方法論記事

制御された遺伝子編集および薬物送達のための光およびX線活性化リポソーム

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DOI:

10.3791/71788

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2026年8月14日

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1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、可視光またはX線照射によって活性化され、CRISPR-Cas9リボ核タンパク質および化学療法剤を時空間的に制御して放出する、ベルテポルフィン統合脂質ナノ粒子の作製方法について解説します。本手法は、眼科および腫瘍学的な応用への翻訳的関連性を有しています。

要約

光力学的療法（PDT）は、光増感剤の活性化を利用して、主に一重項酸素などの活性酸素種（ROS）を生成します。この光化学反応を脂質ナノキャリアシステムによるオンデマンドな貨物放出に転用することで、従来の脂質ナノ粒子では達成できなかった治療薬デリバリーの時空間的制御が可能になります。本プロトコルでは、2種類の異なるベルテポルフィン（VP）統合脂質ナノ粒子製剤の作製および特性評価方法を提示します。(1) CRISPR-Cas9 リボ核タンパク質（RNP）複合体を送達するための、DOTAP、DOPE、コレステロール、および VP で構成される光トリガーリポソーム、および (2) 化学療法剤の制御放出のための、DOTAP、DOPC、VP、および金ナノ粒子で構成される X 線トリガーリポソームです。690 nm（可視光）または臨床用 X 線照射（6 MeV）による活性化により、VP が一重項酸素を生成して不飽和脂質成分を酸化させ、ナノ粒子膜を不安定化させることで、封入された貨物を放出します。ここでは、薄膜水和法および膜押し出し法によるリポソームの製剤化、物理化学的特性評価、光および X 線トリガーによる貨物放出の評価、ヒト細胞における in vitro 遺伝子ノックアウト、ならびに定量的ゼブラフィッシュ視覚リポーターシステムおよびマウス異種移植腫瘍モデルを用いた in vivo 検証のプロトコルを提供します。代表的な結果として、光活性化によりゼブラフィッシュ胚あたり最大約 326 個の緩徐筋線維のノックアウトが達成され、X 線トリガーによるドキソルビシン放出により顕著な腫瘍増殖抑制が示されました。眼科における 689–690 nm のベルテポルフィン活性化の臨床的先行例から、本プラットフォームの眼科的デリバリーへの評価が動機付けられていますが、網膜におけるバイオディストリビューション、薬物動態、および大型動物での安全性については今後の確立が待たれます。これらの手法は、外部制御による治療貨物放出に向けた、トランスレーショナルな可能性を持つ実験的アプローチを提供します。 

概要

脂質ナノ粒子（LNP）は、COVID-19のmRNAワクチンへの導入で実証されたように、核酸治療薬のための最も臨床的に検証された非ウイルス性デリバリープラットフォームとして台頭しています1。しかし、従来のLNPは、細胞内への取り込み後にエンドソーム脱出を通じて貨物を放出するため、ペイロード放出のタイミング、場所、または程度を外部から制御することはできません2。このような時空間的制御の欠如は、部位特異的な遺伝子編集、不均一な腫瘍における標的化学療法、および眼のような解剖学的に到達可能な臓器における滴定的な遺伝子サイレンシングなど、精密かつオンデマンドな放出が治療上の利点となるアプリケーションにおける有用性を制限しています3,4。

光力学療法（PDT）は、外部からトリガーされる生物学的効果のための確立されたメカニズムを提供します。特定の波長で活性化されると、光増感剤は一重項酸素（1O2）やその他のROSを生成し、これにより近傍の生体分子を酸化させることができます5。ベンゾポルフィリン誘導体であるVerteporfin（VP）は、加齢黄斑変性（AMD）における中心窩下脈絡膜新生血管の光力学治療薬としてVisudyneという名称で臨床承認されており、ナノ粒子光増感剤の成分として特に適しています6。VPは眼科領域の光力学療法において臨床的に689 nmで活性化されており、眼球への光照射の先例が確立されています6,7,8。VPは、組織透過性のある波長において、第一世代のヘマトポルフィリン誘導体よりも約4倍高い光力学的活性を有しています6。

VPが臨床的に承認された光増感剤として、またナノ粒子に封入された薬剤放出のための光応答性トリガーとして同時に機能するというこの二重の機能性が、本プロトコルで述べるメカニズムの基礎となっています。VPが低モル比で脂質二重層に組み込まれている場合、光照射によって1O2が生成されます。これは先行文献と一致しており、不飽和ホスホリピドのアシル鎖を酸化させ、膜を不安定化させることで封入された薬剤を放出すると提案されています9。1O2の拡散半径が短いこと（生物学的環境において約20 nm）により、膜の不安定化は光増感剤の直近に限定され、二重層を効率的に破壊しつつ、薬剤へのダメージを最小限に抑えることができます9,10。さらに、X線による活性化様式は、可視光の組織透過深さの制限を克服します。金ナノ粒子（3–5 nm）を脂質二重層に共埋入すると、臨床用X線照射（6 MeV）がオージェ電子媒介のエネルギー伝達を通じてVPの活性化を促進し、深部腫瘍への適用性を拡大します11,12。Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)を用いた一重項酸素の直接測定により、1O2の生成量はX線量に伴って増加し、VP単独の場合と比較して金ナノ粒子の共担することで約1.4倍に増強されることが確認されています11。

このプラットフォームは、眼科領域の遺伝子治療において特に高いトランスレーショナルな関連性を有しています。現在の新生血管性AMDに対する抗VEGF治療では、頻回な硝子体内注射が必要であり、慢性的 insufficient treatment（治療不足）の下では実臨床での転帰が悪化します13,14。一方で、開発中のAAV遺伝子治療は、この負担を軽減しますが、抗VEGFを構成的に発現させるため15,16、用量調節や投与の中止が不可能です。これは、持続的なVEGF抑制が地理的萎縮、網膜虚血、および線維化に関連しているという懸念を踏まえると重大な問題です17,18。代わりに、VPリポソームを用いた光トリガー式CRISPRアプローチを採用すれば、医師が制御可能な空間的に限定されたVEGF-Aノックアウトが可能となり、遺伝子編集の持続性を維持しつつ、初期編集イベントの空間的および時間的なゲーティングを医師が制御できるようになります。同様のトリガー放出の原理は、Stargardt病（ABCA4）19,20などの巨大遺伝子に伴う網膜ジストロフィーや、VPの収束的メカニズムが腫瘍の生物学的特性に適合しているぶどう膜メラノーマ21,22にも適用可能です。

