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方法論記事

AAVS1におけるドキシサイクリン誘導性ASCL1/DLX2発現を用いたヒト誘導多能性幹細胞からのGABA作動性ニューロンの生成

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DOI:

10.3791/71804

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2026年7月31日

 , 
1Centre de recherche Azrieli du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neurosciences, Universite de Montreal

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ドキシサイクリン誘導性トランスジーンを AAVS1 に統合することで、ヒト誘導多能性幹細胞からGABA作動性ニューロンを生成する方法を説明しています。セーフハーバー遺伝子座。安定的で均質なトランスジーン発現により、GABA作動性ニューロンへの直接分化が効率的に行われ、レンチウイルスアプローチでよく見られるトランスジーンサイレンシングを抑制します。

要約

ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSCs)は、人間の神経疾患を in vitro でモデル化する前例のない機会を提供します。ガンマアミノ酪酸(GABA作動性)ニューロンのような定義されたニューロン集団の信頼できる生成は、これらの研究において不可欠です。本プロトコルは、ドキシサイクリン誘導系を用いてhiPSCをGABA作動性ニューロンに分化する堅牢な方法を詳述しています。このアプローチは、転写因子 ASCL1 および DLX2 をコードするトランスジェーンをCRISPR/Cas9介在のノックインを介してセーフハーバー腺症関連ウイルス統合部位1(AAVS1.)に安定的に統合することに依存しています。この標的統合により、ランダムなレンチウイルス統合でよく見られるトランスジーンサイレンシングを回避します。プロトコルはhiPSCの維持、遺伝子移植統合のためのヌクレオフェクションプロセス、成功裏に改造された細胞を濃縮するためのプロマイシン選択、そして段階的な分化手順をカバーしています。ドキシサイクリン誘導後、改造されたhiPScsは細胞周期を迅速に離脱し、神経形態を獲得し、21日以内にGABA作動系譜マーカーを発現します。主要なステップには、特定の成長因子を用いた神経誘導とその後の成熟、成熟中の細胞接着を改善するための潜在的なアプローチが含まれます。この標準化された手法により、GABA作動性系譜マーカーを発現する誘導ニューロンの濃縮集団が得られ、神経科学研究や細胞モデリングに貴重なツールを提供します。

概要

ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSCs)は、人間の神経疾患をin vitro でモデル化し、発生と変性を促進する複雑な分子メカニズムを調査するための独自のプラットフォームを提供します。この技術により、患者特異的な細胞モデルの生成が可能となり、症候群性毛病の初期神経発達異常2から 、散発性アルツハイマー病で観察される微小なエピゲノム変化3まで、幅広い状態を調査できます。その結果、hiPSCの指向性分化は現代分子神経科学の基盤となっています。

人間の神経過程の微妙なニュアンスを効果的に捉えるためには、高度に特異的で純粋な神経サブタイプを生成することが不可欠です。例えば、MECP2のようなタンパク質のヒトニューロンにおける特定の転写役割を明らかにしたり、SARS-CoV-2のような末梢感覚ニューロンのウイルス感染に対する標的的脆弱性を評価するためには、定義された神経集団が必要です。さらに、機能的なミクログリアを3次元脳オルガノイドに組み込むような複雑で生理学的に重要な微小環境を構築することは、基本的に異なる神経およびグリア系統の堅牢で予測可能な生成に依存しています。これらのサブタイプの中で、GABA作動性ニューロンは中枢神経系における重要な抑制的役割と、さまざまな神経学的および精神疾患への関与から特に注目されています7。この手法の全体的な目的は、hiPSCを誘導ニューロンに誘導しGABA作動系系マーカーを発現させるための信頼性が高く効率的かつ再現性の高いプロトコルを提供することです。GABA作動性ニューロンに対する従来の指向性分化プロトコルは、外因性シグナル伝達分子に依存しており、時間がかかり、変動が大きく、細胞集団が不均一になることがあります8。

