方法論記事

分子病理学者のためのIntegrative Genomics Viewer（IGV）を用いた臨床的バリアント解釈

DOI：

10.3791/71808

⸱

2026年8月14日

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1University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2University of Michigan, Department of Pathology, 3Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), 4University of Chicago, Department of Pathology, 5University of Colorado, Department of Pathology, 6University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 7Broad Institute of MIT and Harvard, 8University of California San Diego, Department of Medicine, 9Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

統合ゲノミクスビューア（IGV）ソフトウェアは、臨床的バリアントコールの根拠となるデータに対し、詳細かつ直感的な閲覧ウィンドウを提供します。ここでは、真の病原性イベントとアーティファクトを迅速に判別する方法を示す5つのビネットを提示し、次世代シーケンシングアッセイの分子的な判定（サインアウト）を行う実務者の診断的信頼性を最終的に高める手法を解説します。

要約

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Integrative Genomics Viewer（IGV）は、複雑なシーケンシングデータの可視化および解釈を可能にする、臨床ゲノミクスにおける極めて重要なツールです。シーケンシング結果の視覚的評価に臨床的知見を組み合わせて検討することは、分子病理医などの専門家が症例を評価し、最終診断を下すための主要な手段となっています。さまざまなソフトウェアツールが補助となりますが、それらと基礎データの関係性を理解し、体系的に適用する必要があります。本研究では、次世代シーケンシング（NGS）のデータファイル形式（例：FASTQ、BAM、VCF）について、そのフォーマットと目的を含む不可欠な背景知識を解説します。次に、これらのファイルから得られる詳細な情報を抽出するためのIGVの機能を説明します。また、臨床的なビネットに基づく一連の精選された実例を用い、読者がIGVソフトウェアを使用して臨床NGSシーケンシングデータを操作し、ヒト参照ゲノムに対するさまざまな臨床的に重要なバリアントを確認する方法を提示します。これらの臨床ビネットは、ゲノムデータの解釈における複雑性の例を示し、定型的なバイオインフォマティクス・ソフトウェアのアルゴリズムによるバリアントコールを超えて、日常的なワークフローの一部としてIGVを活用することで、バリアントに関するさらなる解釈上の情報をどのように得られるかを説明するために精選されました。IGV内のツールを用いたゲノムバリアントの視覚的検査により、バリアントアレル頻度、ストランドバイアス、組織特異的コンテキストなど、ゲノムバリアントの解釈に影響を与えうる微細なコンテキスト上の手がかりを明らかにすることができます。本研究は体細胞バリアントの検出および解釈におけるIGVの利用に焦点を当てていますが、提示されたアプリケーションは、複雑なバリアントの解析やモザイク現象の検出を含む、生殖細胞系列の設定での利用にも応用可能です。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年、次世代シーケンシング（NGS）技術を用いて診断、予後、および治療法の選択に情報を活用することで、腫瘍学的なケアは大きく変貌しました1。NGS検査は、1) 分子レベルで定義された腫瘍の診断の確定、2) 治療決定のための腫瘍型に依存しない（アグノスティックな）バイオマーカー結果の活用、3) 特定の腫瘍型におけるリスク層別化の決定という点において、複数の腫瘍型で標準治療となっています2,3。NGSおよびその他のバイオマーカー検査による正確かつタイムリーな結果は、腫瘍学における患者ケアと治療計画の極めて重要な構成要素となっています。

NGS検査は通常、大規模な参照検査機関、または、そのような検査を開発・維持するための十分な専門知識とリソースを有する病院内や大学の検査室で実施されます。Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) 組織は、学術的知識の共有および試薬コストの分担に焦点を当てた共同ネットワークとして構想されました4。GOALコンソーシアムの重要な取り組みの一つに、臨床研究のレビューおよび報告における不可欠な構成要素に関するトレーニングセッションがあります。これらは実践的な指導セッションとして開発されており、ゲノム医療における基本的および高度な機能を実演するための integrative genomics viewer (IGV) に関するインタラクティブなワークショップが含まれています。

IGVは、ほとんどのNGSデータが膨大で、グラフィカルユーザーインターフェースなしでは扱いづらいことを考慮し、ユーザーがNGSデータやその他の大規模データセットを容易に確認できるように設計されたデータ可視化ツールです5。IGVは当初から臨床的バリアント解析用に設計されたわけではありません。しかし、バイオインフォマティクスの経験レベルにかかわらず、あらゆる分子生物学の専門家にとって使いやすいため、複雑なデータレビューワークフローの一部として多くの研究室で広く採用されています6。本研究は、ゲノム解析に携わる研究室専門家のより広いコミュニティにこの情報を普及させるためのメカニズムとして構成されました。

臨床ワークフローの一部としてIGVを使用する臨床上の必要性には、シーケンシングエラーの検出、ゲノムバリアントコールの複雑性の処理、および適切なデータ解釈において追加の視覚化が有用となるその他の再発性変異への対応が含まれる。7IGVの使用には、NGS研究に由来する標準的なバイオインフォマティクスファイルが必要です。8IGVソフトウェアのコア機能により、シーケンシングデータの可視化が可能になります。臨床的なバリアント解釈を行うには、一連の設定とオプションを構成する必要があります（付随ファイル 1).

