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方法論記事

ITインフラおよびオンザフライデータ処理パイプラインを備えた学内クライオ電子顕微鏡施設の設計と運用

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DOI:

10.3791/71837

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2026年9月1日

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1ITS-Technology Engineering, Information Technology Services, Physical & Biological Sciences Division, University of California-Santa Cruz, 2Biomolecular Cryo-Electron Microscopy Facility, University of California-Santa Cruz, 3Chemistry and Biochemistry Department, University of California-Santa Cruz

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、学内または施設内でのクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）施設のITインフラストラクチャを設計および運用するための実用的な枠組みを提供します。施設計画、ネットワークアーキテクチャ、ストレージ、GPUコンピューティング、リモートアクセス、およびリアルタイムデータ処理について解説し、拡張性、持続可能性、および高性能なcryo-EM運用を確保しながら、数テラバイトに及ぶデータセットを効率的に管理することを可能にします。

要約

クライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）は、生物学的高分子の高解像度構造決定における主要な手法となりました。世界中で機関内のCryo-EM施設が増加するにつれ、ある持続的な課題が浮上しています。それは、これらの施設をサポートするために必要なデータインフラストラクチャの計画が、日常的に不十分であるということです。直接電子検出器（DED）を搭載した最新のCryo-EM装置は、1日あたり2～5 TBの生データを生成し、20人のユーザーが利用する施設では、1年間の運用で約2 PBのデータが蓄積される可能性があります。これらのデータを処理するには、専用のGPU計算ノード、高速な内部ネットワーク、および堅牢な長期アーカイブ戦略が必要であり、これらはすべてデータ収集を開始する前に整備されていなければなりません。本プロトコルでは、自前でCryo-EM施設を構築するためのITおよび計算設計の統合的なフレームワークを提示します。物理的な施設要件（部屋の設計、電源、冷却、防振）、機器の選定（顕微鏡、DED、および補助装置）、および完全な計算スタック（ネットワークスイッチの構成、ストレージサーバーの選定とサイジング、GPU計算ノードのプロビジョニング、リモートアクセスアーキテクチャ）について解説します。さらに、業界標準のツールを用いて、データ収集中にリアルタイムで動作補正、コントラスト伝達関数（CTF）推定、パーティクルピッキング、および2D分類を行うオンザフライ・データ処理パイプラインを実装するための詳細なプロトコルを提供します。また、外部ユーザー向けのデータ転送戦略についても述べます。本ガイドは文献における重要な空白を埋めるものであり、研究者や管理者が、初日から計算処理の準備が整ったCryo-EM施設を構築することを可能にします。

概要

クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）における解像度革命は構造生物学を一変させ、結晶化を必要とせずにタンパク質、核酸、および高分子複合体の原子レベルでの可視化を可能にしました1,2。この変革を推進したのは、高フレームレートの直接電子検出器（DED）の開発、電子光学および顕微鏡メカニクスの向上、そしてGPU加速による画像処理ソフトウェアの最適化という3つの技術的進歩です3,4,5,6。これらの進歩が相まって、cryo-EMは拡大し続ける構造生物学コミュニティにとって最適な手法となっています。

クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）への需要の高まりにより、大規模な国立センターおよび小規模な機関内施設の両方への大幅な投資が行われてきました。米国のNCCAT、S2C2、PNCC、MCCETや、欧州のeBIC、NeCEN、SciLifeLabなどの国立センター3,5,6は、承認されたプロジェクトに対して最高性能の装置を提供しています。機関内施設は、より迅速なターンアラウンドタイムとユーザーとスタッフの密接な連携により、反復的なプロジェクト固有の研究をサポートし、これらのリソースを補完します。しかし、機能的な機関内施設を設立するには、単に顕微鏡を購入するだけでは不十分です。それを支えるITインフラストラクチャも同様に不可欠であり、その不備は新設施設における運用の失敗の主な原因となっています6。

ハイエンドなクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）のセッション1回につき、24時間で2～5 TBの生ムービーデータが生成される可能性があります。複数の顕微鏡とユーザーが存在する場合、データ負荷は急速にペタバイト規模に達します。これらのデータの処理には、データ収集と並行して動作させる必要があるGPU加速パイプラインが不可欠です7,8。前処理に遅延が生じると、データ品質に関するフィードバックが遅れ、装置の使用時間が無駄になります。こうした実情があるにもかかわらず、cryo-EM施設の管理に関するほとんどの公開ガイドでは、ITコンポーネントにほとんど注意が払われておらず、完全なデータインフラストラクチャを構築し検証するための段階的な運用プロトコルを提供しているものは一つもありません。

本プロトコルでは、その課題に対処します。施設建設における物理的および技術的な要件、顕微鏡および検出器の選定基準、そして最も重要な点として、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）施設の運用を実効的なものにするためのIT基盤の設計と実装について解説します。6特にオンザフライ・データ処理に重点が置かれています。これは、データ収集と並行して自動的に前処理を行うことで、リアルタイムの品質管理を可能にし、収集に関する意思決定を導き、セッション後のターンアラウンドタイムを大幅に短縮するものです。9,10,11本プロトコルに従うことで、施設開発者は、広範な科学コミュニティに対して持続可能かつ効率的に提供できる、完全かつ統合されたクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）運用体制を構築することが可能になります。

