乳腺形態形成を再現する三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルベースの方法

Summary

本プロトコルは、制御された三次元培養システムにおいて乳腺形態形成の重要な特徴を再再現するヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルを用いた方法を記述しています。

Abstract

組織構造や細胞状態動態を再現する生理学的に関連性の高いヒトモデルシステムの開発は、乳房の発生や発がん初期の出来事を研究する上で依然として大きな課題です。従来の二次元培養や多くの三次元システムは、人間の乳腺を定義する構造的組織や微小環境の手がかりを捉えきれていません。ここでは、タイプIコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸からなる定義されたハイドロゲルマトリックス内に埋め込まれた一次上皮細胞から、三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する再現可能な方法を説明します。このシステムは、前駆細胞の拡大、上皮パターン形成、末端管小葉単位状構造の形成、さらに間葉質区画の出現を含む乳腺形態形成の重要な段階を経て、21日間の培養期間で単一細胞の進行をサポートします。ハイドロゲルの調製、細胞シーディング、培養条件に関するステップバイステップのプロトコルを提供します。この手法は、高含有量イメージングおよびオルガノイド数、サイズ分布、構造的複雑度の定量解析と互換性があります。このプラットフォームは、上皮の可塑性や環境的摂動の機構的研究を可能にし、乳がんリスクに関連する早期組織レベルの変化を調査するための拡張可能かつ生物学的に関連性の高いシステムを提供します。

Introduction

ヒト乳腺の発生や悪性変質化の素因となる初期の出来事を理解するには、組織構造、細胞階層、微小環境シグナル伝達を忠実に再現する実験システムが必要です。二次元上皮培養は重要な機構的洞察を提供してきましたが、上皮組織や形態形成をモデル化するために必要な構造的文脈を欠^{いています。}基底膜抽出物に基づく既存の三次元培養システムはこの分野を前進させましたが、組成の変動、細胞外マトリックス成分の不完全な制御、高次組織構造の不整合なサポートにより制約が残っています^1。さらに、基底膜抽出物に基づく多くのオルガノイドシステムは、組織様組織¹の出現を一貫してサポートできないために制約を受けています。特に、多くのシステムは支持的な微小環境の内因性発達を可能にせず、外因性間質成分に依存しているため、組織発生や疾患に中心的な上皮・間葉系相互作用をモデル化する能力が制限されています。これらの制限は、発生過程、上皮可塑性、環境や分子の乱れが組織組織に与える影響の再現性研究を制限しています。

これらの制約に対処するため、一次上皮細胞が定義された細胞外マトリックス^2,3,4,5,8内で組織化された構造を生成することを可能にする、定義されたハイドロゲルベースの三次元ヒト乳房オルガノイドモデルを開発しました。ハイドロゲルはタイプIコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸で構成されており、乳腺の発生や上皮形態形成における役割に基づいて選定されています。これらの細胞外マトリックス分子は、インテグリン、ディスコイジンドメイン受容体、CD44、RHAMMなどの異なる細胞受容体に関与し、上皮極性、分岐形態形成、幹細胞の維持、機械伝達、乳腺の組織組織の調節が知られています。^6,7。このハイドロゲルシステムを記述した先行研究では、これらの細胞外マトリックス成分の組み込みが、コラーゲン単独またはマトリゲル^{ベースの条件と}比べて導管小葉形成および上皮成熟を著しく改善することが示されました^3,8。さらに、このハイドロゲル製剤の物理的特性は原子間力顕微鏡で既に解析されており、複合型細胞外マトリックスハイドロゲルがコラーゲンのみのゲルに比べて剛性が低く膨張が増加することが示されました(ヤング率:256.7 ± 20.0 Pa 対 559.2 ± 204.0 Pa)。これは、より柔らかく水和されたマトリックス環境と一致しています⁸。

重要なのは、このモデルが上皮構造に隣接して生じる間葉質状の区画の出現を支持し、内因性の構造およびシグナル支援を提供し、より自然な組織組織を反映していることです^。このハイドロゲルシステムの生理学的関連性は、形態学的およびトランスクリプトム解析の両方を用いて、従来のマトリゲル基ロガノイド培養との直接比較によって評価されています。以前の研究では、ハイドロゲル培養がマトリゲル系培養よりも組織化された管-小葉組織形成と多系統分化を支援しつつ、ホルモン応答性も維持することが示されました⁸。最近では、ハイドロゲル由来オルガノイド、マトリジェル培養オルガノイド、一次ヒト乳腺組織を比較した統合単細胞RNAシーケンシング解析により、ハイドロゲル培養オルガノイドが上皮層構造、細胞多様性、上皮-間葉系相互作用をより忠実に再現することが示されました³.対照的に、マトリゲル培養オルガノイドは増殖性雑種基底状態に富集され、ストロマル様集団を欠いており、これは上皮の自己組織化と一致し、指向性有機形成とは一致しなかった。