ショートリードシーケンシングのワークフローは、FASTQ、バイナリアライメントマップ（BAM）、およびバリアントコールフォーマット（VCF）というファイル規格によって特徴づけられます。NGSは、数百万本のショートリードを並行して生成することで、高いスループットを実現しています。この戦略によりデータ生成は大幅に加速されますが、各リードは元のDNAまたはRNAの断片にすぎません。各リードは、アダプター配列によってNGSフローセルの特定の位置に固定されます。光学処理から得られた配列情報とベースクオリティ情報は、FASTQファイルに記録されます。これらの生リードは、塩基配列とそのベースごとのクオリティスコアで構成されています。したがって、生リードを処理する初期段階として、各リードをリファレンスゲノムにアライメントします8。各リードにアライメント確率が最も高いリファレンスゲノム上の特定の位置が割り当てられるため、同一の位置に対応するリードが各遺伝子座に"積み重なり（pile up）"、そのようなデータはシーケンスアライメントマッピング（SAM）仕様（https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf で入手可能。最終確認日：2025年9月30日）に従ってBAMファイルに保存されます（図1A）。この情報は、IGVなどのゲノムブラウザで視覚的に確認できます。図1Bに示すように、リード同士、またはリードとリファレンス配列自体を比較することで、塩基配列間の差異や不一致を特定できます。ゲノム全体におけるこれら"バリアント"部位のみの要約がVCFファイルにまとめられます。そのため、VCFファイルはBAMファイルよりもサイズが大幅に小さくなりますが、バリアントレビューに必要な有用な情報の多くを保持しています。以上の理由から、VCFファイルは通常、バリアントコールパイプラインの最終出力となります（図1C）。つまり、FASTQファイルには生リードとクオリティデータが含まれ、BAMファイルはそれらのリードがどの程度の信頼性でゲノムにマッピングされているかを示し、VCFはリファレンス配列とサンプル配列の間の差異を表現しており、潜在的なレポート作成に向けたレビューにおいて、より扱いやすい分量のデータを提供します。

本研究における6つの臨床事例では、分子診断検査室における体細胞変異検出に関連する一般的な解析シナリオと、基礎データの正確な理解および解釈を困難にする問題について示しています。全体として、これらの事例は、より高度な解釈シナリオを例示し、IGVの高度な機能を活用することで、包括的なゲノム特徴をより適切に記述できることを示すために選定されました。本研究では体細胞変異の解釈に焦点を当てていますが、これらの機能は生殖細胞系列変異の可視化および解釈におけるIGVの利用にも適用可能です6。なお、本記事で使用される用語はシーケンシング・バイ・シンセシス（合成によるシーケンシング）化学に基づいており、適宜、他のプラットフォームにおける類似の用語や概念を併記しています。

各臨床ビネットは、非常に簡潔な臨床的背景から始まり、続いてバリアント（変異）の調査方法および、存在するバリアントのうちどれが真正で、どれがアーティファクトであるかという疑問を解決するための手順が説明されています。シーケンシングデータの詳細とともに、この臨床的背景が疑問への回答において重要となります。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここに提示されたデータは、シミュレーションデータと実際の患者のNGSデータの混合です。ただし、すべての患者データは、ラベルの除去と単一ロカスリードの抽出を組み合わせることで匿名化されています。本プロトコルは、すべての著者の所属機関における人間研究倫理委員会の適用ガイドラインに従っています。

1. Integrative Genomics Viewer (IGV) の最新版のダウンロード

注：IGVは、ヒトゲノムを含むさまざまなゲノムを視覚化するための無料ダウンロードプログラムです（https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/）。IGVは定期的に更新されており、最新バージョンの転写産物、フィーチャー、トラックが追加されます。通常、リストの最上部に最新バージョンが表示されます。

  1. 上記のユニフォームリソースロケータ（URL）から、「IGV for Windows, Java Included」という名前のファイルをデスクトップにダウンロードします。所属機関によっては、管理者権限が必要な場合があります。
  2. IGV内でホストされている、レポートから呼び出す予定のヒトゲノムビルド（例：hg19またはhg38）を選択します。
    注：本研究ではIGV 2.19.7を使用しました。このプロトコルでは、Java同梱のWindows版をダウンロードしました。IGVは、デフォルトのメモリ割り当てである8GbのRAMで実行されました。IGVの環境設定タブおよびその他のセクションで推奨される設定は、Supplementary File 1に記載されています。

2. 臨床ビネットの理解と必要ファイルのダウンロード

  1. GitHubリポジトリにアクセスします。すべてのファイルはGitHubリポジトリ https://github.com/Eitan177/Demo_IGV からダウンロード可能です。
    注意：GitHubリポジトリには各ビネットごとのセッションファイルが用意されており、このセッションファイルを読み込むことで、個別のファイルを読み込んで該当する遺伝子座まで移動させる手間を省くことができます。セッションファイルがこれらの手順を自動的に処理するためです。
  2. ファイルメニューからセッションファイルを読み込みます。File > Open Sessionをクリックし、適切なセッションファイルを選択してください。

