C2C12筋芽細胞におけるフェロプトーシス関連読み取りを伴う鉄過剰負荷の鉄過剰負荷モデル

サマリー

ここでは、C2C12ミオブラストにおける鉄負荷、フェロプトーシス関連分子変化、早期のフェロスタチン感受性低下を引き起こす急速な鉄アンモニウムシトレート鉄過剰負荷モデルを提示します。

要約

フェロプトーシスは、老化や変性疾患に関与する鉄依存型の調節された細胞死の形態です。以前に、老化した筋幹細胞は細胞内に鉄を蓄積し、活性化後にフェロプトーシス死を経験することを発見しました。ここでは、シトレートアンモニウムを用いてマウスC2C12の筋芽細胞で鉄過剰を発生させる単純なin vitroモデルを説明します。フェリックアンモニウムクエン酸塩処理は細胞内鉄負荷を増加させ、フェリチンの重鎖および軽鎖転写物の増加、フェリチンタンパク質の増加、そして生細胞不安定な鉄染料からの信号の強化が示されました。フェリックアンモニウムシエントレート(FAC)曝露はフェロプトーシスに関連する分子変化も引き起こし、 Slc40a1 および Hmox1の発現増加、グルタチオンペルオキシダーゼ4タンパク質の減少などが挙げられます。FAC関連のグルタチオンペルオキシダーゼ4の減少は、デフェロキサミンによって部分的に逆転しました。12時間後、細胞毒性のフェリックアンモニウムシエントレートが細胞生存率を低下させ、この効果はフェロスタチン-1によって救われ、これは細胞死におけるフェロプトーシス感受性成分と一致した。後の時点では変動の増加とアッセイの動的レンジの減少により、実用性測定の解釈可能性が制限されます。したがって、このプロトコルはフェリックアンモニウムシエントレート介在の鉄負荷の迅速かつ拡張可能なモデルを提供し、フェロトーシス関連反応の研究や筋細胞における鉄またはフェロトーシス修飾介入の検証に利用できます。

概要

フェロプトーシスは調節された細胞死(RCD)の一種であり、他のRCDとは分子的に異なります。最初に発見されたのは、RAS(ラット肉腫)を選択的にする致死性の小分子であるエラスチンで、非細胞形成性の細胞死を引き起こすことが判明しました^。ディクソンらは画期的な研究で、そのメカニズムを鉄依存性として初めて説明し、「鉄¹による落下(死亡)」を意味するフェロプトーシスという用語を作り出しました。分子レベルでは、鉄の過剰蓄積、脂質過酸化の増加、活性酸素種の蓄積による細胞死の形成として現れます^。酸化ストレスや他のRCD形態と区別できる点は、アポトーシスの特徴であるカスパーゼ活性化に依存しないこと、そしてネクロ^{トーシス3}でのみ見られるリン酸化受容体相互作用タンパク質キナーゼ3(RIPK3)および混合系統キナーゼドメイン様擬キナーゼ(MLKL)が存在しない点で特徴的です。さらに、フェロプトーシスは脂質抗酸化物質であるフェロスタチン-1およびリプロキスタチン-1、鉄キレート剤であるデフェロキ^サミン4によっても緩和可能です。フェロプトーシスは他のタイプのRCDと同様に最終的に細胞死を引き起こす点で似ていますが、その発生性により他のRCDの形態と機械的に区別されます。

フェロプトーシスの研究は過去10年間で注目を集めており、主に新たな特徴を特定し、その基礎的なメカニズムや^{人間の疾患への}寄与を研究するための新しいツールの開発に向けた継続的な取り組みによるものです5。最近の証拠は、鉄過剰負荷とフェロプトーシスが加齢による虚弱や肉減少症の十分な研究がされていない要因であることを示唆しています^6,7,8。最近、老化筋幹細胞(MuSCs)が慢性炎症によるエピジェネティックサイ^{レンシングによる}抗酸化遺伝子プログラムの抑制によりフェロプトース死に特有であることを示しました。私たちは、老化したMuSCが成体の約30倍に高い異常な細胞内元素鉄を蓄積していることを発見しました。フェロトーシスは複数の臓器や組織、主に老化に関連する疾患と関連していますが、その生理学的役割はまだ明確ではなく、さらなる調査が必要です。

以前の研究では、老化したMuSCsが活性化時にフェロプトティック死に感作されることを示しましたが、その表現型に対する鉄負荷の具体的な貢献は依然として明らかになっていません。ここでは、シエン酸鉄アンモニウム(FAC)で処理されたC2C12の筋芽細胞において単純な鉄過剰負荷モデルを構築し、過剰な鉄がフェロプトーシス関連の分子変化やフェロスタチン感受性の生存率喪失を引き起こすのに十分かどうかを検証します。C2C12細胞は、低メンテナンスでスケーラブルかつ容易に入手可能なマウス筋前駆系を提供します。¹⁰。このアプローチは、筋細胞における鉄駆動のストレス応答の研究や、フェロトーシス関連表現型を修飾する介入の検証に実用的なプラットフォームを提供すると期待しています。

