mouse CD3ε、CD4、CD8a、CD11b、CD11c、CD49b、TER-119、Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)（すべて各 0.5 µL）、および anti-mouse CD19 (2 µL) を含むビオチン化リネージ混合液。洗浄後、Brilliant Violet 605 Streptavidin (2 µL) を用いて 4 °C で 30 分間インキュベートした。データは BD フローサイトメータープラットフォームで取得し、FlowJo ソフトウェアを用いて解析した。蛍光スピルオーバー補正マトリックスは、装置のキャリブレーション済み取得ソフトウェアによって自動的にモニタリングおよび調整された。肺 ILC2 を同定するための階層的ゲーティング戦略は、以下の手順で逐次的に実施した：まず、前方散乱光/側方散乱光 (FSC-A/SSC-A) の形態により全リンパ球を分離し、次にシングレットゲーティング (FSC-H/FSC-A) によりダブレットを除去した。続いて、死細胞除去 (Ghost Dye-) により生存細胞を同定し、標準的なゲートを段階的に適用して CD45+ および Lineage- 集団を選択した。生存した CD45+ Lineage- ゲーティングウィンドウ内で、CD90.2+ および KLRG1+ クラスターの連続的なポジティブカスケードゲートに基づいて、肺 ILC2 を明確に定義し定量化した。
免疫蛍光染色 (IF)
凍結肺切片を室温で15～30分間解凍し、PBST（0.05% Tween-20含有PBS）で各6分間、計3回洗浄してOCTコンパウンドを除去した。余分な液体を吸い取った後、免疫組織化学用ペンを用いて組織の周囲に疎水性バリアを形成した。切片を0.3% Triton X-100および5%ヤギ血清を含むブロッキング・透過化バッファー中で37 °Cで100分間インキュベートし、続いて一次抗体とともに4 °Cで一晩（16～20時間）インキュベートした。翌日、切片を室温で30分間静置して馴化した後、PBSTで3回洗浄し、種特異的な蛍光標識二次抗体とともに37 °Cの暗所中で60～90分間インキュベートした。さらにPBSTで3回洗浄した後、DAPI（PBSで1:1または2:1に希釈）を用いて、室温の暗所中で8分間核を対比染色した。最後にPBSTで洗浄（3 × 6分）し、退色防止封入剤で切片を封入して気泡が入らないように密閉し、暗所で保存した。画像は共焦点顕微鏡を用い、400×の倍率で撮影した。1視野あたりの陽性細胞数をLeica LAS Xソフトウェアを用いて手動でカウントした。各実験群について、計15箇所のランダムな顕微鏡視野を撮影し、生の細胞数を取得した。3視野ごとのデータの平均値を1つの独立したデータポイントとし、統計解析のための最終的なサンプルサイズを1群あたりn = 5リプリケートとした。カウントは盲検法にて実施した。
免疫組織化学 (IHC)
パラフィン切片をキシレンで3回脱パラフィンし（各15分）、段階的なエタノール系列（100%を2回、85%、75%；各5分）で再水和させた後、蒸留水で洗浄した。抗原賦活化は、圧力鍋を用い、クエン酸緩衝液（pH 6.0）中で沸騰後に高圧状態で3分間行い、続いて冷却し、PBS（pH 7.4）で5分間の洗浄を3回行った。内因性ペルオキシダーゼを、3% H2O2を用いて室温・遮光下で15分間ブロッキングした。洗浄後、切片を疎水性ペンで囲み、3%ヤギ血清で30分間ブロッキングした。その後、PBSで希釈した一次抗体（anti-IL-4 1:400、anti-IL-5 1:300、またはanti-IL-13 1:150）を用いて、4 °Cで一晩インキュベートした。翌日、切片を洗浄し、HRP標識二次抗体（IL-4にはanti-mouse、IL-5およびIL-13にはanti-rabbit）を用いて室温で50分間インキュベートした。信号は、顕微鏡下で制御しながら、調製直後のDAB溶液を用いて可視化し、水道水で反応を停止させた。最後に、切片をヘマトキシリンで対比染色し、分化、青染、段階的なアルコールおよびキシレンによる脱水を行い、中性バルサムで封入して顕微鏡観察に供した。平均光学的密度（IOD/Area）を、画像解析ソフトウェアプラットフォームを用いて200×倍率で定量化した。各実験群について、合計15箇所のランダムな顕微鏡視野を撮影して生の値を得た。3視野ごとのデータを平均して1つの独立したデータ点とし、統計解析のための最終的なサンプルサイズを1群あたりn = 5反復とした。スコアリングは、盲検化された2名の観察者によって行われた。
ウェスタンブロッティング (WB)
