方法論記事

C57BL/6マウスにおける毛髪再生に向けた3BDO搭載溶解性マイクロニードルパッチの作製および評価

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DOI：

10.3791/71814

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2026年8月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Stomatology, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、マウスの毛髪再生モデルにおける経皮薬物輸送のための、3BDO封入型溶解性マイクロニードルパッチの作製、特性評価、および応用について説明します。

要約

男性型脱毛症（AGA）に対する従来の治療法には限界があるため、代替的な投与アプローチが求められています。本プロトコルでは、C57BL/6マウスの毛髪再生モデルにおける、3BDO封入ヒアルロン酸/キトサン（HA/CS）溶解性マイクロニードル（MN）パッチの作製、特性評価、および適用について記述します。この手法では、ポリジメチルシロキサン（PDMS）モールドを用いた2段階の成形プロセスを採用し、薬剤を含まないHA/CS基材層を形成しつつ、ニードルの先端に3BDOを濃縮させます。パッチの特性評価は、走査電子顕微鏡（SEM）観察、機械的試験、皮膚への刺入および溶解試験、in vitro放出試験、抗菌試験、細胞毒性試験、およびin vivo毛髪再生評価によって行われます。刺入後、MNの先端が溶解し、3BDOが局所的に放出されます。In vivo評価の結果、3BDO封入MN群は、皮下注射群および対照群よりも均一な毛髪再生を示しました。また、本プロトコルは、パッチの形態、刺入性能、および局所的な生体適合性の評価も可能です。本手法は、毛髪再生への応用に向けて、MNを介した3BDO投与を評価するための前臨床ワークフローを提供します。

概要

男性型脱毛症（AGA）は、主に頭髪の進行的な菲薄化と脱落を特徴とする、最も一般的な臨床的脱毛疾患の一つである。男性における生涯有病率は一貫して高く、早急な解決が求められる重要な健康課題となっている1,2。現在、AGAの臨床治療は主に薬理学的介入と外科的移植に分類されるが、いずれも大きな欠点がある。フィナステリドやミノキシジルなどの第一選択薬は一定の治療効果を示すが、性機能不全、頭皮の瘙痒感、頭皮の乾燥といった明確な副作用を伴う1,3。自毛植毛は局所的な発毛を実現できるが、治療費の高騰、ドナー領域の毛量不足、移植後の生着率の変動といった制限があり、臨床現場で広く普及させることは困難である1。これらの限界を踏まえ、有効性、安全性、および患者のコンプライアンスを兼ね備えた新しい治療戦略が必要とされている。

3BDOは、ラパマイシンと競合する低分子mTOR活性化剤である4。これは、さまざまな系においてオートファジー阻害剤として広く用いられてきた5,6,7。例えば、3BDOによる長期的な処置は、オートファゴソームの数を減少させることで記憶機能を改善させ得ることが示されている8。加えて、3BDOがmTOR活性化剤として独立して作用することを示唆する証拠が蓄積されつつある。例として、3BDOはmTOR活性とは独立して、マウスにおける血管内皮細胞の死および動脈硬化の進行を抑制した9。しかし、毛包の成長におけるその潜在的な役割については報告されていない。特筆すべき点として、我々の予備研究において、3BDOが毛髪の再成長を促進することが見出された。しかし、従来の局所的な薬剤投与法には明らかな限界がある。皮膚の角質層が経皮吸収効率を制限するため、真皮にある毛包という標的部位に薬剤を届けることが困難である。経皮吸収性ゲルは薬剤の保持時間を延長できるが、好ましくない残留物を残す可能性がある。上述した両方の治療戦略の臨床的有効性は、依然として不十分である10,11。