3. カバレッジトラックの設定

注：IGVのメインウィンドウには"カバレッジトラック"が含まれています。特定の状況下では、特定の癌変異を含むリードがごくわずかであっても、臨床的に重要な意味を持つ場合があります。そのため、解析対象となるゲノム領域において非常に高いリード深度を達成することが極めて重要です。ある変異を含むリードがわずか2%である場合、その変異を確実に判定するには数百から数千のリード深度が必要になることがあります。これが"ディープシーケンシング"という用語の由来です。

  1. カバレッジトラックが表示されていることを確認する: 上部メニューから View > Preferences をクリックし、Alignments タブを選択します。タブの上部に 「Show coverage track」 というラベルのボックスがあります。ここにチェックが入っていることを確認してください。
  2. 臨床的に有意な低頻度バリアントの閾値を設定する：ステップ3.1で詳述した Alignments タブに移動し、Coverage allele-fraction というラベルのボックスが表示されるまで下にスクロールします。ボックス内の数値を 0.01 に設定し、Save をクリックします（Save をクリックすると、設定ウィンドウが閉じます）。

4. ソフトクリップリードの設定

注意：この設定は、遺伝子再編、コピー数変化、または挿入・欠失の複合イベントなどの大きな構造変異を検出するために非常に有用です。ソフトクリップされたリードが、標準的なバリアントコール法では見落とされる可能性のある構造変異の存在をどのように裏付けるかは、EGFR増幅および欠失に焦点を当てた高度なビネットなどで実証されています。

  1. ソフトクリップを有効にする： オーバーヘッドメニューから View > Preferences をクリックし、Alignments タブを選択します。Show soft-clipped bases のボックスまでスクロールし、チェックが入っていることを確認します（Supplementary File 1）。これにより、リファレンスに完全にマップされず、端が"クリップ"された部分的にアラインメントされたリードが表示されます。