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プロトコル

本プロトコルで使用した機器、ソフトウェア、および材料の詳細は、材料表に記載されています。

1. 物理的施設の設計、人員、およびインフラ計画

  1. 設置場所の評価を行う。以下の条件を満たす建設予定地を選定すること：防振床を備えていること（周囲の振動レベルが、理想的には < 1 µm/s 1～100 HzにおけるRMS値）；磁場安定性（< 1 mG/mの空間勾配および < 0.1 mG/mの時間的変動（300 kV装置の場合）；安定した室温（18–22 °C 〜を用いて < 0.5 °C 変動）；湿度制御（40–60% RH）；および低音響ノイズ（<50 dB）。計画段階の早い時期に、顕微鏡メーカーの設置要件を確認してください。
    注： 既存の部屋を改修する場合、新築と同等の費用がかかることがあります。目安として、部屋の整備予算には顕微鏡の購入価格の約20%を見込んでください。
  2. 機能ゾーンを明確に空間的に分離した施設レイアウトを設計してください：(a) 低温透過電子顕微鏡（cryo-TEM）用の顕微鏡室、(b) グリッドの操作および保管用の試料作製前室、(c) ウォーターチラー、UPSユニット、および顕微鏡用チラーシステムを設置するコントローラー室、(d) ストレージおよび計算インフラストラクチャ用の独立したサーバー室またはデータセンター。
    注：以下のコントロールルームを維持してください 26 °C 常時稼働させ、専用のバックアップ電源と冷却設備を設けてください。コントローラー室での温度逸脱は、顕微鏡のダウンタイムが発生する一般的な要因となります。
  3. 電源インフラを計画してください。ハイエンドのクライオ電子顕微鏡（cryo-TEM）用に専用の三相電源回路を設置します。すべての顕微鏡、カメラ、およびサーバー機器を、指定された保護電源インフラに接続してください。停電時でも顕微鏡の動作と冷却水の流れを維持できる非常用発電機を導入できるよう、施設の管理チームと調整を行ってください。
    注：クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）施設内のいくつかの装置では、安全な電源のオン・オフ（パワーサイクル）に1日以上の時間を要します。予期せぬ停電は、精密な回路基板に損傷を与え、実行中のデータ収集セッションの喪失を招く恐れがあります。
  4. 電子顕微鏡および関連ハードウェアに冷却水システムを設置する。自動フェイルオーバー機能を備えたバックアップ冷却水回路を構築する。顕微鏡の統合モニタリングシステムまたは専用のセンサーアレイを使用して、水流速、温度、および導電率を継続的に監視する。
  5. 建設または改装時に、顕微鏡室からサーバー室まで光ファイバーケーブルを敷設してください。仕様は、最低でもOM4マルチモードまたはOS2シングルモードファイバーとし、十分な余裕長を設け、両端にラベルを貼付したパッチパネルを設置してください。
    注：ファイバーを事前に敷設しておく方が、後から適合させるよりも大幅に費用を抑えることができます。
  6. 機器のメンテナンス、ユーザー教育、スケジューリング、サンプルの最適化、およびデータ取得サポートを行うため、専任の顕微鏡オペレーターまたはファシリティサイエンティストを配置してください。また、インフラストラクチャ、ネットワークパフォーマンス、サイバーセキュリティ、データバックアップ、ソフトウェアの展開、GPUコンピューティングリソース、およびユーザーのリモートアクセスの管理を行うため、専任のIT担当者を配置してください。
  7. 提供するユーザサポートのレベルと計算インフラストラクチャの複雑さに応じて、必要な人員数を決定してください。UCSC Biomolecular cryo-EM Facilityのような小規模な施設では、これらの責任を計算機専門知識を持つ施設マネージャーや、機関の中央ITサービスが分担する場合もあります。しかし、顕微鏡の台数、ユーザー数、および年間のデータ収集セッション数が増加するにつれ、専門人員の必要性がますます高まります。
  8. 複数のクライオ電子顕微鏡（cryo-TEM）を運用する施設には、中断のないデータ収集、効率的なデータ管理、および拡張可能な計算リソースを確保するため、専用のITサポートを提供してください。施設の開発段階から堅牢なITインフラストラクチャと人員に投資することで、運用のダウンタイムを最小限に抑え、将来の拡張を容易にし、拡大するユーザーコミュニティとデータ集約度が高まるクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）ワークフローをサポートできる持続可能な枠組みを構築してください。

2. 顕微鏡および検出器の選択

  1. 顕微鏡を選定する前に、施設の主たる科学的ミッションを定義してください。その際、以下の点について検討してください。(a) 主なワークフローが、単粒子解析（SPA）、クライオ電子トモグラフィー（cryo-ET）、マイクロ電子回折（microED）、またはそれらの組み合わせのいずれになるか。(b) 想定されるユーザー数の規模およびプロジェクトの多様性。(c) 導入費用および継続的なサービス契約の両方に関する予算上の制約。
  2. 目的のアプリケーションに応じて、利用可能なクライオTEMプラットフォームを評価してください。高解像度の単粒子解析（SPA）およびサブトモグラム平均化（STA）には、300 kVの装置を検討してください。スクリーニングおよび中解像度のデータ収集には、200 kVの装置を検討してください。スクリーニング機能を備えた低コストの導入検討には、100～120 kVを評価してください（以下に要約）。 表1).
    注意：仕様書は頻繁に変更されます。機器の選定を確定させる前に、必ずメーカーに最新の構成詳細および価格を直接問い合わせてください。
  3. 顕微鏡およびアプリケーションに適したDEDを選択してください。Thermo Fisher Scientific (TFS) 社の装置を用いて高解像度SPAを行う場合、現在はKriosおよびGlaciosシリーズにおいてFalcon 4iが主要な選択肢となっています。
  4. JEOL CryoARM装置において、Gatan K3は優れた感度とフレームレートを提供します。SPAとmicroEDの両方を目的とする施設では、検出器が電子回折データ収集モードと互換性があることを確認してください（表 2).
    注： DEDは施設内で最も高価なコンポーネントの一つであり、データの質とストレージ要件に大きな影響を与えます。例えば、電子イベントレジスタ（EER）モードでは、従来の圧縮フォーマットよりも大幅に大きなRAWファイルが生成されるため、比例してより多くのストレージ容量とネットワーク帯域幅が必要となります。
  5. クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）の装置構成を選択する際は、エネルギーフィルターの役割を評価してください。エネルギーフィルターは、画像品質、検出器の選択、およびシステム全体の性能に大きな影響を与える可能性があります。非弾性散乱電子を除去することで、エネルギーフィルターはコントラストと信号対雑音比（S/N比）を向上させます。これは、困難な試料、高分解能の単粒子解析（SPA、有用）、クライオ電子トモグラフィー（cryo-ET、不可欠）、およびマイクロ結晶電子回折（microED、有用）のアプリケーションにおいて特に有益です。
  6. 装置選定の際には、利用可能なエネルギーフィルタシステムを評価してください。Gatan BioquantumおよびBiocontinuum、あるいはThermo Fisher Scientific SelectrisおよびSelectrisXシステムは、構成によって異なりますが、通常は約30万〜150万米ドルの費用がかかります。
  7. 最終的な装置構成を選択する前に、検出器の性能、施設の目標、および想定されるユーザーのアプリケーションと併せて、エネルギーフィルターの導入に伴う追加コストと複雑性を評価してください。
  8. 総取得コストを算出する際は、サービス契約を考慮に入れてください。サービス契約では通常、顕微鏡、エネルギーフィルター、検出器、および水冷システムがカバーされます。
  9. 装置の購入時に、応答時間の保証や代替部品の提供可否を含むサービス契約条件を交渉してください。サービス保守費用として、装置購入価格の年間8～15%を予算に組み込んでください。

