乳腺形態形成を再現する三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルベースの方法

サマリー

本プロトコルは、制御された三次元培養システムにおいて乳腺形態形成の重要な特徴を再再現するヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルを用いた方法を記述しています。

要約

組織構造や細胞状態動態を再現する生理学的に関連性の高いヒトモデルシステムの開発は、乳房の発生や発がん初期の出来事を研究する上で依然として大きな課題です。従来の二次元培養や多くの三次元システムは、人間の乳腺を定義する構造的組織や微小環境の手がかりを捉えきれていません。ここでは、タイプIコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸からなる定義されたハイドロゲルマトリックス内に埋め込まれた一次上皮細胞から、三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する再現可能な方法を説明します。このシステムは、前駆細胞の拡大、上皮パターン形成、末端管小葉単位状構造の形成、さらに間葉質区画の出現を含む乳腺形態形成の重要な段階を経て、21日間の培養期間で単一細胞の進行をサポートします。ハイドロゲルの調製、細胞シーディング、培養条件に関するステップバイステップのプロトコルを提供します。この手法は、高含有量イメージングおよびオルガノイド数、サイズ分布、構造的複雑度の定量解析と互換性があります。このプラットフォームは、上皮の可塑性や環境的摂動の機構的研究を可能にし、乳がんリスクに関連する早期組織レベルの変化を調査するための拡張可能かつ生物学的に関連性の高いシステムを提供します。

概要

ヒト乳腺の発生や悪性変質化の素因となる初期の出来事を理解するには、組織構造、細胞階層、微小環境シグナル伝達を忠実に再現する実験システムが必要です。二次元上皮培養は重要な機構的洞察を提供してきましたが、上皮組織や形態形成をモデル化するために必要な構造的文脈を欠^{いています。}基底膜抽出物に基づく既存の三次元培養システムはこの分野を前進させましたが、組成の変動、細胞外マトリックス成分の不完全な制御、高次組織構造の不整合なサポートにより制約が残っています^1。さらに、基底膜抽出物に基づく多くのオルガノイドシステムは、組織様組織¹の出現を一貫してサポートできないために制約を受けています。特に、多くのシステムは支持的な微小環境の内因性発達を可能にせず、外因性間質成分に依存しているため、組織発生や疾患に中心的な上皮・間葉系相互作用をモデル化する能力が制限されています。これらの制限は、発生過程、上皮可塑性、環境や分子の乱れが組織組織に与える影響の再現性研究を制限しています。

これらの制約に対処するため、一次上皮細胞が定義された細胞外マトリックス^2,3,4,5,8内で組織化された構造を生成することを可能にする、定義されたハイドロゲルベースの三次元ヒト乳房オルガノイドモデルを開発しました。ハイドロゲルはタイプIコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸で構成されており、乳腺の発生や上皮形態形成における役割に基づいて選定されています。これらの細胞外マトリックス分子は、インテグリン、ディスコイジンドメイン受容体、CD44、RHAMMなどの異なる細胞受容体に関与し、上皮極性、分岐形態形成、幹細胞の維持、機械伝達、乳腺の組織組織の調節が知られています。^6,7。このハイドロゲルシステムを記述した先行研究では、これらの細胞外マトリックス成分の組み込みが、コラーゲン単独またはマトリゲル^{ベースの条件と}比べて導管小葉形成および上皮成熟を著しく改善することが示されました^3,8。さらに、このハイドロゲル製剤の物理的特性は原子間力顕微鏡で既に解析されており、複合型細胞外マトリックスハイドロゲルがコラーゲンのみのゲルに比べて剛性が低く膨張が増加することが示されました(ヤング率:256.7 ± 20.0 Pa 対 559.2 ± 204.0 Pa)。これは、より柔らかく水和されたマトリックス環境と一致しています⁸。

重要なのは、このモデルが上皮構造に隣接して生じる間葉質状の区画の出現を支持し、内因性の構造およびシグナル支援を提供し、より自然な組織組織を反映していることです^。このハイドロゲルシステムの生理学的関連性は、形態学的およびトランスクリプトム解析の両方を用いて、従来のマトリゲル基ロガノイド培養との直接比較によって評価されています。以前の研究では、ハイドロゲル培養がマトリゲル系培養よりも組織化された管-小葉組織形成と多系統分化を支援しつつ、ホルモン応答性も維持することが示されました⁸。最近では、ハイドロゲル由来オルガノイド、マトリジェル培養オルガノイド、一次ヒト乳腺組織を比較した統合単細胞RNAシーケンシング解析により、ハイドロゲル培養オルガノイドが上皮層構造、細胞多様性、上皮-間葉系相互作用をより忠実に再現することが示されました³.対照的に、マトリゲル培養オルガノイドは増殖性雑種基底状態に富集され、ストロマル様集団を欠いており、これは上皮の自己組織化と一致し、指向性有機形成とは一致しなかった。