ここで説明するプロトコルは、一次ヒト組織からオルガノイドを生成する再現可能かつ拡張可能な方法を提供し、線維芽細胞の枯渇や単一細胞への解離のオプションステップも含めます。このプラットフォームはライブイメージング、高濃度イメージング、定量形態計測解析、細胞追跡、遺伝的撹乱研究と互換性があるため、オルガノイドの数、サイズ、構造、成長動態を評価する下流アプローチと統合可能です。したがって、このプラットフォームは人間の乳房発生、上皮可塑性、上皮と微小環境の相互作用、発生、分子、環境の摂動に対する組織レベルの応答を研究するための生物学的に関連性の高いシステムを提供します。

組織処理、ハイドロゲル調製、オルガノイド培養、発生進行、下流解析を含むワークフローの概要は 図1に示されており、このプラットフォームを用いて生成された代表的なオルガノイド形態は 図2に示されています。

図1。ハイドロゲルベースのオルガノイド生成ワークフローの概要。 (A) プロトコルのワークフローをまとめたフローチャートで、組織採取、組織処理、凍結保存、回収および任意の細胞準備、ハイドロゲル調製、オルガノイド培養、オルガノイド発生、および下流の分析応用を含む。(B) ハイドロゲルベースのオルガノイド生成プロトコルの主要段階を示す視覚的な概略図(組織処理と準備、回収および任意の細胞準備、ハイドロゲル準備およびオルガノイドシーディングを含む)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2。定義されたハイドロゲル系で生成される代表的なオルガノイド形態。 定義されたハイドロゲルマトリックス内で培養された異なるヒト組織から得られたオルガノイドの代表的な明視野画像。乳形成術由来の単一上皮細胞から生成された乳オルガノイドは培養21日目に画像化されました。腫瘍断片から生成された患者由来の異種移植片オルガノイドは培養16日目に画像化されました。上皮断片から生成された唾液腺オルガノイドは培養3日目に画像化されました。上皮断片から生成された腎臓オルガノイドは培養17日目に画像化されました。スケールバー=50μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

Protocol

手術後に医療廃棄物として廃棄されるはずだった一次組織は、メイン医療センターおよびタフツ医療センターの機関審査委員会が承認したプロトコルを用いて、関連法律に準拠して取得されました。すべての組織は移植前に匿名化されており、特定の患者に特定できませんでした。このため、本研究はマサチューセッツ工科大学およびタフツ大学健康科学部の実験対象者としての人間利用委員会(IRB #13521)から免除資格を与えられました。本研究に登録されたすべての患者は、研究への参加および結果の公表に同意するインフォームドコンセントフォームに署名しました。

1. 組織処理と調製

注意:ヒト組織を含むすべての処置は、機関のバイオセーフティおよび倫理ガイドラインに従って行ってください。手順開始前に、プロトコルステップやオルガノイド準備のワークフローを視覚的に把握するために、図1Aおよび1Bに示されたワークフローの回路図を参照してください。