5. 臨床事例

  1. ビネット #1：真の〜を区別する KRAS シーケンシングのアーティファクトによる（Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog）病原性バリアント。
    注：症例Aは、新たに肺腺癌と診断された65歳男性であり、組織学的評価では腫瘍含有率が約80%と推定された。NGSプロファイリングにより、以下のものが特定された。 KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C)変異体であり、これは非小細胞肺がん（NSCLC）における既知のドライバー変異である。その結果生じるミスセンス変異体 KRAS c.34G>T (p.G12C)は肺腺癌の約13%に認められ、標的治療の適応となる。9症例Bは、肉腫であることが判明している54歳の女性である（腫瘍50％、正常組織50％と推定）。同一の KRAS c.34G>本サンプルにおいてT (p.G12C) 変異が同定されました。しかしながら、 KRAS c.34G>T (p.G12C) が肉腫で報告されることは稀であり、その存在が認められた場合は、シーケンシング上のアーティファクトである可能性が疑われる。 
    1. IGVワークフロー（セッションファイル KRAS.xml）             
      1. データのロード：ゲノムのドロップダウンメニューからHg19を選択し、bamファイル（kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam）をロードして、chr12:25,398,281–25,403,833に移動し、以下に焦点を合わせます。 KRAS 遺伝子領域。インデックスファイル（bamファイルと同じ名前で、拡張子が.baiのもの）がbamファイルと同じディレクトリにある必要があることに注意してください。  
      2. カバレッジおよびVAFを調査する：エクソン2（NM_004985.5）のコドン12を確認する) 次に、カバレッジトラック内のバリアント位置をクリックし、その位置におけるリード深度を表示します。VAFが35%〜40%のG→T置換（トランスバージョン）が認められ、これはヘテロ接合性のクローナルドライバー変異と極めて整合性が高いことに注目してください（図2A）、特に腫瘍細胞率が約80%である状況において。   
      3. StrandBiasを確認する：ストランドごとに色分けする（参照 補足ファイル 1、ステップ4）により、肺サンプルにおいてフォワード（赤）：リバース（青）がほぼ50:50の分布であることが明らかになります。  
      4. ケースB（肉腫サンプル）について、ステップ5.1.1.1～5.1.1.3を繰り返します。bamファイル（kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam）をロードし、以下を確認してください。 <VAF（バリアントアレル頻度）が1%であり、かつほぼ排他的にフォワードストランドのみに支持されており、これはPCRまたはアライメントのアーティファクトであることを示唆している（図2B).
  2. ビネット #2: 多ヌクレオチド変異（MNV）の誤分類を解消する。
    注：転移性メラノーマの50歳女性に、NGSベースの腫瘍プロファイリングを実施した。解析により、潜在的な BRAF (B-Raf原がん遺伝子、セリン/スレオニンキナーゼ) c.1798_1799delinsAA変異。 BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E)は、さまざまな固形腫瘍においてより一般的であり、 BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) はメラノーマに比較的特異的であり、これは紫外線がCを誘導し得るためである。 > ジピリミジンのT転換10HGVSルールに従い、2つの一塩基変異（SNV）を シス体 単一のMNVとして命名されるべきです。多くの場合、バイオインフォマティクス・パイプラインにおいて、この複合変異が2つの隣接するSNVとして誤って同定されることがあります。 シス位に: BRAF c.1798G>Aおよび BRAF c.1799T>A. 技術的（すなわちバリアントコーラーに関連する）および生物学的（シス体 対 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。 （区別に関する）検討事項として、臨床レビュー時にデータの可視化が行われない限り、サインアウト（結果報告）時に変異が誤って報告される懸念がある。      
    1. IGVワークフロー（セッションファイル BRAF.xml）           
      1. データのロード：ゲノムのドロップダウンメニューでHg38を選択し、bamファイル（kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam）をロードして、chr7:140,453,136–140,753,336へ移動します。インデックスファイル（bamファイルと同名で、拡張子が.baiのもの）がbamファイルと同じディレクトリにある必要があることに注意してください。
      2. のコドン600を拡大します BRAF隣接するカバレッジトラックの位置が灰色ではなく緑色と青色であることから、p.V600Kと一致するGT→AAジヌクレオチド置換を確認する。. 
      3. 2つの個別のSNVをスキャンし、それらが〜にあるかを確認する シス（cis） または 翻訳してください。両方のSNVが同一のリードにマッピングされており、かつ～にあることに注意してください。 シス.  
      4. ストランドとカバレッジの調査：リードを色分けして、フォワードおよびリバースのサポートがほぼ均等であることを示す（参照 補完ファイル 1、ステップ4）、およびクローナルドライバーと一致する50%を超えるVAF。カバレッジトラックの閾値は0.01（参照 補足ファイル 1（セットアップの手順3）により、部分的なサブクローンが存在する場合でも、それらが可視状態に維持されることが保証されます（図2C).  
      5. 文脈およびMNVの命名法についての注意：2つのヌクレオチド置換が互いに隣接している。専門家のコンセンサスに基づき、同一のシークエンスリード上にマップされ、かつ距離が50 bp以内のSNVは、単一の変異として定義する。 "複合体" または "欠失挿入（delins）" 変異体11. 
  3. ビネット #3：～を調査する キット 胃腸管間質腫瘍（GIST）におけるKITプロトオンコジーン（受容体チロシンキナーゼ）のエクソン9挿入
    注：胃腸管間質腫瘍（GIST）の58歳男性患者が切除術を受け、NGS検査がオーダーされた。結果、以下の変異の可能性が示された。 キット. キット 変異はGISTにおいて頻度の高いドライバーであり、約75%の症例で認められ、治療標的となります。エクソン11の活性化変異に続き、 キット エクソン9の活性化変異が最も一般的なドライバーとして同定されていますが、エクソン9変異GISTとエクソン11変異GISTでは、チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性が異なります。12. 
    1. IGVワークフロー（セッションファイル KIT.xml）
      1. データの読み込み：Hg19ゲノムを選択し、BAMファイル（KITdupmod2.bam）を読み込みます。その際、インデックスファイル（BAMファイルと同名で、末尾が.baiのもの）が同一ディレクトリにあることを確認してください。chr4:55,592,144-55,592,257（エクソン9の一部に相当）まで移動します。 キット 遺伝子
      2. ビューを圧縮する：アライメントトラックを右クリックし、以下を選択します。 圧迫された 表示を凝縮するために（図3A).
      3. インサートの特定：55,592,178番目と55,592,179番目の位置にあり、カバレッジトラックの直上に表示されている、矢印のような形状のインサーションマーカーを確認します。これは短鎖インサート（図3B,C).