マイクロニードル（MN）は、角質層を容易に透過し、表皮と真皮の境界にある毛包周囲の微小環境に薬剤を正確に届けることができるという核心的な利点を持つ、斬新で無痛の薬物送達技術である。さらに、MNは使用が簡便であり、低侵襲で、コスト面でも合理的である12,13,14。外用3BDOの経皮送達におけるボトルネックを解消するため、ヒアルロン酸（HA）をマトリックス、キトサン（CS）を機能性成分として用いたMNパッチが開発された。CSの導入は、抗菌能を持つ機能性成分を提供することを目的としている。また、脱毛したマウスの皮膚にHAを適用することで、毛包の発達を著しく刺激できることが示されている15。したがって、本プロトコルでは、3BDOを搭載した溶解性MNシステムの作製と特性評価、および脱毛させたC57BL/6マウスの毛髪再生モデルへの適用について記述する。このモデルは脱毛後の毛髪再生反応を評価するのに有用であるが、それ自体でAGAに対する臨床的有効性を立証するものではない。

プロトコル

本研究は、山東第一医科大学の動物倫理委員会の承認を得て実施された。 & 山東省医学科学院 (W202112030345)。すべての手法は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施されました。

1. 3BDO@MNパッチの作製

  1. CS/HA製剤の調製
    1. CS粉末（脱アセチル化度 ≥ 95%）1 gを量り取り、蒸留水20 mLに加えて室温（RT）で10分間撹拌する。
    2. 2% (v/v) 酢酸溶液（分子量 60.05）0.4 mLを加え、さらに2時間撹拌を続ける。
      注意：濃酢酸は腐食性がある。希釈および取り扱いはドラフトチャンバー内で行い、皮膚や粘膜への接触を防ぐため、使い捨て手袋とゴーグルを着用すること。
    3. 続いてHA粉末2 gを加え、混合製剤を1,207 × g（約3,000 rpm）で5分間遠心分離し、完全に溶解させる。
      ​注：CS/HA製剤は調製後すぐに使用すること。保存する場合は4 °Cの冷蔵庫で24時間以内に使用すること。
  2. 3BDO封入CS/HA製剤の調製
    1. あらかじめ溶解させた3BDO溶液（2 mg/mL）をジメチルスルホキシド（DMSO）に加える。
      注意：DMSOは皮膚透過性がある。操作中は直接皮膚に触れないよう手袋を着用し、これをCS/HA製剤に加える。完全に溶解するまで混合する。
    2. 混合製剤を1,207 × gで5分間遠心分離し、混入した気泡を除去する。
      ​注：遠心分離後も気泡が残っている場合は、製剤を5分間静置してから再度遠心分離を行う。
  3. 3BDO@MNパッチの作製
    1. 高さ600 µm、底面直径250 µm、ピッチ550 µmの円錐状チップが20 × 20配列で配置されたポリジメチルシロキサン（PDMS）MNモールドを使用する。
    2. プラズマクリーナーを用いてPDMSモールドの表面処理を行い、完全に親水性にする。
    3. 3BDO@CS/HA製剤1 mLをPDMS MNモールドに加える。モールドを真空チャンバーに入れ、10分間真空をかけて、粘性の高い製剤をマイクロキャビティ内に浸透させる。
    4. モールドを室温で134 × g、5分間遠心分離し、製剤がすべてのキャビティを満たすようにする。滅菌済みのメタルスクレーパーを用いて、モールド表面から過剰な製剤を慎重に取り除き、完全に平坦な面にする。
    5. 3BDOを含まないCS/HAマトリックスブレンドをモールド表面に分注する。室温で134 × g、5分間遠心分離し、均一なバッキング層を形成させる。
    6. モールドを温度36 °C、湿度37%のオーブンに入れ、一晩（約12～16時間）乾燥させる。
    7. モールドが室温まで冷却した後、完全に乾燥したMNパッチをモールドから剥離させる。
      注：作製した3BDO@MNパッチは、使用するまで4 °Cの冷蔵庫で保存すること。