試料調製のため、マウス肺組織（約 30 mg）を細かく刻み、1% プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテルを添加した予冷 RIPA 溶解バッファー 300 µL 中でホモジナイズした。ホモジナイズは組織ホモジナイザーを用い、60 Hz で 4 サイクル（1 サイクルあたり 60 s）行った。その後、溶解物を 4 °C で約 13,400 × g で 15 分間遠心分離し、上清を回収した。全タンパク質濃度は、標準的な BCA タンパク質定量キットを用いて測定した。次いで試料を等量に調製し、5x ローディングバッファーと 4:1 の容量比で混合した後、95 °C で 7 分間加熱変性させた。SDS-PAGE では、タンパク質試料（1 レーンあたり 20 µg）をプレステインタンパク質分子量マーカーと共にロードし、一定電圧 80 V で 20 分間、その後 120 V に調整して 70 分間泳動した。その後、タンパク質を氷バス中で 300 mA の定電流にて 120 分間、0.22 µm PVDF メンブレンにウェット転写した。メンブレンを TBST 中の 5% BSA で室温で 1 時間ブロッキングし、CGRP に対する一次抗体 (1:500) および GAPDH に対する一次抗体 (1:2000) と共に 4 °C で一晩（最大 18 時間）インキュベートした。TBST で 3 回（各 10 分間）洗浄した後、メンブレンを horseradish peroxidase 標識二次抗体 (1:10000) と共に室温で 1～2 時間インキュベートした。さらに 3 回洗浄した後、VILBER Fusion FX イメージングシステムを用いて、強化化学発光 (ECL) 基質によりタンパク質バンドを可視化した。バンド強度は ImageJ 1.8 を用いて定量し、標的タンパク質の発現量を GAPDH 内部標準で正規化した。
統計解析
すべての実験データは平均値として表している。 ± 標準偏差（SD）。データ解析および統計プロットは、専用の統計ソフトウェアプラットフォームを用いて行った。群間比較に先立ち、データセットに対して系統的に正規性検定を実施した。分散が均一で正規分布を示すデータについては、一元配置または二元配置分散分析（ANOVA）を行い、続いて多重比較としてTukey法、Šídák法、Holm-Šídák法、またはFisherのLSDポストホックテストを適用した。複数の群を単一の対照群と比較する場合は、Dunnettの検定を用いた。分散が不均一なデータセットについては、Brown-Forsythe ANOVAを用い、続いてDunnett's T3ポストホックテストを行った。正規分布に従わないデータセットについては、非パラメトリック検定であるKruskal-Wallis検定を行い、続いて多重比較としてDunnのポストホックテストを適用した。P値 < p < 0.05を統計的に有意な差ありとみなした。異なる有意水準は*で動的に示されている。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001、および****p < 組織学的スコアリング、フローサイトメトリー解析、および画像定量化を含むすべての実験結果の評価は、厳格な盲検化の手法を用いて実施した。
結果
KASTは肺のILC2sを減少させ、タイプ2気道炎症を軽減する
KASTの治療効果を調査するため、OVA誘発AAマウスモデルを構築し、肺俞（BL13）、膈俞（BL17）、脾俞（BL20）、および腎俞（BL23）のツボにパッチを貼付して治療を行った（Figure 1A）。モデル作成後、AAマウスでは体重の減少が見られたが、KAST投与マウスではモデル群と比較して体重が有意に増加した（Figure 1B）。肺炎症の指標である肺係数は、AAマウスで上昇したが、KAST投与後に著しく減少した（Figure 1C）。行動評価では、AAマウスにおいて鼻の掻破行動とくしゃみがに増加したが、これらはKASTによって有意に緩和された（Figure 1D–E）。全身プレチスモグラフィーにより、気道過敏性の指標であるPenh値がAAマウスで上昇し、治療後に減少したことが示され、肺機能の改善が示唆された（Figure 1F）。HE染色による組織病理学的解析では、正常対照群と比較して、モデル群で気管支周囲および肺胞周囲への炎症細胞浸潤が認められた。対照的に、KAST群では炎症浸潤が減少していた（Figure 2A–B）。免疫組織化学染色により、IL-4、IL-5、およびIL-13は主に浸潤した炎症細胞および一部の上皮細胞の細胞質に局在し、間質空間にも蓄積している可能性が示された。正常対照群と比較して、モデル群では陽性信号および平均光学的密度値が著しく増加したが、KAST群ではこれらが有意に減少した（Figure 2C–H）。さらにフローサイトメトリーにより、AAマウスの肺におけるILC2数は正常対照群と比較して有意に増加していたが、KASTによりILC2数が著しく減少したことが示された（Figure 2I–J）。
KASTはCGRP/RAMP1軸を抑制することで、タイプ2気道炎症を軽減する
ILC2の過剰活性化は複数の因子によって調節されています。RNA-seq解析により、AAマウスにおいてCGRPの発現が有意に上昇していることが明らかになり、KASTは肺におけるCGRPレベルを著しく低下させました（図 3A）。ウェスタンブロットおよびELISAにより、コントロール群と比較してモデル群でCGRPタンパク質レベルが上昇していることが確認され、KASTによってこれが抑制されました（図 3B–D）。これらの結果は、KASTがAA肺におけるCGRPの発現を減衰させ、それによってILC2の免疫応答を調節することを示唆しています。以上のハイスループットシーケンシングおよびタンパク質スクリーニングによる変動は、KASTによる治療介入とAAマウスにおける肺CGRPレベルの低下との間に強い関連があることを示唆しています。
