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方法論記事

免疫したアカゲザルの血液および骨髄における抗原特異的および総抗体分泌細胞を定量するためのELISpotアッセイ

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DOI:

10.3791/71836

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2026年8月21日

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1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

この記事について

サマリー

B細胞ELISpotは、血液（免疫後の短寿命プラズマブラストを反映）およびより持続的な骨髄ASCにおける、抗原特異的なIgG、IgM、およびIgAの長寿命プラズマ細胞、ならびに総抗体分泌細胞（ASC）の量と持続性を定量化するための検証済み手法です。

要約

新規ワクチン抗原およびアジュバントの評価は、伝統的に抗体価の測定に依存していますが、抗体価は免疫後に上昇するまで時間を要します。初回免疫およびブースター免疫後の抗体分泌細胞（ASC）の定量は、ワクチン誘発性液性免疫のより早期かつ機序的に有益な指標となり、ワクチン処方や免疫戦略の最適化を促進することができます。本稿では、HIVワクチン研究において重要な前臨床モデルであるアカゲザルの末梢血単核細胞（PBMC）および骨髄（BM）細胞からASCを計数するためのプロトコルについて説明します。この酵素結合免疫スポット（ELISpot）アッセイでは、絶対頻度および相対頻度を測定することにより、抗原特異的および総IgG、IgM、IgA ASCの両方を定量することが可能です。末梢血においては、本アッセイにより免疫後のプラズマブラスト反応のピークを捕捉し、骨髄においては、異なるアイソタイプの抗原特異的形質細胞の蓄積を検出することで、長寿命ASCの持続性を評価します。本プロトコルは、前臨床ワクチン研究における免疫原とアジュバントの組み合わせを評価するための強固で再現性の高いアプローチを提供し、有望なワクチン候補の臨床開発への移行を支持する貴重なデータを提供します。

概要

抗体分泌細胞（ASC）は獲得免疫の主要な構成要素であり、免疫後の迅速な生成による短寿命のプラズマブラストと、持続的な抗体産生を担う長寿命のプラズマ細胞の両方を含みます。プラズマブラストは末梢血および二次リンパ組織で一過性に検出され、免疫後の特定の時点において出現頻度がピークに達しますが、その時期はワクチン製剤や宿主種によって異なります（一般的にアカゲザルでは4〜5日後、ヒトでは約7日後です）。対照的に、成熟したプラズマ細胞は長寿命であり、主に二次リンパ組織および骨髄（BM）に局在しています。効果的なワクチンは、強力な液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘発する必要があります。ブースター免疫後の末梢血単核細胞（PBMC）におけるプラズマブラストの急速な増殖に反映される想起応答の測定は、ワクチン誘発性免疫応答の大きさを把握するための貴重な知見を提供します。本プロトコルの全体的な目的は、アカゲザルにおけるEnv特異的免疫後の初期プラズマブラストおよび長寿命プラズマ細胞の応答を定量化するための堅牢な手法を提供することです。

酵素結合免疫スポット（ELISpot）アッセイでは、抗原（Ag）でコーティングされたポリフッ化ビニリデン（PVDF）または混合セルロースエステル（MCE）膜底の96ウェルプレートでASCを培養し、生存細胞が分泌したタンパク質を膜表面で直接捕捉します。捕捉されたタンパク質は、その後、従来のサンドイッチ免疫測定法の形式を用いて抗体で検出されます。発色ELISpotアッセイでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によって基質である3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC）が不溶性の有色沈殿物に変換されることでスポットが形成され、個々のASCの可視化と計数が可能になります。ELISpotには、ex vivoでの抗原特異的反応の検出能、個々の免疫細胞の高感度な機能評価、および前臨床および臨床研究の両方におけるT細胞およびB細胞の免疫応答の定量的モニタリングなど、いくつかの重要な利点があります1,2,3。

ここでは、アカゲザルのPBMCおよびBM 細胞における、総および抗原特異的なIgG、IgM、IgA ASCを定量するためのB細胞ELISpotプロトコルについて説明します。本プロトコルでは、総およびEnv特異的なプラズマブラストおよび形質細胞応答のキネティクスを特性評価するために、プレートコーティング、ブロッキング、細胞播種、アッセイ展開、スポット計数、およびデータ解析を含むすべての重要なステップを詳細に解説しています。本手法は、前臨床ワクチン研究において異なる抗原およびアジュバント製剤の免疫原性を評価および比較するための再現可能なアプローチを提供し、その後の臨床応用へ向けたワクチン戦略の最適化を支援します。