本プロトコルの総合的な目的は、可視光（690 nm）で活性化するものとX線照射で活性化するものの2種類の異なる処方を用いて、VP統合脂質ナノ粒子を作製し、in vitroおよびin vivoの両モデルシステムでデリバリー効率を評価するための、包括的かつ再現可能な手法を提供することである。これらの処方は、脂質組成、カーゴ充填戦略、および活性化様式が異なるため、個別のプロトコルとして提示する。本プロトコルは、トリガー放出ナノ粒子プラットフォーム、PDTベースのデリバリー戦略、時空間的に制御された遺伝子編集、または光活性化による眼科および腫瘍学的なドラッグデリバリーを研究する研究者を対象としている。

プロトコル

ゼブラフィッシュを用いたすべての動物実験は、マッコーリー大学の動物研究倫理委員会によって承認されたプロトコル（ARA: 2015-034）に基づき、標準的な条件下で実施されました。マウス異種移植実験は、マッコーリー大学動物倫理委員会（承認番号 2017/001）の規定に従って実施されました。すべての手順は、1985年動物研究法および2010年動物研究規則を遵守して行われました。

パートA：CRISPR-Cas9デリバリーのための光トリガー型VP-リポソーム（Aksoyら9に基づく）

1. CRISPR-Cas9 RNPを封入した光トリガー作動性VPリポソームの調製

  1. ガラス製丸底フラスコ内で、DOTAP、DOPE、コレステロール（Chol）、およびVPを、モル比1:0.94:1:0.06で500 µLのクロロホルムに溶解させる9。
    注意：クロロホルムは毒性があり揮発性である。クロロホルムを用いるすべての工程は、ニトリル手袋や保護メガネなどの適切な個人用保護具を着用し、化学用ドラフトチャンバー内で行うこと。
  2. アルゴンガスの気流下でクロロホルムを蒸発させ、フラスコ壁面に薄い脂質膜を形成させる。
  3. フラスコを真空下（例：真空ポンプに接続した凍結乾燥機またはデシケーター内）に一晩（≥12 h）置き、残留溶媒を完全に除去する。
  4. 500 µLのヌクレアーゼフリーウォーターに、sgRNA（最終濃度0.01 µM）とCas9タンパク質（最終濃度0.1 mg/mL）を混合して水和溶液を調製する。水和させる前に、sgRNAとCas9を室温で5分間プリインキュベートし、リボ核タンパク質（RNP）複合体を形成させる。
    注：RNP複合体は水和ステップでロードさせ、形成後に添加するのではない。これにより、リポソームの水性コア内への封入を確実にする。
  5. 500 µLのRNP溶液を乾燥した脂質膜に直接添加して水和させ、懸濁液が均一になるまで混合する。水和させた脂質懸濁液を室温で2時間放置し、脂質を完全に水和させる。
  6. 得られた多層小胞懸濁液を、ミニエクストルーダーを用いて200 nmのポリカーボネート膜で11回押し出し、均一なサイズの単層リポソームを作製する9。
    注：本処方におけるサイズ縮小法は、ソニケーションではなくエクストルージョンである。最終産物が開始材料とは反対側の膜面に位置するように、奇数回（11回）通過させ、未処理の小胞による汚染を低減させる。
  7. VPリポソームは遮光し、4°Cで保存する。最適な活性を得るため、調製後48時間以内に使用すること。この48時間という使用期限は保守的な数値であり、10% FBS中での96時間におけるVP放出率は3%未満に維持される9。
    注：in vitroおよびin vivoへの適用には、標準的な無菌操作を用いてリポソームを調製・取り扱い、使用前に0.22 µmフィルターを通過させて最終懸濁液を滅菌すること。

2. VPリポソームの物理化学的特性評価

  1. リポソーム懸濁液をヌクレアーゼフリー水で1:100に希釈する。動的光散乱法（DLS）を用いて、流体力学的直径、多分散指数（PDI）、およびゼータ電位を測定する。すべてのDLS測定はサンプルあたり3連（n = 3 テクニカルレプリケート）で行い、値を平均値 ± 標準偏差として報告する。
    注：パートAの製剤が成功した場合の期待される特性は、流体力学的直径 167.5 ± 1.9 nm、PDI < 0.3、ゼータ電位 +28 ± 1.1 mV、および約 75.09% の Cas9 封入効率である。成功した製剤の代表的な物理化学的特性は表1にまとめられている。9
  2. 透過電子顕微鏡（TEM）観察のため、希釈したリポソーム懸濁液 10 µL をカーボンコート銅グリッド上に滴下する。2% 酢酸ウラニルで 20 s 間染色する。100 kV9で撮影し、バッチあたり少なくとも10枚の代表的な画像を取得する。
パラメータパートA：VPリポソーム
（光トリガー）		パートB：VP/AuNPリポソーム
（X線トリガー）
流体力学的直径167.5 ± 1.9 nm~100–150 nm
多分散指数 (PDI)<0.3< 0.3 (典型的)
ゼータ電位+28 ± 1.1 mV正電荷 (DOTAPベース)
封入効率Cas9 RNP: 75.09%ドキソルビシン：硫酸アンモニウム遠隔負荷法；0.1% Triton X-100による溶解後に定量
金ナノ粒子負荷量該当なしリポソームあたり 156 ± 24 AuNPs (ICP-MS)
カーゴ放出安定性10% FBS中 96 hでVP放出率 <3%0%, 10%, 25%, および 50% FBS、ならびに pH 7.4, 6.0, および 5.0 において 48 hまで安定
活性化条件690 nm, 0.15 mW/cm² LED照射6 MeV 臨床X線照射
主要カーゴCRISPR-Cas9 RNP複合体ドキソルビシン
活性化様式可視光X線放射線
想定用途トリガー式遺伝子編集トリガー式化学療法剤放出