これらの制約を克服するために、転写因子を媒介した前方プログラミングが強力な代替手段として登場しました。このプロトコルは、ドキシサイクリン誘導性発現システムを用いて、前神経転写因子ASCL1およびDLX2の発現を促します。CRISPR/Cas9を用いてこれらのトランスジーンをアデノ関連ウイルス統合部位1(AAVS1.)セーフハーバー遺伝子座に標的化することで、ランダムレンチウイルス統合に伴うトランスジェーンサイレンシングの問題を回避します。ドナー構造体には、mCherryのような蛍光リポーターが含まれており、選択後にトランスジーン陽性細胞を監視します。この戦略はランダム統合アプローチよりも均質なトランス遺伝子発現を支援することを目的としていますが、各設計系統ごとに発現の安定性と分化再現性の検証が必要です。この標準化された手法は、約21日で誘導されたGABA作動性系統マーカーの濃縮集団を生成し、従来の小分子アプローチの8.10よりも短い時間です。このプロトコルは、高濃度顕微鏡、単一細胞トランスクリプトミクス、機能生理学的アッセイなどの後継用途でスケーラブルで一貫したニューロン集団を必要とする研究者に非常に適しています。

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プロトコル

注意:ヒトhiPSC培養は、機関のバイオセーフティ手順の下で潜在的に生物有害物質として扱うべきです。すべてのヒトhiPSC培養手技は、認証済みクラスIIの生物学的安全キャビネットで無菌技術を用いて実施します。ヒト細胞を含むすべての廃棄物、ヒト細胞に曝露された培地、CRISPR/Cas9プラスミド材料は、廃棄前に地域のバイオセーフティガイドラインに従って除染されるべきです。ドキシサイクリン、プロマイシン、DMSOおよびその他の化学試薬は手袋を着用し、適切な眼や皮膚保護を着用し、廃棄物は施設の化学廃棄物処理手順に従って処分されるべきです。基底膜抽出物(BME)は、早期重合を防ぐために滅菌技術で取り扱い、使用前に氷上保存する必要があります。液体窒素の貯蔵やクライオバル取り扱いは、適切な低温手袋、顔保護具、そして解凍中の冷やバイアル爆発を防ぐために注意して行うべきです。

注:CRISPR/Cas9介在の編集および神経分化の前に、hiPSC培養はあらかじめ定められた品質管理基準を満たす必要があります。細胞はマイコプラズマ陰性であることを確認し、正常な核型または許容されるゲノム完全性プロファイルを示し、 OCT4、 SOX2、 NANOG、 TRA-1-60、 SSEA4 などの多能性マーカーの強力な発現を維持しなければなりません。培養は典型的なコンパクトなhiPSCコロニー形態を示し、高い核対細胞質比、明確なコロニー境界、最小限の自発分化を示すべきです。推奨されるパスセージ範囲内の活性増殖培養のみを使用し、特に検証がない限り、通常は40番以下である検査室で定められた最大パス数を超えてはなりません。異常な形態、過度な自発分化、成長不良、確定汚染、またはゲノム不安定性の証拠を示す培養は、編集および分化実験から除外すべきです。このプロトコルに必要なすべての材料、メディアレシピも含めて、材料 表に記載されています。