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プロトコル

本プロトコルで使用したアカゲザルは、ニューイベリア研究センターの特定病原体未感染（SPF）コロニーから導入し、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターのマイケル・E・キーリング比較医学・研究センターで飼育した。動物の飼育およびすべての実験手順は、「実験動物のケアおよび使用に関するガイドライン」に準拠し、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの動物実験委員会（承認番号 #2616RN00）の承認を得て実施した。

本プロトコルは、ASC応答を検出するために開発された、以前の免疫前臨床研究4,5,6,7で述べられている手法を最適化したものです。以下のプロトコルでは、HIV実験的ワクチンプロトコルに従事したアカゲザルから調製した新鮮なPBMCs およびBM 細胞を用いたELISpotの手順について説明します。

注意：セクション1〜4のすべての手順は、認証済みのクラスIIバイオセーフティキャビネット内で、無菌操作を用いて行ってください。可能な限りマルチチャンネルピペットを使用してください。

1. ELISpotプレートの準備

  1. ELISpotプレートのコーティング
    1. 総免疫グロブリン（Ig）用プレート1および3に、滅菌DPBSで希釈した5 µg/mLの非標識ヤギ抗サルIgG + IgM + IgAを100 µL/wellずつ添加してコーティングする。プレートを4 °Cで少なくとも8時間、好ましくは一晩インキュベートする（Figure 1A,C）。
    2. 抗原特異的プレート2および4に、DPBSで希釈した20 µg/mLのGalanthus nivalisレクチン（GNL）を100 µL/wellずつ添加してコーティングする。プレートを4 °Cで少なくとも8時間、好ましくは一晩インキュベートする（Figure 1B,D）。
    3. コーティング済みのプレートは、使用時まで4 °Cで保存する。
  2. 総免疫グロブリンプレートの洗浄およびブロッキング
    1. 各プレートを廃棄容器の上に素早く反転させ、プレート1および3からコーティング液を除去する。反転させたプレートを吸収紙でしっかりと叩き、残留液を取り除く。
    2. 0.05% Tween 20を含むPBSを200 µL/wellずつ用い、各プレートを2回洗浄する。その後、残留した界面活性剤を除去するため、200 µL/wellのDPBSでプレートを2回洗浄する。
      注：Tween 20は細胞毒性がある。細胞を播種する前に完全に除去すること。
    3. 各ウェルにRPMI-10を200 µL/wellずつ添加する。加湿インキュベーター内にて、プレートを37 °Cで2時間インキュベートする。
  3. 抗原特異的プレートの洗浄およびブロッキング
    1. 各プレートを廃棄容器の上に素早く反転させ、プレート2および4からGNLコーティング液を除去する。反転させたプレートを吸収紙でしっかりと叩き、残留液を取り除く。
    2. 200 µL/wellのDPBSで各プレートを4回洗浄する。
      注：GNLコーティングプレートにTween 20を含むPBSを使用しないこと。
    3. 各ウェルにRPMI-10を200 µL/wellずつ添加する。加湿インキュベーター内にて、プレートを37 °Cで2時間インキュベートする。
    4. ブロッキング液を廃棄し、200 µL/wellのDPBSで各プレートを4回洗浄する。
    5. 最終濃度5 µg/mLとなるように、CH505 SOSIP抗原を100 µL/wellずつ添加する。プレートを37 °Cで2時間インキュベートする。
    6. 抗原溶液を廃棄し、滅菌DPBSで各プレートを4回洗浄する。
      注：細胞播種前にMCE膜が乾燥するのを防ぐため、最終洗浄後はウェルにDPBSを残しておくこと。