表1：2種類のベルテポルフィン（VP）リポソーム処方の物理化学的特性基準および安定性プロファイル。光トリガーVPリポソーム処方（パートA）およびX線トリガーVP/AuNPリポソーム処方（パートB）の代表的な処方特性、封入パラメータ、安定性プロファイル、および活性化条件。これらの値は、処方の調製および特性評価を成功させるための期待される品質管理基準であり、本プロトコルを再現する際の参照基準として使用することができる。

3. 光トリガーによるカーゴ放出および一重項酸素の測定

  1. 光トリガー放出アッセイでは、同一の脂質組成および水和・エクストルージョンプロトコルを用いてVPリポソームを調製する。PBS中のリポソーム懸濁液100 µLを、80 rpmで撹拌される12 mLのPBSに浸漬させた透析デバイスに分注する。
  2. 定義された時間間隔（2、4、および6分）で、690 nmのLED光源を用い、0.15 mW/cm2の強度でサンプルに照射する9。
  3. 0、1、3、6、および24時間後に外部透析液をサンプリングし、蛍光法により放出されたVPを定量する。また、同量の分注液を0.1% Triton X-100で溶解させ、VPの総量を求める。
  4. VPの放出率をRvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100として算出する。ここで、Ft、F0、Fmaxは、それぞれ時間t、ベースライン、およびTriton溶解後の蛍光値である（n = 3）。
  5. 照射前後の動的光散乱法（DLS）による流体力学的直径の変化を測定し、膜の不安定化を確認する。
    注：調製および保存の全過程において、VPを含むすべてのサンプルを周囲の光から保護すること。アンバーチューブまたはアルミホイルによる遮光を行う。

4. In vitro トランスフェクションおよび遺伝子ノックアウトアッセイ

  1. HEK293-GFP細胞（または同等のレポーター細胞株）を、処理時のコンフルエンシーが約70%になる適切な密度で96ウェルプレートに播種する。完全培地（DMEM + 10% FBS + 1% ペニシリン・ストレプトマイシン）を用い、37°C、5% CO2条件下で細胞を培養する。2.
  2. anti-GFP sgRNA/Cas9 RNPを封入したVPリポソームを、50 $\mu$g/mLの濃度で各ウェルに添加する。蛍光顕微鏡分析を行う場合は2時間、フローサイトメトリー分析を行う場合は1時間インキュベートする。
  3. 培地を新鮮な完全培地に交換する。処理したウェルに、0.15 mW/cm2の690 nm LED光を照射する。蛍光顕微鏡解析の場合は2分、4分、または6分間照射し、フローサイトメトリー解析の場合は4分間照射する。暗所コントロール（リポソームなしで非照射）および光のみのコントロール（リポソームなしで照射）を含める。
  4. 処理後48時間に、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーを用いてGFPノックアウトを評価する。
    注：ガイドRNAは使用前に検証する必要があります。元の研究では、候補となるeGFPガイドについて制限断片長多型（RFLP）分析を用いて切断効率をスクリーニングし、選出されたガイド（sg_eGFP_06）は88.24%の切断率を達成しました。オフターゲットのリスクは、ガイドの一意性を確認することでin silicoで最小限に抑えられました（Bowtie/Bowtie2を用いてリファレンスゲノムに対しBLASTNを行い、3'末端側の最初の10塩基においてミスマッチを許容しない条件で実施）。ゲノムワイドなオフターゲットシーケンシングは実施されていませんが、治療への応用においては推奨されるステップです。9.
  5. 封入効率を測定するため、遠心分離を行い、 リポソームのサンプルを4 °Cで15,000 rpmで1時間遠心分離し、続いて上清を20 nmのWhatman Anotop 10シリンジフィルターでろ過する。
  6. BCAタンパク質定量法により、ろ液中の遊離（非封入）Cas9を定量する。
  7. 封入効率を EE (%) = [(Ctot − Csup) / C総計] × 100（ここで C は合計 Cas9の総添加量およびCはsup 非カプセル化Cas9は上清中に回収されます。参照してください。 表1 代表的な製剤の性能指標および期待される封入効率について。

5. 生体内（in vivo）検証：ゼブラフィッシュ視覚レポーターアッセイ

  1. 元のプロトコル9で指定された比率に従い、eGFP標的sgRNAおよびCas9タンパク質を封入したVP-liposomeを混合して、注入用MasterMixを調製する。最終的な8 uLのMasterMixは、3.5 uLのsgRNA (75 ng/uL)、1.0 uLのCas9タンパク質 (500 ng/uL)、2.5 uLのVP-liposomes、および1.0 uLのフェノールレッドを含む。コントロール用のMasterMixでは、リポソームの代わりに2.5 uLのヌクレアーゼフリー水を用いる。
  2. 校正済みマイクロインジェクションシステム9を用い、1細胞期のゼブラフィッシュ胚の細胞（卵黄ではない）に2 nLのMasterMixをマイクロインジェクションする。
    注意：すべてのゼブラフィッシュを用いた実験は、承認された動物倫理プロトコルのもとで実施すること。注入時の機械的損傷を最小限に抑えるため、胚は慎重に取り扱うこと。
  3. 受精後2時間（hpf）で、注入した胚に690 nmのLED光を0.15 mW/cm2で規定の時間（例：0、1、2、5分）照射し、カーゴの放出を活性化させる9。
  4. 72 hpfで、胚をTricaineで麻酔し、1%低融点アガロースに固定する。smyhc1:eGFPトランスジェニックレポーターラインを用い、倒立蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡を使用して、eGFP蛍光の消失として緩筋線維のノックアウトを定量化する。
  5. フォーカススタッキング画像を撮影し、胚あたりのeGFP陰性（ノックアウトされた）緩筋線維数をカウントする。通常、1グループあたり16個の胚を解析する（例：Imarisを使用）9。
    注：このアッセイにより、遺伝子ノックアウト効率を定量的かつ視覚的に読み取ることができる。smyhc1:eGFPレポーターラインでは、緩筋線維は通常eGFP陽性であり、これらの線維におけるeGFP蛍光の消失をノックアウト成功として判定する9。