CGRPの役割をさらに検討するため、AAマウスに外因性CGRP、CGRP受容体アンタゴニストであるBIBN-4096、またはKASTとCGRPの併用投与を行った。ELISAの結果、KAST群およびBIBN-4096群ではCGRPタンパク質レベルが有意に低下し、CGRP群ではレベルが上昇し、KAST + CGRP群ではKAST単独群と比較してレベルが高くなった（図 4A）。フローサイトメトリーにより、モデル群と比較してILC2数がKAST群およびBIBN-4096群で減少した一方、CGRP群およびKAST + CGRP群では増加していることが明らかになった（図 4B–C）。HE染色では、KAST群およびBIBN-4096群において気道および肺胞周囲の炎症細胞浸潤の減少が認められたが、CGRP群およびKAST + CGRP群では浸潤が悪化した（図 4D–E）。さらにELISAにより、KAST群およびBIBN-4096群ではIL-4、IL-5、およびIL-13のレベルが低下したが、CGRP群およびKAST + CGRP群ではレベルが上昇していることが確認された（図 4F–H）。
異なる群間における肺のRAMP1+ILC2数の評価を、多色免疫蛍光染色を用いて行った。その結果、正常対照群と比較して、モデル群の肺組織における総RAMP1+ILC2数が有意に増加していることが示された。モデル群と比較して、CGRP群では肺のRAMP1+ILC2数がさらに有意に増加した一方で、BIBN-4096群およびKAST群では顕著に減少した。注目すべき点として、KAST群と比較してKAST + CGRP群では肺のRAMP1+ILC2数が有意に上昇しており、外因性CGRPの補充が、総RAMP1+ILC2集団に対するKASTの抑制効果を正常に回復させたことが示された（Figure 5A–B)）。
データの利用可能性：
本研究で生成および解析されたすべての生データセットは、公開リポジトリに保存されています。具体的に、これらの包括的な資料には、ウェスタンブロット（WB）アッセイのすべての完全なオリジナルメンブランスキャン、組織学（HEおよびIHC）および免疫蛍光（IF）アッセイのすべての完全な生の高解像度顕微鏡画像、ならびに個々の再現データセットおよび定量のExcelシートが含まれています。すべての生データは、以下の永続的DOIからオープンに利用可能です：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065。フローサイトメトリーのゲーティング順序は付録図1に記載されています。2つの完全なブロット画像は付録図2–3として、定量データは付録表1として提出されています。
図1: AAマウスの症状および肺機能に対するKASTの影響。 (A) OVAを用いたアレルギー性喘息の誘発プロトコル。(B) 各群のマウスの体重統計、n = 5。(C) 各群のマウスの肺係数、n = 5。(D) 最終惹起後の10分間における鼻擦り回数、n = 5。(E) 最終惹起後の10分間におけるくしゃみの頻度、n = 5。(F) 異なる濃度のアセチルコリンによる刺激後の各群のマウスのPenh値、n = 5。データは平均値 ± SDで示している。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。統計的比較は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）または二元配置分散分析（two-way ANOVA）を用い、必要に応じて事後多重比較検定を行った。n = 生物学的反復。 こちらのリンクから、この図の拡大版を表示できます。
図 2: AAマウスにおけるKASTによるILC2数および2型気道炎症の調節。 (A) HE染色により調べた肺の形態学的変化。スケールバー = 50 µm。倍率: 200×。炎症スコアはブラインド法で評価した。 (B) 各群間における炎症スコアの統計解析、n = 5。 (C–H) 各群の肺組織におけるIL-4 (C, D)、IL-5 (E, F)、およびIL-13 (G, H) タンパク質発現の代表的なIHC画像および平均光学密度値、n = 5。スケールバー = 50 µm。倍率: 200×。 (I) Normal群、Model群、およびKAST群における肺ILC2の最終的なゲーティングを示す代表的なフローサイトメトリープロット。シングレットの生存細胞をCD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19)、次いでCD90.2+の順にゲーティングし、最終的にKLRG1+の陽性発現によって肺ILC2を同定した。データは高性能フローサイトメトリープラットフォームで取得し、専用のフローサイトメトリー解析ソフトウェアパッケージを用いて解析した。 (J) 生細胞中のCD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ 細胞の割合によって示したILC2の解析、n = 5。データは平均値 ± SDで表示している。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。統計的比較は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、その後適切なポストホック多重比較検定を用いて実施した。