      4. インサートを操作する：矢印をクリックして表示を拡大し、ギャップを埋める塩基を持つリードのいずれかをクリックして、ポップアップで詳細を確認してください。挿入された配列とリファレンス配列を比較し、それが重複であるかどうかを判断します（図3D,E).
      5. カバレッジを確認します。挿入箇所を示す矢印の直近にあるカバレッジトラックをクリックして、支持リード数を表示させます。これを総リード数と比較することで、おおよその変異アレル頻度（VAF）を決定でき、本例では約28%となります。
      6. ストランドバイアスの確認：リードをリードストランドごとにソートし、ソフトクリップされた塩基を確認します（参照： 補足ファイル 1（セクション3）を参照し、リバースリードにおける挿入部位に隣接する関心領域を示す。図3F).
  4. ビネット #4：～を調査する 上皮成長因子受容体 非小細胞肺癌（NSCLC）における（上皮成長因子受容体）EGFR exon 19欠失。
    注：非小細胞肺癌（NSCLC）と新たに診断された70歳の女性患者に対し、腫瘤の外科的切除術が行われた。十分な腫瘍純度を有する組織切片を用いてNGS（次世代シーケンシング）が実施され、その結果、以下の変異の可能性が示された。 EGFR多く EGFR これらの変異はチロシンキナーゼ阻害剤に感受性があり、このバリアントは患者の治療および予後に影響を及ぼす可能性がある。13.
    1. IGVワークフロー（セッションファイル EGFR.xml）
      1. ロード データ：Hg19ゲノムを選択し、bamファイルEGFRE746_A750delmod.bamをロードします。インデックスファイル（bamファイルと同名で、拡張子が.baiのもの）が同じディレクトリにあることを確認し、エクソン19の一部に相当するchr7:55,242,420-55,242,513へ移動します。 EGFR 遺伝子
      2. カバレッジトラックを用いて欠失を調査する：カバレッジトラックを確認し、リードの両端ではない位置にある、カバレッジが低下している狭い領域を特定する（図4A,B）。カバレッジトラックを確認すると、エクソン19の一部でカバレッジが低下していることがわかります。
      3. リードを用いて欠失を調査する：アライメントビューを拡大し、リード内の黒い線で示されるアライメントギャップを持つリードを表示します（図4C,D).
      4. ゲノムコンテキストを考慮する：欠失に関与する、およびその直近周囲のリファレンスのヌクレオチド配列を調査する。リファレンス配列内での位置を考慮して欠失コールを評価する。ホモポリマー領域や反復領域における欠失は、特にバリアントアレル頻度が低い場合に、シーケンシングアーティファクトである可能性がある。次を参照。 小さな欠失の観察 ～の一部 補足ファイル 2 ワークフローの詳細な説明については。
  5. ビネット #5：調査 EGFR 膠芽腫患者における変異。
    注：77歳の女性、～を伴う イソクエン酸デヒドロゲナーゼ 野生型神経膠芽腫について、次世代シーケンシング（NGS）検査を実施した。その結果、～の可能性が示された。 上皮成長因子受容体 (EGFR) コピー数増加および潜在的な EGFRvIII 再編成（エクソン2–7の欠失）。両方の 上皮成長因子受容体（EGFR） 増幅と EGFRvIII これらの変異は、膠芽腫において予後的および治療的な意義を持ちます。さらに、これら2つの変異は頻繁に共起するため、低レベルで検出された場合に、一方の存在がもう一方の妥当性を裏付ける可能性があります。
    1. IGVワークフロー（セッションファイル copynumber.xml）：
      1. データのロード：Hg38ゲノムを選択し、セグメントファイル（proband.seg）および比較サンプルをロードします。 c1.seg-c9.segをIGVウィンドウにドラッグ・アンド・ドロップして読み込みます。その後、Chr7へ移動します。
        注：CNVKitから生成されたセグメンテーションファイルがダウンロード用に提供されています。CNVKitを用いてコピー数定量を行うための全ワークフローは、本研究の範囲外です。簡潔に述べると、正常で正倍数性の検体で構成される既製のプール参照試料を用いたCNVKitバージョン0.9.9（https://github.com/etal/cnvkit からダウンロード可能）を使用しました。入力データは、ゲノム全体に分布する9,144箇所のCNVバックボーンプローブ位置を含むbedファイルで構成されています。ここでの重要な考慮事項は、コピー数パイプラインの入力およびパラメータの詳細は、1回のランにおけるすべてのサンプルに同一の設定を用いて処理されるという事実よりも重要ではないということです。これにより、系統的バイアスの認識が容易になります。
      2. ヒートマップの評価：目的のサンプルの相対的な色の強度を比較します（このサンプルに対応するヒートマップの行を探します。ラベルは 発端者) およびその他のサンプル (c1-9) を用い、真のコピー数変化とアーティファクトを区別します。
        注：すべてのサンプルの同一遺伝子座を垂直方向に視覚的に比較することで、背景に対する各サンプルの当該遺伝子座におけるアノマリー（行をまたいだ色の違いに基づく定性的な差異であり、定量的な差異ではないもの）を特定します。以下を参照してください。 図5 および コピー数変化の視覚化 ～の切片 補足ファイル 2 詳細な手順については、こちらをご参照ください。
  6. ビネット #6：調査 EGFRvIII 膠芽腫患者において。
    注：同一の患者に、～の根拠も認められる。 EGFRvIII 再構成（エキソン2–7の欠失）。いずれの EGFR（上皮成長因子受容体） 増幅および EGFRvIII これらの変異は、膠芽腫において予後的および治療的な意義を有します。さらに、これら2つの変異は頻繁に共起するため、低レベルで検出された場合に、一方の存在がもう一方の妥当性を裏付ける可能性があります。
    1. IGVワークフロー（セッションファイル egfr_vIII.xml）：
      1. データの読み込み：Hg19ゲノムを選択し、患者のbamファイル（proband.bam）を読み込みます。その際、インデックスファイル（bamファイルと同名で、拡張子が.baiのもの）が同じディレクトリにあることを確認し、以下へ進みます。 EGFR 遺伝子
      2. ～のブレイクポイントを可視化する EGFRvIII表示を調整し、候補となるブレークポイント（エキソン2の上流およびエキソン7の下流）を個別に検討します。 EGFRvIII）、そして「ベースでソート」を実行します。  （またはショートカットを使用） Ctrl-s Windows/Linux上、または Cmd-s （Macの場合）ブレークポイントにおいて、ソフトクリップされたリードのパイルアップを可視化します。
      3. BLATでリードをアライメントする：ソフトクリップされた配列を右クリックして、以下を選択します。 BLAT配列（IGVはUCSCのデフォルト設定を使用しています。BLATのデフォルトパラメータについては、https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html を参照してください）。最初の行をクリックし、以下を確認します。 BLAST検索（BLATトラック） IGVトラックセクションの下端に表示されます。
        注：エクソン1／イントロン1の接合部およびイントロン6／エクソン7の接合部の両方にマッピングされるリードが1本でもあれば、それだけで十分な根拠となり得ます。 EGFRvIII、 別のサンプルからのクロスコンタミネーションがこのリードの原因ではないことが確認できれば、（それに限り）。〜を参照してください。 図6 および 構造再編の観察 ～の切片 補足ファイル 2 詳細な手順については、こちらを参照してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