ここで説明するプロトコルは、一次ヒト組織からオルガノイドを生成する再現可能かつ拡張可能な方法を提供し、線維芽細胞の枯渇や単一細胞への解離のオプションステップも含めます。このプラットフォームはライブイメージング、高濃度イメージング、定量形態計測解析、細胞追跡、遺伝的撹乱研究と互換性があるため、オルガノイドの数、サイズ、構造、成長動態を評価する下流アプローチと統合可能です。したがって、このプラットフォームは人間の乳房発生、上皮可塑性、上皮と微小環境の相互作用、発生、分子、環境の摂動に対する組織レベルの応答を研究するための生物学的に関連性の高いシステムを提供します。

組織処理、ハイドロゲル調製、オルガノイド培養、発生進行、下流解析を含むワークフローの概要は 図1に示されており、このプラットフォームを用いて生成された代表的なオルガノイド形態は 図2に示されています。

図1。ハイドロゲルベースのオルガノイド生成ワークフローの概要。 (A) プロトコルのワークフローをまとめたフローチャートで、組織採取、組織処理、凍結保存、回収および任意の細胞準備、ハイドロゲル調製、オルガノイド培養、オルガノイド発生、および下流の分析応用を含む。(B) ハイドロゲルベースのオルガノイド生成プロトコルの主要段階を示す視覚的な概略図(組織処理と準備、回収および任意の細胞準備、ハイドロゲル準備およびオルガノイドシーディングを含む)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2。定義されたハイドロゲル系で生成される代表的なオルガノイド形態。 定義されたハイドロゲルマトリックス内で培養された異なるヒト組織から得られたオルガノイドの代表的な明視野画像。乳形成術由来の単一上皮細胞から生成された乳オルガノイドは培養21日目に画像化されました。腫瘍断片から生成された患者由来の異種移植片オルガノイドは培養16日目に画像化されました。上皮断片から生成された唾液腺オルガノイドは培養3日目に画像化されました。上皮断片から生成された腎臓オルガノイドは培養17日目に画像化されました。スケールバー=50μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

プロトコル

手術後に医療廃棄物として廃棄されるはずだった一次組織は、メイン医療センターおよびタフツ医療センターの機関審査委員会が承認したプロトコルを用いて、関連法律に準拠して取得されました。すべての組織は移植前に匿名化されており、特定の患者に特定できませんでした。このため、本研究はマサチューセッツ工科大学およびタフツ大学健康科学部の実験対象者としての人間利用委員会(IRB #13521)から免除資格を与えられました。本研究に登録されたすべての患者は、研究への参加および結果の公表に同意するインフォームドコンセントフォームに署名しました。

1. 組織処理と調製

注意:ヒト組織を含むすべての処置は、機関のバイオセーフティおよび倫理ガイドラインに従って行ってください。手順開始前に、プロトコルステップやオルガノイド準備のワークフローを視覚的に把握するために、図1Aおよび1Bに示されたワークフローの回路図を参照してください。