パートB：化学療法剤デリバリーのためのX線トリガー型VP-リポソーム（Dengら11に基づく）

6. ドキソルビシン封入X線トリガー VP/AuNP-リポソームの調製

  1. ガラス製の丸底フラスコに、DOTAP (100 mg/mL in chloroform) 350 µLとDOPC (100 mg/mL in chloroform) 370 µLを合わせ、クロロホルムで全量を1.0 mLにする11。
    注：パートBではDOPEではなくDOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) を使用する。これら2つの処方はヘルパー脂質が異なり、この区別は再現性において極めて重要である。
  2. 脂質混合物に、VP (2.3 mg/mL in DMSO) 50 µLと金ナノ粒子懸濁液 (直径 3–5 nm) 40 µLを加える。これにより、ICP-MSで定量された通り、リポソーム1個あたり約156 ± 24個の金ナノ粒子が含まれることになる11。
    注：脂質二重層に組み込むためには、金ナノ粒子の直径が3–5 nmである必要がある。より大きな粒子 (例：50 nm) は膜に取り込まれず、X線活性化に必要なオージェ電子エネルギー転移を媒介できない11。
    注：ここで述べている基本処方は非標的性である。元の研究では、リポソームを葉酸受容体発現腫瘍細胞に向かわせるために、DSPE-PEG2000-Folateを後挿入するというオプションの能動的標的化修飾が導入されており、このステップはコアとなるVP/AuNP放出メカニズムを変更せずに追加することが可能である11。
  3. ステップ1.2–1.3に記載されている通り、アルゴン気流下でクロロホルムを蒸発させ、真空中で一晩乾燥させる。
  4. 250 mM 硫酸アンモニウム緩衝液 (pH 5.5) 1.0 mLで脂質フィルムを水和させる。ボルテックス処理し、水和懸濁液を一晩放置した後、200 nm ポリカーボネート膜で11回エクストルードする11。
  5. 膜を横断する硫酸アンモニウム勾配を形成させるため、PBS (pH 7.4)を用いて4 °Cで4回の緩衝液交換を伴う透析を行い、遊離の硫酸アンモニウムを除去する。
  6. 透析後のリポソームを、薬剤対脂質の重量比1:10で60°Cで1時間インキュベートし、ドキソルビシン (Dox) を封入する11。硫酸アンモニウム勾配により、Doxがリポソーム内部に蓄積する。
  7. PBSを用いて4 °Cで4回の緩衝液交換を伴う透析を行い、未封入のDoxを除去する。
  8. DLSによって封入後のリポソームを特性解析し (予想サイズ：~100–150 nm)、0.1% Triton X-100でリポソームを溶解し Doxの蛍光 (励起 485 nm、蛍光 590 nm) を定量して封入効率を測定する 。
    注：パートBの処方が成功した場合、通常は流体力学的直径が約100–150 nm、PDI < 0.3となり、リポソーム1個あたり約156 ± 24個の金ナノ粒子が組み込まれる。代表的な物理化学的特性は表1にまとめられている11。

7. X線誘発薬剤放出およびin vitro細胞毒性

  1. カルセイン封入VP/AuNPリポソームを、臨床用リニアック（6 MeV光子線）を用いて規定の線量（1、2、および4 Gy）で照射する11。カルセインの蛍光（励起 485 nm、蛍光 510 nm）を測定してカーゴの放出量を定量し、0.1% Triton X-100で破砕した後の全放出量を取得する。"
  2. 細胞毒性アッセイでは、HCT116ヒト大腸がん細胞を96ウェルプレートに播種する（例：10% FBS中で 2 × 104 cells/mL）。
  3. Dox封入VP/AuNPリポソームで細胞を処理し、上述の方法でX線を照射する。この際、LipoDoxのみ、X線のみ、および未処理のコントロールを含める。4 Gy照射後の0、2、4、および24時間において、MTSアッセイにより細胞生存率を評価する11。

8. In vivo検証：マウス異種移植腫瘍モデル

  1. 6～7週齢の雌 BALB/c ヌードマウスの側腹部に、100 µL の無血清 McCoy’s 5A Medium11 に懸濁した 5 × 106 個の HCT116 細胞を皮下接種する。
  2. 腫瘍体積が ~100 mm3 に達したとき、Dox 封入 VP/AuNP-リポソーム（Dox 換算で 10 mg/kg）を 20 µL の容量で腫瘍内に投与する11。
  3. 投与後 24 時間に、非標的組織を適切に遮蔽した状態で、臨床用リニアックを用いて腫瘍に 4 Gy の X線照射（6 MeV）を行う。
  4. デジタルキャリパーを用いて 2 日ごとに腫瘍体積を測定する。腫瘍体積は V = (π/6) × L × W2 として算出する。ここで L は最大径、W はそれに直交する幅とする11。
  5. 実験終了時に腫瘍を摘出し、10% 中性緩衝ホルマリンで固定した後、組織学的解析（H&E 染色）のために 6 µm の凍結切片を作成する11。

9. 統計解析

  1. 特に断りのない限り、定量データは平均値 ± 標準偏差 (SD) として提示します。
  2. ゼブラフィッシュの遺伝子ノックアウト研究の統計解析は、元の研究報告に従い、一元配置分散分析 (one-way ANOVA) を用いて行いました。また、2群間の比較は、両側 Student's t-test を用いて解析しました。統計的有意性は p < 0.05 と定義しました。
  3. X線誘起リポソームの研究については、元の論文に記載されている通り、腫瘍増殖、体重、カーゴ放出、および組織学的データセットを Student's t-test を用いて解析しました。
  4. 各実験における n の定義は、対応する図の説明に記載しています。
  5. 統計解析には GraphPad Prism version 7.0 (GraphPad Software) を使用しました。
    注：本プロトコルは、過去に発表された研究の実験ワークフローおよび代表的なデータセットを再現したものです。統計解析の詳細については、必要に応じて元の論文9,11を参照してください。