2. サンプルの調製：PBMCおよび骨髄単核細胞の分離

  1. 全血からのPBMCの分離
    1. 10 mLのEDTA採血管を450 x gで遠心分離する。 g ブレーキをかけずに室温で20分間。
    2. 血漿を除去し、Ca不含DPBSを4 mL添加する。2+ およびMg2+10 mLセロロジカルピペットを用いて、静かに混合する。
    3. 15 mL遠心チューブに入れた4 mLのFicollの上に、希釈した血液を慎重に重層させる。800 x gで遠心分離を行う。 g 緩やかな加速および減速設定を用い、室温で30分間遠心分離を行う。
    4. 末梢血単核球を含むバフィーコートを新しい15 mLチューブに移す。DPBSを8〜10 mL加え、450 x gで遠心分離する。 g 室温で10分間。
    5. 上清を除去し、細胞ペレットを穏やかに再懸濁する。
    6. 細胞懸濁液に2 mLの塩化アンモニウム・カリウム（ACK）溶解バッファーを加え、室温で5分間インキュベートする。
      注意：ACK溶血バッファーへの長時間曝露は細胞生存率を低下させるため、インキュベーション時間を5分以内にしてください。
    7. 2%胎児牛血清（FBS）含有DPBSを10 mL加えて、赤血球溶解を停止させます。細胞を300 x g 室温で10分間。
    8. 上清を捨て、細胞をRPMI-10に再懸濁する。
    9. 適切な細胞計数法を用いてPBMCを計数し、生存率が以下の通りであることを確認します。 >90%（例：トリパンブルー染色による）。
    10. 1つの分注量を5に調整します。 × 106 抗原特異的ELISpotアッセイ用に、細胞数を〇〇 cells/mLに調整する。2つ目の分注分を1〇〇に調整する。 × 106 総免疫グロブリンELISpotアッセイにおけるcells/mL。
  2. 骨髄単核細胞の分離
    1. 70μLを分注します。 µセルストレーナーを50 mL遠心チューブに装着する。1 mLのDPBSでストレーナーをあらかじめ濡らす。
    2. 骨髄吸引液1 mLに DPBS 4 mLを加える。セロロジカルピペットを用いて十分に混ぜ合わせる。
    3. 骨髄懸濁液を70μmのフィルターに通します。 µセルストレーナー。ストレーナーを廃棄する前に、2 mLのDPBSで洗浄する。
    4. ろ過した懸濁液を、15 mL遠心チューブ内の4 mLのFicollの上に静かに重ねます。800 x g 緩やかな加速および減速設定を用い、室温で30分間処理する。
    5. 単核細胞層を新しい15 mLチューブに移す。DPBSを8～10 mL加え、450 x gで遠心分離を行う。 g 室温で10分間。
    6. 上清を捨て、細胞ペレットを穏やかに再懸濁させる。
    7. 細胞懸濁液にACK溶血バッファーを2 mL加える。室温で5分間インキュベートする。
      注意：細胞生存率を維持するため、推奨される溶解時間を超えないようにしてください。
    8. 2% FBSを含むDPBS 10 mLを加えて赤血球溶解を停止させる。細胞を300 x g 室温で10分間。
    9. 上清を捨て、細胞をRPMI-10に再懸濁する。
    10. 適切な細胞計数法を用いて骨髄単核細胞数を測定し、生存率が >90%（例：トリパンブルー染色による）
    11. 1アリコートを5に調整する × 106 抗原特異的ELISpotアッセイ用に、10^6 cells/mLに調整します。2つ目の分注サンプルを1 × 106 総免疫グロブリンELISpotアッセイにおけるcells/mL