n = 生物的反復数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: KASTはAAマウスの肺組織におけるCGRP発現を抑制する。 (A) 各群間における遺伝子発現のヒートマップ、n = 4. (B) 各群の肺組織におけるCGRP (10 kDa) および GAPDH (37 kDa) 発現の代表的なWB画像. (C) 肺組織におけるCGRPタンパク質発現のWB解析。相対的なCGRP発現量（CGRP/GAPDH比）として表示、n = 3. (D) 肺組織におけるCGRPタンパク質発現のELISA解析、n = 4. データは平均値 ± SDで示されている。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 統計学的比較は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびそれに続く事後多重比較検定を用いて行った。n = 生物学的レプリケート。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 4: AAマウスにおいてCGRPを介してILC2数およびタイプ2気道炎症に及ぼすKASTの影響。 (A) 各群の肺組織におけるCGRPタンパク質発現のELISA解析、n = 4. (B) 各群におけるILC2 (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) の代表的なフローサイトメトリープロット. (C) 生細胞中のCD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ 細胞の割合によるILC2の解析、n = 5. (D) HE染色により調べた肺の形態学的変化。スケールバー = 50 µm。倍率：200×. (E) 各群間における炎症スコアの統計解析、n = 5. (F–H) 各群の肺組織におけるIL-4 (F)、IL-5 (G)、およびIL-13 (H) タンパク質発現のELISA解析、n = 4. データは平均値 ± SDで示す。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 統計比較は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）の後、適切なポストホック多重比較検定を用いて行った。n = 生物学的反復数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5CGRP/RAMP1経路を介した、肺組織におけるILC2数に対するKASTの影響。 (ARAMP1の細胞数⁺ ILC2（KLRG1として定義される）⁺GATA3⁺RAMP1⁺ （トリプルポジティブ細胞）／400個× 肺組織の視野、n = 5。 (B肺組織の代表的な蛍光染色像。核をDAPI（青）で染色し、KLRG1（紫）、GATA3（赤）、およびRAMP1（緑）の免疫染色を行った。スケールバー = 50 µm定量：RAMP1の手動計数⁺ ILC2（KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ 専用の画像解析プラットフォームを用い、ブラインド法で（細胞を）解析した。データは平均値として提示する。 ± 標準偏差（SD）p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 統計的比較は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、続いてポストホック多重比較検定を用いて実施した。n = 生物学的反復。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1：肺ILC2の単離における連続的なゲーティング戦略を示す代表的なフローサイトメトリープロット。 まず、前方散乱光（FSC-A）および側方散乱光（SSC-A）を用いて全イベントをゲーティングした。次に、FSC-A vs. FSC-Hによりダブレットを除去し、シングルセルを抽出した。死細胞集団を除去するため、Ghost Dye Red 780⁻ を生存細胞として同定した。その後、CD45⁺ で白血球をゲーティングし、続いてリネージ陰性（Lin⁻）細胞を選択した。CD45⁺ Lin⁻ サブセットにおいて、さらにCD90.2⁺ でゲーティングを行い、最終的にKLRG1の陽性発現（KLRG1⁺）によって肺ILC2を定義した。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
補足図 2： マウス肺組織サンプルから得られた内部標準 GAPDH (37 kDa) の代表的なウェスタンブロット画像。 その後の正規化のため、ImageJ ソフトウェアを用いてバンドの積分光学密度を定量化した。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
補足図3：マウス肺組織サンプルにおける標的タンパク質CGRP (10 kDa) の代表的なウェスタンブロット像。 CGRPの相対的発現量は、CGRPバンドの積分光学密度を対応するGAPDHの積分光学密度で除して算出した。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