1. 乳腺上皮基底培地に52 μg/mLの牛下垂体抽出物、10 ng/mLのヒト表皮成長因子、5 μg/mLのインスリン、500 ng/mLのヒドロコルチゾン、1%(v/v)のGlutaMAX、1%(v/v)抗生物質-抗菌薬(100X)を補足してMEGMを製製します。
2. 乳腺上皮増殖培地(MEGM)に1.5 mg/mLのコラーゲン酵素A(−20°Cで保存)と100 U/mLのヒアルロニダーゼ(4°Cで保存)を加えて解離培地を準備します。
3. 予防的乳房切除術および縮小乳房形成術から得られたヒト乳房組織を、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で固定せず、4°Cで維持します。 組織を精密な秤で計量し、全体の組織重量を測定します。
4. 組織を滅菌されたバイオセーフティキャビネットに入れてください。無菌メスを使って組織を3〜5 mm、³ 片ずつ機械的に粉砕します。約2〜3gの挽き組織を15 mLの円錐形チューブに移します。各チューブに10mLの解離培地を加えます。
5. チューブを37°Cで8回転の軌道回転器に12〜18時間培養し、酵素的に組織を消化します。消化完了とみなすのは、大きな組織断片が残っておらず、培地全体に均一に断片化された物質の均一な懸濁液が見られる場合です。
6. 上皮片は重力で5分間沈降させます。媒体中に目に見える破片が浮遊していないこと、そして明確なペレットが存在することを確認しましょう。ペレットを乱さずに上清液を慎重にデカントし、捨ててください。
   注:上清液には間質細胞やマトリックス成分が含まれており、洗浄して使用したり、他の研究のために保存したりすることができます。
7. ペレットをPBSに含む5%胎児用牛血清(FBS)を含む10mLのウォッシュ培地に再懸浮させます。室温のスイングバケット遠心分離機で250×gで5分間遠心分離機に置きます。
8. 洗浄工程をさらに3回繰り返し、または上澄液が透明で目に見えるゴミがなくなるまで繰り返します。
9. 最終ペレットをMEGM中の10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む冷凍培地に、初期組織重量1グラムあたり1 mLの容量で再懸浮させます。
   注意:DMSOは接触や吸入時に有害です。適切な個人用防護具の使用を行い、機関のガイドラインで求められる場合は化学物質安全フードの着用を行ってください。
10. 各クライオヴィアルに1mLの懸濁液を分け合う。液体窒素で長期保存する前に、冷凍容器で−80°Cの温度で冷凍保存します。
    注意:このステップは一時停止のポイントを表しています。長期保存条件に移す前に、サンプルは−80°Cで保存します。

2. 回収と任意の細胞調製

1. 解凍と初期回復
   1. −80°Cの冷凍保存から少なくとも24時間凍結後、または液体窒素の長期保存から組織を取り出します。すぐにクライオビアをキャップまで37°Cの水浴に浸し、細胞死を最小限に抑えるために1分間素早く解凍します。
      注意:解凍中は均一な温熱を確保するためにクライオビアを優しくかき混ぜてください。
   2. 完全に解凍されたら、すぐにクライオビアの内容物を10mLのMEGMを含む15 mLの円錐形チューブに移します。遠心分離機で250 × gで5分間加熱します。
2. 任意の線維芽細胞除去
   注:プレプレートによる線維芽細胞枯渇は、より上皮細胞が豊富な初期集団を望む場合に、急速に付着する間質細胞や線維芽細胞集団を減らすためのオプション的な濃縮ステップです。この工程はオルガノイド形成には必須ではなく、実験目的に応じて調整可能です。
   1. ペレットを10mLのMEGMに再懸浮させます。
   2. 再懸濁組織を10cmの細胞培養皿に移します。線維芽細胞の付着を可能にするために、37°Cで5%のCO₂を含んだ加湿インキュベーターで90分間培養します。
      注意:培養皿を洗礼中は動かさないように、線維芽細胞の準着を確実にしてください。
   3. 10mLの血清学ピペットで、培養皿を約45°に優しく傾けながら、非接着細胞を含む上清液を採取します。プレートを5mLのPBSで優しくすすいで、そのすすぎ液と採取した上清液を混ぜます。
   4. 結合懸浮液を250×gで5分間遠心分離し、上皮細胞濃縮物質を回収します。
      注:プレートに付着した細胞は乳腺線維芽細胞として濃縮されており、DMEM + 10% FBSおよび抗生物質を含み地を加えることで別途増殖させることができます。
3. 単一細胞への任意解離
   1. ペレットを0.25%トリプシンを含む予温(37°C)解離酵素溶液500μLに再懸浮させます。代替解離試薬は最適化が必要かもしれません。懸濁液を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。P1000ピペットを使ってサンプルを20回分砕し、解離を促進します。
      注意:酵素解離試薬は有害である可能性があります。適切な個人用保護具の使用を心がけ、肌や目を合わせないようにしましょう。
   2. 37°Cで3〜5分間培養します。培養直後にP1000ピペットで20回のトリチーリングを行い、機械的に解離します。
   3. 酵素反応を中和するために血清含有ウォッシュ培地1mLを加えます。500 × gで遠心分離機を5分間加熱します。
   4. ペレットを300μLの分散液(5 U/mL)および30 μL DNase溶液(1 mg/mL)に再懸濁させます。37°Cで3〜5分間培養します。
   5. 試料を15〜20回ピペッティングして機械的に解離します。懸濁液に700μLの血清含有ウォッシュメディウムを加えます。
   6. セルの懸濁液を40μmのセルストレーナーでろ過し、きれいなチューブに入ります。標準的な40μmセルストレーナーまたはFlowmiピペット先端ストレーナーのいずれかが使用されます。フローミストレーナーは、限られた細胞数で作業する場合、サンプル損失を減らす可能性があります。
   7. トリパンブルー排除を用いて生存細胞数を決定します。セル懸濁液10μLをトリパンブルーと1:1の比率で混合し、10μLを細胞計数室または計数スライドに注入します。自動細胞カウンターまたは血液細胞計を用いて細胞生存率を測定します。
   8. 懸濁液を500 × gで室温で5分間遠心分離します。
   9. 細胞ペレットをMEGMに所定濃度で再懸濁し、ハイドロゲルシーディングを行います。
      注:単細胞シーディング実験では、実験目的やドナーサンプルの特性により、200 μLのハイドロゲルあたり約1,000〜5,000セルの入力量が一般的です。低いシーディング密度は、個々のオルガノイド発生の追跡を促進するために一般的にライブイメージングや形態形成研究に用いられますが、高密度はRNAやタンパク質の収集を含むエンドポイント分子解析に一般的に用いられます。