なお、本研究は臨床報告におけるIGVを用いたバリアントレビューの詳細な検討に焦点を当てています。最終的な臨床報告は、各ラボで検証されたパイプライン、品質基準、および報告方針に基づく必要があります。この重要なトピックに関する完全な議論は本研究の範囲外ですが、米国医学遺伝学・ゲノミクス学会（ACMG）および分子病理学協会（AMP）によって推奨される標準規格およびガイドライン7が策定されており、臨床検査施設で定期的に導入されています。

症例提示 #1 の解釈：

高いVAF、バランスの取れたストランド分布、および肺癌におけるKRAS c.34G>T (p.G12C)の既知の発生率（図 2A）を考慮すると、症例Aのバリアントは標的療法につながる可能性があり、臨床的に報告することが極めて重要です。2例目（肉腫）の症例においても、同じKRAS c.34 G>Tバリアントに対して陽性の判定がなされましたが（図 2B）、偽陽性判定を示す複数の警告サインが存在します。(1) 報告されたバリアントアレル頻度（VAF）が約1%であり、低腫瘍含有率（20%）と推定されるサンプルにおいてドライバーイベントに期待される値より大幅に低いこと、および (2) このバリアントを支持するリードにストランドバイアスがあり、ほぼフォワードストランドのみに現れていることです。この種の癌における生物学的妥当性の欠如と合わせ、これらの根拠は症例Bの検出結果がアーティファクトであることを示唆しています。

臨床ビネット #2 の解釈：

このビネットでは、臨床医が留意すべき複数の異なるエラーについて説明します。第一に、バリアントコーラーは、隣接する遺伝子バリアントを2つのSNVとして、あるいは単一のMNVとして、適切または不適切にコールする場合があります（図 2C）。これは、体細胞バリアントコーラーにおけるハプロタイプを考慮したバリアントコールアルゴリズムの実装に差があるためです。この機能を組み込んでいるバリアントコーラーは、最近発表されたごく少数のものに限られています14,15。第二に、このような技術的および命名法に基づく差異が、異なるバイオインフォマティクスパイプラインを使用するシーケンシングセンターによって外部データベースに登録されます。そのため、本来は単一の遺伝子バリアントとして記載されるべきものが、複数の異なる記述として含まれている可能性があります。データベースのフェージングが定期的に行われない限り、これは下流の臨床解釈にさまざまな不都合な影響を及ぼす可能性があります。総合すると、これらの潜在的なエラーの原因が重なり、不正確な患者報告書につながる恐れがあります。このような複雑なシナリオは、IGVなどの高品質なソフトウェアを用いたバリアント可視化の価値を強調しています。

臨床事例 #3 の解釈：

GISTにおける exon 9 重複による KIT の構成的活性化の既知のメカニズムと、重複に対するマルチリードのサポートを考慮すると、この KIT c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) 変異はアーティファクトではなく、真正であると結論付けることができます（図3）。KIT変異はGISTにおいて頻度の高いドライバーであり、約90%の症例で認められます。ここでは正確な変異特性の評価が極めて重要です。なぜなら、exon 11 の活性化変異が最も一般的である一方、exon 9 変異を有するGISTはチロシンキナーゼ阻害剤への感受性が異なり、治療アプローチが変わるためです。GISTにおける KIT 変異の臨床的重要性を考慮し、本変異を最終報告に含めるべきです。

臨床事例 #4 の解釈：

カバレッジトラック、典型的な短い欠失の形態、リードの裏付け、およびNSCLCにおけるEGFRエクソン19欠失の恒常的活性化の既知のメカニズムに基づき、このEGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del)変異はアーティファクトではなく、真正であると結論付けることができます（図4）。このよく知られたエクソン19欠失を含む多くのEGFR変異は、チロシンキナーゼ阻害剤に対して高い感受性を示します。 NSCLCにおけるEGFR変異の臨床的重要性を考慮すると、この変異は最終報告書に含めるべきです。

臨床事例 #5 および事例 #6 の解釈：

ヒートマップ表示によりEGFRの増幅が確認され、BLATで評価したエキソン1と8の間のブレイクポイント接合部により、この患者における両方の所見が裏付けられました（図5および図6）。EGFR増幅は一般に、より進行性の疾患の予後因子と考えられており、EGFRvIII遺伝子再構成はGBM特異的なバイオマーカーであり、潜在的な治療標的となります16,17。

選択したワークフローは、GitHubリポジトリ https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (2026年6月9日更新) のメインブランチに保存されているファイルを使用して再現可能です。このリポジトリには、各ビネットに対応する6つのセッションファイル、アライメントファイルを使用する各ビネットに対応する5組のbamおよびbaiファイル、そしてアライメントファイルの代わりにセグメントファイルを使用するビネット5用の10個のsegファイルが含まれています。

figure-results-1
図1NGSファイルの標準規格およびシーケンシングワークフロー。 (Aフローセル上で生成されたショートリードは、光学的な測定によって追跡され、配列データと塩基ごとのクオリティスコアの両方を含むFASTQ形式で保存されます。これらのリードはその後、 ソート済み および アライメント済み リファレンスゲノムにマッピングし、各リードを含むBAMファイルを生成します "蓄積した" その対応する遺伝子座に。Bリファレンスとリードの間の不一致（点突然変異や小さなインデルなど）は、バリアントコールアルゴリズムによって同定されます。C最後に、これらの検出された変異をVCFファイルにまとめ、その位置、リファレンス/オルタナティブ塩基、およびその他のアノテーションデータを集約します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