1. 試薬および培養プレートの準備

  1. 凍結培地は、ノックアウト血清置換(KOSR)40mLとジメチルスルホキシド(DMSO)10mLを50mL円錐形チューブ内に混合して準備します。
  2. 冷凍培地をピペットで上下に10回均質化します。溶液は4°Cで最大1ヶ月間保存します。
  3. 基底膜エキス(BME)を最終濃度80 μg/mLでDulbecco's Modified Eagle Medium/F12(DMEM/F12)培地で希釈します。
    注意:希釈前に、ベンダーのウェブサイトにあるロット番号を使って受け取ったBME溶液の濃度を確認してください。
  4. 6ウェルプレートに1ウェルあたり希釈したBMEを1mL加えます。すぐに純正のBMEを4°Cに戻し、最大1ヶ月間保持してください。
  5. プレートを傾けて溶液が井戸全体の表面に均等に広がるようにします。コーティングされていない部分がないか確認してください。
  6. 使用前に37°Cで最低30分間培養してください。
    注意:最大潜伏期間はありません。1日以上孵化する場合は、DMEM/F-12が蒸発しないように注意してください。1本の井戸に使われるBME溶液は、2本目の井戸をコーティングするために一度しか再利用できません。室温でのBMEの操作は、その急速な重合のため短時間であるべきです。

2. hiPSCの維持と伝達

注:このプロトコルにおけるhiPSCメンテナンス媒体はmTeSR plusを指します。mTeSR plusは、ルーチンメンテナンス、伝達、ヌクレオフェクション後の回復、およびプロマイシン選択に推奨される培地です。

  1. 細胞が60%の合流度に達したら、約4〜6日ごとにhiPSCのパッセージを行います。
  2. 吸引ピペットを使ってウェルから培養培地を吸引します。
  3. ウェルに1mLのReLeSRを加え、室温で30秒培養します。
  4. 解離試薬を吸引し、37°Cで8分間培養します。
  5. 5mLピペットを使ってhiPSC維持培地1mLを優しく加えます。細胞懸濁液を50mLチューブに集めます。
  6. マイクロ遠心分離機チューブ内で細胞懸濁液10μLとトリパンブルー10μLを混ぜます。混合液10μLをセルカウンタースライドに負荷し、生存可能な細胞濃度を測定します。
  7. 事前に準備された井戸からBMEコーティングを吸引します。hiPSC維持培地2mLにRho関連コイルコイルキナーゼ(ROCK)阻害剤(Y-27632;10 μM最終値)を添加します。
  8. 井戸に10万個のhiPSCをまき、>90%の生存率を目指します。プレートを8字の動きで動かし、細胞の均一な分布を確保します。
  9. 細胞を37°Cで5%のCO2で培養します。
  10. 24時間後、培地を新鮮なmTeSR2mLとROCK阻害剤なしの培地に置き換えます。
    注:ROCK阻害剤の存在下では、細胞形態の一時的な変化(細胞伸長)が予想されます。細胞が除去後に特徴的な形態を取り戻すことを確認しましょう。

3. hiPSCの核発化

  1. 合流点が約60%に達したらセルを通過させてください。
    注:このプロトコルでは、約60%のコンフルエンスは、井戸表面の半分強を覆う活発に成長するhiPSCコロニーに対応し、コロニー間の可視空間と最小限の自発分化に対応しています。コロニーは核発現時に過剰に生えたり、広範囲に融合したり、密集した多層的中心を示すべきではありません。
  2. 核反応装置が作動し、核反応サプリメントを核反応溶液P3に加えることを確認します。氷のバケツを用意して。
  3. 氷の上に置かれたマイクロ遠心分離機チューブに、核反応液P3を110μL加えます。
  4. チューブにCRISPR/Cas9プラスミド1μgとドキシサイクリン誘導性ASCL1-P2A-DLX2を含むドナープラスミド1μgを加えます。カセット、蛍光リポーター、プロマイシン耐性カセットをチューブに追加します。泡を出さずに優しく混ぜます。
  5. 2つの被覆井戸からBMEを吸引して目的地プレートを準備します。各ウェルにROCK阻害剤を含むhiPSC維持培地2mLを加え、プレートを37°Cで培養します。
  6. ステップ2.2から2.5に記載されているように、6ウェルプレートのウェルから60%合流したところでhiPSCを解離します。懸濁液を無菌チューブに移し、室温で500 x g の遠心分離機で5分間浸します。
  7. 上清液を廃棄し、細胞ペレットをプラスミドを含む110μLの核偏移液P3に再懸濁します。泡ができないようにピペットを優しく使ってください。
  8. 細胞懸濁液100μLを氷上に置いた核反応キュベットに移します。
  9. キュベットを核検査器に挿入し、hiPSCsのCB-150プログラムを実行します。
  10. すぐにプラスチック製のパスツールピペットで細胞を採取します。セル懸濁液の体積を、事前に準備した2つの井戸に均等に移します。
  11. 細胞を8字の動きで分散させ、37°Cで培養します。
  12. 24時間後は、ROCK阻害剤を含まないmTeSRと培地に交換します。該当する場合は蛍光を観測して核分離効率を検証します。