3. ネットワークアーキテクチャの設計と実装

  1. コアとなる高速スイッチを中心として、施設内ネットワークを設計します。顕微鏡コントローラー、カメラコントローラー（多くの場合、別のワークステーションとなる）、ストレージサーバー、およびGPU計算ノードなど、すべてのデータ生成デバイスおよびデータ消費デバイスを、サポートされている最高速でこのスイッチに直接接続します。
  2. 各デバイスに最低 10 Gbps の接続を提供します。予算が許す場合は、スイッチとストレージおよび計算ノードとの間に 25 Gbps 以上のアップリンクを確保してください。
    注： 1 Gbps の場合、20 TB の生データを転送するのに 2～3 日かかります。10 Gbps では、同じ転送に 5～6 時間かかります。25 Gbps では、約 2 時間で完了します。ネットワーク速度は、オンザフライ処理がデータ取得速度に追いつけるかどうかを直接的に決定します。
  3. コアスイッチを指定します。要件は以下の通りです：(a) フルラインレートでのノンブロッキングスイッチングファブリックであること、(b) すべての施設デバイスに対応する十分な SFP+ または QSFP ポートを備えていること、(c) マネージドスイッチ機能（VLAN サポート、トラフィックモニタリング、診断用ポートミラーリング）を有すること、(d) 電源モジュールが冗長化されていること。ノンブロッキングスイッチングファブリック、十分な高速ポート、トラフィック管理機能、および冗長電源を備えたエンタープライズグレードのマネージドスイッチを選択してください。
  4. VLAN を使用してネットワークをセグメント化し、以下を分離します：(a) データ取得 VLAN（顕微鏡およびカメラコントローラー、ストレージサーバー）、(b) 計算 VLAN（GPU ワークステーションおよびクラスターノード）、(c) 管理 VLAN（リモートアクセス、モニタリング、管理）。
    注：ネットワークのセグメント化により、ブロードキャストトラフィックが削減され、セキュリティが向上し、各サブシステムの独立したトラブルシューティングが可能になります。
  5. コアスイッチの専用アップリンクポートを介して、施設ネットワークを機関の WAN に接続します。リモートアクセスおよび外部データ転送には、キャンパスネットワークへの 1～10 Gbps のアップリンクで十分です。
  6. 機関の IT 部門と調整し、施設からアクセス可能なすべてのデバイスに対して、静的 IP アドレス、DNS エントリ、および適切なファイアウォールルールを割り当てます（図 1）。
  7. すべてのネットワークケーブルを配線し、ラベルを貼ります。100m までの 10 Gbps 以上の接続には、ダイレクトアタッチケーブルまたはアクティブ光ケーブルを使用します（シールド付き Cat6A も 100m まで 10 Gbps で利用可能です）。ラック間の 25 Gbps 以上のリンクには、あらかじめ成端されたファイバーアセンブリ（LC-LC または MTP）を使用します。
  8. デバイス名、IP アドレス、ポート割り当て、および VLAN 所属を明記したネットワーク図を用いて、完全な配線計画を文書化します。
    注：小規模な cryo-EM 施設向けの推奨最小ネットワークトポロジの概略図については、図 2 を参照してください。