3. ハイドロゲルの調製とオルガノイドシーディング

1. 在庫の準備と体積計算
   1. 使用前にラミニン溶液(1.18 mg/mL)、ヒアルロン酸溶液(滅菌水に1 mg/mL)、フィブロネクチン溶液(滅菌水中2 mg/mL)、PBS 1×を氷に入れます。ラミニンおよびフィブロネクチンのアリコートは−80°Cで保存し、ヒアルロン酸溶液は4°Cで保存します。 使用前に0°C〜4°Cの氷上でゆっくりと凍結した部品を解凍します。
   2. 25×細胞外マトリックスサプリメントのストック溶液を準備します。1 mLを製製するには、425 μLラミニン、250 μLヒアルロン酸、250 μLフィブロネクチン、75 μL PBSを氷上に置いたチューブで組み合わせます。チューブを3〜4回逆さまにして優しく混ぜます。溶液は最大1ヶ月間4°Cで保存します。
   3. 準備前に望ましい最終ハイドロゲルの体積と組成を決定してください。ピペッティングおよび移送中の物質損失を考慮し、少なくとも20%の余剰体積を準備してください。
      注:ハイドロゲル製剤は、コラーゲンI(細胞外マトリックス補給物の最終濃度1×(25×ストックから)と、pH中和および重合のためにコラーゲンI体積に対して12.5%(v/v) 0.1N水酸化ナトリウムで構成されています。
      注:最終的なハイドロゲル濃度は、1.7 mg/mL コラーゲンI、20 μg/mL ラミニン、20 μg/mL フィブロネクチン、10 μg/mL ヒアルロン酸です。
   4. 次の式で必要なコラーゲンI(V_{コラーゲン})の量を計算します。
      
      ここで、 C_最終 値=1.7 mg/mL、 V_総量 は最終的なハイドロゲル量、C_ストック はコラーゲンストック溶液の濃度です。コラーゲンストック濃度は2〜12 mg/mLの範囲で使用してください。
      注意:コラーゲンストックの濃度はバッチごとに異なる場合があります。濃度が高いほど粘度が上がり、ピペットはゆっくりと行うべきです。
   5. 0.1 N水酸化ナトリウム(V_NaOH)の体積を次の式で計算します:
      V_NaOH = 0.125 × V_{コラーゲン}
      無菌水中で1N水酸化ナトリウムを希釈して、0.1N水酸化ナトリウム作動溶液を準備します。
   6. 以下の式で細胞外マトリックス補足(V_ES)の体積を計算します。
      