4. 抗生物質選択

注意:プロマイシンは有毒です。適切な個人用防護具を着用し、機関のガイドラインに従って廃棄物を処分してください。

注:編集済みhiPSCを選択する前に、各hiPSCラインの最適なプロマイシン濃度を決定してください。未編集のhiPSCを、BME被覆6ウェルプレートで100,000個の100,000細胞を、HIPSC維持培地にROCK阻害剤を添加したもので種子化しました。24時間後、0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 μg/mLのピュロマイシンを含む新しいhiPSC維持培地に交換します。毎日プロマイシン含有培地を交換し、5日間ブライトフィールド顕微鏡で細胞の形態と生存を監視します。選択された濃度は、過剰な毒性を最小限に抑えつつ、3〜5日以内に未編集のhiPSCをすべて除去するべきです。このプロトコルでは、最適なプロマイシン濃度は通常0.4〜0.6 μg/mLです。

  1. ヌクレオフェクション後は3回の通過を待ち、通常は回復や成長速度に応じて約1〜2週間待ち、非統合プラスミドの喪失を待ってから選択を開始します。
  2. 細胞通過を行い、1ウェルあたり10万個の細胞をシーディングします。
  3. 24時間後、キルカーブで決まる濃度(通常0.4〜0.6 μg/mL)でプロマイシンを追加します。
  4. プリロマイシンの選択は、あらかじめ決められた期間、一般的に約5日間維持してください。
  5. 選択された集団を蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで検証し、レポーター陽性細胞の割合を推定します。
    注意:概ね均質なレポーター発現を示すプール集団のみを進めてください。理想的には>80〜90%のレポーター陽性細胞。レポーター発現がモザイク状態のままであれば、選択を延長したり、リッチングを繰り返したり、分化前にクローンの分離を検討してください。
  6. 神経分化を開始する前に、接合PCRによる正しい AAVS1 .標的化を確認してください。
  7. 厳密な検証が必要な場合は、サンガーシーケンシングでPCR産物を検証し、qPCR、ddPCR、または他の適切なコピー番号アッセイでトランスジェーンコピー数を評価します。
  8. プラスミド骨格配列やより広範なゲノム全体統合解析において、PCRベースのアッセイを用いたランダム統合を評価すること。これは、意図された下流の応用に応じます。
  9. 選択されたhiPSC集団がマイコプラズマ陰性であり、典型的なhiPSCコロニー形態を保持し、プロマイシン選択後も強健な成長を維持することを確認する。
  10. 特に編集細胞が疾患モデリング、機能的アッセイ、長期研究に使用される場合、核型解析、SNPアレイ、またはその他の検証済みアッセイでゲノムの完全性を再評価します。
  11. 予測されるオフターゲット部位の標的シーケンシング、必要に応じてより広範なゲノム的アプローチを用いて、CRISPR/Cas9の潜在的なオフターゲット効果を評価する。
    注意:異常な形態、選択後の回復不良、持続的なモザイク報告発現、確定したゲノム異常、 またはAAVS1 統合失敗を示す培養は、分化に使用しないでください。このプロトコルでは、選択された設計されたhiPScsがプール集団として使用され、報告体発現 AAVS1 が検証された後にドキシサイクリン誘導前にクリオ保存されます。標的化、形態学、成長が検証されます。ドキシサイクリン誘導後や神経成熟中の凍結保存は標準的なワークフローの一部ではなく、使用前に実証的に検証されるべきです。