3. 細胞の播種およびインキュベーション

  1. 総免疫グロブリンプレートへの播種
    1. プレート1および3を廃棄容器の上に素早く反転させて、ブロッキング剤を除去する。反転させたプレートを吸収紙の上でしっかりと叩き、残留した培地を取り除く。
    2. 1行目の各ウェルに100 µLのRPMI-10を、2行目と3行目の各ウェルに133 µLのRPMI-10を加える。これらはテクニカルデュープリケートで作成する。
    3. プレート1の各列の最初のウェルに、100 µLのPBMC懸濁液（1 × 106 cells/mL）を加える。プレートレイアウトに従ってサンプルを配置する［例：ウェルA1～A6をアカゲザル1（RM1）、A7～A12をアカゲザル2（RM2）とする］。
    4. プレート3の各列の最初のウェルに、100 µLの骨髄細胞懸濁液（1 × 106 cells/mL）を加える。プレートレイアウトに従ってサンプルを配置する。
    5. あるウェルから次のウェルへ67 µLずつ移し、移すたびに十分に混合することで、3倍段階希釈液を調製する。指定のウェルまで段階希釈を繰り返し、最後に67 µLを廃棄して、各ウェルの最終容量を133 µLに維持する。
    6. 5% CO2を含む37 °Cの加湿インキュベーターで、プレートを一晩インキュベートする。
      ​注意：ダブルスポットの発生を防ぐため、インキュベート中はプレートを移動させたり乱したりしないこと。
  2. 抗原特異的プレートへの播種
    1. プレート2および4を廃棄容器の上に素早く反転させて、DPBSを除去する。反転させたプレートを吸収紙の上でしっかりと叩き、残留したバッファーを取り除く。
    2. 1行目の各ウェルに100 µLのRPMI-10を、2行目と3行目の各ウェルに133 µLのRPMI-10を加える。
    3. プレート2の各列の最初のウェルに、100 µLのPBMC懸濁液（5 × 106 cells/mL）を加える。プレートレイアウトに従ってサンプルを加える。
    4. プレート4の各列の最初のウェルに、100 µLの骨髄細胞懸濁液（5 × 106 cells/mL）を加える。プレートレイアウトに従ってサンプルを加える。
    5. あるウェルから次のウェルへ67 µLずつ移し、移すたびに十分に混合することで、3倍段階希釈液を調製する。指定のウェルまで段階希釈を繰り返し、最後に67 µLを廃棄して、各ウェルの最終容量を133 µLに維持する。
    6. 5% CO2を含む37 °Cの加湿インキュベーターで、プレートを一晩インキュベートする。
      注意：振動によってダブルスポットやコメットテール状のアーティファクトが生じる可能性があるため、インキュベート中はインキュベーターを乱さないこと。

4. ELISpotプレートの処理

  1. 総免疫グロブリンプレートの処理
    1. 約18時間の培養後、インキュベーターからプレートを取り出す。
    2. 10%漂白剤を入れた廃棄容器の上に各プレートを素早く逆さまにし、細胞と培地を捨てる。逆さまにしたプレートを吸収紙でしっかりと叩き、残留液体を取り除く。
      注：以降の処理ステップは非無菌条件下で行う。
    3. 0.05% Tween 20含有DPBSを200 µL/wellを用いて、各プレートを4回洗浄する。
      注：メンブレンの乾燥を防ぐため、最後の洗浄バッファーはウェルに残しておく。
    4. 大量のプレートを処理する場合は、代わりに自動マイクロプレートウォッシャーを用いてプレートを洗浄する。
    5. ビオチン化抗サルIgG抗体およびIgM抗体を1:1,000に、ビオチン化抗サルIgA抗体を1:500に、0.05% Tween 20および1% FBS含有DPBSで希釈し、検出抗体溶液を調製する。
    6. プレートを吸収紙で叩いて最後の洗浄バッファーを取り除く。希釈した抗IgG抗体を列1、2、7、8に、抗IgM抗体を列3、4、9、10に、抗IgA抗体を列5、6、11、12に、それぞれ100 µL/wellずつ加える。
      注：メンブレンの乾燥を防ぐため、プレートは1枚ずつ処理する。
    7. プレートを室温で2時間インキュベートする。
    8. 検出抗体溶液を捨て、0.05% Tween 20含有DPBSでプレートを4回洗浄する。
    9. HRP-avidinを0.05% Tween 20および1% FBS含有DPBSで1:1,000に希釈し、酵素複合体を調製する。
    10. 各ウェルに希釈したHRP-avidinを100 µL/well加える。遮光し、室温で2時間インキュベートする。
    11. HRP-avidin溶液を捨て、0.05% Tween-20含有DPBSでプレートを4回洗浄する。
      ​注：基質発色が完了するまで、最後の洗浄バッファーはウェルに残しておく。
  2. 抗原特異的プレートの処理
    注：手順は総免疫グロブリンプレートに使用したものと同様である。ただし、GNLコーティングを保持するため、すべての洗浄ステップはTween 20を含まないDPBSを用いて行う。
    1. 約18時間の培養後、インキュベーターからプレートを取り出す。
    2. 10%漂白剤を入れた廃棄容器の上に各プレートを素早く逆さまにし、細胞と培地を捨てる。逆さまにしたプレートを吸収紙でしっかりと叩き、残留液体を取り除く。
      注：以降の処理ステップは非無菌条件下で行う。
    3. DPBSを200 µL/wellを用いて、各プレートを4回洗浄する。
      注：メンブレンの乾燥を防ぐため、最後の洗浄バッファーはウェルに残しておく。
    4. ビオチン化抗サルIgG抗体およびIgM抗体を1:1,000に、ビオチン化抗サルIgA抗体を1:500に、1% FBS含有DPBSで希釈し、検出抗体溶液を調製する。
    5. プレートを吸収紙で叩いて最後の洗浄バッファーを取り除く。希釈した抗IgG抗体を列1、2、7、8に、抗IgM抗体を列3、4、9、10に、抗IgA抗体を列5、6、11、12に、それぞれ100 µL/wellずつ加える。
      注：メンブレンの乾燥を防ぐため、プレートは1枚ずつ処理する。
    6. プレートを室温で2時間インキュベートする。
    7. 検出抗体溶液を捨て、200 µL/wellのDPBSでプレートを4回洗浄する。
    8. HRP-avidinを1% FBS含有DPBSで1:1,000に希釈し、酵素複合体を調製する。
    9. 各ウェルに希釈したHRP-avidinを100 µL/well加える。遮光し、室温で2時間インキュベートする。
    10. HRP-avidin溶液を捨て、200 µL/wellのDPBSでプレートを4回洗浄する。
      注：基質発色が完了するまで、最後の洗浄バッファーはウェルに残しておく。
  3. 自動洗浄の実施（オプション）
    1. 製造元の指示に従い、自動マイクロプレートウォッシャーをDPBSでプライミングする。
    2. 定義済みのELISpot洗浄プログラムを選択し、すべての洗浄ステップをDPBSを用いて行う。
      注：異なる洗浄バッファーで装置を繰り返しプライミングする手間を省くため、すべての自動洗浄にDPBSを使用する。
    3. マイクロプレートウォッシャーには、 表1に記載されているウォッシャー設定を使用する。