1. 乳腺上皮基底培地に52 μg/mLの牛下垂体抽出物、10 ng/mLのヒト表皮成長因子、5 μg/mLのインスリン、500 ng/mLのヒドロコルチゾン、1%(v/v)のGlutaMAX、1%(v/v)抗生物質-抗菌薬(100X)を補足してMEGMを製製します。
2. 乳腺上皮増殖培地(MEGM)に1.5 mg/mLのコラーゲン酵素A(−20°Cで保存)と100 U/mLのヒアルロニダーゼ(4°Cで保存)を加えて解離培地を準備します。
3. 予防的乳房切除術および縮小乳房形成術から得られたヒト乳房組織を、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で固定せず、4°Cで維持します。 組織を精密な秤で計量し、全体の組織重量を測定します。
4. 組織を滅菌されたバイオセーフティキャビネットに入れてください。無菌メスを使って組織を3〜5 mm、³ 片ずつ機械的に粉砕します。約2〜3gの挽き組織を15 mLの円錐形チューブに移します。各チューブに10mLの解離培地を加えます。
5. チューブを37°Cで8回転の軌道回転器に12〜18時間培養し、酵素的に組織を消化します。消化完了とみなすのは、大きな組織断片が残っておらず、培地全体に均一に断片化された物質の均一な懸濁液が見られる場合です。
6. 上皮片は重力で5分間沈降させます。媒体中に目に見える破片が浮遊していないこと、そして明確なペレットが存在することを確認しましょう。ペレットを乱さずに上清液を慎重にデカントし、捨ててください。
   注:上清液には間質細胞やマトリックス成分が含まれており、洗浄して使用したり、他の研究のために保存したりすることができます。
7. ペレットをPBSに含む5%胎児用牛血清(FBS)を含む10mLのウォッシュ培地に再懸浮させます。室温のスイングバケット遠心分離機で250×gで5分間遠心分離機に置きます。
8. 洗浄工程をさらに3回繰り返し、または上澄液が透明で目に見えるゴミがなくなるまで繰り返します。
9. 最終ペレットをMEGM中の10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む冷凍培地に、初期組織重量1グラムあたり1 mLの容量で再懸浮させます。
   注意:DMSOは接触や吸入時に有害です。適切な個人用防護具の使用を行い、機関のガイドラインで求められる場合は化学物質安全フードの着用を行ってください。
10. 各クライオヴィアルに1mLの懸濁液を分け合う。液体窒素で長期保存する前に、冷凍容器で−80°Cの温度で冷凍保存します。
    注意:このステップは一時停止のポイントを表しています。長期保存条件に移す前に、サンプルは−80°Cで保存します。

2. 回収と任意の細胞調製

1. 解凍と初期回復
   1. −80°Cの冷凍保存から少なくとも24時間凍結後、または液体窒素の長期保存から組織を取り出します。すぐにクライオビアをキャップまで37°Cの水浴に浸し、細胞死を最小限に抑えるために1分間素早く解凍します。
      注意:解凍中は均一な温熱を確保するためにクライオビアを優しくかき混ぜてください。
   2. 完全に解凍されたら、すぐにクライオビアの内容物を10mLのMEGMを含む15 mLの円錐形チューブに移します。遠心分離機で250 × gで5分間加熱します。
2. 任意の線維芽細胞除去
   注:プレプレートによる線維芽細胞枯渇は、より上皮細胞が豊富な初期集団を望む場合に、急速に付着する間質細胞や線維芽細胞集団を減らすためのオプション的な濃縮ステップです。この工程はオルガノイド形成には必須ではなく、実験目的に応じて調整可能です。
   1. ペレットを10mLのMEGMに再懸浮させます。
   2. 再懸濁組織を10cmの細胞培養皿に移します。線維芽細胞の付着を可能にするために、37°Cで5%のCO₂を含んだ加湿インキュベーターで90分間培養します。
      注意:培養皿を洗礼中は動かさないように、線維芽細胞の準着を確実にしてください。
   3. 10mLの血清学ピペットで、培養皿を約45°に優しく傾けながら、非接着細胞を含む上清液を採取します。プレートを5mLのPBSで優しくすすいで、そのすすぎ液と採取した上清液を混ぜます。
   4. 結合懸浮液を250×gで5分間遠心分離し、上皮細胞濃縮物質を回収します。
      注:プレートに付着した細胞は乳腺線維芽細胞として濃縮されており、DMEM + 10% FBSおよび抗生物質を含み地を加えることで別途増殖させることができます。
3. 単一細胞への任意解離
   1. ペレットを0.25%トリプシンを含む予温(37°C)解離酵素溶液500μLに再懸浮させます。代替解離試薬は最適化が必要かもしれません。懸濁液を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。P1000ピペットを使ってサンプルを20回分砕し、解離を促進します。
      注意:酵素解離試薬は有害である可能性があります。適切な個人用保護具の使用を心がけ、肌や目を合わせないようにしましょう。
   2. 37°Cで3〜5分間培養します。培養直後にP1000ピペットで20回のトリチーリングを行い、機械的に解離します。
   3. 酵素反応を中和するために血清含有ウォッシュ培地1mLを加えます。500 × gで遠心分離機を5分間加熱します。
   4. ペレットを300μLの分散液(5 U/mL)および30 μL DNase溶液(1 mg/mL)に再懸濁させます。37°Cで3〜5分間培養します。
   5. 試料を15〜20回ピペッティングして機械的に解離します。懸濁液に700μLの血清含有ウォッシュメディウムを加えます。
   6. セルの懸濁液を40μmのセルストレーナーでろ過し、きれいなチューブに入ります。標準的な40μmセルストレーナーまたはFlowmiピペット先端ストレーナーのいずれかが使用されます。フローミストレーナーは、限られた細胞数で作業する場合、サンプル損失を減らす可能性があります。
   7. トリパンブルー排除を用いて生存細胞数を決定します。セル懸濁液10μLをトリパンブルーと1:1の比率で混合し、10μLを細胞計数室または計数スライドに注入します。自動細胞カウンターまたは血液細胞計を用いて細胞生存率を測定します。
   8. 懸濁液を500 × gで室温で5分間遠心分離します。
   9. 細胞ペレットをMEGMに所定濃度で再懸濁し、ハイドロゲルシーディングを行います。
      注:単細胞シーディング実験では、実験目的やドナーサンプルの特性により、200 μLのハイドロゲルあたり約1,000〜5,000セルの入力量が一般的です。低いシーディング密度は、個々のオルガノイド発生の追跡を促進するために一般的にライブイメージングや形態形成研究に用いられますが、高密度はRNAやタンパク質の収集を含むエンドポイント分子解析に一般的に用いられます。