5. GABA作動性ニューロンへの分化

  1. 必要な数のBME被覆井戸を準備してください。なお、Day 0に1井にシードすると、GABA作動性ニューロンの井戸が1つ生まれます。
  2. 1ウェルあたり6.9 mLの神経誘導培地を準備し、ドキシサイクリン(1 μg/mL)を補足します。蒸発やピペッティングの誤差を考慮して、15%の余分な体積を含めてください。
    注:ドキシサイクリンは最終濃度1 μg/mLで、0日目から使用され、分化および成熟期を通じて維持されます。一貫したトランスジーン誘導を維持するため、各培地交換時に新鮮なドキシサイクリン含有培地が準備されます。この用量は、強力なレポーター発現と効率的な神経変換を手で生じさせるため選ばれました。このプロトコルでは正式なドキシサイクリン用量応答は行われませんでした。したがって、この方法を応用した研究室では、トランスジーン誘導が最適でない場合に0.1〜2 μg/mLのドキシサイクリンを経験的に検査することがあります。
  3. 0日目に、改造されたhiPSCを解離し、20万個の細胞を準備済みのBME被覆ウェルにシードします。37°Cで孵化します。
  4. 1日目、2日目、3日目には培地を吸引し、ドキシサイクリンを含む新鮮な神経誘導培地2 mLを加えます。
    注:3日目には細胞の拡大が著しく減少し、樹状構造が現れ始めることがあります。細胞周期終了の実験的確認が必要な場合は、3〜4日目にKi-67免疫染色またはEdU/BrdU組入を行うことができます。
  5. 4日目に、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン3(NT-3)を含む神経成熟培地を最終濃度10 ng/mL、ドキシサイクリン1 μg/mL、PluriSlnを20 μMで準備します。
  6. 神経誘導培地を吸引しろ。新たに形成されたニューロンを乱さないように、ウェルの壁に沿って2mLの神経成熟培地を慎重に滴り加えます。
  7. 7日目に培地を吸引し、神経栄養素とドキシサイクリンを含む神経成熟培地2mLを優しく加えますが、多能性細胞生存阻害剤は省きます。
  8. 長期的な維持のためには、細胞密度に応じて頻度を調整しながら、3〜4日ごとに神経成熟培地を完全に交換してください。
    注:21日目がGABA作動性神経細胞同一性の標準的な評価項目です。21日目までに、細胞は DLX1を含むGABA作動性神経機能を示すはずです。発現し、軸索ネットワークを成熟させ続けています。過密化や成熟に伴う細胞死を避けつつ、十分な間隔の群落を作るために、20万個のシーディング密度を経験的に選択しました。密度は150,000〜300,000セル/井戸で適合し、形態学的には低密度、物質回収には高密度が好ましいです。剥離を減らすには、1,000μLピペットを低流量で板を傾けずにより頻繁に半媒体交換を行う。必要に応じて、3日間のドキシサイクリン誘導後、成熟培地を加える前に、ポリL-リジン/ラミニンやラミニン-521などの強化コーティングを用いて細胞を再プレートすることもあります。成熟が始まった後のさらなる通過は避けるべきです。
  9. ネットワークが結合し、生存可能で、増殖するhiPSC様コロニーがいなければ、培養は21日目を超えて長期成熟を維持できる可能性があります。21日目以降は、ドキシサイクリンおよび神経栄養因子を含む新しい神経成熟培地で3〜4日ごとに半培地交換を行います。
    注:神経の形態と神経突起ネットワークが安定し、剥離が最小限で、未分化コロニーが見えない時点で、下流のアッセイには培養を用いてください。私たちの手では、培養は通常21日目から35日目の間に使用されます。