結果

光トリガー遺伝子編集（パートA）：

パートAのプロトコルに従い、CRISPR-Cas9 RNPを封入したVPリポソームは光依存的なカーゴ放出を示した。暗条件下では放出は最小限であったが、690 nm（0.15 mW/cm2）での照射により、照射時間の増加に伴い用量依存的な放出が認められた（図1A）9。ゼブラフィッシュeGFPレポーターアッセイにより、遺伝子ノックアウト効率の定量的な視覚的読み取りが行われた。光活性化させた胚では、暗所コントロールの53.15 ± 35.38本（n = 80）に対し、1個あたり308.37 ± 40.21本のeGFP陽性緩徐筋線維のノックアウトが認められ、5分間の照射後には326.12 ± 36.5本に増加した（n = 60）（図1B,C）9。in vitroにおいて、光活性化VPリポソームはLipofectamine 200と同等のGFPノックダウン（約53%対50%の減少）を達成し、同時に独自の光ゲートによる時空間的制御を可能にした（図1C）9。これらの結果は、同一のナノ粒子製剤でありながら光照射に応じてノックアウト効率が著しく異なることから、時空間的制御が実現していることを示している（図1A–C）。

光化学的な遺伝子編集法；CRISPR-Cas9、LED誘導、蛍光顕微鏡、実験結果、強度測定。
図1ゼブラフィッシュ胚における光誘起CRISPR-Cas9導入および時空間的な遺伝子ノックアウト (ACas9/sgRNAリボ核タンパク質（RNP）複合体を封入したベルテポルフィン（VP）リポソーム（DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06）の模式図。690 nmの光を照射すると、VPが活性酸素種を生成し、これによりリポソーム膜が不安定化して、CRISPR-Cas9カーゴの細胞内放出がトリガーされる。B) の代表的な蛍光画像 smyhc1:eGFP VPリポソーム投与および光照射時間の延長（0、1、2、5分；690 nm、0.15 mW/cm²）後、受精後72時間（hpf）のゼブラフィッシュ胚2). eGFP蛍光の消失は、遅筋線維のノックアウトを示している。挿入図は、枠で囲まれた領域の拡大図である。(C) 胚1個あたりの蛍光強度およびノックアウトされた緩徐筋線維数の定量化。これにより、光依存的なCRISPR-Cas9の活性化および遺伝子ノックアウトが実証された。データは平均値 ± 標準偏差（SD）で示す。ゼブラフィッシュの実験は一元配置分散分析（one-way ANOVA）により解析した（n = 蛍光強度測定用の胚80個および n = 繊維数解析用胚60個； p < 0.001)。HEK293-GFPのバリデーション実験は、両側検定を用いて解析した。 t-検定（n = 4)。スケールバー = 500 µm （概観画像）および 100 µm （拡大画像）。Aksoyらより許可を得て改変。9 Copyright © 2020 American Chemical Society. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ゼブラフィッシュアッセイにおける不十分な結果には、以下が含まれる可能性があります。(a) 胚あたりの断裂繊維が50本未満である場合：リポソームの品質不良、Cas9活性の不足、または不適切な光量を示します。(b) 胚の死亡率が20%を超える場合：マイクロインジェクション時の機械的な損傷、または過剰なVP光毒性が示唆されます。(c) 非照射コントロールで繊維の断裂が見られる場合：リポソーム製剤からのカーゴの早期漏出を示します。

X線誘起薬剤輸送（パートB）：

パートBのプロトコルに従って調製したVP/AuNP-リポソームは、1–4 Gyの範囲で用量依存的なカルセイン放出を示しました（Figure 2A,B）1。HCT16異種移植モデルにおいて、Dox封入VP/AuNP-リポソームを投与し、その後4 GyのX線照射を行ったマウスは、遊離Dox、X線単独、および非照射リポソームの対照群と比較して、有意な腫瘍増殖抑制を示しました（Figure 2C）1。腫瘍切片の組織学的解析において、H&E染色により評価したところ、併用治療群でより広範な壊死領域が認められました（Figure 2D）。

X線標的リポソームを用いたがん治療：カルセイン放出、腫瘍サイズ、壊死分析に関するグラフ
図2X線誘起ドキソルビシン放出による腫瘍増殖抑制 (A) ドキソルビシン（Dox）を含む、ベルテポルフィン（VP）／金ナノ粒子（AuNP）統合リポソームの模式図。X線照射により、AuNPを介したエネルギー転移を通じてVPが活性化され、一重項酸素が生成される。これにより脂質二重層が不安定化し、薬物の放出が誘発される。 (BX線照射量を増加（0～4 Gy）させた際のリポソームからのカルセイン放出プロファイルであり、VP/AuNP-リポソームからの貨物放出が線量依存的に起こることが示されている。エラーバーは4回の測定値の標準偏差を表す。C) PBS、LipoDox、X線単独、またはX線誘起LipoDoxで処置したHCT16異種移植片担持マウスにおける腫瘍体積（左）および体重（右）の測定値。データは平均値 ± 標準偏差（SD）で表示されている（n = 各群4匹のマウス）。統計的有意性は、以下の方法を用いて評価した。 t-試験（P < 0.05, P値 < 0.01, P < 0.001). (D) 代表的なヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色像&H&E染色した腫瘍切片および平均腫瘍壊死領域の形態計測分析。矢印は代表的な壊死領域を示す。箱ひげ図は中央値と四分位範囲を示し、ひげは1.5 × IQRまで延びている。データは以下の方法を用いて解析した。 t-試験（n = 5). スケールバー = 50 µmDengらより改変。11 クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの条件に基づいています。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

キセノグラフトモデルにおける不十分な結果には、以下のような例が考えられます。(a) 照射したリポソーム群と照射していないリポソーム群の間で腫瘍増殖に差が見られない場合。これは、VPによる放出が不十分であるか、金ナノ粒子の組み込みが不適切であることを示しています。(b) 全身毒性（体重減少 > 15%）が見られる場合。これは、X線活性化の前にリポソームからDoxが漏出したことを示唆しています。

ディスカッション

これらのプロトコルのいくつかのステップは、成功させるために極めて重要です。パートAでは、脂質のモル比（DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06）を正確に維持する必要があります。これは、VP濃度が1O2生成量、ひいては貨物放出効率9を直接的に決定するためです。水性コアへの封入には、複合体形成後の複合化ではなく、水和ステップ中にCas9/sgRNA RNPをロードすることが不可欠です。200 nmのポリカーボネート膜によるエクストルージョン（11回通過）により、均一な単層小胞が作製されます。超音波処理はCas9タンパク質を変性させる可能性があるため、代用してはいけません。パートBでは、金ナノ粒子のサイズ（3–5 nm）が重要です。X線照射下でVPへ効果的なオージェ電子介在エネルギー伝達を行うには、粒子が脂質二重層に埋め込まれるのに十分な大きさである必要があるためです11。Doxのロードに使用される硫酸アンモニウム勾配法では、薬剤を添加する前に外部の硫酸アンモニウムを完全に透析させる必要があります。透析が不十分な場合、ロード効率が低下します。