付随表 1：生データ値 グラフ作成に使用した生データ値です。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
AAの治療には、長期的な薬物使用に伴う副作用、不完全な症状管理、および頻繁な再発などのいくつかの限界があります。従来の薬物療法は有効であるものの、ステロイド依存症などの有害な結果を伴うことがよくあります26,27。対照的に、KASTはAAの管理において、安全で経済的、かつ簡便な代替手段を提供します。臨床的根拠により、KASTが肺の免疫機能を調節することで喘息症状を効果的に軽減できることが示されています28。本研究において、我々はKASTがCGRP/RAMP1経路を抑制し、ILC2の数を減少させることで、AAマウスにおけるタイプ2気道炎症を減弱させることをさらに実証しました。
自然免疫、特にILC2は、アレルギー性気道炎症（AA）におけるタイプ2気道炎症の開始、増幅、および維持において不可欠な役割を果たしている29。アレルゲンへの暴露に伴い、ILC2は上皮由来のアラミンに迅速に反応し、数時間以内に大量のIL-5およびIL-13を分泌することで、タイプ2炎症反応を誘発する30,31。さらに、ILC2はTh2分化とIgE合成を促進し、獲得免疫応答をさらに増幅させて気道炎症を悪化させる32。研究により、AAモデルにおけるILC2の遺伝的欠損は気道炎症の期間を有意に短縮させることが示されており、タイプ2炎症の維持におけるILC2の中心的な役割が浮き彫りになっている18。ILC2は、サイトカイン（例：IL-25、IL-33、TSLP）、炎症メディエーター（例：ロイコトリエン）、およびニューロペプチド（例：CGRP、VIP、NMU）によって調節される33。これらの中でも、ニューロペプチドは自然免疫調節において極めて重要な役割を担っている。Neuromedin U (NMU) はILC2活性を直接的に高め、IL-5およびIL-13の放出を迅速に誘導する34。血管活性腸ペプチド (VIP) は栄養摂取や概日リズムの調節に寄与し、ILC2によるIL-5産生を促進して好酸球の恒常性を維持する33。CGRPはILC2からのIL-5放出を著しく増強し、それによってAAにおける気道炎症を促進する。特に、CGRPの受容体サブユニットであるRAMP1は、他のニューロペプチド受容体と比較してILC2上で非常に高いレベルで発現しており、CGRPがILC2活性化において最も強力なリガンドであることが示唆されている35。本研究において、トランスクリプトーム解析によりCGRPがAAマウスで最も差分発現しているニューロペプチドの一つであることが特定され、タンパク質レベルの解析により肺組織におけるその発現上昇が確認された。CGRPの外因性投与は、ILC2数およびタイプ2サイトカインの放出をさらに増加させ、気道炎症を悪化させた。
メカニズムとしては、CGRPがILC2上のRAMP1に結合することで、その下流の免疫応答を調節しています。既存の一部の文献では、CGRPは過剰な炎症から保護するためにILC2の増殖を制限する負の調節因子として特徴付けられていますが20,21、一方で、特定の病理学的微小環境において、CGRPがアラミンと協調してグループ2先天性免疫を強力に誘発し得ることを示す対立的な証拠もあります。本研究の実験的エンドポイントは特に後者のカスケードと一致しており、OVA誘発性アレルギー微小環境においてCGRPが肺へのILC2浸潤を促進することを示しています。逆に、受容体アンタゴニストであるBIBN-4096を用いてCGRP経路を遮断すると、ILC2介在性の気道炎症が有意に改善されます。直接的な遺伝子欠損による証拠を提示するのではなく、本研究の結果は、連関的なトランスクリプトームの変化と、平行して行った薬理学的介入実験（外因性CGRPおよびアンタゴニストBIBN-4096の使用）を活用し、KASTによる治療的保護がILC2上のCGRP/RAMP1シグナリングクラスターの抑制と密接に関連していることを証明しています。
これらの有望な知見がある一方で、いくつかの固有の限界を認める必要があります。第一に、OVA誘導マウスモデルは貴重なメカニズム的知見を提供しますが、種間差があるため、ヒトのアレルギー性喘息における複雑な病態生理学的および免疫学的状況を完全に再現できていない可能性があります。第二に、一部の探索的アッセイにおけるサンプルサイズが比較的に小さいため、より広範な統計的一般化を達成するには、より大きなコホートが必要です。第三に、本研究では主にCGRP/RAMP1/ILC2シグナル伝達軸を優先したため、他の潜在的に関連する神経免疫クロストーク経路や重複するサイトカインネットワークについては、今後のさらなる探索が必要です。特に、主要な技術的限界として、非薬剤パッチや非経穴部位を用いた専用の偽経穴貼付コントロール群が欠如していることが挙げられます。その結果、除毛による機械的ストレス、実験的な取り扱い、およびパッチ自体の粘着刺激などの潜在的な非特異的交絡因子を、KASTの特異的な治療特性から完全に分離することができません。これらの懸念点を解消するため、今後の研究パイプラインでは、厳格に設計された偽コントロールとマルチパスウェイ検証を厳密に組み込み、これらの知見の特異性と再現性をさらに強固なものにします。