2. 3BDO@MNパッチの特性評価

  1. 作製した3BDO@MNパッチを、両面導電性カーボンテープを用いてスタブに固定する。
    1. 電気伝導性を高めるため、固定したサンプルに金（または白金）の薄い層をスパッタコーティングする。
    2. 試料スタブを電界放出形走査電子顕微鏡（FE-SEM）の真空チャンバーにロードする。
    3. 高解像度画像を得るために、加速電圧と作動距離を調整する。アレイ全体の形態と、個々のMNの微細な表面トポグラフィーを観察する。
    4. 代表的なSEMマイクログラフを取得する。MNの長さと先端径を測定する。
  2. 機械的強度試験
    1. テクスチャーアナライザーのサンプル試験ステージ上に、MNパッチを平らに配置する。基材が完全に平坦であり、針先が真上を向いていることを確認する。
    2. 平坦な円筒形プローブ（直径25 mm）を装置のロードセルにしっかりと取り付ける。
    3. プローブを垂直に下げ、MNの先端の直上に配置する。試験前にプローブと先端が物理的に接触しないように注意する。
    4. ソフトウェアで特定の試験パラメータを設定する。下降速度を0.05 mm/sに、目標変位距離を0.7 mmに設定する。
  3. 溶解試験
    1. ラットの背部皮膚を解剖ボード上に広げ、皮膚表面の水分を吸い取る。皮膚を平らに保ち、しわがないようにする。
    2. 乾燥させたMNパッチの針先を下にして皮膚表面に配置し、均一な垂直圧力を加えてMNを皮膚に挿入させる。
    3. あらかじめ定めた時間間隔（5、10、30、および60 s）でパッチを皮膚から取り除き、5分間乾燥させる。
    4. 同一の撮像条件下で、SEMを用いて残留形態を観察する。
  4. In vitro 薬物放出アッセイ
    1. 6ウェルプレートの各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を500 µLずつ加える。3BDO封入MNを各ウェルに配置し、PBSに接触させる。
    2. プレートを室温でインキュベートする。各タイムポイントで、3BDO濃度定量用にPBSを500 µL回収する。
    3. シンク条件を維持するため、直ちに各ウェルに新鮮なPBSを500 µL補充する。
    4. MNに最初に封入されていた総薬物量に基づき、3BDOの累積放出率（%）を算出する。
  5. 抗菌アッセイ
    1. -80 °Cで保存していた細菌細胞ストック（E. coliおよびStaphylococcus aureus）を取り出し、各細菌細胞ストック10 µLを5 mLのLB培地 respectively に加える。
    2. 接種した培地をインキュベーターシェーカーを用い、37 °C、250 rpmで約16時間（オーバーナイト）インキュベートする。
    3. LB培地を用いて細菌培養液を調整し、初期OD620を0.01にする。
    4. CSストック溶液を滅菌水で希釈し、6つの濃度（1, 5, 10, 50, 100, および500 mg/mL）のCS溶液を調製する。各濃度につき3つの反復（n=3）を用意する。
    5. サンプルをブランク群、コントロール群、CS群の3群に分ける。ブランク群にはLBを200 µL加える。コントロール群には細菌溶液180 µLと滅菌水20 µLを加える。CS群には細菌溶液180 µLと、対応する濃度のCS溶液20 µLを加える。
    6. 37 °Cで20時間インキュベートする。
    7. 吸光度プレートリーダーを用い、0時間および20時間時点で96ウェルプレートの各ウェルのOD620を測定し、記録する。
  6. 細胞毒性評価
    1. 表皮細胞または真皮細胞懸濁液100 µLを96ウェルプレートに播種する（1ウェルあたり2 × 103 cells）。
    2. 指定のウェルにそれぞれの処理剤10 µLを加え、4つの群（コントロール群［培地］、3BDO群［最終濃度1 µM］、MN抽出物群、および3BDO+MN抽出物群）を設定する。各群につき3つの反復（n=3）を用意する。
    3. 37 °C、5% CO₂で24時間インキュベートする。
    4. 各ウェルにCell Counting Kit-8（CCK-8）作動液を10 µL加える。
      注：気泡は吸光度測定に影響を与える可能性があるため、ウェル内に気泡ができないように注意する。
    5. 37 °C、5% CO₂で2時間インキュベートする。
    6. マイクロプレート分光光度計を用い、すべてのウェルの450 nmにおける吸光度を測定する。
    7. データを解析し、細胞生存率を算出する。