VP介在性の放出機構を維持しつつ、脂質組成をさまざまな用途に合わせて調整することが可能です。例えば、DOTAPの一部をPEG化脂質（例：DSPE-PEG2000を5 mol%）で置換すると、全身投与時の血中滞留時間が向上する可能性がありますが、これにより表面の正電荷が減少し、in vitroでの細胞取り込みが低下することがあります2。DLS測定でPDIが > 0.3となった場合は、エクストルージョンの回数を増やすか、メンブレンの完全性を確認してください。VPが正しく組み込まれているにもかかわらず一重項酸素の生成が低い場合は、VPの活性化は波長依存的であるため（ソレット帯の最大励起波長は425 nm、Q帯の治療活性化波長は689–690 nm）、校正済みパワーメーターを用いてLED光源の波長とパワー密度を確認してください9。ゼブラフィッシュアッセイにおいて、処置群の胚の死亡率が20%を超える場合は、VPに関連する光毒性を最小限に抑えるために、注入量またはリポソーム濃度を下げてください。表1のベンチマークに基づいた構造的なトラブルシューティングの枠組みは以下の通りです。PDI > 0.3：エクストルージョンの回数を増やし、メンブレンの完全性を確認する。VPが正しく組み込まれているが、トリガー放出が低い、または認められない：校正済みパワーメーターで690 nmの出力を確認し、VPのモル比を検証する。胚1個あたりのノックアウトされた緩徐筋線維が約50本未満：リポソームを再調製し、RNP活性を確認するか、照射時間を延長する。非照射コントロールでeGFP信号が消失した：調製後48時間以内にリポソームを使用し、4°Cの暗所で保存して保存条件を確認するとともに、メンブレンの安定性を検証する。異種移植モデルにおいて、照射群と非照射リポソーム群の間に差がない場合は、3–5 nmの金ナノ粒子の埋め込みを確認し、照射したX線量を確認する必要があります。

光トリガー方式（パートA）の主な制限は、690 nmの光の浸透深さであり、これにより直接的な活性化は表面からアクセス可能な組織、またはファイバーオプティクスによる光照射が可能な組織に限定される5。X線トリガー方式（パートB）はこの深さの制限を克服しているが、臨床用リニアックへのアクセスが必要であり、治療用線量ではあるものの、周囲の組織を電離放射線にさらすことになる11,12。どちらの製剤も現在はDOTAPに依存しているが、このカチオン性脂質は用量依存的な細胞毒性と関連しており、全身投与における治療窓（therapeutic window）を制限する可能性がある2。RNP介在性ゲノム編集の一過性の性質は安全性において有利であるが、標的細胞集団でのノックアウトが不十分な場合、ナノ粒子の再投与なしに同一部位への反復投与で補完することはできないことを意味する。さらに、これらのプロトコルは細胞株および小動物モデルで検証されており、大型動物モデル、そして最終的にはヒトへの臨床応用に移行するには、製剤の最適化、薬物動態研究、およびGLP条件下での正式な毒性評価が必要となる。特に、本プロトコルには薬物動態、生体内分布、または網膜浸透に関するデータは含まれていない。眼球およびその他の組織への光浸透については、波長、色素沈着、組織に依存することが文献で十分に特性化されており（また、光学透明化剤で増強することも可能である）、定量的薬物動態、生体内分布、および網膜送達の研究は、トランスレーショナルな主張を実証するための重要な次のステップである。

mRNAワクチンに使用されているものを含む従来のLNPシステムは、エンドソーム脱出による細胞取り込み後にカーゴを受動的に放出するため、送達のタイミングや場所を制御することができない1,2。AAVなどのウイルスベクターは効率的な遺伝子送達を可能にするが、パッケージング容量（~4.7 kb）の制限、再投与時の免疫原性、および投与後に調節できない構成的な導入遺伝子発現といった課題がある3。VPリポソームプラットフォームは、カーゴの種類に依存せず、大きなペイロード（タンパク質、RNP複合体、低分子化合物）に対応し、非ウイルス性であるため、反復投与時の免疫原性と毒性試験の結果次第で、繰り返し投与への適合性が期待できる外部制御可能な放出メカニズムを提供することで、これらの制限を解消する 。光遺伝学的なシステムや熱応答性システムとは異なり、VPベースのアプローチは、安全性データが確立され、既存の臨床用レーザーインフラ（特に689 nmのVisudyneレーザーがすでに標準設備となっている眼科領域）を利用可能な、臨床承認済みの光増感剤を活用している6。Sangらはさらに、VP含有脂質-ポリマーハイブリッドナノ粒子が大腸がんモデルにおける放射線動態療法の有効性を高めることを示し、異なるナノ粒子構造においてもVP介在性のROS生成が適応可能であることを確認した12。