BIBN-4096投与後に観察されたCGRPタンパク質レベルの減少に関して、BIBN-4096は直接的なCGRP合成阻害剤ではなく、主にRAMP1/CRLR受容体複合体を標的とする競合的アンタゴニストとして機能しますが、そのin vivo投与により局所的なリガンド組織蓄積がダウンレギュレートされる可能性があることを明確にしておくことが重要です。この二次的な現象は、神経免疫陽性フィードバックループの遮断を介して起こると考えられます。ILC2などの標的免疫細胞上のRAMP1をブロックすることで、BIBN-4096はエフェクターサイトカインの下流放出を抑制し、それが結果として感覚神経末端および肺神経内分泌細胞（PNECs）の逆行性炎症活性化を減少させ、それによって間接的に下流のCGRP合成と組織保持を減衰させます。
要約すると、我々の経験的な知見は、KASTが神経系のCGRP/RAMP1軸を標的とすることで、肺の自然免疫微小環境を効果的に再構築することを実証しています。齧歯類とヒトの生物学的な違いを考慮すると、直接的な臨床への転用には慎重な最適化が必要であることは認識していますが、これらのエンドポイントは、伝統的な「肺与皮毛合（肺は皮膚や毛と結びついている）」という理論を実証する、これまで欠落していた重要な機序的基盤を提供するものです。洗練された神経免疫学的視点を提供することで、本プロトコルは、アレルギー性喘息管理のための伝統的な薬物貼付療法の将来的な前方視的・多施設共同臨床応用の指針となり、それを支援する信頼性の高い科学的ベースラインを確立します。
開示事項
著者は、申告すべき利益相反がないことを表明します。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（No. 82274632）、江蘇省中医学領軍人才培養工程（No. SLJ0309）、江蘇省自然科学基金（No. BK20231381）、江蘇省中医学科学技術発展計画プロジェクト（No. ZT202205）、および南京中医学大学における教育部鍼灸医学重点研究室（No. AML202304）の支援を受けて行われました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3M メディカル 通気性テープ | 3M, USA | 1530C | パッチ固定 |
| 塩化アセチルコリン | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | 気管支誘発試験 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies（米国） | G2939BA | RNAの品質および完全性の評価 |
| Alexa Fluor 488 標識ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | （カスタムオーダー） | 免疫蛍光染色（二次抗体） |
| 水酸化アルミニウム | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | アジュバント |
| 抗CGRP抗体（ウサギ） | Abcam, UK | ab81887 | ウェスタンブロッティング / 免疫蛍光染色 |
| BALB/cマウス（雌、SPF、8週齢）–10週、18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | 動物モデル |
| BB700 ラット抗マウス CD90.2 抗体 (クローン 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | フローサイトメトリー |
| BD FACSCanto II フローサイトメーター | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | フローサイトメトリー |
| BIBN-4096（塩酸オルセゲパント） | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | CGRP受容体拮抗薬 |
| ビオチン標識リネージカクテル | BD Biosciences, USA | （記述に従ってカスタマイズおよびクローニング済み） | フローサイトメトリー |
| Brilliant Violet 605 ストレプトアビジン | BD Biosciences, USA | 563260 | フローサイトメトリー |
| BSA アルブミン 分画V | BioFroxx (neoFroxx GmbH)、ドイツ | 4240GR100 | ブロッキング |
| カルシトニン/CALCAタンパク質 | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | CGRP介入 |
| CD11c/ITGAX抗体（ウサギ） | Abmart、中国、上海 | MU115408S | 免疫蛍光染色法 |
| クエン酸抗原賦活化緩衝液 | Boster（中国） | AR0024 | 免疫組織化学 |
| DAPI染色液 | Beyotime、中国、上海 | C1006 | 核染色 |