プロトコル

1. C2C12細胞の調製

1. 解凍細胞
   注意:すべての細胞培養工程は無菌のバイオセーフティキャビネット内で行うべきです。
   1. 温かい完全培地9mL(高グルコースとピルビン酸+10%胎児用牛血清+1%ペン/溶連菌)を含む円錐形チューブを準備します。
   2. 凍結されたC2C12細胞1本(~100万)を解凍するには、メイン培地から予温された完全培地800μLを加えて溶かします。ゆっくり上下にピペットで動かします。
   3. 解凍バイアルに加えた培地が冷めたら取り出して円錐形のチューブに加えます。チューブから同じ量の温かいメディアに交換してください。ピペットで上下にピペットを繰り返し、培地を交換しながら凍結した細胞が再懸浮するまで続けます。
   4. バイアルの内容物を培地の円錐形のチューブにピペットで移します。逆さまに混ぜ、10cmの細胞培養処理皿に内容物を加えます。37°Cで4時間孵卵します。
   5. 顕微鏡で細胞が付着しているか確認してください。付着した細胞は細長く見えますが、浮遊細胞は円形で板が動くと動きます。
      注意:プレート化された細胞が健康であれば、ほとんどは付着しているはずです。
   6. 培地から吸引して、死んだ細胞やゴミを取り除きます。温められた完全な培地10mLに交換し、インキュベーターに戻します。一晩、またはプレートの濃度が80%に達するまで培養させます。
2. 鉄処理のためのC2C12細胞のシーディング
   1. 希望の合流点に達したら、細胞培地から吸引します。プレートに2mLのPBSを滴りごとに加え、表面全体を覆うようにします。吸引する。
   2. 細胞に0.25%のトリプシンを2mL加えます。37°Cで5〜10分間、または細胞が剥離するまで培養します。剥離されると、顕微鏡で見ると細胞は円形に見え、トリプシンと細胞の懸濁液は濁り厚くなります。
   3. トリプシンを中和するには、温かい完全なDMEMを8mL加えます。血清学的ピペットを使って溶液を十分に混ぜ、プレートを洗浄します。セルの懸濁液を円錐形の管に移します。
   4. チューブを優しく3〜5回逆さまにします。適切な体積を取り除き、推奨する方法(細胞計、血細胞計など)で細胞数を数えます。
   5. 各条件に対してn=3に対して、所望の数のウェル/プレートをシードするのに十分な細胞の懸液を作ってください。10cmプレート(ウェスタンブロット用):100,000セル/プレート、6ウェルプレート(qPCR用):50,000セル/ウェル、96ウェルプレート(不安定な鉄および発光染色用):1,000セル/ウェル。細胞を37°Cで一晩抱卵させます。
3. 種子細胞への鉄処理の適用
   1. 治療当日に、フェリックアンモニウムクエントレート(FAC;式=C₆H₁₁FeNO₇⁺³)を添加します。MW = 265 g/mol)を無菌条件下で以下の濃度で完成させるDMEMを完成させる:重度:180 μM(0.0477 mg/mL)、細胞毒性:1,800 μM(0.477 mg/mL)。
      注意:対照群の追加も検討してください。これには、重度+150μMデフェロキサミン(鉄キレート剤)、車両+150μMデフェロキサミン、および/または車両+RSL3(フェロトーシス誘導薬;ポジティブコントロール)が含まれますが、これらに限定されません。さらに、DMEMにはベースラインで鉄の供給源であるIII級硝酸塩非水和鉄が少量含まれている可能性があることも注意が必要です。読者は、上記の推奨FAC濃度を、車両培養培地中に既に存在する鉄鉄に加えて加算するものと解釈してください。
   2. FACが完全な培地で溶けるまでインバートして混色します。
      注:FACは水溶性であるため、DMSOや追加の溶媒は不要です。FACの添加は溶液のpHを変化させる可能性があるため、培地の色が劇的に変化した場合は、処理培地に加えた際の細胞の生存可能性を確保するためにpHを測定することが推奨されます。
   3. 細胞から培地を吸引しろ。処理条件には同じ量の鉄分補完完全培地を、未処理の完全培地を車両ウェルやプレートに追加します。37°Cで望む処理期間を培養した後、選択したアッセイに進みます:不安定鉄アッセイ:2時間FAC処理、qPCRおよびウェスタンブロット:12〜24時間FAC処理、ルミネセンスアッセイ:12時間FAC処理。