4. ストレージサーバーの設計と展開

  1. ハードウェアを調達する前に、ストレージ要件を算出します。基準として、ハイエンドのcryo-EMセッション1回につき、1日あたり2–5 TBの生データが生成されます。
  2. 想定される施設の利用状況に基づいて、長期的なストレージ要件を推定します。2台の顕微鏡を運用する20人規模の施設では、稼働後3–6か月以内に約2 PBのデータが生成される可能性があります。生データのストレージ（短期、高スループット）と、処理済みデータのストレージ（中期、大容量）の両方を計画してください。処理済みデータセットは、多くの場合、生の入力データの10–20倍のサイズになります。
  3. 堅牢なストレージアーキテクチャを選択します。ほとんどの施設において、コストパフォーマンスに優れ、データ整合性の検証（チェックサム）が組み込まれ、柔軟なRAID相当の構成（RAIDZ、RAIDZ2）とスナップショット機能を備えた、スタンドアロンのZFSベースサーバーが推奨される開始点となります。クラスター分散ファイルシステム（Gluster、Ceph、GPFS/IBM Spectrum Scale）は、より高いパフォーマンスと拡張性を提供しますが、複数の物理サーバーが必要となり、管理もより複雑になります。
  4. ZFSストレージプールを構成します。推奨される初期構成は、2つのRAIDZ2 vdev（それぞれ6–8台の高容量SAS HDD、1台あたり16–20 TBで構成）であり、これにより、2台のドライブが同時に故障しても保護され、約60–70%の利用可能容量が確保されます。
  5. 2–4台のNVMe SSDを使用して、専用のSSD書き込みキャッシュ（L2ARC）vdevを追加し、アクティブな処理ジョブのランダムリード性能を向上させます。
    注： 運用環境のストレージアレイにコンシューマー向けSATAドライブを使用しないでください。cryo-EMワークフローの持続的なランダムI/Oパターンには、定格ワークロード容量（例：550 TB/year）を備えたエンタープライズSASまたはNL-SASドライブが不可欠です。
  6. ZFSストレージサーバー上で、NFSエクスポート（Linuxクライアント用）およびSMB共有（Windowsクライアント用）を構成します。中間コピーなしでデータに直接アクセスできるよう、すべてのGPU計算ノードおよびカメラコントローラーワークステーションにプライマリデータ共有をマウントします。
  7. データの保持およびライフサイクルポリシーを策定します。以下を定義してください：(a) 生ムービーの保持期間（通常は収集後3–6か月）、(b) モーション補正済みマイクログラフの保持、(c) 最終処理済みデータセットの保持（出版まで無期限）、(d) 完了したプロジェクトのアーカイブ手順。
  8. ストレージ使用率が70%を超えた場合に自動アラートを実装し、追加ストレージを適時に調達できるようにします。
    注： ストレージは、cryo-EM施設の計画において最も過小評価されやすいコストです。顕微鏡の導入承認を、十分なストレージ予算が確保されたことと混同しないでください。ストレージの調達は、データ収集が始まる後ではなく、装置の設置と並行して計画する必要があります。

5. GPU計算インフラストラクチャ

  1. 予想されるスループットに基づいてコンピューティング要件を決定します。1台の顕微鏡で24時間のセッションあたり3,000～5,000枚のマイクログラフを生成する場合、収集速度でのオンザフライ前処理を維持するために、それぞれ4枚のNVIDIA GPUカード（Maxwell以降、11+ GB VRAM、例：RTX 3090、RTX 4090、またはA100）を搭載したコンピューティングノードが最低2台必要です。
  2. より大規模な施設や、ティルトシリーズのボリュームが多いcryo-ETワークフローの場合は、追加のノードを準備してください。
  3. GPUコンピューティングノードのハードウェアを指定します。各ノードには以下を含めてください：(a) CUDAをサポートするNVIDIA GPU 4枚（CryoSPARCおよびRELION 3Dリファインメント用にGPUあたり最低24 GB VRAM）、(b) 並列CPUバウンドステップ（CTF推定、ファイルI/O）をサポートするための高コア数CPU（AMD EPYCまたはIntel Xeon、≥32 cores）、(c) ≥256 GBのシステムRAM、(d) アクティブなジョブの中間ファイル用の2～4 TB NVMe SSDローカルスクラッチスペース、(e) 10/25 Gbpsネットワークインターフェースカード（NIC）、(f) 作業データセット用の十分なローカルストレージ（通常はRAIDボリューム）。注：コンシューマー向けGPU（RTX 4090）は、cryo-EMワークロードにおいて、エンタープライズ向け代替製品（A100）と同等の性能を大幅に低いコストで提供できます。CryoSPARCとRELIONのメモリアクセスパターンは高メモリ帯域幅GPUに適しているため、特にこれらのベンチマークを評価してください。
  4. 各コンピューティングノードに、NVIDIAドライバースタック、CUDAツールキット（CryoSPARCおよびRELIONと互換性のあるバージョン）、およびcuDNNをインストールします。構成管理ツールを使用して、すべてのノードでソフトウェア環境を標準化し、将来のアップデートを簡素化してください。
  5. CryoSPARCをスタンドアロンまたはクラスター構成で展開します。マルチノード施設の場合、専用のヘッドノードにCryoSPARC-masterを、各GPUコンピューティングノードにCryoSPARC-workerをインストールします。
  6. 複数のユーザーが同時に処理ジョブを送信できるよう、ジョブスケジューリングを構成します。最小システム要件およびネットワーク構成については、CryoSPARCの公式アーキテクチャドキュメントに従ってください。
  7. ユーザーが両方の処理エコシステムを利用できるよう、メインの処理プラットフォームに加えてRELIONをインストールします。スケジューラー（SLURMまたはPBS/Torque）を介してローカルコンピューティングノードを使用するようにソフトウェアを構成します。
  8. アクセサリーツールをインストールします：MotionCor2（モーション補正）、CTFFIND4およびGctf（CTF推定）、TOPAZ（機械学習ベースのパーティクルピッキング）、crYOLO（ニューラルネットワークパーティクルピッカー）、およびcryoDRGN（不均一性解析）。SPA、cryo-ET、STA、およびmicroEDで利用可能なソフトウェアパッケージの概要については、Table 3を参照してください。 
  9. 再現可能でバージョン管理されたソフトウェア環境を維持するために、SBGridコンソーシアムによる展開またはコンテナベースのソフトウェア管理（HPC環境ではSingularity/Apptainer、ワークステーションではDocker）を使用します。
    注：SBGridは、学術機関向けに自動アップデート管理機能を備えた、主要なすべてのcryo-EMソフトウェアツールのプリコンパイル済みで検証済みのビルドを提供しています。