figure-results-2
図 2: IGVに基づくKRAS c.34G>T (p.G12C)およびBRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K)の可視化。 (A) IGVにおける実際のバリアント (KRAS c.34G>T (p.G12C)) の可視化。高いリード深度（数千リード）であり、リードの約35–40%にG→Tの変化があることが示されている。フォワードリード（赤）とリバースリード（青）のバランスが取れており、真のヘテロ接合性変異であることが示唆される。 (B) 非関連組織におけるアーティファクトの疑い。リードの支持が極めて少ないバリアント (1% VAF) が示されている。変異リードのほとんどがフォワードストランド（赤）に現れており、ストランドバイアスが認められる。 (C) IGVで観察された複雑なバリアント BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K)。cisでの2塩基置換 (GT→AA) が明らかになっている。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図3小さな挿入の可視化 (A) "圧壊された" ～の様子 キット IGVにおけるエキソン9を確認することで、目的領域を特定します。B) インサーションバーとソフトクリップされた塩基を可視化することで特定した関心領域（赤枠）。(C) 設定 "拡張された" IGVで表示し、インサーションを可視化します。D挿入バー（赤枠）をクリックすると、挿入された配列が表示されます。E挿入配列をリファレンス配列と比較し、重複塩基を特定します。Fリードをリードストランドごとにソートすると、ソフトクリップされた塩基がリバースリードにおける挿入に対応していることがわかります。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4: 小規模欠失の可視化。 (A) 多数のリードに欠失が存在することを示すEGFRエクソン19の「圧縮」表示。 (B) カバレッジトラックを用いて、欠失内部および隣接部位のリード数を確認している。 (C) 欠失を示し、欠失塩基数を特定している「拡大」表示。 (D) リファレンス配列（赤枠）との比較により、欠失塩基を特定している。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 5: コピー数増加の可視化。 (A) segファイルには、サンプルID、染色体、開始点、終了点、セグメント内のマーカー、およびセグメントの平均値の6つの列があります。 (B) segファイルをIGVに直接読み込むことで、便利な可視化が可能です。 (C) ゲノムワイドビューでのデータの可視化。各サンプルが1行のデータとして表示され、色は値を指定し、赤は>0、青は<0を示し、色が濃いほど0から離れた値であることを反映します。対象のサンプルと同一ランから無作為に選んだ9つのサンプルを開くと、10行のマルチサンプルヒートマップに結果が表示されます。対象のサンプルは下部の赤色の枠で強調表示されています。 (D) EGFR遺伝子座にビューを絞り込むと、下部の対象サンプルに赤いバーが見え、無作為サンプルには白いバーまたは青いバーが見えます。対象サンプルと他行の無作為サンプルとの間のこの色の差は、対象サンプルにおける増幅判定が、この遺伝子座におけるバックグラウンドまたはノイズを上回っていることを示しています。 (E) chr7までズームアウトすると、本サンプルのEGFRを含む遺伝子座と、無作為サンプルのそれとの間にコントラストが認められます。EGFR増幅は、最下部のサンプルの赤い細い線として表示されます。 (F) MET遺伝子座にビューを絞り込むと、MET増幅が対象サンプルと共に9つの無作為サンプル全体でさまざまな程度で再現されており、この増幅判定がアーティファクトであることを示唆しています。これは、EGFR遺伝子座における真のコピー数判定とアーティファクトの外見上の違いを強調しています。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-6
図6: EGFRvIII 遺伝子再編成の可視化。このケースを処理する前に、ソフトクリップ塩基の可視化設定が完了していることを確認してください（詳細は補足ファイル1を参照）。(A) 最初の候補接合部へ移動し、アライメントトラックの表示を「Squished」に設定します。(B) その領域を移動しながら、塩基順にソートするショートカット「control-s」を繰り返し適用し、アライメントトラックの上部に同様のソフトクリップリードのパイルアップが表示されるまで操作します。パイルアップ内で同様のソフトクリップリード（赤枠）の数が多いほど、構造再編成の信頼性は高くなります。(C) BLATツールは、ソフトクリップ塩基の配列を抽出し、その配列がゲノムのどこに存在するかを特定し、ターゲットデータベース内の特定の配列とどの程度密接にアライメントしているかを示す定量的なスコアを表示します。特定の行を選択すると、その位置へ移動します。(D) 再度「control-s」による塩基ソート機能を使用すると、今度はリードの反対側でソフトクリップのパイルアップが確認できます。hg38リファレンスに対してサンプルに追加の塩基がないことを確認するために、ソフトクリップ塩基が連続しているリードを右クリックし、再度ソフトクリップ塩基をBLATします。表示されるテーブルには、接合部の最初のブレイクポイントである、最初に可視化した領域（エキソン1-イントロン1接合部）が表示されます。(E) 最上行を選択すると、最初のブレイクポイントに戻ります。BLATリファレンスアライメントの接合部にある塩基は、クエリとして使用したソフトクリップ塩基と同一であり、ソフトクリップリードの連続全体がリファレンス配列アライメントに含まれていることを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1： 推奨されるIGV設定。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 2：要約ワークフロー。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