3. ハイドロゲルの調製とオルガノイドシーディング

1. 在庫の準備と体積計算
   1. 使用前にラミニン溶液(1.18 mg/mL)、ヒアルロン酸溶液(滅菌水に1 mg/mL)、フィブロネクチン溶液(滅菌水中2 mg/mL)、PBS 1×を氷に入れます。ラミニンおよびフィブロネクチンのアリコートは−80°Cで保存し、ヒアルロン酸溶液は4°Cで保存します。 使用前に0°C〜4°Cの氷上でゆっくりと凍結した部品を解凍します。
   2. 25×細胞外マトリックスサプリメントのストック溶液を準備します。1 mLを製製するには、425 μLラミニン、250 μLヒアルロン酸、250 μLフィブロネクチン、75 μL PBSを氷上に置いたチューブで組み合わせます。チューブを3〜4回逆さまにして優しく混ぜます。溶液は最大1ヶ月間4°Cで保存します。
   3. 準備前に望ましい最終ハイドロゲルの体積と組成を決定してください。ピペッティングおよび移送中の物質損失を考慮し、少なくとも20%の余剰体積を準備してください。
      注:ハイドロゲル製剤は、コラーゲンI(細胞外マトリックス補給物の最終濃度1×(25×ストックから)と、pH中和および重合のためにコラーゲンI体積に対して12.5%(v/v) 0.1N水酸化ナトリウムで構成されています。
      注:最終的なハイドロゲル濃度は、1.7 mg/mL コラーゲンI、20 μg/mL ラミニン、20 μg/mL フィブロネクチン、10 μg/mL ヒアルロン酸です。
   4. 次の式で必要なコラーゲンI(V_{コラーゲン})の量を計算します。
      
      ここで、 C_最終 値=1.7 mg/mL、 V_総量 は最終的なハイドロゲル量、C_ストック はコラーゲンストック溶液の濃度です。コラーゲンストック濃度は2〜12 mg/mLの範囲で使用してください。
      注意:コラーゲンストックの濃度はバッチごとに異なる場合があります。濃度が高いほど粘度が上がり、ピペットはゆっくりと行うべきです。
   5. 0.1 N水酸化ナトリウム(V_NaOH)の体積を次の式で計算します:
      V_NaOH = 0.125 × V_{コラーゲン}
      無菌水中で1N水酸化ナトリウムを希釈して、0.1N水酸化ナトリウム作動溶液を準備します。
   6. 以下の式で細胞外マトリックス補足(V_ES)の体積を計算します。
      