2. qPCR

1. qPCRのためのmRNA単離
   注意:RNA抽出試薬とクロロホルムは呼吸器の危険性があります。適切なPPE(白衣、耐薬剤使い捨て手袋、目の保護具)を着用して、ボンド内でのみ扱ってください。
   1. ベンチで細胞から搾取液を吸引します。細胞を2回無菌PBSで洗浄し、残った液体は十分に吸引します。
   2. フームフード内で、細胞に以下の容量でRNA抽出試薬を加えます:6ウェルプレート:250 μL/ウェル、10 cm皿:1皿あたり1 mL。
   3. 排気フードの氷を扱う際は、セルスクレーパーを使って溶けた細胞を優しくこそげ落とします。RNA収率を最大化するために、プレートのすべての部分を徹底的にこすり取るように注意してください。
   4. 溶解液を無菌で予冷処理されたRNAseフリーズマイクロフュージチューブにピペットで移します。室温で5分間置いてください。
   5. 抽出試薬1mLごとに、 フームフード内に 200μLのクロロホルムを加えます。抽出試薬とクロロホルムを混合するために、少なくとも30秒間激しく振ってください。室温で5分間置いてください。
      注:時間経過後、相分離が起こり、その上にRNAを含む透明な水相が置かれます。
   6. 遠心分離機で12,000 × g 、4°Cで15分間サンプルを採取します。 その間に、新しいオートクレーブチューブにラベルを付け、氷のチューブに500μL(抽出試薬1mlあたり)のイソプロパノールを加えます。
   7. 対応する各管に水相のみを転送します。逆さまに混ぜてから室温で10分間置きます。収量が低いと予想される場合は、ペレットの様子を把握するためにGlycoBlueを2μL加えます。
   8. 遠心分離機で12,000 × g 、4°Cで15分間。
      注意:沈殿したRNAはチューブの底部に見えることがあります。
   9. 余分なイソプロパノールを指定された廃棄ビーカーに慎重に注ぎます。分子グレードの100%エタノールをチューブに滴り下がらせ、ペレットが外れないように注意してください。遠心分離機で7,500 g 、4°Cで5分間×。
   10. エタノールを流し出します。チューブを逆さにして、キャップをペーパータオルの上に開けたままにしてください。ペレットを滴のないまで乾燥させます(~15〜30分)。
       注意:グリコブルーを加えなかった場合、ペレットが半透明になる可能性があります。
   11. ペレットを25μLの滅菌・RNAseフリー水に再懸浮させます。RNA濃度を紫外線可視光度法で定量化します。サンプル間で均一な濃度に正規化し、1サンプルあたり最大1 μgのRNAを16 μLで許容します。
2. qPCRのためのcDNA合成
   注意:RNA/cDNAの収率を最大化するために、氷上ですべての工程を完了してください。
   1. 解凍サンプル。作業エリアはRNAseクリーナーで洗ってください。
   2. 各サンプルから1μgのRNAを対応するPCRストリップチューブに追加します。
   3. 各チューブに4μLのcDNA混合物を加えます。必要に応じて、滅菌水を加えて総体積を20μLにします。混合液を以下の温度で処理します:25°Cで5分、42°Cで30分、85°Cで5分、4°Cで無限に。
3. qPCRの実行
   1. さらに反応を行う前に、無菌水中でcDNAを1:10希釈します。
      注:cDNAは-20°Cで1ヶ月、または-80°Cで6ヶ月凍結することができます。
   2. プライマーを滅菌水で10μM濃度まで希釈します。適切な対照遺伝子やハウスキーピング遺伝子(例: B2M、 TBP1)を含めてください。
   3. 各ハウスキーピング遺伝子と興味のある遺伝子ごとにマスターミックスを作成し、各DNA条件を三重に実行できる十分な反応ミックスを確保しましょう。マスターミックスのレシピ(反応ごとの)は以下の通りです:2xPCRミックス:10μL、順方向プライマー(10μM):1μL、逆プライマー(10μM):1μL、滅菌水:8μL。
   4. qPCR反応プレートを96ウェル冷却した金属ブロックに置きます。各サンプルウェルに希釈したcDNA5 μL、反応マスターミックス20 μLを加えます。各井戸を点検して同じ体積が入っているか確認し、プレートシーラーを塗り、平らなエッジツールで気泡を滑らかにします。
   5. 板を1,000 × g 、4°Cで1分間遠心分離します。プレートをqPCRマシンに置き、正しい向きで装填します。
   6. qPCRソフトウェア上で、各ウェルごとにサンプルおよび関心遺伝子の同定を指定します。同じセットアップで複数回のレプリケートを実行する予定なら、テンプレートを作ることを検討してください。
   7. 表1に示されたqPCRプログラム(持続時間:~1:36時間)を実行してください。
   8. 結果を.としてエクスポートします。CSVまたは 。XLSXファイル。使用するqPCRマシンでエクスポートする値を選択できる場合は、エクスポートされたファイルにCT値が含まれているか確認してください。
   9. 各疾患および関心遺伝子の平均CT値を、対応する疾患のハウスキーピング遺伝子のCT値と比較して、各遺伝子のフォールド変化を計算します。車両の状態の折りたたみ変化を1.0に正規化します。