6. リモートアクセス・インフラストラクチャ

  1. すべての学外ユーザーおよびスタッフの主要な安全なエントリーポイントとして、VPNベースのリモートアクセスを確立します。機関のIT部門と連携し、デバイスを広範なパブリックインターネットにさらすことなく、施設の計算およびストレージネットワークへのアクセスを許可する施設固有のVPNプロファイルまたはトンネルをプロビジョニングします。
  2. すべてのリモートアクセスポイントに2要素認証（2FA）を実装します（図 2）。
  3. 顕微鏡コントローラーおよびGPUワークステーションへのグラフィカルなアクセス用に、リモートデスクトップソフトウェアを導入します。推奨されるオプション：（a）TeamViewer（商用、クロスプラットフォーム、NATトラバース対応 ― 顕微鏡コントローラーへのアクセスに適しています）、（b）NoMachine（商用、クロスプラットフォーム、OpenGL 3Dグラフィックスフォワーディングをサポート ― 可視化ツールを実行するGPUワークステーションに推奨されます）、（c）TurboVNCとVirtualGL（オープンソース、Linux専用、リモート3Dレンダリングをサポート）。
    注：多くのクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）可視化ツールは、3DレンダリングにOpenGLを使用しています。標準的なX11フォワーディングは、ハードウェア加速されたOpenGLをサポートしていません。これらのアプリケーションにはNoMachineまたはVirtualGL/TurboVNCを使用してください。
  4. 顕微鏡データ収集ソフトウェアへのリモートアクセスを構成します。機関のVPN経由でのリモート操作には、LeginonまたはSerialEMを使用します。顕微鏡収集ソフトウェアには、承認済みのリモートデスクトップアプリケーションを通じてリモートでアクセスできます。
  5. ユーザー運用を開始する前に、代表的な学外の場所（自宅ネットワーク、共同研究機関）からリモート接続をテストします（表 4）。
  6. スタッフとユーザーがデータ収集状況、前処理の出力、ストレージの使用率、および計算キューの状態をリモートで監視できるように、ウェブベースの施設監視ダッシュボードを構築します。Leginonには、組み込みのウェブ監視インターフェースが含まれています。
  7. CryoSPARCワークフローについては、パイプラインのログ出力およびシステム監視ツール（Prometheus、node_exporter）からデータを供給するGrafanaまたはカスタムウェブダッシュボードを構成します。
  8. 外部ユーザー向けにデータ配信メカニズムを確立します。施設のストレージ上に、Globus Connect Serverなどの認証済みデータ転送サービスを構成します。
  9. Globusを利用できないユーザー向けに、チェックサムを記録したUSBハードドライブの配送手順を準備します。外部ユーザーが数TBのデータセットを直接ダウンロードすることを実用的に可能にするには、10 Gbpsのインターネットアップリンクが必要です。

7. オンザフライデータ処理ワークフロー：実装

  1. データ収集セッションを開始する前に、データフローパスを事前設定してください。以下の項目を確認してください：(a) カメラコントローラーが、施設のNFSマウント済み高性能ストレージにRAWムービーを直接書き込む設定になっていること。(b) すべてのGPU計算ノードでNFS共有がマウントされ、アクセス可能であること。(c) 計画しているセッションに対して十分な空きストレージ容量があること（24時間のSPAセッションの場合、最低5 TBの空き容量が必要）。(d) GPU計算ノードが利用可能であり、リソースを競合させるような長時間実行ジョブが存在しないこと。
  2. ゲインリファレンス補正を設定します。各セッションの前に、検出器ベンダーが指定する方法（通常はグリッドの空き領域へのブランクビーム照射）で、ゲインリファレンス画像を取得してください。
  3. ゲイン補正ファイルを指定の前処理入力ディレクトリに配置します。すべてのモーション補正ソフトウェア（MotionCor2、RELIONの独自実装）は、正しく設定されていれば、このリファレンスを自動的に適用します。
  4. CryoSPARC-Liveを用いて、オンザフライの前処理パイプラインを起動します（リアルタイムでの可視化に推奨されます）。パイプラインは、出力ディレクトリに最初のムービーが表示された時点で開始してください。通常、自動データ収集を開始してから5〜10分以内に表示されます。
    注：CryoSPARC-Liveは、指定されたディレクトリを継続的に監視して新しいムービーファイルを取り込み、到着したファイルから順に処理します。最大の違いは、CryoSPARC-Liveがモニタリング用のリアルタイム対話型ウェブインターフェースを提供している点にあります。
  5. CryoSPARC-Liveワークフロー
    1. ウェブインターフェースで、新規または既存のプロジェクトに移動し、新しいライブセッションを作成します。11,36.
    2. 入力ソースを設定します。具体的には、カメラコントローラーによって書き込みが行われているディレクトリパス（「ウォッチフォルダ」）、RAW動画ファイルに一致するファイルパターン（例：*.tif、*.mrc、またはEERフォーマットのFalcon 4iデータの場合は*.eer）、およびゲインリファレンスファイルのパスを指定してください。
    3. モーション補正パラメータを設定します。使用するフレーム数、パッチベースのモーション補正（推奨：5x5パッチ）、出力ビニング係数（通常、ナイキスト限界付近でのデータ収集では1、初期スクリーニングでは2）、および1フレームあたりの電子線量（総線量とフレーム数から算出）を指定してください。
    4. CTF推定パラメータを設定する：フィッティングのための最小および最大分解能（通常は30 Å および 4 Å）、デフォーカス探索範囲（0.5–5 µm （SPAに推奨）、および許容最大乱視量を設定します。cryo-ETデータセットに対しては、チルトごとのCTF推定を有効にします。
    5. 粒子ピッキングの設定：ピッキング方法を選択します（初回セッションではBlobピッカー、良好な2Dクラスが最初に得られた後はテンプレートピッカー、困難なサンプルの場合はTOPAZピッカーを使用します）。想定される粒子の直径および粒子の最小・最大間隔を設定してください。
    6. ストレージ要件、データ転送負荷、および計算コストを大幅に削減するため、粒子抽出時にフーリエクロッピングを4倍（物理ピクセルサイズを4倍にする）することを推奨します。日常的なデータ品質評価には、3〜5の中間解像度を Å 通常、オンザフライ処理においてはこれで十分です。
    7. ライブセッション内で2D分類を有効にします。2Dクラス数（通常50～200）、インクリメンタルアップデート用のバッチサイズ（200～500粒子）、および分類の解像度制限（6～8 Å）を設定してください。 Å （初期評価用）。
    8. ライブセッションを開始します。以下の項目についてリアルタイムダッシュボードを監視してください：取り込まれたムービーの数とレート、モーション補正の品質（ムービーあたりの総モーション。以下の場合はムービーを拒絶してください： >30 Å （経験則としての全モーション量）、CTFフィッティングの品質（CTFフィッティング解像度が低いマイクログラフは除外する） >6–8 Å）、マイクログラフあたりの粒子収量、および進化する2Dクラス平均の品質。
    9. 自動キュレーションの許容閾値を設定します。「Filters」パネルで、モーション（total motion cutoff）、CTF品質（fit resolution cutoff）、およびデフォーカス範囲（極端なアンダーフォーカスまたはオーバーフォーカスのマイクログラフを除外）の拒否基準を定義します。キュレーションされた粒子は、後続の2D分類ジョブに自動的に送られます。