   7. 次の式で残りの体積を計算します。
      V_増殖培地 = _V総量 - (V_{コラーゲン}+V、_NaOH + _V、ES + V_{細胞/組織})
      注意:各実験ごとに細胞または組織断片の体積を個別に決定してください。許容容量内で10〜100μLの範囲を標準的に使用してください。断片の大きさや組成が調製ごとに大きく異なるため、正確な断片計数は行われません。断片の豊富さと分布を視覚的に評価して播種を標準化します。
2. ハイドロゲルマスターミックスの調製
   1. コラーゲンI、細胞外マトリックスサプリメント、水酸化ナトリウム(0.1N)、培養培地を0°C〜4°Cの氷床に置きます。 すべての成分を低温で保ち、早期重合を防ぎます。
   2. 計算されたコラーゲンIの体積を冷却したマイクロ遠心分離機チューブに加えます。
   3. 計算された冷却された培地の量をコラーゲン溶液に加えます。
   4. 計算された体積0.1 Nの水酸化ナトリウムを加えて溶液を中和します。
      注:以前の最適化により、これらの条件が適切なゲルpHを生成することが確立されています。したがって、ハイドロゲル混合物の定期的なpH検査は不要です。
      注意:コラーゲンの早期重合を防ぐため、以降のすべての工程を迅速に実施してください。
   5. チューブを1秒あたり約1回の激しく振って、少なくとも6回振って溶液を混ぜます。
   6. 計算された細胞外マトリックスサプリメントの量を混合物に加えます。
   7. P1000ピペットまたはワイドボアピペットの先端を使って、計算された単一細胞または組織断片の体積を加えます。ステップ3.2.5で説明されている通り、すぐに振って混ぜ、次のステップに進みます。
3. ハイドロゲル沈着
   1. ヒドロゲル混合物を各ウェルあたりの所定容量で培養容器にピペットで移管します。4ウェルチャンバースライドには1ウェルあたり200μLのハイドロゲルを使用し、8ウェルチャンバースライドでは100μL、96ウェルプレートには20μLを使用します。
   2. チャンバースライドを使う際は、ヒドロゲルを表面に薄く広げます。ピペットの先端をチャンバーウェルの中央上部端に位置させ、ゲルを分散しながら先端を表面に引きずり、均一なパッドを作ります。96ウェルプレートの場合、ピペットの先端をウェルの中央に位置しつつ表面と接触を保ち、ゲルを中央に分散してドーム構造を維持します。ゲルに空気をピペットで入れることは気泡ができてしまうので避けてください。
   3. 培養容器は37°Cで加湿インキュベーターに5%_CO2を含み、60分間培養して完全な重合を可能にします。
      注:ここで述べた重合条件は、本研究で用いられた培養フォーマットに合わせて最適化されています。培養容器の形状、ハイドロゲルの容積、培養条件に応じて、重合時間のわずかな調整が必要になることがあります。
4. 文化と維持
   1. 各ウェルに予備加熱済みのMEGMを加えます。使用する培養フォーマットに応じて体積を調整してください。
   2. ピペットチップでハイドロゲルを培養面から優しく剥がし、ゲルを浮かせます。ピペットの先端をゲルの周囲に滑らせ、重合ハイドロゲルの下を優しく持ち上げて表面から解放します。
   3. MEGMは週に2回、新鮮な予温された培地に交換してください。培養は5%のCO₂を含んだ加湿インキュベーターで約3〜4週間保持し、完全なハイドロゲル崩壊が起こる前に培養を終了します。凝縮したハイドロゲルは、ゲル内の広範な細胞増殖によって生じる密で不透明なプラグ状構造の出現によって識別できます(補 足図1の代表例を参照)。

結果

このプロトコルの成功裏の実行により、組織化された上皮形態や組織特異的構造特徴を示す三次元オルガノイド構造が形成されます。オルガノイドは種まき後3〜7日以内に形成され始め、培養期間を通じて発育を続けます。このハイドロゲルオルガノイドシステムの以前の特性評価では、複数の独立した一次ヒトドナー間で再現可能なオルガノイド形成が示されました³。その研究では、12人の疾患のない縮小乳房形成ドナーから単離された一次上皮細胞が評価され、12サンプル中11サンプルが該当する培養条件下でオルガノイドを成功裏に生成しました。ドナー全体で、シード細胞100個あたり形成されるオルガノイド構造の中央値数は1.775(95%信頼区間:0.45–4.10)でした。オルガノイド形成効率や成長動態においてドナー間で大きなばらつきが観察されたものの、複雑な管-小葉およびアシナル形態はドナー間で再現性に生成されました。