   7. 次の式で残りの体積を計算します。
      V_増殖培地 = _V総量 - (V_{コラーゲン}+V、_NaOH + _V、ES + V_{細胞/組織})
      注意:各実験ごとに細胞または組織断片の体積を個別に決定してください。許容容量内で10〜100μLの範囲を標準的に使用してください。断片の大きさや組成が調製ごとに大きく異なるため、正確な断片計数は行われません。断片の豊富さと分布を視覚的に評価して播種を標準化します。
2. ハイドロゲルマスターミックスの調製
   1. コラーゲンI、細胞外マトリックスサプリメント、水酸化ナトリウム(0.1N)、培養培地を0°C〜4°Cの氷床に置きます。 すべての成分を低温で保ち、早期重合を防ぎます。
   2. 計算されたコラーゲンIの体積を冷却したマイクロ遠心分離機チューブに加えます。
   3. 計算された冷却された培地の量をコラーゲン溶液に加えます。
   4. 計算された体積0.1 Nの水酸化ナトリウムを加えて溶液を中和します。
      注:以前の最適化により、これらの条件が適切なゲルpHを生成することが確立されています。したがって、ハイドロゲル混合物の定期的なpH検査は不要です。
      注意:コラーゲンの早期重合を防ぐため、以降のすべての工程を迅速に実施してください。
   5. チューブを1秒あたり約1回の激しく振って、少なくとも6回振って溶液を混ぜます。
   6. 計算された細胞外マトリックスサプリメントの量を混合物に加えます。
   7. P1000ピペットまたはワイドボアピペットの先端を使って、計算された単一細胞または組織断片の体積を加えます。ステップ3.2.5で説明されている通り、すぐに振って混ぜ、次のステップに進みます。
3. ハイドロゲル沈着
   1. ヒドロゲル混合物を各ウェルあたりの所定容量で培養容器にピペットで移管します。4ウェルチャンバースライドには1ウェルあたり200μLのハイドロゲルを使用し、8ウェルチャンバースライドでは100μL、96ウェルプレートには20μLを使用します。
   2. チャンバースライドを使う際は、ヒドロゲルを表面に薄く広げます。ピペットの先端をチャンバーウェルの中央上部端に位置させ、ゲルを分散しながら先端を表面に引きずり、均一なパッドを作ります。96ウェルプレートの場合、ピペットの先端をウェルの中央に位置しつつ表面と接触を保ち、ゲルを中央に分散してドーム構造を維持します。ゲルに空気をピペットで入れることは気泡ができてしまうので避けてください。
   3. 培養容器は37°Cで加湿インキュベーターに5%_CO2を含み、60分間培養して完全な重合を可能にします。
      注:ここで述べた重合条件は、本研究で用いられた培養フォーマットに合わせて最適化されています。培養容器の形状、ハイドロゲルの容積、培養条件に応じて、重合時間のわずかな調整が必要になることがあります。
4. 文化と維持
   1. 各ウェルに予備加熱済みのMEGMを加えます。使用する培養フォーマットに応じて体積を調整してください。
   2. ピペットチップでハイドロゲルを培養面から優しく剥がし、ゲルを浮かせます。ピペットの先端をゲルの周囲に滑らせ、重合ハイドロゲルの下を優しく持ち上げて表面から解放します。
   3. MEGMは週に2回、新鮮な予温された培地に交換してください。培養は5%のCO₂を含んだ加湿インキュベーターで約3〜4週間保持し、完全なハイドロゲル崩壊が起こる前に培養を終了します。凝縮したハイドロゲルは、ゲル内の広範な細胞増殖によって生じる密で不透明なプラグ状構造の出現によって識別できます(補 足図1の代表例を参照)。

Results

このプロトコルの成功裏の実行により、組織化された上皮形態や組織特異的構造特徴を示す三次元オルガノイド構造が形成されます。オルガノイドは種まき後3〜7日以内に形成され始め、培養期間を通じて発育を続けます。このハイドロゲルオルガノイドシステムの以前の特性評価では、複数の独立した一次ヒトドナー間で再現可能なオルガノイド形成が示されました³。その研究では、12人の疾患のない縮小乳房形成ドナーから単離された一次上皮細胞が評価され、12サンプル中11サンプルが該当する培養条件下でオルガノイドを成功裏に生成しました。ドナー全体で、シード細胞100個あたり形成されるオルガノイド構造の中央値数は1.775(95%信頼区間:0.45–4.10)でした。オルガノイド形成効率や成長動態においてドナー間で大きなばらつきが観察されたものの、複雑な管-小葉およびアシナル形態はドナー間で再現性に生成されました。