8. データ収集中のリアルタイム品質管理とフィードバック

  1. セッション全体を通して、CTF統計を継続的にモニタリングしてください。各マイクログラフのデフォーカス値をプロットします。分布は、意図したデフォーカス範囲（通常は−0.5から−3.0 µm （SPA用）。
  2. デフォーカス値が高くなる方向への系統的なドリフトは、ステージのドリフトまたはユーセントリック高さの校正ミスを示している可能性があります。CTFフィッティング分解能が6 Åを下回った場合は、直ちに施設スタッフに通知してください。 Åこれは通常、氷の混入、ビームの不安定性、または介入を必要とするフォーカスのドリフトを示しているためです。
  3. モーション補正出力をモニタリングしてください。1ムービーあたりのフレーム内総モーション量は10〜30未満である必要があります。 Å 高品質なデータを得るためです。初期フレームにおける系統的な大きな動きは想定されており、補正されます。しかし、動画全体にわたって大きな動きが持続する場合（>40 Å （合計）は、メカニカルステージの不安定性または試料のチャージアップを示している可能性があり、調査する必要があります。
  4. セッション中に更新される2Dクラス平均を（30〜60分ごとに）確認してください。高品質なデータセットの指標は、クラス平均に二次構造の特徴が見られること、粒子の異なる複数の視点が得られていること、およびスタッキングや凝集によるアーティファクトがないことです。
  5. 介入が必要な指標がないか監視してください。具体的には、すべての粒子が特徴のない「ジャンク」クラスに分類される（サンプルの質または氷の質が低いことを示唆）、特定のビューが完全に欠如している（優先配向を示唆し、グリッドの最適化が必要な場合がある）、またはマイクログラフあたりの粒子収量が極端に低いといった状況が挙げられます。
  6. すべての観察事項を構造化されたセッションログに記録してください。記録項目は、セッションの開始/終了時刻、顕微鏡およびカメラの設定、即時統計サマリー（収集した総ムービー数、CTFフィルターを通過した割合、モーションフィルターを通過した割合、ピックした総粒子数、2Dクラス評価）、および実施したあらゆる介入措置とします。このログは、遡及的な品質評価および施設のパフォーマンス報告において不可欠です。
  7. セッション終了時に、データ品質サマリーレポートを生成します。ライブ処理プラットフォームにより、セッションサマリーが自動的にエクスポートされます。
    注：サマリーやレポートを作成するためのもう一つの選択肢として、VitreumなどのAIツールの利用が挙げられます。UCSC Biomolecular Cryo-EM Facilityでは、実験ワークフローと実験ドキュメントの管理にVitreumプラットフォームが導入されています。Vitreumは、実験ステップをリアルタイムで記録し、プロトコルレベルの制約を適用し、定義済みの品質基準に基づいてワークフローの実行を検証し、ラボ活動の監査可能な記録を提供します。ラボ運用を施設の計算およびデータ管理インフラストラクチャと統合することで、このプラットフォームは手動による記録保存を最小限に抑え、再現性を向上させ、施設スタッフと利用者の間のコミュニケーションを促進し、試料調製からデータ収集、そして後続の計算解析に至るまで、一貫した実験追跡を可能にします。