単一上皮細胞由来の乳房オルガノイドは進行的な形態形成を示し、培養21日目までに分岐構造を...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、乳腺形態形成の主要な特徴を支える定義されたハイドロゲルマイクロ環境内で、三次元のヒト乳房オルガノイドの再現可能生成^{を可能にします。}この方法の成功にはいくつかのステップが重要です。まず、組織処理と酵素解離を慎重に制御し、上皮の生存能力を維持しつつ、過剰消化が細胞収量を低下させ、その後の形態形成を妨げる要因を最小限に抑えなければなりません^。特に、短時間かつ連続的な酵素治療と穏やかな機械的解離の組み合わせは、機能的な上皮集団を維持するために不可欠です。次に、ハイドロゲルの調製にはコラーゲン濃度、pH、タイミングの正確な制御^{が必要です。}コラーゲンの中和は重合を開始します。したがって、水酸化ナトリウム添加後のすべての工程は、均一なゲル形成を確保するために迅速かつ氷上で行う必要があります。不完全または遅延した重合は、オルガノイドの発生を支えない構造化や崩壊したハイドロゲルを引き起こすことがあります。最後に、ドナー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL コニカルチューブ	VWR	89039-664	組織処理と遠心分離用無菌チューブ
40 μm セルストレーナー	VWR	732-2757	単一細胞懸濁液調製用濾過装置
低容量用40 μm セルストレーナー	Bel-Art	136800040	単一細胞懸濁液調製用濾過装置
自動細胞カウンター	Bio-Rad	1450102	細胞数を数え、生存率を決定するために使用する装置
ウシ下垂体エキス	Thermo Scientific	13028014	上皮細胞培地の補充剤
細胞計数用スライド	Bio-Rad	145-0011	細胞計数に使用するデュアルチャンバースライド
遠心機	N/A	N/A	ベンチトップ遠心機/sは少なくとも500 x gの速度能力と15 mLおよび1.5 mLチューブの収容が必要です。
コラーゲンI	Millipore Sigma	08-115	ハイドロゲル形成に使用する細胞外マトリックスタンパク質
コラゲナーゼA	Sigma-Aldrich	11088793001	組織解離に使用する酵素
クリオバイアル	Corning	976171	サンプルの凍結保存用無菌バイアル
培養容器（例：チャンバースライド、マルチウェルプレート）	Corning	354104 354108 3603	ハイドロゲル沈着とオルガノイド培養のためのプラットフォーム。
ジメチルスルホキシド	Millipore Sigma	317275	凍結培地に使用する凍結保護剤
Dispase II	Roche	4942078001	二次組織解離に使用する酵素
DNase I	Roche	10104159001	細胞解離中に使用する酵素。
ウシ胎児血清	Gibco	10437	洗浄および中和培地に使用する血清補充剤
フィブロネクチン	Sigma-Aldrich	F2006	細胞外マトリックスタンパク質成分
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	上皮細胞培地の補充剤
ヒト上皮成長因子	Sigma-Aldrich	E9644	上皮細胞培地の補充剤
ヒドロコルチゾン	Sigma-Aldrich	H0888	上皮細胞培地の補充剤
ヒアルロン酸	Millipore Sigma	385908	ハイドロゲル配合のための細胞外マトリックス成分
ヒアルロニダーゼ	Sigma-Aldrich	H3506	組織解離に使用する酵素
インキュベーター	Thermo Scientific	3598	組織培養インキュベーションに使用する装置
インスリン	Sigma-Aldrich	I9278	上皮細胞培地の補充剤
ラミニン	Gibco	23017-015	細胞外マトリックスタンパク質成分
乳腺上皮基底培地	Thermo Scientific	M171500	上皮細胞用成長培地
マイクロ遠心管（1.5 mL）	Thermo Scientific	3451	小容量反応に使用するチューブ
軌道ローテーター	Thermo Scientific	400110	酵素分解による組織分散用ローテーター
P1000ピペット	Gilson	P1000	最大1,000 μLの体積を混合および移動するために使用する装置
ペニシリン-ストレプトマイシン	Thermo Scientific	15140122	上皮細胞培地の抗生物質補充剤
リン酸緩衝生理食塩水	Gibco	20012-027	洗浄およびすすぎに使用するバッファー溶液
精密バランス	Mettler Toledo	ML303E	組織の重量測定に使用するバランス
精密ピペット	Nunc	170356N	非接着性上皮細胞の収穫に使用するピペット
水酸化ナトリウム（1 N）	Fisher Chemical	SS261	コラーゲン中和に使用する試薬
無菌メス	Bard-Parker	372615	機械的組織ミンチングに使用する工具
トライパンブルー溶液	Gibco	15250061	細胞生存率評価に使用する染色剤
トライプシン（0.25％）	Gibco	25200056	細胞解離に使用する酵素製剤
水浴（37 ℃）	VWR	10LA	サンプルの制御融解に使用する装置