単一上皮細胞由来の乳房オルガノイドは進行的な形態形成を示し、培養21日目までに分岐構造を形成します(図2)。これらの構造は、細長い突起と多細胞組織によって特徴づけられます。オルガノイドは18日目までに10,000〜90,000μm^²の予測面積を示し、円形度値は0.3未満で、4π ×(面積/周囲²)^3,9と計算されました。組織断片由来のオルガノイドは通常、18日目までに90,000μm²を超える構造を形成したのに対し、腫瘍断片由来のオルガノイドはより密度が高く不規則な構造を形成し、組織が減少し放射状の突出が増加し、成長行動の変化と一致しました。

唾液腺および腎上皮断片から得られるオルガノイドも、同じハイドロゲル条件下で異なる形態を示します(図2)。唾液のリン体オルガノイドは早い時点(3日目)に緻密な構造を形成するのに対し、腎臓のオルガノイドは17日目までに細長く非対称な形態を発達させます。これらの観察は、乳腺組織を超えたハイドロゲルベースのオルガノイドシステムの広範な適応性を示し、複数の上皮組織源からのオルガノイド形成を支える能力を示すために含まれています。

これまでに行われた^3,5,8の免疫染色および分子解析では、KRT8、KRT18、KRT19、E-カデリン、GATA3、JAG1、Notch1、MUC1などの上皮系譜マーカーの存在、さらに基底または筋上皮マーカーのKRT5、KRT14、Slug、SOX9、TP63が存在し、オルガノイド内の上皮異質性の保存を示しました。末端管小葉単位のような組織構造と一致する構造的特徴は、共焦点顕微鏡および三次元再構築によって観察され、長く伸びた管領域が末端小葉または肺胞様芽と接続されている構造として定義され、これは人間の原生末端管小葉単位の組織に似たものでした。これらの構造はまた、層状の上皮組織を示し、先行の解析と一致する腔内および基底細胞のパターンを示し^ました。

間葉質のような区画が上皮構造と関連し、VIM、SNAI1、ZEB1、S100A、CD90、FAPαなどのマーカーの発現と移動行動を特徴としました。タイムラプス顕微鏡分析と組み合わせることで、これらの観察は^{培養システム内に}支援的な微小環境の出現を支持しています。

重要なのは、このプロトコルが単一の固定された生物学的ベンチマークを確立するのではなく、広く適応可能な方法論的枠組みを提供することを意図している点です。オルガノイド形成効率、サイズ、分岐の複雑さ、細胞組成などの定量的結果は、ドナーの供給源、更年期の状態、出発物質(例:組織断片か単一細胞か)、実験条件によって異なる場合があります。

最適でない結果としては、オルガノイド形成効率の低下(500個のシード細胞あたり<1個のオルガノイド)、過剰な細胞残骸、コラーゲン重合の失敗、または組織化された構造の確立の失敗が含まれます。これらのアウトカムは、細胞生存率の低下、組織解離の不完全、ハイドロゲル組成の不正確、pHの中和不良と一般的に関連しています。

オルガノイド発生の定量解析は、ライブイメージングおよび高濃度イメージング手法を用いて、オルガノイドの数、サイズ分布、分岐挙動、構造複雑性、細胞動態を測定することが可能です。このプラットフォームを用いた従来の研究では、縦断的なライブイメージング、細胞追跡、形態計測解析、遺伝的摂動研究が行われ、オルガノイドの成長動態^と系統挙動を時間経過で定量化^{しました。}画像化は共焦点顕微鏡を用いて行われ、画像解析はNIS-Elementsソフトウェアを使用して行われました。

補足図1。長期オルガノイド培養18日目のヒドロゲル崩壊の代表例。崩壊 したハイドロゲルは、広範な細胞の増殖とマトリックス収縮によって生じた、密度が高く不透明なプラグ状の構造として現れます。これらの形態的特徴は、完全なハイドロゲル崩壊前に培養を終了させる基準として用いられました。スケールバー=500μm。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ここで説明するプロトコルは、乳腺形態形成の主要な特徴を支える定義されたハイドロゲルマイクロ環境内で、三次元のヒト乳房オルガノイドの再現可能生成^{を可能にします。}この方法の成功にはいくつかのステップが重要です。まず、組織処理と酵素解離を慎重に制御し、上皮の生存能力を維持しつつ、過剰消化が細胞収量を低下させ、その後の形態形成を妨げる要因を最小限に抑えなければなりません^。特に、短時間かつ連続的な酵素治療と穏やかな機械的解離の組み合わせは、機能的な上皮集団を維持するために不可欠です。次に、ハイドロゲルの調製にはコラーゲン濃度、pH、タイミングの正確な制御^{が必要です。}コラーゲンの中和は重合を開始します。したがって、水酸化ナトリウム添加後のすべての工程は、均一なゲル形成を確保するために迅速かつ氷上で行う必要があります。不完全または遅延した重合は、オルガノイドの発生を支えない構造化や崩壊したハイドロゲルを引き起こすことがあります。最後に、ドナーサンプルごとにシーディング密度を経験的に最適化する必要があります。なぜなら、過剰な組織や細胞負荷が急速にゲル収縮し、構造的完全性が失われる可能性があるからです^。