9. 回収後のデータ処理パイプライン

  1. オンザフライの前処理が完了した後、キュレーション済みのビン化粒子スタックが、キュレーション済みの前処理済みムービーと共にエクスポートされます。
  2. CryoSPARCプロジェクトをメインワークステーションからデタッチし、リモートアクセス可能な別の共有ワークステーションに再アタッチします。これにより、迅速なオフロードと切り替えが可能になり、次のデータ収集セッションを開始できます。
    注： 一般的なデータ収集は1～2日程度であり、CryoSPARC-Liveで容易にモニタリングできます。しかし、3D処理ステップには数週間から数ヶ月かかる場合があるため、ワークステーション間やストレージサーバー間でのプロジェクト転送が正当化されます。
  3. CryoSPARCにおいて、ライブセッションからキュレーション済みのビン化粒子を標準プロジェクトへエクスポートし、オフラインでの3D処理を行います36。 
  4. ab initio 3D再構成を行います。CryoSPARCのAb Initio Reconstructionジョブを使用します（不均一なサンプルの場合は3～5個の初期モデルを推奨）。構造的な不均一性を評価するために、1～4個の初期モデルを生成します。
  5. 再構成された値が十分であると判断されたら、全体の分解能を向上させるために、ビン化されていない粒子を再抽出します。
  6. 不均一リファインメント（複数のコンフォメーションやクラスが想定される場合）を行い、続いて最適なクラスに対して均一リファインメントを行います。CryoSPARCでは、heterogeneous refinementに続いてnon-uniform refinementを使用します。 
  7. ユーザーの好みに応じて、RELIONでのBayesian polishing13を適用するか、粒子ごとのモーション補正およびCTFリファインメント（CryoSPARCのCTF refinementジョブ）を使用して、ビーム誘起運動と粒子ごとのデフォーカスを考慮し、粒子ごとの信号を改善します。このステップにより、最終的なマップ分解能が通常0.2～0.5 Å向上します。さらに、分解能とマップ品質を向上させるためのオプションとして、CryoSPARCのリファレンスベースモーション補正（RBMC）も利用可能です。
  8. ゴールドスタンダードのFourier shell correlation (FSC) 手法を用いて最終マップを検証します。粒子スタックを2つの独立したハーフセットに分割して独立してリファインし、2つのハーフマップ間のFSCを算出します。FSC = 0.143における最終分解能を報告します。
  9. 独立した検証指標として、原子モデルフィッティング後にマップ対モデルFSC (FSC-Q) およびQスコアを算出します37。
  10. 原子モデルの構築と検証を行います。密度マップから自動的にde novoモデルを構築するにはModelAngeloを使用します20。PHENIXのリアルスペースリファインメントを用いてモデルを精査し、MolProbityで検証します。
  11. 初期モデルの生成後、COOT35を用いて密度マップを可視化し、原子座標のフィッティングや調整、モデリングエラーの修正、欠損領域の構築、およびタンパク質、核酸、またはリガンド構造の最適化を行います。これにより、残基、側鎖コンフォメーション、二次構造、および配列割り当てのインタラクティブな編集が可能になり、その後のリアルスペースリファインメントによって原子モデルと実験的な密度との整合性が向上します。
  12. 最後に、最終的な原子モデルをProtein Data Bank (PDB)に、密度マップをElectron Microscopy Data Bank (EMDB)に、そして生データまたは前処理済みデータをElectron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR)に登録します。

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結果

A successfully implemented facility IT infrastructure and on-the-fly data processing pipeline will produce the following verifiable outcomes at each stage:

Network and storage
Internal data transfer between the camera controller and storage server should sustain ≥800 MB/s (approaching theoretical 10 Gbps throughput) when measured with tools such as iperf3 or fio. This throughput is sufficient to transfer a 10–12 GB movie stack from the detector in under 15 seconds, ensurin...

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ディスカッション

クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）施設のITインフラストラクチャは、単なる補助的な後付けの設備ではなく、運用のための必須条件です。十分なストレージ、ネットワーク、および処理能力を確保せずにデータ収集を開始した施設は、例外なく、生データの破棄、データ収集の中断、あるいは構造決定に数ヶ月の遅延が生じるという選択肢に直面することになります。ここで述べるプロトコルは、最初のユーザーセッションが始まる前に計算基盤の設計、テスト、および検証を行うことで、このような事態を回避することを目的としています。

クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）のIT設計において最も重要な原則は、ストレージとネットワークの容量を、施設設計者の経験的な直感ではなく、検出器のデータ出力に合わせて構築しなければならないということです。EERモードでは、検出器は1ムービースタックあたり 8–12 GB を書き込みます。24時間のセッションで1分間に約15ムービーを撮影した場合、圧縮前の生データ量は約 2–5 TB に達します。オンザフライのロスレス圧縮（CryoSPARC-Liveで利用可能）により、これを 50–70% ...