臨床報告のための正確なバリアントレビューは、複雑なバイオインフォマティクスアルゴリズムと、IGVを用いた複雑なバリアントの視覚的レビューの統合に依存している。5,6本研究は、IGVにおいて単純および複雑なゲノム変異を可視化するための推奨設定を簡潔なリソースとしてまとめることを目的として設計されました。補足ファイル 1）。本研究では、一般的な体細胞変異と、それらをIGVで確認する方法に焦点を当てる。

本プロトコルでは、まず単純置換変異（図2A）と複雑置換変異（図2C）の評価から始め、同定された所見が実際のものであるか、あるいはアーチファクトであるかの判定に特に重点を置きます。次に、単純挿入（図3）および単純欠失（図4）へと進み、これらの変異がIGV上でどのように表示されるかを明らかにします。最後に、コピー数異常（図5）や構造再編（図6）を含む複雑なゲノム異常について解説します。これらの各特徴における主要なステップをまとめた簡略化ワークフローは、付録ファイル2に要約されています。本研究は、さまざまなゲノム異常がIGVでどのように表示されるかについて、読者に習熟してもらうことを目的としています5。

なお、IGVはバリアントを独立して検出するためのパイプラインツールとして利用されるものではありません。本稿の範囲外となりますが、バリアントアレル頻度およびカバレッジ深度に関するアッセイバリデーションの限界に基づいた報告すべきバリアントへの対応、特定の状況下でバリアントの直交確認が必要か否か、バイオインフォマティクスソフトウェアのバージョン管理に伴う複雑性、および視覚的解釈における観察者間誤差について、研究室では十分に検討し、臨床検査室では規定することが強く推奨されます1,7。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全著者は、利益相反がないことを開示します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IGVソフトウェアのすべての開発者、および現在IGVの開発を支援しているNIHグラント U24CA258406に深く感謝いたします。本研究の開発にあたって、外部からの資金提供は受けておりません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BLATBLAT Search Genomehttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatスタンドアロンのBLATウェブページ。BLAT APIはIGV内で利用可能であり、追加のインストールは不要です
CNVKitGitHubhttps://github.com/etal/cnvkitCNVKitを無料でダウンロード可能な公開GitHubリポジトリ。CNVKitのダウンロードおよび実行手順もこちらで確認できます
ビネット #5 用の比較セグメントファイル #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.segコピー数ファイル
ビネット #5 用の比較セグメントファイル #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.segコピー数ファイル
ビネット #5 用の比較セグメントファイル #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.segコピー数ファイル
ビネット #5 用の比較セグメントファイル #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.segコピー数ファイル
ビネット #5 用の比較セグメントファイル #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.segコピー数ファイル
ビネット #5 用の比較セグメントファイル #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.segコピー数ファイル
ビネット #5 用の比較セグメントファイル #7GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.segコピー数ファイル
ビネット #5 用の比較セグメントファイル #8GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.segコピー数ファイル
ビネット #5 用の比較セグメントファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.segコピー数ファイル
ヒトゲノム配列ヒトゲノム配列https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gzHg38ヒトゲノムビルドを含むダウンロード可能なfastaファイル。 これはIGV内で利用可能であり、追加のダウンロードは不要です
ヒトゲノム配列ヒトゲノム配列https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gzHg19ヒトゲノムビルドを含むダウンロード可能なfastaファイル。これはIGV内で利用可能であり、追加のダウンロードは不要です
IGVソフトウェアバンドルIGVソフトウェアhttps://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exeJava (JDK 21) 搭載の IGV ソフトウェアバージョン 2.19.7。無料でダウンロード可能です。提示されているリンクはWindows用ですが、LinuxおよびMac用リンクも利用可能です
ビネット #5 ケース用セグメントファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.segコピー数ファイル
チュートリアルGitHubリポジトリGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main6つのビネットを再現するために必要なすべてのファイルを含む公開GitHubリポジトリ
ビネット #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xmlセッションファイル
ビネット #1 ケース A bai インデックスGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam.bai		アライメントファイル
ビネット #1 ケース A bam アライメントファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam		アライメントファイル
ビネット #1 ケース B bai インデックスGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam.bai		アライメントファイル
ビネット #1 ケース B bam アライメントファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam		アライメントファイル
ビネット #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xmlセッションファイル
ビネット #2  bai インデックスGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai		アライメントファイル
ビネット #2  bam アライメントファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam		アライメントファイル
ビネット #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xmlセッションファイル
ビネット #3 bai インデックスファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.baiアライメントファイル
ビネット #3 bam アライメントファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bamアライメントファイル
ビネット #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xmlセッションファイル
ビネット #4 アライメントファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bamアライメントファイル
ビネット #4 bai インデックスGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.baiアライメントファイル
ビネット #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xmlセッションファイル
ビネット #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xmlセッションファイル
ビネット #6 bai インデックスGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.baiアライメントファイル
ビネット #6 bam アライメントファイルGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bamアライメントファイル

参考文献

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