3. ウエスタン・ブロット

1. ウェスタンブロットのためのタンパク質単離
   注意:タンパク質収量を最大化するために、すべての手順を氷上で行ってください。
   1. バイオセーフティキャビネット内で、培養液を吸引してください。培養皿の底を覆うほどの冷たいPBSで細胞をすすぎます。吸引して、また繰り返します。
   2. プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤カクテルを補ったRIPAバッファーを追加し、タンパク質の分解を防ぎます。6ウェルプレートで培養するには75μLのRIPA溶液、または10cmプレートで200μLのRIPA溶液を使用します。
   3. 氷の上で作業する場合は、セルスクレーパーを使って溶けた細胞を優しくプレートから緩めます。プレートのすべての部分、縁も含めて細胞を取り除くことに特に注意してください。溶液は透明でやや粘性のあるように見えます。
   4. RIPAセルの懸濁液を冷却されたマイクロフュージチューブにピペットで移します。遠心分離機で最大速度4°Cで10分間サンプルを採取します。 上清液(タンパク質溶解液)を予備冷却チューブに移します。ペレットは捨てる。
   5. ブラッドフォードアッセイやBCAアッセイでタンパク質濃度を定量化します。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルリッチの純水を氷上で1 μg/μLに正規化します。
   6. ラエムリバッファーで溶解液を希釈し、最終的なタンパク質濃度がサンプル間で均一であることを保証します。タンパク質を変性させるために95°Cで10分間のボイル溶解液を使います。最良の結果を得るためには、準備直後にウェスタンブロッティングを行ってください。それ以外の場合は、タンパク質をLaemmliに短期的に-20°C(≤1ヶ月)、長期は-80°Cで保存してください。
2. SDS-PAGE用のアクリルアミドゲルの準備
   注意:アクリルアミドは神経毒であり、適切なPPE(白衣、耐薬手袋、目の保護具)を着用した状態でのみ取り扱うべきです。
   1. 使用する抗体の会社のウェブサイトを参照して、関心のあるタンパク質とその大きさを判断してください。対象タンパク質の予測サイズを用いて、ゲルにアクリルアミドの割合を決めます。
      注意:10%〜15%のアクリルアミドはほとんどの分子量によく合います。
   2. メーカーの指示に従ってジェルキャスティングスタンドとフレームを組み立ててください。
   3. 分離ゲルには、アクリルアミド、滅菌水、1.5 M Tris/HCl pH8.8バッファー、10%ドデシル硫酸ナトリウムを円錐形チューブ内で、準備するゲルのアクリルアミド数と割合に応じた適切な容量で混合します( 表2には2つのゲルに必要な成分が記載されています)。インバージョンでミックスします。
   4. 10%の過硫酸アンモニウム溶液を加え、TEMEDを加えます。ミックスするにはインバート(逆バージョン)をします。
   5. すぐに溶液をゲル鋳造フレームに加え、ジェル鋳造枠内の溶液の量が、コームを挿入する場合にコームの底に届くのに必要な量より少し下になるまで満たします。
   6. すぐに硬化ゲルの上に純粋なエタノールを滴ごとに100〜200μL加えます。タンパク質溶解液を解凍または変性させる必要がある場合は、この潜伏期間中に完了してください。タンパク質は氷で解凍します。
      注意:これにより溶液が分散し、ゲルが不均一に硬化しないようにします。
   7. 硬化したらエタノールを流し出します。スタッキングゲルの場合、アクリルアミド、滅菌水、0.5 M Tris/HCl pH6.8バッファー、10%ドデシル硫酸ナトリウムを円錐形チューブ内で、準備するゲルのアクリルアミド数と割合に応じた適切な体積で混ぜます( 表2 には2つのゲルに必要な成分が記載されています)。インバージョンでミックスします。
   8. 10%過硫酸アンモニウム溶液とTEMEDを混合物に加えます。インバージョンでミックスします。
   9. すぐに積み重ね液をゲルキャスティングフレームに加え、体積が上まで積み上げます。ジェルを注いだ直後にジェルコームを加えてください。ゲルキャスティングスタンドを軽く揺らした際に、ウェルの形状が変わらないまで~1時間休ませます。
3. ローディングゲル
   1. 電気泳動チャンバーにランバッファーを充填し、実行するゲル数に応じて適切な充填ラインに注ぎます。
   2. コームがまだ中にあるゲルフレームを電気泳動チャンバーに移します。ゲルの間の隙間にランバッファーを追加し、そのリザーバーが満杯になるまで続けます。浸したジェルから櫛を優しく引き抜きます。
   3. 各ゲルのウェルにラダー5〜10μLをピペットで注入します。
   4. 抽出したタンパク質5〜20μLとレームリバッファーサンプルを各ウェルにピペーパーで送ります。空の井戸に1xラエムリバッファーを5〜10μL加えます。
      注意:追加量は、対象タンパク質の有病率や抗体の有効性に基づいて最適化が必要になる場合があります。
4. SDS-PAGEの実行
   1. 電気泳動チャンバーを電源パックに接続します。150Vで45分間動作するように設定しました。
      注意:セットアップによっては、完全な移行により多くの時間や高い電圧が必要な場合があるため、必要に応じて調整してください。
   2. タンパク質がゲルの端(ゲルキャスターとゲルフレームが装置の下部で接合する部分)に移動したら、ランを停止してパワーパックをオフにします。
5. タンパク質移植の完了
   注:このセクションは迅速タンパク質輸送装置を用いて開発されました。
   1. 転写バッファーをゲルトレイに注ぎます。トランスファースタックを加え、その後ニトロセルロース膜、さらに液体へのトランスファースタックを加え、膜を中央に置くサンドイッチ状にします。サンドイッチスタックが完全にトランスファーバッファに浸透していることを確認しましょう。
   2. 迅速タンパク質輸送装置を起動し、対象のゲル数とタンパク質のサイズに合った適切なプロトコルを選択します。
      注:1.3 Aと25 Vで10分間は良好に動作することがわかっていますが、最適化が必要かもしれません。
   3. 鉗子で上部のトランスファースタックを取り除き、余分な液体がゲルトレイに流れ込むようにしてください。スタックをタンパク質輸送装置に移し、できるだけ平らかつまっすぐに置きます。ローラーや円錐形のチューブを使ってしわを滑らかにしましょう。膜でも同じことを繰り返します。
   4. 鈍い先端の工具を使って、鋳造フレームの上下半分を優しく切り離します。ゲルをタンパク質輸送装置の膜に移します。
   5. 鉗子を使って残りの移植スタックをゲルトレイから持ち上げます。余分な液体を抜き、膜ともう一方のスタックの上に置きます。ゲルボックスを閉じてプログラムを実行してください。
6. 抗体によるブロッキングと染色
   1. ゲルボックスを開けて鉗子で上部のスタックを取り除き、その後ジェルを持ち上げます。膜にはしごのバンドがあるか確認してください。膜を切断して、興味のあるサイズ範囲だけを選びます。
   2. 膜をきれいなブロットボックスに移してください。ブロッキングバッファーを5mL、または膜を覆う量を加えます。室温で1時間攪拌してブロックします。
   3. その間、推奨濃度の一次抗体を5mLの2%牛血清アルブミンに、膜ごとに洗浄バッファーに加えて、抗体染色の準備をしてください。家事用タンパク質用の染色(例:GAPDH、βアクチン)も使えます。
   4. 攪拌を解除し、ブロッキングバッファーを注ぎます。一次抗体溶液を5mL加えます。暗闇で攪拌し、4°Cで一晩(~12〜16時間)孵化させます。
      注意:今後は、すべての手順を暗闇の中で行うべきです。
   5. 室温で3分5分、洗浄バッファーを使って膜を洗います。
   6. 推奨濃度の二次抗体を5%のBSAにウォッシュバッファーに加えます。各膜ごとに5mLの溶液を準備します。
   7. 余分なウォッシュバッファーを流し出します。各ブロットに5mLの二次抗体溶液を加えます。暗闇で室温の攪拌下で1時間孵化します。
   8. 室温で洗浄バッファーを使って3回10分ほど洗います。すぐにイメージを。
7. 関心のあるタンパク質の検出と解析
   1. 選択したプラットフォームを使ったタンパク質の画像化。
   2. ImageJや他のプラットフォームを使って、関心のあるバンドの強度を定量化してください。