5. 検出

  1. 基質溶液の調製
    1. 基質溶液1 mLあたり1滴の発色剤溶液を加え、使用直前にAEC作動基質を調製する。ボルテックスミキサーで十分に混ぜ合わせる。
      注：96ウェルプレート4枚分として、作動基質を約40 mL調製する。
  2. 室温でのELISpotプレートの発色処理
    1. プレートを1枚ずつ処理する。最終洗浄バッファーを捨て、直ちにAEC作動基質を100 µL/well添加する。
    2. 明確な赤色のスポットが視認できるようになるまで、視覚的に発色を確認する（通常2–4 min以内）。
      注意：過剰な発色はバックグラウンド染色を増加させ、スポットの分解能を低下させるため、プレートの過剰発色を避けること。
    3. プレートを流水で十分にすすぎ、酵素反応を停止させる。
    4. 水道水でプレートを4〜5回洗浄する。吸収性のペーパータオルを用いて余剰な水分を取り除く。
    5. プレートの下部のドレインを取り除き、スポットをカウントする前に約24 h室温で自然乾燥させる。
      注：過剰発色を防ぐため、最も細胞濃度の高いウェルでスポットが視認でき次第、直ちに反応を停止させる。
    6. 残りの各プレートについて、ステップ5.2.1–5.2.5を繰り返す。

6. スポットの定量化

  1. ELISpot画像の取得
    1. 画像取得ソフトウェアを搭載したELISpotリーダーを用いて、各プレートをスキャンする。
    2. 適切なプレートテンプレートを選択し、解析対象のウェルを定義し、ソフトウェアの指示に従って画像を取得する。
    3. 生データを保存し、アーカイブ目的でプレート画像をTIFF形式でエクスポートする。
  2. 抗体産生細胞の計数
    1. 各ウェルの自動スポット計数結果を確認する。
    2. 各ウェルを目視で検証し、誤って統合または分割されたスポットを特定する。正確な計数値を得るために、必要に応じて個別のスポットを手動でマークする。
      注：大きなスポットは自動解析ソフトウェアによって重複してカウントされる可能性があるため、目視による検証を推奨する。
    3. Table 2に記載されている通り、スポット数に対応する希釈係数とともに、スプレッドシートに記録する。
    4. 各希釈段階の平均スポット数を算出する前に、IgG、IgM、およびIgAについて、デュプリケートのウェルを個別に解析する。
    5. 平均スポット数に corresponding な希釈係数を乗じて、投入細胞100万個あたりの抗体産生細胞数を算出する。
      注：総免疫グロブリンアッセイには15×、45×、135×の希釈係数を、抗原特異的アッセイには3×、9×、27×の希釈係数を使用する。
    6. すべての計算をスプレッドシートソフトウェアで行い、統計グラフ作成ソフトウェアを用いてグラフを生成する。