いくつかのトラブルシューティングの考慮点が再現性を高めることができます。オルガノイド形成不良は、細胞生存率の低下、最適でないハイドロゲル組成、または^沈着時のゲル取り扱いの不適切なためが生じる可能性があります。コラーゲンストックが4°Cに保たれ、早期重合を経験していないことを確認することは、一貫したゲル品質のために不可欠です^。さらに、重合後に培養表面からハイドロゲルが成功して剥離することは、適切なゲル形成の指標となります。剥離しに失敗した場合、通常は重合不完全または表面条件が不適切であることを反映しています¹⁴。オルガノイドのサイズや形態のばらつきはドナーサンプル間で予想され、技術的失敗ではなく生物学的異質性を反映しています。このプラットフォームを用いた過去の研究では、オルガノイド形成効率および形態形成に大きな間差があるにもかかわらず、独立した一次ヒトドナーの幅広いグループで再現可能なオルガノイド形成が示^{されました。}

この方法にはいくつかの制限があります。このモデルは上皮構造と並行して間葉質状区画の出現を支持しますが、生体内のストロマル、免疫、血管微小環境の複雑さを完全には再現していません。ハイドロゲルの組成は定義されていますが、単純化された細胞外マトリックスであり、自然組織に存在するすべての生体力学的または生化学的手がかりを捉えきれない可能性があります^15,16。さらに、ドナー間変動はオルガノイドの成長動態や形態に影響を与えるため、特定の用途に応じた経験的最適化が必要です。これらの制約にもかかわらず、このシステムが自己組織化および内因性上皮・間葉相互作用を支える能力は、多くの既存の^{文化モデルに対して}大きな進歩を示しています。

一般的に使われている基底膜エキスベースのシステムと比較して、この方法は細胞外マトリックスの組成をより細かく制御し、未定義材料に伴う変動を低減します¹⁷。このハイドロゲルプラットフォームとマトリゲル系オルガノイド系を直接比較した先行研究では、組織組織や^{細胞組成に}大きな違いがあることが示されました^3,8。ヒドロゲル培養オルガノイドは形態学的および転写体レベルの両方で、多系統上皮集団(腔内、基底、前体、間葉様区画を含む)を保持し、マトリゲル培養オルガノイドは増殖性のハイブリッド基底様状態が優勢で、間質集団を欠いていました。さらに、外因性間質細胞の添加に依存する共培養システムとは異なり、このモデルは支持的な間葉質様区画の内在的な出現を可能にし、より生理学的に関連性が高く人工的に作られていない文脈で上皮細胞と微小環境の相互作用を研究することを可能にします。ハイドロゲル内で出現する間葉様集団は、補完的なライブイメージング、免疫染色、単細胞トランスクリプトミクス解析によって以前に検証されています^。3.これらの研究は、Vimentin、THY1/CD90、FAP、S100A4、ZEB1、Snailなどの間葉系および上皮–間葉系シグナル伝達相互作用を発現する高運動性のストロマル様細胞の出現と、リガンド–受容体解析を通じて同定された相互上皮–間葉シグナル伝達相互作用の出現を示しました。これらの特徴により、形態形成、上皮可塑性、初期組織再構築など、組織構造や細胞間コミュニケーションに依存するプロセスの研究に特に適しています^4,5。