| ddH2O（二回蒸留水） | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | タンパク質の再構成および粉末の溶解 |
| DESeq2 | Bioconductor (Rパッケージ) | バージョン 1.42.0 | 発現変動解析ソフトウェア |
| DNase I | Roche Diagnostics, ドイツ | 10104159001 | 肺組織の消化 |
| ドンキー抗マウスIgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam（英国） | ab150106 | 免疫蛍光染色（二次抗体） |
| ECL基質 (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech（中国） | – | ウェスタンブロット化学発光法 |
| 高感度BCAタンパク質定量キット | Beyotime（中国、上海） | P0010 | タンパク質定量 |
| エオシンY染色液 | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | 組織学（HE染色） |
| エタノール（絶対、分析グレード） | Sinopharm Chemical Reagent（中国） | 10009218 | 組織の脱水および組織学 |
| F4/80抗体（マウス、クローンC-7） | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | 免疫蛍光法 |
| fastp | オープンソース (GitHub) | バージョン 0.23.4 | RNA-seq生データ品質管理ソフトウェア |
| FITC標識抗マウスCD45抗体 (クローン 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | フローサイトメトリー |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | フローサイトメトリー解析 |
| GAPDHモノクローナル抗体（マウス） | Proteintech, 中国、武漢 | 60004-1-Ig | ウェスタンブロット |
| GATA3抗体（マウス、クローンL50-823） | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | 免疫蛍光染色法 |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences、米国 | 13-0865-T100 | 死細胞の排除 |
| ヤギ抗ウサギIgG (H+L) クロスアドソープ二次抗体 | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | 免疫蛍光染色（二次抗体） |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | 統計解析 |
| ヘマトキシリン溶液（ハリス式） | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | 組織学（HE染色） |
| HISAT2 | ジョンズ・ホプキンス大学（オープンソース） | バージョン 2.2.1 | RNA-seqリファレンスゲノムアライメントソフトウェア |
| HRP標識ヤギ抗マウスIgG (H+L) | Proteintech, 中国 武漢 | SA00001-1 | ウェスタンブロット（二次抗体） |
| HRP標識ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 抗体 | Proteintech、中国、武漢 | SA00001-2 | ウェスタンブロット（二次抗体） |
| HTSeq-count | EMBL (Pythonユーティリティ) | バージョン 2.0.3 | RNA-seqゲノム領域リードカウント用ユーティリティ |
| 過酸化水素（H2O2、3%溶液） | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | 内因性ペルオキシダーゼのブロッキング |
| iFluor™ 488標識ヤギ抗ウサギIgG抗体 | Huabio（中国） | HA1121 | 免疫蛍光染色（二次抗体） |
| IL-4モノクローナル抗体 | Proteintech, 中国 武漢 | 66142-1-Ig | ウェスタンブロット |
| IL13抗体 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | ウェスタンブロッティング |
| IL5抗体 | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | ウェスタンブロッティング |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina, USA | – | RNAシーケンシング |
| ImageJ | 米国国立衛生研究所（NIH） | 1.8 | ウェスタンブロット定量 |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | バージョン 6.0 | 画像光学密度の定量化 |