3. 動物実験

  1. 実験動物の調製および処置
    1. 7週齢の雄性C57BL/6マウスをイソフルランで麻酔し、麻酔中は体温調節を行う。
      注意：イソフルランは揮発性麻酔薬です。過剰な吸入を避けるため、換気の良い環境で操作してください。
    2. 乾燥から保護するため、マウスの目に眼用潤滑剤を塗布する。
    3. 電気シェーバーを用いて、マウスの背部の被毛を約2 × 2 cm2の範囲で剃毛する。
    4. 除毛クリームを塗布し、5–10 s待機した後、拭き取る。生理食塩水で浸した綿棒で皮膚を拭き、残った除毛クリームや被毛を除去する。
    5. MNパッチを切り揃え、準備しておく。
    6. 剃毛したマウスをランダムに5群（1群あたりn = 5）に分け、以下のように処置する：
      1. 未処置コントロール群：処置は行わず、剃毛のみを行う。
      2. ブランクMNパッチ群：3BDOを含まないMNパッチを用い、3BDO@MN群と同じスケジュールで剃毛部位に処置する。
      3. 3BDO@MNパッチ群：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13日目に3BDO@MNパッチを剃毛部位に処置する。
      4. PBS皮下注射群：マウスの背部剃毛部位にPBS溶液を毎日皮下注射する。
      5. 3BDO皮下注射群：マウスの背部剃毛部位に3BDO溶液を毎日皮下注射する。
    7. 3BDO@MNパッチを剃毛した皮膚に配置し、MNが皮膚に確実に挿入されるよう垂直に均一な圧力をかける。3BDO@MNパッチを弾性包帯で固定し、ストレートクランプを用いて包帯を保持する。
      ​注：投与スケジュールは、各手法の異なる送達特性に基づいて選択した。3BDO@MNパッチは局所的な徐放を提供し、皮下注射は3BDOを一括投与（bolus dose）として送達するためである。
    8. 実験期間中、マウスを観察し、麻酔から完全に回復したことを確認する。
  2. サンプルの採取および被毛成長の評価
    1. 被毛の成長を記録するため、毎日マウスの背部皮膚を写真撮影する。
    2. 15日目に、毛幹径、被毛被覆率、および被毛密度を測定して、被毛の再成長を評価する。ImageJソフトウェアを用いて、処置領域における被毛被覆率（%）を定量化する。

結果

本プロトコルでは、3BDO@MNパッチの作製および特性評価について解説する。 図1 3BDO@MNパッチの作製プロセスの概略図を示す。3BDOをCS/HA処方に混合し、このマトリックスブレンドをPDMS MNモールドに添加して遠心分離し、針先端部を充填させた。3BDOを含まないCS/HAマトリックスブレンドをモールド表面に添加して遠心分離し、バッキング層を充填させた。完全に乾燥させた後、パッチを剥離して3BDO@MNパッチを得た。MNの形態をSEMで評価し、その結果を以下に示す。 図2A.

円錐形のMNは、15 × 15 mmのパッチ上に20 × 20の配列で均一に形成され、個々の底辺幅は250 µm、高さは600 µmであった。MNの先端は1.2 Nの力に耐え、これは皮膚への穿刺に十分な強度である。このことは、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色によって観察された明確な刺入ピンホールにより証明された（Figure 2B,C）。次に、マウスの背部皮膚を用いて3BDO@MNパッチの適用試験を行った。パッチをマウス皮膚に押し当てて溶解時間を測定したところ、MNの先端は60 s以内に完全に溶解した（Figure 2D）。in vitroアッセイにおいて、MNからの3BDOの放出プロファイルを確認したところ、薬剤の約90%が放出された（Figure 2E）。MN抽出液は表皮細胞および真皮細胞に対して細胞毒性を示さなかった一方で、1 µMの3BDOは細胞増殖を有意に促進した（Figure 2F）。キトサン含有製剤は、E. coliおよびS. aureusの両方に対して濃度依存的な抗菌活性を示し、10 mg/mLを超える濃度でより顕著な効果が見られた（Figure 2G,H）。これらの結果は、MN製剤の機能的成分としてキトサンを使用することを支持しているが、適用条件下での抗菌性能を確認するには、最終的に作製したパッチのさらなる試験が必要である。