本稿で述べる手法は、3つの眼科疾患に特に深く関連している。新生血管性AMDでは、抗VEGF薬の注射による負担が、最適な治療結果を得るための重大な障壁となっている。実世界のレジストリデータでは、臨床試験プロトコルと比較して著しい治療不足が示されており（1年目の平均注射回数が、臨床試験の12回に対し7.3回であり、患者の38.8%が治療を中止し、視力改善は最小限であった）14、また、頻回な投与にもかかわらず長期的な視力低下が見られる23。この負担を軽減するために開発されているAAV遺伝子治療（ixoberogene soroparvovec15、ABBV-RGX-31416、およびRMAT指定を受けた4D-150（注射回数を83%削減）24）は、それでも抗VEGFトランスジーンを構成的に発現させ、用量の調整や投与の中止を行うことができない。持続的なVEGF抑制が地図状萎縮に関連するというエビデンス（CATT17、4,609眼のメタ解析18、および8年間で萎縮の有病率が78.3%まで上昇した報告25）を考慮すると、これは潜在的な懸念事項である。VEGF-Aを標的とするCRISPR-Cas9を搭載した光トリガー型VP-リポソームシステムを用いれば、空間的に限定された遺伝子ノックアウトが可能となり、遺伝子編集の持続性を維持しつつ、臨床医が初期の編集イベントの空間的および時間的なゲーティングを制御できるようになる 。前臨床研究はこのアプローチの実現可能性を支持している。Cas9 mRNAとVEGFAを標的とするsgRNAをLNPで共導入することで、マウスにおけるレーザー誘発脈絡膜新生血管（CNV）が抑制され26、PEG変異体LNPにより網膜色素上皮（RPE）でのゲノム編集が達成され27、ペプチド誘導LNPにより非ヒト霊長類の視細胞へmRNAが送達された28。しかし、2026年初頭時点でLNPベースの網膜遺伝子治療は臨床試験に入っておらず29、これがトランスレーショナルな機会であることを強調している。スターガルト病では、約6.8 kbのABCA4コード領域がAAVのパッケージング容量を超えているため、導入効率の低下を伴うデュアルベクター戦略が必要となる19。臨床候補には、デュアルAAVプラットフォームであるSB-007およびVG80130や、遺伝子に依存しない修飾療法であるOCU410ST31がある。非ウイルス性の核酸送達は、AAVのパッケージング制限を回避できる。ABCA4プラスミドを搭載したPEG-ECOナノ粒子は、Abca4-/-マウスにおけるA2Eの蓄積を減少させ20、別の研究では大型の網膜DNA構築物の送達32およびLNPを介した眼組織でのmRNA発現が実証されている33。中心視能を維持するには黄斑および中心窩の局所的な治療で十分であるため、VP-リポソームは遺伝子治療カーゴを高濃度でこれらの領域に正確に送達するのに適している。葡萄膜メラノーマにおいて、ベルテポルフィンは3つの相補的なメカニズムを通じて作用する。すなわち、PDT介在性の細胞毒性、YAP/TAZ経路の抑制（YAP1の発現は、最強の転移マーカーであるモノソミー3およびBAP1喪失と相関する）21、およびcGAS-STING活性化による免疫原性細胞死である。VP介在性のYAP抑制およびPDTと抗PD-L1療法を組み合わせることで、免疫学的に「cold」な腫瘍を免疫学的に活性な腫瘍へと転換させ、正位モデルにおいて腫瘍増殖を著しく抑制し生存期間を延長させた22。これらの知見は、脈絡膜メラノーマの一次治療としてのベルテポルフィンベースPDTで報告されている80%という奏効率と一致している34。689 nmの活性化に対する眼の光学的アクセスの良さと、ほとんどの葡萄膜メラノーマの部位が明確であることから、VP-リポソームは局所治療を実現するための有望なプラットフォームとなり、現在の小線源治療や陽子線治療に伴う罹患率を低減できる可能性がある。

上述した眼科および腫瘍学への応用以外にも、VP-リポソームプラットフォームは、外部制御によるオンデマンドのペイロード放出を必要とするあらゆる治療コンテキストに適用可能です。潜在的な応用例としては、経皮照明が可能な皮膚疾患における光トリガーによる遺伝子編集、臨床的な放射線治療の分画スケジュールに同期させたX線トリガーによる化学療法の放出、および発生生物学の研究における空間的なパターン形成を伴う遺伝子ノックアウトなどが挙げられます。非網膜組織において、in vivoでの時空間的に制御されたゲノム編集を可能にするMag-ABE光活性化ベースエディター35や、時空間的に制御されたCRISPR-Cas9編集および光力学療法のためのNIR活性化アップコンバージョンナノ粒子システム36を含む、いくつかの光活性化遺伝子編集システムが実証されています。眼科学においては、持続的なVEGF抑制戦略への関心が高まっており、長期的な治療効果と、生物学的活性のタイミングおよび場所に対する外部制御を兼ね備えたデリバリーシステムの必要性がさらに強調されています37。これらの作製手法を、新興の網膜LNPデリバリー技術および光活性化遺伝子編集システムと統合することは、個別に検証済みのコンポーネントを融合させることを意味し、それらを眼内で組み合わせて適用することは、依然として未開拓で、潜在的にインパクトの高い研究フロンティアです。当グループで現在進行中の研究は、網膜下および硝子体腔内投与経路に向けた製剤の最適化、大型動物の眼モデルにおける安全性プロファイルの評価、および臨床腫瘍学における標準的な放射線治療プロトコルと併用するためのX線トリガー方式の適応に向けられています。

開示事項

Y.A.A.は、本書に記載されている光活性化脂質ナノ粒子技術に関連する特許を保有するEosGene Therapeutics Pty Ltdの取締役兼共同創設者です。E.M.G.およびW.D.は、EosGene Therapeuticsの共同創設者です。