4. 不安定な鉄染料アッセイ

1. 不安定な鉄染料染色
   1. セクション1の全てを完了し、鉄処理を施した96ウェルプレートに細胞のシーディングを2時間かけて行ってください。鉄処理条件ごとに少なくとも3つのウェルを設け、さらに負(載体;培養培地+鉄キレート剤デフェロキサミン150μM)および陽性対照(培養培地+180μMのFAC+不安定な鉄染料共処理)対照群も確保してください。
   2. 1mMの不安定な鉄染料のストック溶液を、血清フリー培地で1:200の希釈液を1:200で準備し、各サンプルウェルごとに200μLを確保します。
   3. 培養培地から吸引してください。PBSで2回洗いましょう。
   4. 染色液を各ウェルに加え、37°Cで1時間培養します。
   5. PBSで一度洗ってください。PBSに置き換えてください。
   6. 蛍光顕微鏡の遠赤チャネル(646/662 nm)を使って細胞を画像化してください。画像を保存してエクスポートしてください。TIFファイル。
2. 染色解析
   1. 画像をImageJで開いてください。
   2. mボタンを押して測定ウィンドウを開きます。測定ウィンドウ内の「結果|」で測定値を設定し、面積、統合密度、平均グレー値を選択します。 OKを選択してください。
   3. ポリゴンツールを使って画像内の各セルの周りを描いてください。各セルの後にmを押すと、測定ウィンドウに測定値を追加できます。
   4. 画像内のすべてのセルが定量化されたら、すべての値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。 サークルツール を使って、セルが占拠されていないエリアで少なくとも3回の背景測定を行ってください。
   5. 以下の式を使って各細胞の補正された全細胞蛍光(CTCF)を計算します。
      CTCF = 積分密度 – (選択セル面積×背景平均グレー値)
   6. 鉄処理セルのCTCF値を車両セルと比較してください。CTCFが増加すると、不安定な鉄のレベルが上昇します。