このプラットフォームは、基礎研究およびトランスレーショナル研究に広く応用されています。これは人間の乳房発生の研究、病気の初期段階のモデル化、分子や環境の乱れが組織組織に与える影響の評価に利用できます。このプラットフォームを用いた以前の研究では、DDR1やRUNX1などの発生調節因子の機能的摂動が三次^{元培養における}系統分化、上皮組織、管-小葉形態形成を変化させることが示されました^5,18。定量イメージングや高濃度解析との互換性により、オルガノイドのサイズ、構造、複雑性の変化を含む表現型の結果の体系的な検証も可能となります。したがって、この手法は、人間の組織構造とその疾患関連文脈における破壊を研究するための、拡張可能かつ生物学的に関連性の高いプラットフォームを提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL円錐形チューブ	VWR	89039-664	組織処理および遠心分離のための滅菌チューブ
40 & mu;M細胞ストレーナー	VWR	732-2757	単一セル懸濁液準備用のろ過装置
40 & mu;低容量用のMセルストレーナー	ベルアート	136800040	単一セル懸濁液準備用のろ過装置
自動セルカウンター	バイオ・ラッド	1450102	細胞数と生存能力の判断に用いられる装置
牛の下垂体抽出物	サーモ・サイエンティフィック	13028014	上皮細胞培養物の補足
細胞計数スライド	バイオ・ラッド	145-0011	細胞計数に用いられる二室スライド
遠心分離機	該当なし	該当なし	ベンチトップ遠心分離機は少なくとも500 x gの速度能力と、15 mLおよび1.5 mLのチューブの収容能力を持つ必要があります。nbsp;
コラーゲンI	ミリポール・シグマ	08-115	ヒドロゲル形成に用いられる細胞外マトリックスタンパク質
コラーゲン酵素A型	シグマ・オルドリッチ	11088793001	組織解離に使われる酵素
クライオバイアル	コーニング	976171	サンプルの極低温保存用の滅菌バイアル
培養容器(例:チャンバースライド、マルチウェルプレート)	コーニング	354104 354108 3603	ハイドロゲル沈着およびオルガノイド培養のためのプラットフォーム。
ジメチルスルホキシド	ミリポール・シグマ	317275	冷凍培地で使用されるクライオプロテクタント
ディスパースII	ロッシュ	4942078001	二次組織解離に用いられる酵素
DNase I	ロッシュ	10104159001	細胞解離時に使用された酵素。
胎児用牛血清	ギブコ	10437	洗浄および中和媒体に使用される血清サプリメント
フィブロネクチン	シグマ・オルドリッチ	F2006	細胞外マトリックスタンパク質成分
グルタマックス	サーモ・サイエンティフィック	35050061	上皮細胞培養物の補足
人間の表皮成長因子	シグマ・オルドリッチ	E9644	上皮細胞培養物の補足
ヒドロコルチゾン	シグマ・オルドリッチ	H0888	上皮細胞培養物の補足
ヒアルロン酸	ミリポール・シグマ	385908	ハイドロゲル製剤のための細胞外マトリックス成分
ヒアルロニダーゼ	シグマ・オルドリッチ	H3506	組織解離に使われる酵素
インキュベーター	サーモ・サイエンティフィック	3598	組織培養用デバイス
インスリン	シグマ・オルドリッチ	I9278	上皮細胞培養物の補足
ラミニン	ギブコ	23017-015	細胞外マトリックスタンパク質成分
乳腺上皮基底育地	サーモ・サイエンティフィック	M171500	上皮細胞の培養培地
マイクロ遠心分離機チューブ(1.5 mL)	サーモ・サイエンティフィック	3451	小容量反応に用いられる管
軌道回転子	サーモ・サイエンティフィック	400110	酵素解離時に組織分散に用いられる回転子
P1000ピペット	ギルソン	P1000	最大1,000 & muのボリュームを混音・転送するための装置;L
ペニシリン・ストレプトマイシン	サーモ・サイエンティフィック	15140122	上皮細胞培地に対する抗生物質補助
リン酸塩緩衝塩水	ギブコ	20012-027	洗浄とすすいで使う緩衝液
精密バランス	メトラー・トレド	ML303E	組織計量に使われるバランス
血清学的ピペット	ナンク	170356N	非接着型上皮細胞の採取に使用されるピペット
水酸化ナトリウム(1N)	フィッシャー・ケミカル	SS261	コラーゲン中和に用いられる試薬
滅菌メス	バード・パーカー	372615	機械的な組織粉砕に使われる工具
トリパンブルー溶液	ギブコ	15250061	細胞生存能力評価に用いられる染料
トリプシン(0.25%)	ギブコ	25200056	細胞解離に用いられる酵素試薬
水浴(37度および度数;C)	VWR	10LA	試料の制御解凍に使用される装置