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結果

このプロトコルの成功裏の適用により、GABA作動性分子特徴を持つ誘導ニューロンの集団が豊富に生成されます。この戦略は、AAVS1遺伝子座にドキシサイクリン誘導性ASCL1-P2A-DLX2カセットを標的的に挿入することに基づいています(図1A)。設計されたhiPSCの選択後、ドキシサイクリン誘導がGABA作動性神経細胞分化を促進するために用いられます。これは図1Bに示されたタイムラインに示されています。ヌクレオフェクションおよびプロマイシン選択後、研究者はhiPSCコロニー全体で統合蛍光リポーター(例:mCherry)のほぼ均質な発現を観察し、これは工学細胞の成功した濃縮と一致します。分化段階では、ドキシサイクリンの添加によりhiPScの急速な形態変化が誘導されます(図1C)。陽性の結果は、3日目までに細胞分裂が停止し、そ...

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ディスカッション

GABA作動性ニューロンの成功は、このプロトコル内のいくつかの重要なステップに大きく依存しています。高品質で未分化のhiPSCを維持することが最優先であり、核分離前の自発分化は統合効率と下流の神経純度を著しく低下させます。さらに、プロマイシンキルカーブの正確な決定は、適切に設計されたクローンに過度な負担をかけずに非統合細胞を完全に除去するために不可欠です。分化段階では、培養物を丁寧かつ優しく取り扱い、特にウェル壁に一滴ずつ媒体を加えることが、脆弱な神経ネットワークの剥離を防ぐために非常に重要です。

研究者は、ターゲットを絞ったトラブルシューティングを必要とするいくつかの課題に直面することがあります。核生化生存率が異常に低い場合は、細胞の核生化溶液への曝露時間を短縮し、氷上で厳格な温度管理を維持することで生存率が大幅に向上します。未分化幹細胞が成熟期に残る場合、早期成熟時に多能性細胞生存阻害剤を導入することは(ステップ5.5で詳細参照)、汚染された未分化幹細胞を選択的に...