謝辞

著者らは、マッコーリー大学ゼブラフィッシュ施設（ゼブラフィッシュに関する研究）およびマッコーリー大学動物倫理委員会による設備提供および技術支援に感謝いたします。本研究は、ARC Centre of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CE140100003) からの一部支援を受けて実施されました。また、著者らは EosGene Therapeutics Pty Ltd. からの支援に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20 nm ろ過膜 (Anotop 10 または同等品)Whatman (Cytiva)N/A封入効率測定時の遊離Cas9の分離に使用
690 nm LED光源ThorlabsM690L4VP介在性リポソーム内容物放出のトリガー用光源、出力密度調整可能
抗生物質–抗真菌剤 (100X)Thermo Fisher Scientific15240062細胞培養サプリメント、最終濃度 1%
アルゴンガスシリンダーおよびレギュレーターN/AN/A脂質膜調製時の溶媒蒸発に使用
Avanti Mini ExtruderAvanti Polar Lipids610000リポソームサイズの標準化に使用する、200 nm ポリカーボネート膜を用いた手動エクストルーダーシステム
BALB/c ヌードマウス (雌、5–6 週齢)Animal Resources CentreN/AHCT116 異種移植腫瘍モデルに使用する免疫不全マウス
BCA タンパク質定量アッセイキットThermo Fisher ScientificN/A遊離Cas9の定量および封入効率の測定に使用
Bio-Rad ChemiDoc MP イメージングシステムBio-Rad Laboratories12003154ゲルおよびウェスタンブロット用イメージングシステム
カルセインSigma-AldrichC0875放出アッセイ用蛍光染料、高濃度で自己消光する
Cary 5000 UV-Vis-NIR 分光光度計Agilent TechnologiesN/AリポソームおよびベルテポルフィンのUV-Vis吸収分光測定に使用
CCD841 CoN 細胞 (ヒト正常結腸上皮)ATCCCRL-1790正常結腸上皮細胞株、非がん対照として使用
クロロホルムSigma-Aldrich288306脂質膜調製用の有機溶媒
コレステロールSigma-AldrichC8667光トリガー製剤に使用されるリポソーム膜成分
臨床用リニアアクセラレーター (6 MeV 光子ビーム)Varian Medical SystemsN/A照射研究用の臨床用X線源
デジタルキャリパーN/AN/A異種移植腫瘍の体積測定に使用
ジメチルスルホキシド (DMSO)Sigma-Aldrich472301ベルテポルフィンのストック溶液調製用溶媒
DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850375PX線トリガー製剤に使用される脂質成分
DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)Sigma-AldrichP1223光トリガー製剤に使用されるヘルパー脂質
DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)Avanti Polar Lipids890890P両方の製剤に使用されるカチオン性脂質
ドキソルビシン塩酸塩Sigma-AldrichD1515X線トリガーリポソームに封入される化学療法剤
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PX線トリガー製剤に使用されるPEG化脂質
ダルベッコ改正規格イーグル培地 (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092HEK293およびPC12細胞用培養培地
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144洗浄緩衝液
胎児ウシ血清 (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141細胞培養サプリメント、最終濃度 10%
Fluorolog-Tau3 分光蛍光光度計HORIBA ScientificN/Aベルテポルフィンの特性評価用蛍光分光測定に使用
フォーカススタッキングソフト (例: Zerene Stacker)N/AN/Aゼブラフィッシュイメージングにおけるフォーカススタック画像の生成に使用
凍結乾燥機 (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/A真空乾燥および溶媒除去に使用
GFP sgRNAThermo Fisher ScientificA35943eGFPを標的とするシングルガイドRNA、ノックアウト検証に使用
金ナノ粒子 (3–5 nm, クエン酸安定化)NanoComposixN/AX線トリガー製剤に使用される放射線増感剤
GraphPad PrismGraphPad Software7.0統計分析およびデータの可視化
HCT116 細胞 (ヒト大腸がん)ATCCCCL-247in vitro および in vivo 研究に使用される大腸がん細胞株
HEK293/GFP 細胞GenTargetSC001CRISPRノックアウト検証に使用されるGFP安定発現細胞株
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570核染色剤、ワーキング濃度 5 µg/mL
画像解析ソフトウェア (例: Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/Aノックアウトされた緩徐筋線維の定量に使用
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open source画像解析ソフトウェア
倒立蛍光顕微鏡Leica MicrosystemsDMi3000ゼブラフィッシュレポーターイメージングおよびGFP蛍光評価に使用
IVIS SpectrumCT 生体イメージングシステムPerkinElmer128201in vivo 蛍光イメージングシステム
JEOL JEM-1400 透過電子顕微鏡JEOLJEM-1400リポソームのTEMイメージングに使用
Leica SP2 共焦点顕微鏡Leica MicrosystemsN/A細胞内取り込みの共焦点イメージングに使用
低融点アガロースN/AN/Aイメージング時のゼブラフィッシュ胚の固定に使用
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019ポジティブコントロールとして使用されるトランスフェクション試薬
Living Image SoftwarePerkinElmerN/A画像取得および解析ソフトウェア
McCoy's 5A 培地Thermo Fisher Scientific16600082HCT116細胞用培養培地
マイクロインジェクションシステムN/AN/Aゼブラフィッシュ胚の1細胞期マイクロインジェクションに使用
MTS 細胞増殖アッセイPromegaG3582細胞生存率アッセイ
NanoDrop 分光光度計Thermo Fisher ScientificND-2000RNAの純度および濃度測定に使用
ヌクレアーゼフリー水Thermo Fisher ScientificR0582CRISPR-Cas9 RNP調製に使用
Opti-MEM 低血清培地Thermo Fisher Scientific31985070トランスフェクション用培地
パラホルムアルデヒド (4%)Sigma-AldrichP6148組織学的解析用固定液
PC12 細胞 (ラット褐色細胞腫)ATCCCRL-1721取り込み研究に使用される神経細胞様細胞株
ポリカーボネート膜フィルター (200 nm)Avanti Polar Lipids610006リポソームサイズ調整用エクストルージョン膜
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134RNA抽出キット
Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002一重項酸素検出用蛍光プローブ
Slide-A-Lyzer MINI 透析デバイス (10 kDa MWCO)Thermo Fisher Scientific69570リポソーム調製および薬物封入用透析デバイス
SYBR Gold 核酸ゲル染色剤Thermo Fisher ScientificS11494核酸ゲル染色剤
Tg(ubi:EGFP) ゼブラフィッシュZebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2in vivo CRISPR検証に使用されるトランスジェニックゼブラフィッシュ
TNF-α (ヒト組換え)Life TechnologiesRTNFAITNFAIP3誘導研究に使用されるサイトカイン
TNFAIP3 sgRNAThermo Fisher ScientificN/ATNFAIP3を標的とするsgRNA
トリカインメタンスルホネート (MS-222)N/AN/Aイメージング前に使用されるゼブラフィッシュ用麻酔剤
Triton X-100Sigma-AldrichT8787リポソーム溶解および放出アッセイに使用される界面活性剤
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo Fisher ScientificA36498CRISPR-Cas9 RNP調製に使用されるCas9ヌクレアーゼ
トリプシン-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific25200056細胞解離試薬
酢酸ウラニル (2%)Electron Microscopy Sciences22400TEMイメージング用ネガティブ染色剤
ベルテポルフィンSigma-AldrichSML0534-5MGリポソーム製剤に組み込まれる光増感剤
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600動的光散乱およびゼータ電位測定に使用

参考文献

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