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結果

このB細胞ELISpotアッセイでは、HIV-1に対する広域中和抗体（bnAb）の誘導を目的としたワクチン研究において、コーティング抗原として可溶性HIV-1エンベロープ糖タンパク質（Env）三量体であるCH505 SOSIPを用い、抗体産生細胞（ASC）を検出しました。図1に、個別のプレートで総ASC数および抗原特異的ASC数を定量するために使用したELISpotプレートのレイアウトを示します。このレイアウトでは、個々の動物と、IgG、IgM、およびIgAの解析に割り当てられたウェルの位置が特定されています。プレートのラベルには、研究番号、サンプリング時点、および日付も記載されています。さらに、このレイアウトには、アッセイに使用したコーティング濃度、細胞懸濁液量、および段階希釈スキームが指定されています。

図2は、骨髄における代表的な抗原特異的ASC反応を示しており、抗体の分泌量に応じて、個々のASCに対応する様々な大きさおよび強度のスポットが表示されています。...

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ディスカッション

B細胞ELISpotは、血液、血漿、および骨髄細胞における総免疫グロブリンおよび抗原特異的な抗体分泌細胞（ASC）応答を検出するための高感度な手法である8,9,10,11。本プロトコルの再現性を確保するためには、いくつかの重要な工程がある。まず、メンブレンを至適濃度の捕捉抗体で正確にコーティングする必要がある。非特異的結合を防ぐためのメンブレンブロッキングは不可欠であり、本プロトコルに記載されている通り、4 °Cで一晩行うことが望ましい。あるいは、時間が限られている場合は、37 °Cで少なくとも2時間ブロッキングを行うことができる。

もう一つの重要な要因は、採取直後の細胞を用いることで高い細胞生存率を維持することです。T細胞とは異なり、B細胞系譜、特にプラズマブラストや形質細胞は、凍結保存後の機能喪失が起こりやすい傾向にあります...

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開示事項

著者らに申告すべき利益相反はありません。

謝辞

著者らは、動物およびKeeling Center for Comparative Medicine and Researchの研究ケアスタッフによる献身的なケアに感謝するとともに、手順の継続的な改善に貢献した多くの元チームメンバーおよび共同研究者に感謝いたします。このNHP HIVワクチンプロジェクトへの資金提供は、NIHの助成金5R01AI183472（MBZ宛）およびR24OD010947（FJV宛）によって行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ACK溶解バッファーQuality Biological118-156-101500 ml
70µm ストレーナーFisher22363548滅菌済みセルストレーナー、50 mLコニカルチューブ用
AEC用作動基質BD Biosciences55195110プレート分試薬
解析ソフト：ExcelMicrosoft officeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft 365用Microsoft Excel
解析ソフト：GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
抗Rhesus IgAビオチンNHPRRAB-3086851凍結乾燥品
抗モンキーIgGビオチンRocklandP/N 617-106-012凍結乾燥品
抗モンキーIgMビオチンRocklandP/N 617-106-007凍結乾燥品
ブロッキング液ラボ調製試薬院内調製RPMI-10
二次抗体およびHRP希釈用バッファーラボ調製試薬院内調製1% FBS含有1X DPBS
遠心機 Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR、製造年：2013年、TX-750ローターおよび75003608（ラウンドバケット）
コーティングバッファーラボ調製試薬院内調製1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
ELISpotプレートMillipore SigmaMSHAN4B5050プレートパック
ウシ胎児血清 (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
非標識GNLVector LaboratoriesL-1240-5凍結乾燥品
ホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) - アビジンVector LaboratoriesA-20045mg/ml 既製液
Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotリーダーMabtech ABP/N: 2000ELISpotおよびFluorospotアッセイ用自動イメージング・解析装置
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140-122100X
プレートウォッシャーBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRS405 TS マイクロプレートウォッシャー
RPMI-10ラボ調製試薬院内調製RPMI-1640 + 10% ウシ胎児血清および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life sciencesP7949500ml
非標識ポリクローナルヤギ抗モンキー IgG+IgA+IgM抗体 IgG/IgM/IgALS-BioC347340凍結乾燥品
洗浄バッファー（抗原特異的プレート用）ラボ調製試薬院内調製（1X DPBSのみ）
洗浄バッファー（全Igプレート用）ラボ調製試薬院内調製（1X DPBS + 0.05% Tween 20）

参考文献

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
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