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開示事項

著者たちは競合する金銭的利害関係を一切主張していない。

謝辞

支援はカナダ幹細胞ネットワークのジャンプスタートECRプログラムおよびUdeM pour le partenariat CHU Sainte-Justine -Institut Imagine en épilepsie de l'enfant(ファント・エピレプシー・ド・レ・アン・アン・ファン)によって提供されました。テオ・ラビンはオディセ・ネットワークの支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4D-Nucleofector™ Core UnitロンザAAF-1002BhiPSCの電気穿孔/核内導入用。
6ウェル培養プレートサルステッド83.3920300hiPSCの維持および分化のための組織培養処理済みプレート。
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)STEMCELL Technologies78005神経成熟のための組換えヒトタンパク質。製造元の指示に従って調製し、最終濃度10 ng/mLで使用。
セルカウンター (Countess)サーモフィッシャーサイエンティフィックC10283細胞計数用。
遠心分離機VWR76468-134セルペレタイズ用。
CO2インキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィックHeracell VIOS 160iまたは同等37 °C、加湿雰囲気、および5% CO2を維持する細胞培養インキュベーター。
クライオチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック5000-0020hiPSCの凍結用無菌クライオバイアル。同等の外ねじ1.8–2.0 mLクライオバイアルを使用可。
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractBio-TechneBME001-05プロトコルで使用する標準的なBMEコーティングマトリックス。Bio-Techneの分析証明書からロット固有のストック濃度を確認し、DMEM/F-12に80 µg/mLの使用濃度で希釈。
DMEM/F-12Wisent319-090-CLBMEを希釈する際の基礎培地。
DMSO (Dimethyl sulfoxide)シグマ・アルドリッチD2650凍結培地の調製に使用する凍結保護剤。
ドナープラスミド: 誘導性ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1ターゲティングカセットカスタムプラスミドAddgene アクセスは保留中ドキシサイクリン誘導性ASCL1-P2A-DLX2カセットおよび選択/レポーター要素を含むカスタムAAVS1ドナープラスミド。プラスミドマップと完全な配列を補足ファイルとして、または要求に応じて提供。
ドキシサイクリンハイクレートシグマ・アルドリッチD9891ASCL1-P2A-DLX2発現を誘導するために使用。無菌ストック溶液を調製し、分液し、光から保護し、凍結保存し、最終濃度1 µg/mLで使用。
エタノール (70%)商業アルコール / グリーンフィールドグローバルP016EAAN生物安全キャビネット内の滅菌用。認可された70%エタノールまたは同等品を使用。
蛍光顕微鏡ECHORevolve R4レポーター発現と神経形態学の位相差および蛍光イメージングに使用する顕微鏡。
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)STEMCELL Technologies78058神経成熟のための組換えヒトタンパク質。製造元の指示に従って調製し、最終濃度10 ng/mLで使用。
hiPSCラインPGP1EditCo BioPGP1ヒトiPSCラインこのプロトコルで使用する商業的に入手可能なオープンコンセントヒトiPSCライン。編集および分化の前に通過番号とQCステータスを記録。
イメージ分析ソフトウェアImageJ/Fijiオープンソース。使用するバージョンを報告すべき蛍光定量および代表的な画像処理用。
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)サーモフィッシャーサイエンティフィック10828028凍結培地の調製に使用。
ラミニン-521STEMCELL Technologies200-0117オプションのトラブルシューティング試薬のみ。標準コーティングプロトコルの部分ではない。神経細胞の剥離が持続する場合、代替または二重コーティングマトリックスとして使用可。
液体窒素デュワーサーモフィッシャーサイエンティフィックLocator 6 Plusまたは同等機関のクライオジェニック安全手順に従って、蒸気相または液体窒素で凍結されたhiPSCの長期保存。
Mr. Frosty™ Freezing Containerサーモフィッシャーサイエンティフィック5100-0001-80 °Cで細胞の制御速度凍結用。
mTeSR™ PlusSTEMCELL Technologies100-0276hiPSCのフィードフリー維持培地。
ニューロ誘導培地STEMCELL Technologies08582初期神経誘導に使用する商業的ニューロ誘導培地。
ニューロ成熟ベース培地 (BrainPhys™ Neuronal Medium)STEMCELL Technologies05790神経成熟のためのベース培地。BDNF、GDNF、NT-3、ドキシサイクリン、およびPluriSln-1をプロトコルに記載されている通りに補充。
NT-3 (Neurotrophic Factor 3)STEMCELL Technologies78074神経成熟のための組換えヒトタンパク質。製造元の指示に従って調製し、最終濃度10 ng/mLで使用。
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X KitロンザV4XP-3024hiPSC核内導入用ソリューションP3とキュービットを含むキット。
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)サーモフィッシャーサイエンティフィック15140122細菌汚染リスクを低減するオプションの抗生物質。
Plasmocin™予防薬InvivoGenant-mppマイコプラズマ汚染を防ぐオプションの抗生物質。
PluriSIn-1STEMCELL Technologies72822未分化hiPSCを除去するための多能性細胞生存阻害剤。製造元の指示に従ってストックを調製し、最終濃度20 µMで使用。
プアロマイシンジヒドロクロリドサーモフィッシャーサイエンティフィックA1113803選択に使用する抗生物質。無菌ストック溶液を調製し、分液し、凍結保存し、キルカーブで最終使用濃度を決定（通常0.4–0.6 µg/mL）。
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNAプラスミドAddgene85802AAVS1ターゲティングに使用するCRISPR/Cas9プラスミド。AAVS1 gRNAシーケンスをプラスミドマップまたは補足情報に含める。
qPCR分析ソフトウェアApplied Biosystems / サーモフィッシャーサイエンティフィックQuant

参考文献

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