5. 細胞発光アッセイ

1. 発光アッセイのための細胞処理
   1. セクション1を完成させ、各条件ごとに井戸数がn = 3に対応することを確認してください。少なくとも3つのセルフリー(完全な培地のみ)コントロールウェルを追加してください。各ウェルに100μLの細胞と培地を合計に加えるべきです。
   2. 未処理の細胞を一晩培養した後、必要に応じて処理や対照を適用してください。車両(未治療)状態、FACのみの疾患、細胞毒性+10μMフェロスタチン-1(抗フェロプトティック剤)、車両+1μM RSL3、および/または車両+10μMフェロスタチン-1+1μM RSL3を含めるようにしてください。治療効果を最大化し、過剰な細胞死を防ぐために望ましい期間(12〜24時間)インキュベートします。
2. 発光アッセイの完了
   1. 細胞処理後、発光緩衝成分を室温まで解凍します。必要な部品を組み合わせて、暗闇で保管して使用可能になるまで保管してください。温度保存の要件についてはキットの指示を参照してください。
   2. 細胞の処理が完了したら、キットの指示に従って細胞処理を行います。
      注:これには室温の平衡、その後発光バッファーの追加、そして最終的な短期の室温潜伏期間が含まれる可能性が高いです。発光バッファを追加したら、すべての手順は暗闇の中で行うべきです。
   3. プレートリーダーや類似の機器を使って発光を完成させ、記録してください。
      注:このプロトコルでは、積分時間は0.3秒でした。
   4. 実験井戸の発光値を、細胞フリーコントロール井戸の平均発光に正規化します。
      注:発光値が高いほど、生きた細胞の数が多いことを示します。

結果

私たちや他の研究者の過去の研究に基づき、細胞外鉄の増加がマウス筋細胞に細胞内鉄過剰負荷を引き起こし、下流のフェロトーシス関連反応を監視できると仮説を立てました。そのため、 図1に示されたC2C12ワークフローを開発し、細胞は下流アッセイに応じて2〜24時間の定められた濃度のアセリウムアンモニウムにさらされます。

モデルを検証する最初のステップは、FACが細胞内に侵入できることを確認することでした。 表3に記載された検証済みプライマーを用いて、フェリチンの重鎖および軽鎖の両方に対してqPCRを実施し、鉄の投入増加がフェリチンmRNA値の上昇と相関していることを確認しました (図2A,B)。タンパク質レベルでは、FAC濃度の増加とともにフェリチン値も同様に増加しましたが、これは用量依存性はないようです (図2C)。同様に、生体でFAC処理されたC2C12細胞を染色したところ、細胞傷害性鉄剤を投与した細胞と、重度の鉄剤と不安定な鉄染色を同時に正の対照群として処理した細胞は、未処理細胞や鉄キレーターであるデフェロキサミン単独曝露細胞(DFO; 図2D)。全体として、これらの結果はFACを通じて細胞培地に導入された鉄が実際に細胞内に入っていることを示唆しています。

FACが細胞内鉄負荷増加することを確立した後、次に鉄過剰がフェロトーシスに関連する分子および機能の変化を伴うかどうかを調べました。FACは Slc40a1 (フェロポルチン)の発現を増加させ(図3A)、 Hmox1 を上昇させました(図3B)。FACはGPX4タンパク質も減少させ、この減少はデフェロキサミンによって部分的に逆転しました(図3C)。RSL3による治療でもGPX4の減少が類似し、FAC応答をより広いフェロトーシス関連分子文脈に位置づけました。機能的には、細胞毒性FAC用量は12時間で発光ベースの生存率を低下させ、この早期の生存率低下はフェロスタチン-1によって救われました(図3D)。対照的に、24時間では条件間の分離がより顕著で変動が増します(図3E)。フェロスタチン1処理サンプルは細胞毒性FAC単独と比較して高めのままですが、この後の時点で全体のアッセイ動的範囲は減少します。これらのデータを総合すると、FAC処理は鉄過剰、フェロプトーシス関連の分子変化、そして時間依存的なC2C12細胞における生存率の低下を引き起こすことを示しています。

図1:鉄過負荷モデルの図示的要約。このモデルでは、C2C12細胞をシードし、鉄分浸入培地の生理学的に重要な用量の培養培地と直接分子分析で一晩培養させて処理します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:フェリックアンモニウムシエン酸塩添加後の不安定な鉄貯蔵およびフェリチン合成の増加。 (A)フェリチン重鎖および(B)フェリチン軽鎖のmRNAレベルは、シエン酸鉄アンモニウムの添加により増加します。(C) FTH1タンパク質レベルは、システムにフェリック鉄が添加されることで増加します。(D) C2C12細胞で、赤色の不安定鉄染料染色の前後および同時処理で不安定な鉄レベルが増加した場合、これはビクレット+デフェロキサミン対照群と比較して増加すること。共処理条件は、培養培地+180μM FAC+不安定な鉄染料を用いた同時処理を示します。誤差バーは+/- SDです。略称:FTH1 = フェリチン重鎖;FTL1 = フェリチン軽鎖;DFO = デフェロキサミン。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:FAC添加後のフェロトーシス関連分子変化および細胞生存率の時間依存性低下。FAC処理後、(A)フェロポルチン(Slc40a1)および(B)Hmox1のmRNAレベルが増加します。(C) FAC処理後および陽性対照RSL3の存在下でGPX4タンパク質が減少する;デフェロキサミンはFAC関連のGPX4減少を部分的に逆転させます。(D) FAC、RSL3、および/またはフェロスタチン-1による12時間処理後のC2C12細胞の発光(細胞フリー(培地のみ)ウェルに正規化。(E) FAC、RSL3、および/またはフェロスタチン-1による24時間処理後のC2C12細胞の発光が正規化される。誤差バーは+/- SDです。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