動物実験の結果、3BDO@MN群では5日目に顕著な皮膚の色素沈着が認められた。15日目までに、3BDOを注射した群の毛髪被覆率は約45%であったのに対し、対照群は約39%であったが、3BDO@MN群は約90%の被覆率を達成した（図3）。3BDO@MN群における毛髪の再成長はより均一で密度が高く、直接注射よりも薬剤の浸透性と保持性が優れていることが示された。

以上の結果を合わせると、MNを介した3BDOの送達が、本研究で用いた脱毛処置を施したC57BL/6マウスモデルにおいて、毛髪の再成長を促進したことが示唆されます。このアプローチが、男性型脱毛症の疾患特異的モデルや、臨床的に適切な投与条件下で有効であるかを確認するには、さらなる研究が必要です。

3Dバイオプリンティング工程図：3BDOQCS/HAコーティング、遠心分離、真空乾燥、CS/HAマトリックス
図13BDO@MNsの作製プロセスの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マイクロニードルアレイの図および細胞生存率のグラフ：乳酸キトサンの抗菌特性に関する研究。
図23BDO@MNシステムの作製および特性評価。(A) 3BDO@MNsの形態を示すSEM画像。スケールバー = 500 µm. (B) 3BDO@MNsの荷重-変位曲線。 (C) H&3BDO@MNsの挿入およびベース除去後のマウス皮膚横断切片のH&E染色像。組織への浸透が成功したことが確認できる。スケールバー = 100 µm. (D) 皮膚挿入後5秒、10秒、30秒、および60秒におけるMNの溶解を示すSEM画像。 (E) 累積的な in vitro MNsからの3BDOの放出プロファイル。 (F) 3BDO、MN抽出物、および含有MN抽出物で処理した表皮細胞および真皮細胞の細胞生存率 24時間後の3BDO。 (G,H) 620 nmにおける〜の吸光度 (G) 黄色ブドウ球菌 および (H) Escherichia coli 異なる濃度のキトサンを含む培地で培養した懸濁培養細胞。データは平均値 ± 標準偏差（n = 3）で示し、統計的有意性は一元配置分散分析（one-way ANOVA）により解析した（**p < 0.01). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マイクロニードル（MN）パッチを用いた毛髪成長実験；マウスにおける色素沈着および被毛被覆率の結果。
図33BDO@MNsの毛髪再生効果 in vivo(A) 動物実験の概略図。 (B) 処置後0日目（除毛）、5日目、10日目、および15日目におけるマウス背部皮膚の代表画像。 (C) ～における色素沈着スコア（任意単位）の定量分析 (B). (D) 処置領域における毛髪被覆面積（%）の定量分析 (B). （E） 対照群と比較した、処置部位における毛被面積の相対的な倍率変化。データは平均値 ± 標準偏差（n = 5）で示し、統計的有意性は一元配置分散分析（one-way ANOVA）によって解析した（**p < 0.01). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

現在、AGAの臨床治療は主に薬理学的介入と外科的移植に分類されます。本研究では、3BDOを封入したMNsがC57BL/6マウスモデルにおいて毛髪の再生を促進しました。しかし、従来の薬物送達法には、薬物分布の不均一性などの限界があります。本研究における重要なプロトコルは、3BDO封入MNsを作製するための2段階の手法です。HAとCSがMNsの主要成分となります。MNsの品質を確保するためには、いくつかの重要なステップにおいて注意が必要です。