| KASTハーブ製剤 | 南京中医药大学附属医院 pharmacy department | – | 介入 |
| KLRG1モノクローナル抗体 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | 免疫蛍光法 |
| Leica LAS X | Leica Microsystems（ドイツ） | 4.5 | 免疫蛍光定量解析 |
| Leica STELLARIS 8 DIVE 共焦点顕微鏡 | Leica Microsystems（ドイツ） | STELLARIS 8 | 免疫蛍光イメージング |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, ドイツ | 5401119001 | 肺組織の消化 |
| マーカー（プレステインタンパク質ラダー） | NCM Biotech（中国、蘇州） | P9001 | ウェスタンブロット |
| マウスCGRP ELISAキット | Aifang Biotechnology（中国、湖南省） | AF2491-A | エライザ（酵素結合免疫吸着測定法） |
| マウスIL-13 ELISAキット | Aifang Biotechnology、中国湖南省 | AF-02456M1 | ELISA（酵素結合免疫吸着法） |
| マウスIL-4 ELISAキット | Aifang Biotechnology（中国、湖南省） | AF-02448M1 | ELISA（酵素結合免疫吸着測定法） |
| マウスIL-5 ELISAキット | Aifang Biotechnology、中国、湖南省 | AF-11729M1 | エライザ（酵素結合免疫吸着測定法） |
| 中性バルサム封入剤 | 国药集团化学试剂（中国） | 10014061 | 組織切片のスライド封入 |
| 正常ヤギ血清（ブロッキング用） | Abcam, UK | ab7481 | 免疫組織化学/免疫蛍光法のブロッキング |
| OCT包埋剤 | サクラ、アメリカ合衆国 | 4583 | 凍結切片作製のための包埋 |
| ワンステップPAGEゲル迅速調製キット | Vazyme、中国、南京 | E303-01 | SDS-PAGEゲルの作製 |
| オバルブミン (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | 感作/チャレンジ |
| パラホルムアルデヒド（PBS溶液 4%） | Biosharp、中国 | BL539A | 組織固定 |
| PE標識抗マウス/ヒトKLRG1抗体（クローン2F1） | BD Biosciences, USA | 564022 | フローサイトメトリー |
| ホスファターゼ阻害剤カクテル (50×) | Beyotime（中国、上海） | P1092 | タンパク質抽出 |
| ポリ-L-リシン溶液 | Boster、中国 | AR0003 | 組織切片スライドのコーティング |
| プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 | NCM Biotech、中国、蘇州 | P002 | タンパク質抽出 |
| PVDFメンブレン（0.22 μm) | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | ウェスタンブロッティング |
| RAMP1ポリクローナル抗体（ウサギ） | Proteintech、中国、武漢 | 10327-1-AP | 免疫蛍光染色法 |
| 赤血球（RBC）溶血バッファー | Beyotime、中国、上海 | C3702 | フローサイトメトリーのサンプル調製 |
| RIPA溶解バッファー（強力） | Beyotime、中国、上海 | P0013B | タンパク質抽出 |
| RPMI-1640培地 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | 組織細胞消化ベース |
| SuperKine™ 強化抗退色封入剤 | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | 免疫蛍光染色標本の封入 |
| Triton X-100（界面活性剤） | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | 免疫蛍光染色の透過処理 |
| TRIzol試薬 | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | RNA抽出 |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq ライブラリ調製キット | Vazyme、中国、南京 | NR605-01 | RNA-seqライブラリ調製 |
| 全身プレチスモグラフィシステム | 中国、北京、広遠達 | WBP-4 | 肺機能（Penh） |
| キシレン（分析グレード） | Sinopharm Chemical Reagent（中国） | 10023418 | 脱パラフィンおよび透徹 |
参考文献
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