ステージを待って
1	温度を1.6°C/sで50°Cに上げ、2分間保持します
2	温度を1.6°C/sで95°Cに上げ、10分間保持します
PCRステージ(40回走)
1	95°Cで15秒保持
2	60°C、1.6°C/sまで下げ、1分間保持します
メルトカーブステージ
1	1.6°C/sで95°Cまで上げ、15秒保持します
2	60°C、1.6°C/sまで下げ、1分間保持します
3	0.15°C/sで95°Cまで上げ、1秒保持します

表1:プロトコルセクション2のqPCRプログラム(持続時間:~1:36時間)。

	分離ゲル			スタッキングジェル
構成要素	10%	12.50%	15%
アクリルアミド(mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
滅菌水(mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
トリス/HCl、1.5 M pH 8.8 (mL)	4.2			-
トリス/HCl、0.5 M pH 6.8 (mL)	-			1.25
10%ドーデシル硫酸ナトリウム(μL)	166			50
0.1 g/mL 過硫酸アンモニウム(μL)	80			25
テメッド	8.3			5

表2:ウェスタンブロット用の分離および積みゲルの成功するために必要な成分と体積の概要。 提供される体積は2つのゲル分に十分で、それに応じてスケール調整が可能です。パーセンテージは混合物中のアクリルアミドの量を示します。 注意:APSとTEMEDは鋳造準備の最後に加えるべきで、ゲル重合プロセスを誘発します。

遺伝子ターゲット	遺伝子シンボル	機能	種	フォワードシーケンス	逆順
ベータ2-マイクログロブリン	B2m	ハウスキーピング遺伝子	マウス	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
TATAボックス結合タンパク質	簡章	ハウスキーピング遺伝子	マウス	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
フェリチン重鎖	Fth1	鉄貯蔵タンパク質フェリチンのサブユニット	マウス	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTCTTTッタ
フェリチン軽鎖	Ftl1	鉄貯蔵タンパク質フェリチンのサブユニット	マウス	あ アカギャッグ	アガアグチャカ ガグ
ヘムオキシゲーナーゼ1	HMOX1	ヘム、CO2、鉄の存在下でビリベルジンをビリルビンに変換します。フェロプトーシスでは高濃度が存在します	マウス	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT(ちっと GAGCTAGTGC
フェロポルチン1	SLC40a1	過剰な鉄を細胞から運出します	マウス	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG カカッカットガ

表3:鉄輸送およびフェロトーシス遺伝子の検証済みqPCRプライマー一覧。 プライマーはC2C12細胞由来のmRNAに使用されるため、マウス特異的です。

ディスカッション

本研究の目的は、マウス筋の前身における鉄過剰の実用的な in vitro モデルを確立し、フェロトーシス関連反応が確実に検出される条件を定義することでした。このワークフローを用いることで、フェリックアンモニウムシエン酸塩処理は強健な細胞内鉄の蓄積をもたらし、フェリチン発現の増加と不安定な鉄信号の上昇を伴うことを示しました。鉄の負荷は、 Slc40a1および Hmox1の発現増加、GPX4タンパク質の減少など、フェロプトーシス関連ストレスと一致する分子変化とも関連しています。機能的には、細胞毒性FAC曝露は細胞生存能力の低下を誘発し、フェロスタチン1が早期にそれを救い、観測される細胞死に寄与するフェロプトーシス感受性成分の存在を支持します。

鉄の投与量と治療期間は、このシステムの解釈可能性に直接影響を与える重要なパラメータです。私たちの手元では、約12時間の早期時点が最も明確な条件の分離を提供し、フェロスタチン1がFAC誘発性の細胞毒性を再現性のある方法で救済することを可能にします。後の時間点(例:24時間)では、全体的な生存可能性が低下し、条件ごとに変動が増加するため、アッセイのダイナミックレンジは減少します。これは、抗酸化能力の増加や鉄分取り分の変化など、生存集団の蓄積的な細胞損失や適応と一致しています。

鉄鉄(Fe²⁺)ではなく鉄鉄(Fe³⁺)を投与すること、投与された鉄の濃度と治療期間もプロトコルの重要な側面です。鉄の使用は^{不可欠です。なぜ}なら、鉄鉄は鉄輸入の主要な輸送体であるトランスフェリンに容易に取り込まれるからです。鉄は他のトランスポーター(特に二価金属トランスポーターDMT1)に取り込まれることもありますが、この文脈では鉄¹²よりも鉄鉄がより効果的に取り込まれているように見えました。本プロトコルで選ばれたFAC濃度は、生理学的関連性と過去の類似モデルでの使用を考慮して選ばれました(^13,14)。鉄治療の時間は24時間で、私たちや他の研究者の類似モデルに基づいています。しかし、不安定な鉄染色や細胞発光アッセイなど、24時間が治療期間を長すぎる場合もあります。これらのケースでは、24時間の治療で細胞死が著しく、細胞物質の破壊により結論を出すことはできませんでした。例えば、RSL3は非常に強力な脂質過酸化剤であり、12時間の処理期間で脂質過酸化を誘発し、鉄過剰負荷の影響を同時に確認するのに十分でした(図3C-E)。さらに、不安定な鉄染料については、細胞は染色前に2時間だけFAC処理を行い(2時間、4時間、24時間の鉄処理後に染色を試みた後)、鉄過剰負荷に対する初期反応を捉え、過剰な細胞破壊を防ぐために行われました(図2D)。全体として、遺伝子およびタンパク質レベルの変化は鉄処理を12〜24時間後に最もよく測定したと考えられます。これは、これらの変化が細胞の進行に時間がかかるのに対し、染色はより短い処理時間後に行うのが最適であると考えられます。