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開示事項

著者は利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者は、科学的および技術的支援（NIH High-End Instrumentation program, S10OD02509）を提供したカリフォルニア大学サンタクルーズ校化学・生化学科のBiomolecular Cryo-Electron Microscopy Facility（RRID: SCR_021755）に謝意を表します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Krios 5サーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/jp/ja/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-5-cryo-tem.html透過電子顕微鏡
Krios G4サーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html透過型電子顕微鏡
Glaciosサーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/glacios-cryo-tem.html透過電子顕微鏡
Glacios 2サーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/jp/ja/home/電子顕微鏡/製品/透過電子顕微鏡/glacios-2-cryo-tem.html透過電子顕微鏡
Glacios 3サーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/（最新世代；製品ページは地域によって異なる場合があります）透過電子顕微鏡
タルオス アルクティカサーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/talos-arctica.html透過電子顕微鏡
Talos L120Cサーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/jp/ja/home/電子顕微鏡/製品/透過電子顕微鏡/talos-l120c.html透過電子顕微鏡
CRYO ARM 300 II (JEM-Z300FSC)JEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm300ii.php透過電子顕微鏡
CRYO ARM 200JEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm200.php透過電子顕微鏡
JEM-3200FSCJEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/jem3200fsc.php透過電子顕微鏡
HF8300日立https://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/hf8300.html透過型電子顕微鏡
HT7800日立https://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/ht7800.html透過電子顕微鏡
SU9000（TEM／STEM）日立https://www.hitachi-hightech.com/global/ja/products/microscopes/sem-tem/su9000.html透過電子顕微鏡
Falcon 4iサーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/jp/ja/home/電子顕微鏡/製品/直接電子検出装置/falcon-4i.html直接電子検出器
Gatan K3Gatan (AMETEK)https://gatan.com/products/tem-cameras/k3-is-camera直接電子検出器
Gatan K2Gatanhttps://gatan.com/products/tem-cameras/k2-camera直接電子検出器
アポロ直接電子https://directelectron.com/apollo/直接電子検出器
DE64ダイレクトエレクトロンhttps://directelectron.com/de-64/直接電子検出器
RELIONMRC分子生物学研究所（MRC-LMB）、ケンブリッジ大学https://relion.readthedocs.ioSPAソフトウェアパッケージ
cryoSPARCStructura Biotechnologyhttps://cryosparc.comSPAソフトウェアパッケージ
EMAN2ベイラー医科大学（スティーブン・ルトケ研究室開発）https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2SPAソフトウェアパッケージ
cisTEMカナダ国立研究理事会（ティム・グレントおよび同僚らが開発）https://cistem.orgSPAソフトウェアパッケージ
SPHIREマックス・プランク分子生理学研究所およびベイラー医科大学https://sphire.mpg.deSPAソフトウェアパッケージ
cryoDRGNプリンストン大学（エレン・ジョン研究室が開発）https://cryodrgn.cs.princeton.eduSPAソフトウェアパッケージ
トパーズハーバード医科大学（トラビス・ベプラー研究室が開発）https://github.com/tbepler/topazSPAソフトウェアパッケージ
crYOLOマックス・プランク生物物理学研究所https://cryolo.readthedocs.ioSPAソフトウェアパッケージ
ワープ分子生物学MRC研究所（デミトリー・テグーノフが開発）http://www.warpem.comcryo-ETおよびSTAソフトウェアパッケージ
ModelAngeloMRC分子生物学研究所https://www.modelangelo.orgクライオ電子トモグラフィーおよびSTAソフトウェアパッケージ
IMODコロラド大学ボルダー校https://bio3d.colorado.edu/imodクライオ電子顕微鏡トモグラフィー（cryo-ET）および構造平均化（STA）ソフトウェアパッケージ
Dynamo国立バイオテクノロジー研究センターí（CNB-CSIC）https://www.dynamo-em.orgクライオ電子顕微鏡トモグラフィー（cryo-ET）および構造平均化（STA）ソフトウェアパッケージ
emClarityカリフォルニア大学サンフランシスコ校https://github.com/StochasticAnalytics/emClaritycryo-ETおよびSTAソフトウェアパッケージ
RELION（ETモジュール）ケンブリッジ大学MRC分子生物学研究所（MRC-LMB）https://relion.readthedocs.iocryo-ETおよびSTAソフトウェアパッケージ
EMAN2（SPT）ベイラー医科大学https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2cryo-ETおよびSTAソフトウェアパッケージ
ワープ/MMRC分子生物学研究所https://warpem.github.ioクライオ電子トモグラフィーおよびSTAソフトウェアパッケージ
AreTomoスタンフォード大学（Fei SunおよびWah Chiuグループが開発）https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo2クライオ電子顕微鏡トモグラフィー（cryo-ET）および単粒子解析（STA）ソフトウェアパッケージ
PEETコロラド大学ボルダー校https://bio3d.colorado.edu/PEETcryo-ETおよびSTAソフトウェアパッケージ
PyTomマックス・プランク生化学研究所https://pytom.orgクライオ電子顕微鏡トモグラフィー（cryo-ET）および単粒子解析（STA）ソフトウェアパッケージ
Tomo3Dスペイン国立生物工学センター（CNB-CSIC）https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3dクライオ電子顕微鏡トモグラフィー（cryo-ET）および単粒子解析（STA）ソフトウェアパッケージ
crYOLO（3D）マックス・プランク生物物理学研究所https://cryolo.readthedocs.ioクライオ電子顕微鏡トモグラフィー（cryo-ET）および単粒子解析（STA）ソフトウェアパッケージ
AITomカーネギー・メロン大学https://github.com/xulabs/aitomクライオ電子顕微鏡トモグラフィー（cryo-ET）および単粒子解析（STA）ソフトウェアパッケージ
DIALSダイヤモンド・ライト・ソースおよび共同研究者らhttps://dials.github.iomicroEDソフトウェアパッケージ
XDSマックス・プランク医学研究所（ウォルフガング・カプスが開発）https://xds.mr.mpg.demicroEDソフトウェアパッケージ
MOSFLMケンブリッジ大学MRC分子生物学研究所（MRC-LMB）https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/mosflmmicroEDソフトウェアパッケージ
SHELX大学öttingen（George M. Sheldrick氏により開発）https://shelx.uni-goettingen.demicroEDソフトウェアパッケージ
Phenixローレンス・バークレー国立研究所（PHENIXコンソーシアム）https://phenix-online.orgmicroEDソフトウェアパッケージ
クート医学研究評議会分子生物学研究所（MRC-LMB）、ケンブリッジ大学https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/cootmicroEDソフトウェアパッケージ
Linux（Ubuntu、CentOS/Rocky）Ubuntu：Canonical Ltd.；CentOS：CentOS Project；Rocky Linux：Rocky Enterprise Software Foundation（RESF）https://ubuntu.com / https://www.centos.org （レガシー）/  https://rockylinux.org運用システム
WindowsMicrosofthttps://www.microsoft.com/windows運用システム
ZFSOracle Corporation（もとはSun Microsystems）；OpenZFSはOpenZFSコミュニティによって管理されていますhttps://openzfs.orgファイルシステム
NFSSun Microsystems（現在はIETF標準として維持されている）https://www.rfc-editor.org/rfc/rfc8881プロトコル
SMB（CIFS）Microsofthttps://learn.microsoft.com/ja-jp/windows-server/storage/file-server/file-server-smb-overviewプロトコル
Microsoft リモートデスクトップ（RDP）Microsofthttps://learn.microsoft.com/ja-jp/windows-server/remote/remote-desktop-servicesリモートアクセス
NoMachineNoMachinehttps://www.nomachine.comリモートアクセス
TeamViewerTeamViewer SEhttps://www.teamviewer.comリモートアクセス
VirtualGL + TurboVNCVirtualGL：VirtualGLプロジェクト；TurboVNC：TurboVNCプロジェクトhttps://virtualgl.org および https://turbovnc.orgリモートアクセス
CUDANVIDIAhttps://developer.nvidia.com/cuda-toolkitコンピューターフレームワーク

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