第一に、ポリマー溶液中に気泡が閉じ込められるのを避けるため、遠心分離中の溶媒蒸発を遅らせる目的で、あらかじめ冷却したモールドを使用しました。第二に、乾燥条件はチップの脆性とバッキング層の完全性に直接影響します。湿度を制御した状態で36 °Cで16時間乾燥させることで、過乾燥を防ぎつつ、バッキング層の柔軟性を維持しながら十分な機械的強度を持つチップを確保することができました。第三に、134 × gで5分間の遠心分離を行うことで、チップ領域に3BDOを効果的に濃縮できますが、より高速な回転数や長い処理時間は、モールド底部での薬剤の沈殿を引き起こし、送達効率を低下させる可能性があります。in vivo試験では、被毛再成長モデルとしてC57BL/6マウスを使用しました。C57BL/6マウスの毛包は、目視可能な高度に同調した毛周期を示すため、実験上の利便性が高く、皮膚疾患研究において最も一般的なモデルの一つとなっています16。生後約7週になると、C57BL/6マウスの毛包は自然に休止期（telogen phase）に入ります。マウスを人工的に脱毛させると、毛包は直ちに成長期（anagen phase）に再進入します17。このモデルを用いたin vivo試験の結果、本MNシステムは皮下注射よりも均一な被毛再成長を促進することが示されました。

3BDO@MNシステムは、毛髪再生を促す低分子化合物と低侵襲な経皮投与プラットフォームを統合することで、脱毛症治療のための有望な前臨床戦略となる可能性があります。持続性マイクロニードル製剤は、薬物の制御放出または持続放出を可能にし、投与回数を減らし、患者のコンプライアンスを向上させることが報告されており、従来の局所投与や全身投与に伴ういくつかの限界を解消します18,19。さらに、幹細胞投与を含む最近のマイクロニードル支援による毛髪再生戦略は、この分野におけるマイクロニードルプラットフォームのより広範な適用可能性をさらに裏付けています20。それにもかかわらず、臨床応用に向けては、長期的な生物学的安全性、薬物動態/薬力学的プロファイル、投与量の最適化、保存安定性、およびスケールアップ可能な製造方法を評価するためのさらなる研究が依然として必要です。

開示事項

著者らに申告すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（82273554）、山東省医療衛生科学技術発展プロジェクト（No.202304030716）、中国国家大学生創新創業訓練計画（No. 202410439001）、および泰安市科学技術創新発展プロジェクト（No. 2023NS232）の支援を受けて実施されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3BDOYuanye Bio-Technology Co.、中国、上海890405-51-33BDO封入CS/HA製剤の調製
6ウェルプレートCorning Incorporated, USA参照 3516抗菌試験およびin vitro薬物放出試験
75%エタノール山東 Lircon Medical Technology Co., Ltd.1202050004消毒
96ウェルプレートCorning Incorporated, USAREF3599細胞毒性評価および抗菌活性試験
C57BL/6マウスCharles River Laboratories7週間動物実験
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)同仁化学研究所（日本）CK04細胞毒性評価
遠心分離機Thermo Fisher Scientific75007204製剤遠心分離機
キトサン (CS) Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.9012-76-4CS/HA製剤の調製
除毛クリームVeet3059944023307除毛
ジメチルスルホキシド (DMSO)Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd67-68-53BDO封入CS/HA製剤の調製
電子天秤RadwagAS 220.R2粉末の計量
大腸菌 (Escherichia coli)ATCC/抗菌活性試験
ヒアルロン酸（HA）パウダーBloomage Biotechnology Co. 中国9067-32-7CS/HA製剤の調製
ImageJソフトウェア米国国立衛生研究所/統計解析
インキュベーターシェーカーThermo Scientific  50163013細菌の培養
イソフルラン気化器遺伝子&I加速器質量分析法動物麻酔
LB培地Sigma Life ScienceL3022抗菌活性測定
マグネチックスターラーHangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.SP-16製剤の撹拌
Multiskan SkyHigh マイクロプレート分光光度計Thermo Fisher Scientific/OD測定
オーブン上海匯泰儀器製造有限公司DHG-9260Aマイクロニードルの乾燥
Parafilm MAmcor PM-996マイクロニードル封止
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)BiosharpBL302Ain vitro 薬物放出試験
黄色ブドウ球菌 (*Staphylococcus aureus*)ATCC/抗菌活性測定
汎用TAテクスチャーアナライザー上海騰巴儀器科技有限公司/機械的強度試験
真空チャンバー上海匯泰儀器製造有限公司DZF-6050真空乾燥

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