他の企業も同様のモデルを開発しています。あるグループは、フェリックアイアン処理済みC2C12モデルを作成し、フェロプトーシスにおける p53-Slc7a11 軸の役割を研究しました。48時間の鉄酸塩処理で脂質過酸化が増加し、 Slc7a11 のレベルが低下し、フェロプトーシス¹³が示唆されました。もう一つの類似モデルでは、硫酸鉄処理済みC2C12細胞を用いて Akt-FoxO3-E3 ユビキチンリガーゼ経路とフェロトーシスの関係を調べ、4時間¹⁴分の鉄治療を行った。これらに共通しているのは、ミオチューブに分化したC2C12細胞に対して鉄処理を行うことであり、より幹細胞のような筋芽細胞状態にとどまらないことです。これにより、我々のシステムはMuSCsでこれまで観測された鉄の蓄積に特に関連しています。

この方法は、in vitroで筋肉への鉄過剰の影響を直接的に研究する方法であるにもかかわらず、C2C12細胞の文脈でのみ使用されているという限界があります。過去の研究では、筋肉幹細胞は加齢時に鉄過剰に反応しやすいことが示されており、同様の手法がその文脈で有効である可能性を示唆^{しています。}

このモデルを総合すると、鉄過負荷がC2C12細胞におけるフェロプトーシス関連の再現可能な分子変化と、フェロスタチン感受性の生存率低下を誘発するのに十分であることが示されています。追加の直交アッセイは特定の文脈で細胞死の分類をさらに精緻化できますが、ここで観察される分子および薬理学的な応答の組み合わせは、フェロプトーシスに関連する細胞ストレスと一致しています。このアプローチは、筋肉の老化や疾患における鉄の調節異常の機構的研究を促進すると期待しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	-20 °Cで保管する。氷の上で解凍する。
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	神経毒である。適切なPPE（ラボコート、手袋、目の保護具）を着用してのみ扱う。
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	アクリルアミドゲル鋳造用の重合剤として、無菌水中10%重量/体積溶液で使用。粉末は室温で安定しているが、溶液は長期的には-20 °C、短期的には4 °Cで保管する。
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	2% BSA + 洗浄バッファーで1:2000濃度で使用する。37 kDaで走行する。
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	使用には製造元の指示に従う。標準は最初の使用後4 °Cで保管する必要がある。
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	2% BSA + 洗浄バッファーで1:1000濃度で使用する。42 kDaで走行する。
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Laemmliバッファーの調製に使用する。
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	4 °Cで保管する。
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	液体窒素の蒸気相で保管する。
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	-20 °Cで保管する。氷の上で解凍する。
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	大きいので、10 cm以上のディッシュから細胞の抽出に使用する。
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	ヘッドが小さいため、マルチウェルプレートから細胞を除去するのに最適です。
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	フード内でのみ使用し、廃棄物は別の容器に入れる。
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	1錠を500 µLの無菌水に溶解して、100×溶液を作る。
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	CBS 170-120 Vモデルバージョン。細胞培養に使用する。
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFOは鉄キレート剤であるため、細胞に加えることで鉄含有量が低下します。1 Mのストック濃度で水に溶解する。
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	不安定な鉄染色と再構成に使用する。
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	1:5000の比率で、洗浄バッファー中の5% BSAに加える。
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	1:5000の比率で、洗浄バッファー中の5% BSAに加える。
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	室温の溶液にDMSO 50 µLを加えることでストック溶液を調製する。光に敏感。ストック濃度：1 mM
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	in vitroでのフェロプトーシスを阻害し、脂質過酸化の副産物を隔離する。10 mMのストック濃度でDMSOに溶解する。
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	C2C12細胞培養用のDMEMを補足するために使用する。体積比10%で追加する。
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless, 500 pcs.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	2% BSA + 洗浄バッファーで1:1000濃度で使用する。約20 kDaで走行する。
Glycerol, ultrapure	Thermo Fisher Scientific	15514011	6x Laemmliバッファーの調製に使用する。
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	RNA精製中のペレットを可視化するために使用する。
Image-iT Lipid Peroxidation Kit	Thermo Fisher Scientific	C10445	使用準備が整っている。光に敏感。ストック濃度：10 mM
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A	ウェスタンブロットバンドの強度と、顕微鏡画像からの補正された総細胞蛍光量を定量化するために使用する。